Comment étendre nos connaissances des réactions ion-molécule sur des

petits systèmes à des composés biologiques ?

Guillaume van der Rest

Laboratoire des Mécanismes Réactionnels

Ecole Polytechnique, 91128 Palaiseau Cedex

Plan de l’exposé : 1. Introduction: les propriétés qui changent

1. Fonctionnalisation2. Durée de vie des complexes3. Méthodes d’ionisation

2. Réactions de transfert de proton1. Systèmes peptidiques monochargés2. Systèmes multichargés: peptides et protéines

3. Réactions d’échange hydrogène – deutérium1. Etude structurale en phase gazeuse2. Mécanismes mis en jeu

4. Autres réactions1. Ion simple – molécule neutre biologique2. Ion peptide ou oligonucléotide – molécule neutre

5. Perspectives et avenir

Des systèmes polyfonctionnels

• Peptide et protéines: polyamides fonctionnalisés par des groupes –OH, -NH2, -CONH2, -COOH, -SH et groupements aromatiques.

• Oligosaccharides: éthers, carbonyles, hydroxy et amines.• Oligonucléotides: phosphates en plus des précédents.

Des fonctions classiques, pas d’espèces « exotiques »

Une richesse chimique qui proviendra des nombreuses possibilités d’interactions entre les sites réactifs.

Durée de vie du complexe de réaction

• Petit système : peu de degrés de liberté dans le complexe.

- Si la pression est très faible: k1 + k-1 >> kc [B] + kr

- La réaction conduira majoritairement à une dissociation (réactive ou non) du complexe de réaction.

• Système biologique : un grand nombre de degrés de liberté.

- k1 + k-1 << kc [B] + kr

- La stabilisation de l’adduit par réactions termoléculaires ou émission radiative est dominante.

MH+ + R [ MH+, R ]*kc [R]

k-1

kc [B]

kr

k1

[ MH+, R ]

PH+ + N

Changement de méthodes d’ionisation

• Méthode classique: ionisation par impact électronique– Inadaptée à des composés majoritairement peu volatiles et

sensibles à la température.– Méthode dure menant à de multiples fragmentations des

composés.

• Méthodes modernes: électronébullisation (ESI) et désorption-ionisation laser assistée matrice (MALDI)– De la solution à l’ionisation de façon directe.– Méthodes douces.– Ionisation possible en ions positifs ou négatifs.– Leur développement a ouvert la spectrométrie de masse

comme technique de choix pour l’analyse de composés biologiques.

Deux mots sur l’électronébullisation

Production d’ions multichargés lorsque le nombre de sites basiques devient suffisant.

Réactions de transfert de proton

• Mesure des affinités protoniques (PA) et des basicités en phase gazeuse (GB)

B(g) + H+(g) → BH+

(g)

AP(B) = -ΔH0 ; BG(B) = -ΔG0

• Méthodes de mesure:– équilibre :

BH+ + Bref B + BrefH+ ΔG0 = -RT ln(K)

– cinétique :

Pour des composés peu volatiles, il est difficile d’obtenir une mesure par équilibre.

[ B...H+...Bref ]*

BH+ + Bref

BrefH+ + B

[ B...H+...Bref ]

k1

k2

ΔG0 = -RTeff ln(k1/k2)

Cas des polyglycines

GB (kcal/mol)

Glycine Bracketing Cinétique Bracketing (relaxés)

Gly1 203.1 201.4

Gly2 208.5 211.3 210.0

Gly3 209.8 215.0 213.0

Gly4 209.8 219.3 218.1

Gly5 211.5 223.8 218.4

Gly6 226.8 220.1

Gly7 230.2

H2N

O

HN

O

OH

n-1

H+

A.G. Harrison, Mass Spectrom. Rev., 16, 201-217 (1997) et références citées

Peptides contenant de la lysine

• Acide aminé bidendate

• GB: 221.8 kcal/mol

• Un des trois plus basiques avec Arg et HisH2N COOH

CH2

H2N

4

Peptide GB (kcal/mol)

GlyLys 223.2

LysGly 227.4

GlyGlyLys 230.7

GlyLysGly 225.3

LysGlyGly 230.7

Peptide GB (kcal/mol)

GlyLysLysGlyGly 237.8

GlyLysGlyLysGly 238.5

LysGlyGlyGlyLys 241.9

La basicité dépend de la position des sites basiques.

S.R. Carr, C.J. Cassady, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 7, 1203 (1996)

Z. Wu, C. Fenselau, Tetrahedron, 49, 9197 (1993)

Peptides monochargés

• Basicité fonction des groupes basiques présents

• Accroissement de la basicité avec la taille– Meilleure solvatation intramoléculaire de la charge, qui atteint environ

15 kcal/mol pour les chaînes les plus longues.

• Un effet de la structure secondaire existe, mais n’est pas prédominant.

• Difficultés de mesure, liées à la possibilité d’existence de plusieurs conformères.

• Un traitement des variations d’entropie reste à faire pour obtenir des valeurs d’affinités protoniques.

Ions multichargés• Apparition d’une barrière coulombienne supplémentaire

à la dissociation du complexe de réaction.

Impossibilité de mesurer PA (ou GB) par des méthodes cinétiques.

Définition d’une PAapp (ou GBapp) incluant la barrière électrostatique.

P.D. Schnier, D.S. Gross, E.R. Williams, J. Am. Chem. Soc., 117, 6747 (1995).

Effet des charges multiples sur la basicité: cas du cytochrome c

• 104 acides aminés, 24 sites basiques (Lys, His ou Arg).GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRKTGQAPGFTYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYIPGTKMIFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE

GB intrinsèques

GBapp mesurées

GB méthanol

P.D. Schnier, D.S. Gross, E.R. Williams, J. Am. Chem. Soc., 117, 6747 (1995).

Bradykinine et ses homologues doublement chargés

Bradykinine: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg

Des-Arg1-Bk: Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg

Des-Arg9-Bk: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe

GBapp de [M+H]+ (kcal/mol)

Peptide Réaction de déprotonation Méthode cinétique

Bradykinine 225.8 236.1

Des-Arg1-Bk 222.8 222.6

Des-Arg9-Bk 214.9 215.7

Evolution des basicités attendue en fonction des sites disponibles et des répulsions électrostatiques.

Ecart important sur les valeurs obtenues par deux méthodes différentes.

N.P. Ewing, G.A. Pallante, X. Zhang, C.J. Cassady, J. Mass Spectrom., 36, 875 (2001)

Des formes zwitterioniques?• De telles structures ont été mises en évidence pour

la forme monochargée de la bradykinine. Elles sont possibles pour [M+2H]2+.

2 H+ sur les Arg 2 H+ sur les Arg, 1 H+ sur N-terminal et COO- sur le C-terminal

Suivant les conditions de formation des ions, il pourrait y avoir deux formes ioniques et donc deux valeurs de basicité différentes.

A.C. Gill, K.R. Jennings, T. Wyttenbach, M.T. Bowers, Int. J. Mass Spectrom., 195/196, 685 (2000)

Echanges hydrogène – deutérium

• Un champ d’application de la spectrométrie de masse qui connaît un développement considérable.

• Une voie d’accès par spectrométrie de masse à la structure tertiaire des protéines.

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

HH H

H

D2OCD3ODND3

D

D

D

D

H

D

H

H

H

H

H

D

D

D

Peptides avec des ponts disulfures

Vasopressine [M+2H]2+ TGF-α [M+3H]3+

(a) Avec ponts disulfures intacts

(b) Avec ponts disulfures réduits

J. Wang, C.J. Cassady, Int. J. Mass Spectrom., 182/183, 233 (1999)

Echanges H/D sur le cytochrome c

Tem

ps d

e réaction

avec D2O

• Déplacement progressif vers des masses plus élevées• Dédoublement de certains massifs isotopiques

D. Suckau, Y. Shi, S.C. Beu, M.W. Senko, J.P. Quinn, F.M. Wampler III, F.W. McLafferty, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 790 (1993)

Mise en évidence de conformations coexistantes

D. Suckau, Y. Shi, S.C. Beu, M.W. Senko, J.P. Quinn, F.M. Wampler III, F.W. McLafferty, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 790 (1993)

Conformation dépliée

Conformation native

Formation d’une hélice α

• Le nombre d’hydrogènes échangés permet de délimiter des conformations.

• La conformation adoptée en fonction de l’état de charge est parallèle à l’évolution en fonction du pH en solution.

Mécanisme de l’échange H/D• Cinq mécanismes possibles identifiés par le groupe de

Beauchamp sur des oligomères de glycine.

N

H H

H

ND

D D

O

O

OH NH

HO

O

OHN

H

DD

D

N

HH

H

O

NH

O

D

D

N

HH

O

NH

O

D

D

H

Mécanisme ion onium

PA du neutre suffisamment élevée

Mécanisme relai

PA du neutre faible, assistance par une fonction voisine

S. Campbell, M.T. Rodgers, E.M. Marzluff, J.L. Beauchamp, J. Am. Chem. Soc., 117, 12840 (1995)

N

HH

H

O

O

HN

DD

D

N

HH

H

O

O

N

D D

DH

Mécanisme« salt bridge »

R

O

O H

D

O R'

R

O

O H

D O

O

CD3

R

O

O

D

R

O

O

D

H

O R'

H

O

O

CD3

Mécanisme flip-flop

N

HH

H

N

O

H

N

DD

D

N

HH

N

O

N

DD

D

H

H

Mécanisme par tautomérie

Limitations analytiques des échanges H/D• Limité aux conformations en phase gazeuse alors

que les biologistes s’intéressent aux conformations en solution.

• Déplacement des deutériums lors d’une activation collisionnelle ou infra-rouge.

• Tentatives de modélisation des cinétiques d’échange pour étudier l’accessibilité des sites (F. He et A.G. Marshall): problème du grand nombre de sites possibles.

F. He, A.G. Marshall, J. Phys. Chem. A (?)

Autres réactions ion – molécule

• Pour les raisons de durée de vie du complexe, il est nécessaire que les réactions envisagées soient rapides.

• Une des conditions suivantes est requise :– Des réactifs avec faible énergie d’activation donc très actifs

chimiquement– Des molécules biologiques petites, menant à des complexes

à durée de vie limitée.– Former un adduit à longue durée de vie, mais qui aura

conduit à une modification chimique lors de sa formation.

• R.A.J. O’Hair et quelques autres groupes ont travaillé sur des réactions de type additions nucléophiles ou électrophiles.

R.A.J. O’Hair, J. Mass Spectrom., 35, 1377 (2000)

Réactifs électrophiles

• Electrophiles forts: éviter que la réaction dominante soit un transfert de proton.

PCl2+, CH2=O-CH3+,

RCO+ (R=CH3, C6H5, C6F5, (CH3)2N)

• Exemple de RCO+: exothermicité de la réaction comprise entre 37.5 et 47.9 kcal/mole

• Nécessité de faire passer le peptide en phase gazeuse.– Utilisation de nouvelles techniques: Désorption acoustique

induite par laser couplée à un FT-ICR (LIAD-FTMS)

Y.-Q. Yu, C.L. Stumpf, H.L. Kenttämaa, Int. J. Mass Spectrom., 195/196, 609 (2000)

M.A. Freitas, R.A.J. O’Hair, S. Dua, J.H. Bowie, Chem. Commun., 1409 (1997)

G.E. Reid, S.E. Tichy, J. Pérez, R.A.J. O’Hair, R.J. Simpson, H.L. Kenttämaa, J. Am. Chem. Soc., 123, 1184 (2001)

Réaction avec les ions acylium

O

CR

+H2N

CH3

O

HN

O

OH

NH2

CH3

O

HN

O

OH

O

R

NH

CH3

O

H2N

O

OH

O

R HN

OR O

CH3

H2N

O

OH

HN

OR O

CH3

H3N

O

OHou

+

H2NO

OH

+

N

OR O

CH3

Réactif: gaz neutre

• Sur les peptides protonés:

– Nucléophile conduisant à une réaction d’addition-élimination par des amines

– Protonation du réactif par le peptide, formant « in situ » un réactif électrophile par lequel on se ramène au cas précédent.

O O O

R.A.J. O’Hair, G.E. Reid, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 11, 244 (2000)

E.H. Gur, L.J. de Koning, N.M.M. Nibbering, Int. J. Mass Spectrom., 167/168, 135 (1997)

Substitution nucléophile sur des oligonucléotides• Sur des oligonucléotides [M - nH]n- n > 1

• Le produit de la réaction mène à de nouvelles fragmentations plus complètes sous activation collisionnelle.

Adénine

O

O

P

O

O

OOSiCl

Adénine

O

O

P

O

O

OOSi+ Cl

R.A.J. O’Hair, S.A. McLuckey, Int. J. Mass Spectrom., 162, 183 (1997)

Conclusions et perspectives

• Par le travail réalisé en amont sur les petits systèmes, les bases sont bien posées et sont applicables à des systèmes biologiques.– aspects énergétiques, cinétiques, collisionnels– mécanismes de réaction qui restent du domaine de la chimie

• Des questions se posent sur la nature chimique précise du composé biologique.– Sites de protonation, formation de zwittérions, plusieurs

conformations possibles.– Lié au mécanisme de formation de l’ion– Problème également rencontré pour de petits systèmes

auxquels notre groupe s’intéresse depuis quelques années et qui peut s’étudier par des réactions ion-molécule.

Conclusions et perspectives (II)

• Arrivée prochaine d’un instrument de FT-ICR avec des sources adaptées à l’étude de systèmes biologiques.– Projets d’étude de réaction ion-molécule dans les directions

données dans l’exposé.– Etude d’agrégats plus complexes qui peuvent se former

dans la source ESI et de leur propriétés chimiques.– Deux objectifs: meilleure compréhension des interactions

«faibles» en phase gazeuse et leur effet sur la réactivité chimique ainsi que d’apporter nos compétences de chimistes en phase gazeuse à la résolution de problèmes analytiques pour des biologistes.