Clonage Clonage MoléculaireMoléculaire

DéfinitionsDéfinitions

Clonage :Clonage : Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source

originale (Génome) et l’introduire dans un vecteur originale (Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADNd’ADN

Sous-clonage:Sous-clonage: Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie

de ce dernier d’un vecteur à un autre vecteurde ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur Plasmide recombinant:Plasmide recombinant:

Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduitVecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit Organisme recombinantOrganisme recombinant

Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduitintroduit

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Pourquoi cloner?Pourquoi cloner?

Séparer, identifier, manipuler ou Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique exprimer un fragment spécifique d’ADNd’ADN

Étape 1- SéparerÉtape 1- Séparer

Deux approches:Deux approches: Fragmenter/digérer l’ADN génomiqueFragmenter/digérer l’ADN génomique

Génère un très grand nombre de fragmentsGénère un très grand nombre de fragments Peut-être difficile de retrouver le fragment Peut-être difficile de retrouver le fragment

d’intérêtd’intérêt Amplification par PCRAmplification par PCR

Beaucoup moins de fragments Beaucoup moins de fragments Beaucoup plus facile de retrouver la Beaucoup plus facile de retrouver la

séquence d’intérêtséquence d’intérêt

1 plasmide/1 cellule

Enzyme de

restriction

Enzyme de

restriction

TransformationCellules Hôte

Fragment d’intérêt

Vecteur approprié

Générer des extrémités compatibles

Ligature d’ADN

Ligature IntermoléculaireRecombinant

Ligature IntramoléculaireNon-Recombinant

ClonerCloner

Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante

1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert

Duplicationde plasmide

Croissance bactérienne

Amplification des PlasmidesAmplification des Plasmides RecombinantsRecombinants

Criblage et Identification de Clones Criblage et Identification de Clones Recombinants PlasmidiquesRecombinants Plasmidiques

Cartographie de restrictionCartographie de restriction HybridationHybridation PCRPCR

ExpressionExpression

Pourquoi?Pourquoi? Produire la protéine dans un système Produire la protéine dans un système

hétérologuehétérologue Produire la protéine en grande Produire la protéine en grande

quantitéquantité Purifier la protéinePurifier la protéine Étudier l’activité de la protéineÉtudier l’activité de la protéine

Amplification, Mutagenèse, Clonage Amplification, Mutagenèse, Clonage & Expression de LacZ– Projet II& Expression de LacZ– Projet II

Partie IPartie I Amplification & mutagenèse par PCR du Amplification & mutagenèse par PCR du

gène LacZgène LacZ Partie IIPartie II

Clonage de LacZ dans pUC19Clonage de LacZ dans pUC19 Partie IIIPartie III

Esai enzymatique des protéines Esai enzymatique des protéines recombinantesrecombinantes

Purification & Digestion de l’ Amplicon Purification & Digestion de l’ Amplicon Mel 1Mel 1

Purification par QiaQuickPurification par QiaQuick Permet de retirer le tampon, sels, etc.Permet de retirer le tampon, sels, etc. Permet de retirer les amorcesPermet de retirer les amorces Permet de retirer l’enzymePermet de retirer l’enzyme

DigestionDigestion Sites de restriction Sites de restriction BamHIBamHI et et EcoRI EcoRI ont ont

été ajoutés à la séquence de été ajoutés à la séquence de l’ampliconl’amplicon

Absent dans la séquence de Mel 1Absent dans la séquence de Mel 1 Présent dans le site de clonage multiple du Présent dans le site de clonage multiple du

vecteur d’expression (pRS424)vecteur d’expression (pRS424) Permet le clonage dirigéPermet le clonage dirigé