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Congrès annuel de la Société Française de ToxicologieCassis, 16 et 17 Octobre 2003
B. JÉGOU
TOXIQUES ET DEVELOPPEMENT DE LA SPHERE GENITALE
ENFANT ET TOXIQUES
Groupe d'Etude sur la Reproduction chez l'Homme et les Mammifères
GERHM
1
2
3
GERHM & ENDOCRINE DISRUPTION
?ENFANT & TOXIQUES
The testis is vulnerable !!!
LA TRAGEDIE DU DIETHYLSTIBESTROL
hypospadias cryptorchidie•Anomalies du spermogramme•Cancer du testicule ?
•Anatomie du développement de l'appareil reproducteur
•Stérilité•Cancers de l'appareil reproducteur
DES
THE ENDOCRINE DISRUPTION CONCEPT…
DEFINITION“An endocrine disruptor is an exogenous substance that causes adverse health effects in an intact organism, or its progeny, consequent to changes in endocrine function”Waybridge, UK, 1996
THE ENDOCRINE DISRUPTION SINGULARITY
Effects occurring through normal signaling pathways
rather than through "classical" toxicological
damage
ENDOCRINE DISRUPTION
• Female hormone• Male hormone• Thyroid hormone
ENDOCRINE DISRUPTORS• Natural mammalian hormones• Natural phytohormones• Synthetic hormones• Environmental contaminants• Agricultural chemicals• Industrial chemicals
EXAMPLES OF CONTAMINATIONS
1976 : 45 000 tons of p-nonylphenol (weak oestrogen)
1982 : 14 0000 tons of alkyl phenol polyethoxylates
1993 : 64 0000 tons of BPA (USA) (weak oestrogen)
EXAMPLES OF POLLUTIONSLABORATORY ANIMAL HUMAN
1986. Contamination by phenol red (cells in culture; Berthois et al)
1991. Plastic/alkyl phenol (cells in culture; Soto et al)
1993. Bisphenol A (yeasts ; Feldman et al)
1946. Sheep œstrogenized by phytoœstrogens (Bennets et al.)
1987. Cheetahs in zoo ; daidzein & genistein (Setchell et al.)
1970-1971. Turkeys, swines & cattle œstrogenized by Fusarum sp (Meronuck et al; Roine et al; Bristol et al)
60’s-1971. DES
1977. Gynecomastia epidemy in child (meat & hormones)
•Dysgénesie de l'appareil reproducteur•Cancer du sein•Endomètrioses•Puberté précoce
•Dysgénesie de l'appareil reproducteur•Cancers du testicule & prostate•Altération du spermogramme
& : sex ratio
PERTURBATION ENDOCRINIENNE
ENDOCRINE DISRUPTION=
SCIENCE FRICTION
TERMINOLOGY•Hormone Disrupting Chemicals (HDC)•Hormonally Active Agents (HAA)•Endocrine Disrupting Compounds (EDC)
•Endocrine Active Compounds (EAC)
Hormone-mimics/Endocrine disruptors/ Endocrine impostors...
PAS DE PREUVEMAIS DES
PRÉSOMPTIONS FONDÉES
?WHY
Spermdecline
1992
Endocrine disruption
1991
EUROPE USA
THE « BIG BANG »
1938-1990 : 61 publications
15 000 men
SECULAR TREND IN SPERM QUALITY : A META-ANALYSIS
1940113x106/ml
199066x106/ml
(Carlsen and al., 92)
THE LOCHNESS SPERM
INTERNATIONAL TRENDS OF HYPOSPADIAS
(L. J. PAULOZZI , 1999)
CanadaCanada (Alberta)Canada (Ontario)U.S. (Atlanta,GA)United States
Atlanta, GAAtlanta (severe)California (severe)Nationwide
Year of birth
Rate
per
10
000
t ot a
l birt
hs
INTERNATIONAL TRENDS IN RATES OF CRYPTORCHIDISM
(L. J. PAULOZZI , 1999)Year of birth
CanadaCanada (Alberta)Canada (Ontario)U.S. (Atlanta,GA)United States
Rate
pe r
10
0 00
t ota
l bi rt
hs
TRENDS IN AGE-STANDARDIZED INCIDENCE RATES OF TESTICULAR
CANCER
0.0
2.5
5.0
10.0
7.5
1943 1958 1973 1988
Incidence per 100.000
(Adami et al, 1994)
PATERNAL CONCENTRATION OF DIOXIN AND SEX RATIO OF OFFSPRING
Concentration of TCCD ( ppt)to the father
Number ofchildren Sex Ratio ( 95 % CI )
Non-exposed 271 0.557 ( 0.49 – 0.61 )
15.1 – 31.3 80 0.438 ( 0.33 – 0.55 )
31.9 – 60.7 81 0.506 ( 0.40 – 0.61 )
61.4 – 117.0 81 0.469 ( 0.36 – 0.58 )
118.0 – 264.0 80 0.400* ( 0.29 – 0.51 )
281.0 – 26400.0 81 0.383* ( 0.28 – 0.44 )
MOCARELLY et al., Lancet 2000, 355, 1858-63
« Les anomalies observées résultent d'une altération du développement gonadique pendant la vie fœtale »
LE POSTULAT DE SHARPE & SKAKKEBAEK
Testis cancer
Mild TDS Medium TDS Severe TDS
• Impaired spermatogenesis
• Impaired spermatogenesis
• Undescended testis
• Impairedspermatogenesis
• Undescended testis
• Hypospadias
RELATIVE FREQUENCY OF SYMPTOMS OF THE TESTICULAR DYSGENESIS
SYNDROME
Skakkebaek et al., 2001
THE TESTICULAR DYSGENESIS SYNDROME
TESTICULAR DYSGENESIS
DISTURBEDSERTOLI CELLFUNCTION
DECREASEDLEYDIG CELLFUNCTION
Environmental factorsincl. Endocrine disrupters
Genetic defectsincl. 45,X/46,XY and point mutations
IMPAIREDGERM CELLDIFFEREN-TIATION
ANDROGENINSUFFICIENCY
REDUCED SEMEN QUALITY
TESTICULAR
CANCER
HYPOSPADIAS
TESTICULAR MALDESCENT
CIS
1
2
FŒTUS
3
POPULATIONS
GERHM & ENDOCRINE DISRUPTION
"PLAYGROUNDS"
FRENCH WEST INDIES
ARGENTINE
BRITTANY
"Intensive agriculture activities (pesticides…)"
Pour répondre à ces interrogations,il est nécessaire de réaliser des études épidémiologiques
ÉTUDE PÉLAGIE BRETAGNE(Influence de l’Environnement sur la Grossesse)
Quels facteurs environnementaux ? • Pesticides, solvants, métaux lourds, carburants…• Rayonnements ionisants, foyers thermiques…
Quels troubles ?• Atteintes de la fertilité chez l’homme ou chez la femme
• Anomalies du développement intra-utérin ou postnatal de l’enfant
http://www.sedif.com/img_home/fillette.jpg
Quels sont les risques de l’environnement sur la reproduction des populations ?
Pesticides et culture bananière
organophosphorés et carbamates(inhibiteurs de l’Ach)
Pesticides et fertilité masculine
Rattus rattus
Mus musculus
Herpetes javanicus
CANNE ASUCRE
CULTURES BANANIERE
FORET TROPICALE HUMIDE
FORETSECHECOTIER
E
GUADELOUPE
Rattus norvegicus
Action des PE sur la descente testiculaire
?
HORMONES & TESTICULAR DESCENT
PHASE I
Trans-abdominal descent
PHASE II
Trans-abdominal descent
&Inguino-scrotal
descent
Testosterone&
? Œstradiol ?
Insulin-like factor 3 & relaxin ?
ETUDE DES EFFETS DES ŒSTROGENES SUR LE GUBERNACULUM DE RAT?
Effets des œstrogènes sur la descente des testicules
• + DES incidence marquée de cryptorchidie• + E2 bloque la descente testiculaire• ERKO positionnement anormal des testicules
A
ER & GUBERNACULUM TESTIS
Rat testis 21.5 days post-coitum
Epididyme
Caudal genitalligament (CGL)
Bulb of gubernaculum
Efferent duct
B
Caudal genital ligament (18.5 days post-coitum)
Er in mesenchymal cells
ER & GUBERNACULUM TESTIS
Effets directs des hormones & xénohormones
?
CLASSIC APPROACH
1 2
AutopsyAutopsy3
AutopsyAutopsy
4
Endocrinologie de la mère ?
Endocrinologie fœtale ?Action directe ?
Effets indirects ?
LIMITES DE L'APPROCHE CLASSIQUE
Impossible de :- étudier la cinétique d ’action des substances- identifier les cibles cellulaires primaires- contrôler les concentrations auxquelles les fœtus
sont exposés
Atmosphère : 37°C, 95% air, 5% CO2
pendant 1, 2 ou 3 jours
♀ gestante de 14,5 jpc
Anesthésie
± DES ou d’E2 à 4.10-6 M, 4.10-8 M ou 4.10-10 MAnalyse cellulaire :
• Comptage cellulaire
• Prolifération cellulaire
• Apoptose cellulaire
Dosage RIA : • Testostérone • AMPc
Détermination du sexe
TARGETS OF DES IN THE RAT FETAL TESTIS
GONOCYTES
• Number
• Mitotic index
• Apoptosis
LEYDIG CELLS
• Number
• Testosterone- basal- LH-induced
SERTOLI CELLS
• Number
• Mitotic index
• Apoptosis
• AMPc/number
FEGA« FEtal Gonad Assay »
Culture Microdissection
± molecule of interest± molecule of interest
PROTEOMICS
C. PineauB. Jégou
Surface : 350 mSurface : 350 m2 2 including 100 mincluding 100 m2 2 of "dust-free room"of "dust-free room"
Servers NTServers NT Image and data analysis Image and data analysis Database research systemDatabase research system
LWS-LIMSLWS-LIMS
High throughput protein identification platform
2D-PAGE2D-PAGE
++2 nano LC-Q/TOF2 nano LC-Q/TOF
1 Biacore 30001 Biacore 30001 SELDI/TOF1 SELDI/TOF
1 MALDI-TOF/TOF1 MALDI-TOF/TOF
MALDI-TOF MALDI-TOF Autoflex BrukerAutoflex Bruker
Robot target feeder Robot target feeder TwisterTwister
APB Spot handling PlatformAPB Spot handling Platform>1000 protein spots/24 hours>1000 protein spots/24 hours
FEGA with Estradiol 4.10-6 MFEGA Control
PROTEOMICS APPROACH
107 188 50
Control 295
Estradiol 238
Switch off
Switch on
Matching
Securised Access
Client/ProjectClient/Project
TESTIS-2DPAGE&
WEST-2DPAGEfederated databases
LWS
Status of analyses in real timeStatus of analyses in real timeRaw data – validated resultsRaw data – validated results
HISTORICAL MILESTONES
IN REPRODUCTIVE TOXICOLOGY
