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Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

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Page 1: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cinétique et stochiométrie

A. Garnier

GCH-2103

A-2010

Page 2: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cinétique et stochiométrie

Définition Les termes de base Les modes d’opération Les relations de base Détermination théorique Détermination expérimentale

– Taux initiaux– Cuvée– Chemostat– Stop flow

Page 3: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Croissance cellulaire - variables

X S P

Taux de variation

(kg/(m3.s)

dX/dt dS/dt dP/dt

Taux de production /consommation

rx rs rp

Taux spécifique

(kg/(kg.s)

= rx/X qs= -rs/X qp= rP/X

Rendement (kg/kg) Yx/s = rx/rs = /qp

Yp/x, Yp/s

Page 4: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Mode d’opération

Système fermé: cuvée (batch)

•Aucune entrée ou sortie

•Régime transitoire

•dX/dt = rX, dS/dt = rS

•À t = 0, X = X0, S = S0

Page 5: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cuvée alimentée (Fed-batch)

•Alimentation seulement

•Régime transitoire

•À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0

•F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc

•Si S est constant, le sera aussi, = c

F(t), Sin

V, X, S

Page 6: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Chemostat (continu, CSTR)

F, Sin

V, X, S, P

F, S, X, P

•Une entrée, une sortie

•Mélange idéal: Xout = X, Sout = S, Pout = P

•Après une période initiale d’adaptation, ce système atteindra un régime permanent:

V= cst, X= cst, S= cst, P= cst

Page 7: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Chemostat avec recirculation

F F(1+w)

V, X

Bioréacteur Décanteur

F(1+w)

wF, Xx

Fc, Xc

Fex, Xx

•Permet de concentrer les cellules dans le bioréacteur•Permet de repousser le lavage•Développement pour X seulement

Page 8: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Croissance cellulaire –type de modèles

STRUCTURÉ/

SÉGRÉGÉ

NON-STRUCTURÉ

STRUCTURÉ

NON-SÉGRÉGÉ

+ simple

SÉGRÉGÉ

Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulairesSégrégé: Tient compte d’une distribution de population

Page 9: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Modèles de croissance

Du plus simple au plus compliqué– Exponentiel (ordre 0!!)– Linéaire (logistique)

– Monod– Autres

Phénomènes connexes– Maintenance– Mortalité

Production– Luedeking-Piret combiné aux différents modèles

Page 10: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Modèle enzymatique - Monod

SK

S

S

MAX

Xdt

dX

XYXqsdt

dS

SX

/

-Une variable indépendante, 3 variables dépendantes, trois équations = Une solution!

(1)

(2)

(3)

-Pour un système fermé (cuvée) en supposant YX/S constant:

Page 11: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Modèle de Monod

Équation 3 n’est peut-être pas nécessaire:

dt

dX

Ydt

dX

YX

Ydt

dS

sxsxsx ///

11

Xmax-X = Yx/s * S

Alors:

X

XXY

K

XXY

dt

dX

MAXSX

S

MAXSX

MAX

)(

1

)(1

/

/

X

XXYK

XX

MAXSXS

MAXMAX

)(

)(

/

Page 12: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Modèle de Monod

XXXYK

XX

dt

dX

MAXSXS

MAXMAX

)(

)(

/

t

MAX

X

XMAX

MAXSXS dtdXXXX

XXYK0

/

0 )(

)(

t

MAX

X

XMAX

MAX

MAX

SXS dtdXXXX

XX

XXX

YK0

/

0 )(

)(

)(

Page 13: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Modèle de Monod

t

MAX

X

XMAX

SXS dtdXXXXX

YK0

/

0

1

)(

a

xax

xax

)ln(ln

)(

1

Sachant que:

tXX

XXXYK MAX

X

XMAX

MAXSXS

0

)ln()ln(ln

/

tXX

XX

X

YK

X

X

X

XYKMAX

MAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)(

)(lnln

0

/

0

/

Page 14: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Modèle de Monod

tXX

XX

X

YK

X

X

X

XYKMAX

MAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)(

)(lnln

0

/

0

/

Modèle de Monod

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8

temps (-)

X (

-)

0

4

8

12

16

20

24

S (

-)S = (Xmax-X)/Yx/s

Données  

max= 1

Ks= 5

Yx/s= 0,5

So= 20

Xo= 0,1

Page 15: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Détermination théorique

Cinétique…

Rendement: modèles structurés (stochiométriques et autres)

Page 16: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire

[C6H12O6]n C6H12O6 G3P

glycerol

purines

pyruvate Acétyl-CoA

lactate

Acides gras

éthanol

Lipides

Ac.aminéspyrimidinesCycle de

Krebs

Acides nucléiques

protéinesNAD+ATPH2O

NADHADPO2

Chaîne respiratoire

Le catabolisme génère de l’ATP et du NADH

Modèle stochiométrique (cliquez ici)

Page 17: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Autres valeurs du coefficient de rendement

(Bailey&Ollis, McGraw-Hill, 1986)

Page 18: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Détermination expérimentale

Coefficient de rendement

Cinétique– Taux initiaux– Stop-flow– Cuvée– Chemostat

Page 19: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Détermination expérimentale du coefficient de rendement - YX/S constant

tXX

XX

X

YK

X

X

X

XYKMAX

MAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)(

)(lnln

0

/

0

/

Modèle de Monod

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8

temps (-)

X (

-)

0

4

8

12

16

20

24

S (

-)S = (Xmax-X)/Yx/s

Données  

max= 1

Ks= 5

Yx/s= 0,5

So= 20

Xo= 0,1

Page 20: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Estimation des rendements en cuvée

Modèle de Monod -X vs S

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20

S (-)

X (

-)

Avec des données de t, X, S, on peut calculer, Yx/s par un graphe de X vs S:

Ici, Yx/s = 0,5

Page 21: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Effet de maintenance

S = S(croissance) + S(maintenance)

rS = 1/YG* rX + m * X

qs = 1/YG* + m

1/Yx/s = qs/1/YG + m/

Page 22: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Effet de maintenance

1/Yx/s = qs/1/YG + m/

1/Yx/s vs 1/mu

2

2,05

2,1

2,15

2,2

2,25

0 0,5 1 1,5 2 2,5

1/mu

1/(

Yx

/s)

Page 23: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Effet de mortalité

Le taux de mortalité cellulaire:

rd = - kd*X où kd=cste

Donc en cuvée:

dX/dt = *X – kd*X = (– kd)*X

En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée

Page 24: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et le rendement

glutamine

-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma)

GLUCOSE PYRUVATE

TCA cycle,resp. chain

lactate

glucose pyruvate

GLUTAMINE

GLUTAMATE

OU

NH3

NH3

glutamate

Page 25: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Détermination de la cinétique – Taux initiaux

Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3

Page 26: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010
Page 27: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010
Page 28: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Systèmes d’analyse de cinétique rapide

Méthode de flux arrêté (Stopped-flow): Méthode de flux arrêté (Stopped-flow):

Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés.Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés.

Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».

Page 29: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Systèmes d’analyse de cinétique rapide

Moteur

MélangeurMélangeur

LumièreLumièreDétectionDétection

MoteurMoteur

Temps mort :

Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange)

Temps mort :

Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange)

De l’ordre de 1 milliseconde.

Réactif 1Réactif 1 Réactif 2Réactif 2

Page 30: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de :Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de :

Systèmes d’analyse de cinétique rapide

Photodiodes

Dichroïsme circulaire

Tube photomultiplicateur

Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)

Photodiodes

Dichroïsme circulaire

Tube photomultiplicateur

Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)

Page 31: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Systèmes d’analyse de cinétique rapide

Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :

Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires.

Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires.

Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.

Page 32: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Systèmes d’analyse de cinétique rapide

Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :

Types d’étanchage :

Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M)

Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.

Types d’étanchage :

Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M)

Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.

Page 33: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Moteur

MélangeurMélangeur

Moteur

MélangeurMélangeur

Récupération des fractions

Récupération des fractions

Systèmes d’analyse de cinétique rapide

Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes

Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes

Chambre réactionnelle linéaireChambre réactionnelle linéaire

Réactif 1Réactif 1 Réactif 2Réactif 2

Agent étanchant

Agent étanchant

Page 34: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Spectroscopie de masse « en ligne »

Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse

Électrophorèse sur gel,

Comptage à scintillation,

etc…

Spectroscopie de masse « en ligne »

Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse

Électrophorèse sur gel,

Comptage à scintillation,

etc…

Systèmes d’analyse de cinétique rapide

Les fractions recueillies sont analysées par des méthodes non-optiques :

Page 35: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Estimation des paramètres de Monod en cuvée

Puis on peut reformuler l’équation de X pour isoler des termes reliés linéairement:

tXX

XX

X

YK

X

X

X

XYKMAX

MAX

MAX

MAX

SXS

MAX

MAXSXS

)(

)(lnln

0

/

0

/

÷t÷t

t

XX

XXXX

X

YK

t

XX

MAX

MAX

MAX

SXSMAX

00/0

ln)()(

lnln

Y = b + m X

Page 36: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Monod – estimation des paramètres

t

XX

0

ln

t

XX

XXXX

MAX

MAX

00

ln)()(

ln

Modèle de Monod - Estimation des paramètres

y = 0,2475x + 1

0,5

0,55

0,6

0,65

0,7

0,75

0,8

0,85

0,9

-1,9 -1,7 -1,5 -1,3 -1,1 -0,9 -0,7 -0,5

max = 1

m = 0,2475 = Ks*Yx/s/Xmax

Ks= 0,2475*10,1/0,5

Ks= 5

Page 37: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Utilisation du Chemostat pour la détermination des paramètres cinétiques

Relation cinétique, par exemple Monod:

DSK

S

S

MAX

1D

K

D

KDS

MAX

S

MAX

S

Modèle de Monod -=D vs S

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 5 10 15 20 25

S (-)

=

D(-

)

Modèle de Monod - S vs D

0

5

10

15

20

25

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

D (-)

S

Page 38: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Prochain labo: Cuvée alimentée (Fed-batch)

•Alimentation seulement

•Régime transitoire

•À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0

•F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc

•Si S est constant, le sera aussi, = c

F(t), Sin

V, X, S

Page 39: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cuvée alimentée (Fed-batch)

3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle de ce système:

F

dt

dV dtFVV

t

00

tV

VdtFdV

00

VX

dt

XVd

VXdt

XdV

dt

VdX

F

…. )()(

)()()()( tVtX

dt

tXdtVtFtX

Page 40: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cuvée alimentée (Fed-batch)

VXdt

VXd

dt

VX

VXdc

t

c

XV

VXdtVXd

VX 000

1

tVX

VXc

00

ln tceVXVX 00

Page 41: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cuvée alimentée (Fed-batch)

VX

YSF

dt

VSd

sx

cin

/

VX

YSF

dt

VdS

dt

SdV

sx

cin

/

F0

VXY

SSFsx

ccin

/

cinsx

c

SSY

VXF

/

t

cinsx

c ceSSY

VXF

/

00

Page 42: Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

Cuvée alimentée (Fed-batch)

tceVXVX 00

t

cinsx

c ceSSY

VXF

/

00

dtFVVt

00 dte

SSY

VXVV

t t

cinsx

c c

0

/

000

11

/

00

t

cinsx

ceSSY

XVV

11/

0

0

t

cinsx

t

c

c

eSSY

X

eXX