Cours Histologie Et Immunohistochimie

5/26/2018 Cours Histologie Et Immunohistochimie

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Mthodes danalysemorphologique destissusAurlie PAGNON-MINOT, phD

Novotec _ 13, 15 rue Jacques Monod 69007 [email protected]

Certificat RB8 Biotechnologie et Ingnierie biomdicale Master M1 Recherche Biomdicale


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HISTOLOGIE :

Association des cellules pour former des tissus

Un tissu se dfinit par la structure

lagencement des cellules

la prsence ou non de matriel extracellulaire

Ensemble coopratif de cellules diffrencies formant une association

territoriale, fonctionnelle et biologique

Histologie cellulaire Histologie tissulaire

5 !m

K

F

F

50 !m


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1 mm 10 !m 1 !m 10 nm 1 nm

Macroscopie

Microscopie

photoniqueMicroscopie

lectronique

Microscopieforce atomique

! Rsolution de lanalyse structurale

HISTOLOGIE :

Association des cellules pour former des tissus


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Que faire dun prlvement tissulaire ?

Analyse qualitative ousemi-quantitative

Analyse quantitative

Tissus

Hybridation in situ

Immunohistochimie

Immunofluorescence

Coloration

Analyse structurale

Analyse ultrastructurale

MEB

MET

RT-PCR

PCR quantitative

Western-Blot

ELISA

Structuregnrale

gnes

protines

protines

gnes

protines

protines

gnes


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Prlvement

Tissulaire

(biopsies / pices dexrses)

Immunohistochimie/

ImmunofluorescenceColorations histologiques

standards

Hybridation in situ

Examen Microscopie

lectronique

Microscopie optique

standard

Organigramme de traitement des prlvements tissulaires

Fixation

Microtomie

conglation

Microtome

InclusionInclusion ou non en OCT

Ultramicrotomie

Chimique

Rsinesplastiques

Physique

Physique

paraffine


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! La dure minimale de la technique est de deux troisjours, mais elle est en fait trs variable selon :

- la taille des prlvements : certaines pices opratoires ncessitent 2 3 jours de fixation.

- la nature des prlvements : osseux ou calcifis ncessite unedcalcification pralable (qq heures plusieurs semaines)

- les colorations spciales, ncessaires de nombreux diagnostics,peuvent durer plusieurs jours.

- l'urgence de certains diagnostics, qui impose de raccourcir aumaximum les diffrentes tapes des techniques.

Traitement des prlvements tissulaires


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.Prlvements tissulaires"La biopsie est le prlvement dun fragment de tissu. Elle permet lexamendune partie (partielle) ou de la totalit (exrse) dune lsion. Elle est faite :

!Sous contrle de la vue, au bistouri ou avec diverses pinces!A laiguille ou trocard dans les organes profonds.

"La pice opratoire est le rsultat dun acte chirurgical avec rsection dun ouplusieurs organes. Son tude comporte un bilan macroscopique des lsions(nombre, sige, aspect), qui peuvent faire l'objet de photographiesmacroscopiques, et la ralisation des prlvements ncessaires lexamen.

" Lautopsie(ou ncropsie) est un examen fait sur un individu/animal dcdpour prciser les lsions responsables des symptmes observs, tablir lescauses mdicales et/ou juger ventuellement des effets de traitements appliqus.


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. Fixation : accs des anticorps lantigne 1/3" Evite :

. La dcomposition post-mortem

. La digestion enzymatique" Prserve larchitecture des tissus/cellules

" Immobilise les tissus/cellules dans un tat aussi proche que possible de ltat initial.

Points critiques :

La fixation doit se faire aussi vite que possible :. Immdiatement pour les biopsies. #2h pour les pices opratoires


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. Fixation : accs des anticorps lantigne 2/31. Fixation physique : conglation

Tissu plong dans un liquide refroidissant (isopentane 130C) ou dans de lacarboglace

! Avantages :- maintien de la ractivit de l Ag (fixation idale)- tat proche du vivant- maintien en place des constituants solubles

_ prservation dorganites sensibles la pression osmotique

! Inconvnients :_ peu pratique (azote liquide)_ moins bonne morphologie


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. Fixation : accs des anticorps lantigne 3/32. Fixation chimique :

!Les agents prcipitants: Alcool thylique, actoneModification structure tertiaire des protines : effet dnaturant

! Avantage : - Antignicit prserv! Inconvnients : - Altrations morphologiques

- Dshydratation simultane

!Les agents pontants: Formol, liquide de BouinImmobilisation par des liens intra et intermolculaires! Avantages : - Structures mieux prserves: bonne morphologie

- Meilleure immobilisation des protines! Inconvnients : - Dnaturation + svre des Ag

- Masquage des Ag

Points critiques :Dure de fixation : minimum 24h ( temprature ambiante ou 4C selon le fixateur)Volume de fixateur : 10 fois le volume de la biopsie/pice opratoire.


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Bouin

Formol tamponn

Ethanol

MET MEB

IMAGERIE CELLULAIRE & TISSULAIRE :

INFLUENCE DU FIXATEUR

Bouin

Formoltamponn

Ethanol

MO MET MEB


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Liquide de Bouin

Dure darchivage 20 ans

Liquidede Bouin

Dure darchivage 6 mois


Influence de la dure de fixation


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Type dantigne Tissu fix Tissu

congel

Ag extra

cellulaire +/- +

Ag membranaire Svt - +

Ag intra cellulaire + +


Influence de la fixation


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. Inclusion :" Donne aux pices anatomiques fixes, la consistance ferme, ncessaire la

coupe.

!Imprgnation des tissus par une substance qui durcit secondairement :paraffine, epon, spurr, mthacrylate.Les rsines tant hydrophobes, le prlvement doit pralablement tre dshydrats(immersion dans des bains dalcool). Les tissus fixs suivant cette mthode ne peuvent pastres utiliss pour dtecter les antignes labiles

!Fixation et inclusion peuvent tre remplaces par la conglation (examensextemporans, tudes de structures qui peuvent tre altres par une fixation). Les tissusfrais peuvent tre inclus dans un compos dO.C.T. . Cette technique solidifie les tissuspermettant des coupes trs minces. Les tissus non fixs et congels ont une antignicitexcellente, mais une prservation morphologique mdiocre.

Points critiques :

La temprature de ltape denrobage ne doit pas tre suprieure 58C $risque de sousvaluation du marquage


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Prparations tissulaires (histologiques)

1. Coupes :" Microtome : coupes de 3 8 %m dpaisseur." Cryostat : coupes de 3 20 %m dpaisseur. Permet dobtenir un diagnostic

rapide ou de pallier aux problmes de fixation menaant lintgrit desconstituants cellulaires. Morphologie des tissus non-optimale.

" Ultra- ou cryo-microtome : coupes de 0.02 0.1 %m dpaisseur.

2. Dpt des coupes sur une lame de verre ou sur des grilles(ME)3. Coloration/IHC/IF/ISH/Imprgnation mtallique4. Montage des lames


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! Les colorations : premires tapes du processus permettant lexamenmicroscopique des tissus pour mieux identifier certains constituants de la cellule.

! Les diffrentes tapes de la coloration :

!Dparaffinage (xylne ou OTTIX ; xylne-thanol)La paraffine est insoluble dans leau et lalcool, mais soluble dans leshydrocarbures tels que le xylne

!Hydratation!Coloration proprement dit (routine ou spciale)!Dshydratation (thanol)!claircissement (tolune / xylne).

Aperu des diffrentes colorations histologiques etintrts


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! Les colorations classiques : permettent de mettre en vidence la structure gnraledes tissus.

"Hmatoxyline/Eosine (HE)

"Hmatoxyline/Eosine/Safran


collagne...................................................roseplemuscle..................................................... rose fonc

Cytoplasme acidophile...............................rougebasophiles.................................................pourpre

noyaux......................................................bleurythrocytes.......................................... Rouge cerise

collagne............................................jaune orang

muscle................................................rosecytoplasme..........................rosenoyaux................................................bleu

rythrocytes.........................................rouge


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! Les colorations spciales : sont ralises pour prciser des structures, dessubstances, des constituants (lipides, glucides, protines, acides nucliques,mtaux, etc).


Gordon Sweet Trichrome de Goldner Bleu de Toluidine


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! Mise en vidence des fibres conjonctives : Trichrome de MassonCette coloration met en videnceles fibres de collagne. Cettemthode est trs populaire. Utiledans ltude de la pathologie ducoeur (infarctus), foie (cirrhose ) , rein(fibrose glomrulaire)

Rsultats :Noyau , chromatine et nuclole....bleu fonc noirCytoplasme rouge

Globule rouge rouge

Collagne bleu ou verte

(Variante Goldner)

Coloration habituellement utilise pour observer lastructure de los (inclusion en rsine MMA) : colorationverte de los.



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! Mise en vidence des fibres de collagne et rticuline : Rouge de picroSiriusCette coloration met en videnceles fibres de collagnes.

Rsultats :Noyau , cytoplasmetransparent/rose ple

Collagne rouge



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! Mise en vidence des fibres lastiques : VerhoeffElle met en vidence le rseau de fibres lastiques. Cette

coloration est utile dans le cadre des diagnostics de lsionsdgnratives congnitales ou acquises (vergetures, lastose

solaire), de vascularite (peut tre demande pour mettre envidence la limitante lastique des

vaisseaux), dartrite temporale.

Rsultats :Noyaux gris noir

Fibres lastiques noir

Cytoplasme..selon contre-colorationGlobules rouges selon contre-coloration

Collagneselon contre-coloration



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! Mise en vidence des glucides : Periodic Acid Schiff (PAS)L a c o l o r a t i o n P A S m e t e n v i d e n c e l e s

mucines (pith. bordures en brosse), les membranesbasales, le glycogne ainsi que les filaments et spores

mycliens.Dans les tumeurs indiffrencies, cette

coloration est utile pour orienter le diagnostic vers

une origine glandulaire (adnocarcinome). Elle estdemande dans le diagnostic de pathologiesdu foie et rein.

Rsultats :Noyauxbleu

Glycogne violet



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! Mise en vidence des lipides : Red OilLa coloration Red Oil se fait sur descoupes congeles avec un montageaqueux. Elle est surtout demande pour

observer la statose (microvsicules ou

macrovsicules de statose).

RsultatsLipides rougeNoyauxbleu



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! Mise en vidence des dpts de calciumVon Kossa : Les sels de calcium sont transforms en

sels dargent rduits ensuite en forme mtallique,

indiquant les sites de calcification.

Rsultats :Sels de calcium: noir

Noyaux: bleu

Rouge alizarin: Met en vidence le calcium tissulaire.

Rsultats :

Sels calcium: orange-rougeFond: vert



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! Mise en vidence des pigments et prcipitsLa coloration de Perls: Elle tudie le mtabolisme du

fer. Elle est utile dans certaines pathologies

hpatiques. Caractrise danciennes cicatrices.

Rsultats :Sels ferriquesBleu

Noyaux et cytoplasmeRos



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! Objectif:Mettre en vidence et localiser lchelon tissulaire, cellulaire ou sub-

cellulaire toutes sortes dantignes, rvls par leurs anticorps spcifiques.

! Principe :Le complexe antigne-anticorps est rvl par ladjonction de molcules

enzymatiques sur lesquelles on fait agir un substrat spcifique (microscopie en

lumire blanche) ou de fluochromes (microscopie en lumire ultra-violette) ou

de corps opaques aux lectrons (microscopie lectronique). transmission

Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence

L'immunohistochimie est ne la fin des annes 1930 - dbut des annes 1940 : pour la premirefois en effet des anticorps marqus avec un traceur fluorescent, la fluorescine, taient utiliss pourrvler des antignes cellulaires (Coons et coll., 1941). Depuis, limmunohistochimie a connu un

immense essor.


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Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :mthodes

Une immunoraction est compose de trois lments principaux :

1. l' chantillon marquer (tissu, cellule, organite subcellulaire, virus ...) contenantl'antigne tudier ;2. un anticorps dirig contre l'antigne recherch : il reconnait un motif (pitope) de cetantigne ;3. le systme rvlateur qui permet de visualiser l'immunoraction.

Les diffrents composantsd une imm unoraction

La qualit des rsultats dpend de l'utilisation judicieuse de ces trois lments.


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. Immunofluorescence!sur tissus congels

!observations : - Microscope photonique (filtres spcifiques)

- Microscope confocal

Immunoenzymologie :!sur tissus congels et/ou fixs

!observations : - Microscope photonique (lumire blanche)

- Microscope confocal

- Microscope lectronique transmission



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! ATTENTION !!


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Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :diffrents tapes

Dparaffinage

Prtraitement :dmasquage antignique

Anticorps primaire

Anticorpssecondaire

Inhibition desproxydases

Contre-coloration

Rvlation

IHC

IF


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Accs des anticorps lantigne : dmasquageantignique , permabilisation des membranes

. Dmasquage enzymatique

!Hyaluronidase (protine de la matrice extracellulaire)!Trypsine!Pronase

!Pepsine

. Dmasquage la chaleur!tampon citrate/four micro-onde!tampon EDTA

!bain-marie ++!tuve

. Permabilisation des membranes :!dtergent non ionique : Triton X-100


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Les anticorps primaires polyclonaux et monoclonaux

. Anticorps polyclonaux

!AvantagesPlusieurs anticorps contre un seul antignePlus sensible

Fixation moins critique

!InconvnientsSpcificit moindre : reconnait diffrents dterminants dun mme antigneAffinit et spcificit variable en fonction des lots.

. Anticorps monoclonaux

!AvantagesMono-spcifique (1 pitope)Affinit homogne

!InconvnientsRalisation plus difficile

Plus grande sensibilit la fixation

Les anticorps sont les ractifs essentiels des ractions immunohistochimiques : sans bonsanticorps, pas d'immunoraction.


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33

Production danticorps par des animaux

hyper-immuniss

ANTICORPS POLYCLONAUX


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34

Technique des hybridomes

ANTICORPS

MONOCLONAUX


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35

Milieu HATHypoxanthineAminoptrineThymidine

Laminoptrine bloqueune voie mtabolique quipeut tre contourne par

lutilisationdhypoxanthine et dethymidine sauf par lescellules du mylome


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Les anticorps secondaires

. Immunofluorescence

Utilisation dAc anti-Ig de lapin ou souris coupls un chromogne fluorescent(Fluorescine, Rhodamine, Rouge Texas.).

Avantages : - permet facilement les doubles marquages- vite les problmes lis aux peroxydases endognes

Inconvnients : - fadding ou photobleaching (dcroissance plus ou moins rapide

de la fluorescence en fonction du temps). Des milieux de montages spciauxpermettent d'liminer l'effacement du marquage

- recouvrement des spectres des fluorochromes

. Immunohistochimie

Utilisation dAc anti-Ig de lapin ou souris coupls des enzymes :- la peroxydase- la phosphatase alcaline

Novotec

Aggrcan

Les rvlateurs


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Les rvlateurs1. La fluorescence

Principe dabsorption -Emission

Avantages : - Protocoles rapides- Grande sensibilit- Colocalisations possibles- Confocal

Inconvnients : - Montage aqueux #disparait au cours du temps- Sensibilit la lumire : stockage 4C- Extinction du signal sous UV- Microscope spcialement quip, chambre noire- Marche mal en paraffine

Les rvlateurs


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Substances fluorescentes : Fluoresceine (FITC), Rhodamine, Texas Red, Alexa ,

Couleur $Absorptionde la lumire par une molcule aromatique (benzme etdrivs)

Coloration visible observe correspondant la couleur complmentaire de la couleurabsorbe :

!Vert 510 570nm = rouge!Jaune 570 600nm = bleu

!Orang-rouge 600 _ 750 nm =bleu-vert

Les rvlateurs1. La fluorescence

Les rvlateurs


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Les rvlateurs2. Les Marqueurs enzymatiques

. Les enzymes :

!HRP : peroxydase de raifort!Phosphatase alcaline!Plus rarement : -galactosidase

. Les substrats = chromogne

Les rvlateurs


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Les rvlateurs2. Les Marqueurs enzymatiques

. Les avantages:

!Visualisation aise, microscopie optique!Grande sensibilit!Diffrentes couleurs et contre-colorations

!Stables si dshydrats!Double marquage avec vision simultane (sauf si [Ag1] >> [Ag2]

et colocalisation)

. Les inconvnients

!Protocoles longs!Pas de colocalisation

!Contraste insuffisant si [Ag] faible!Substrats potentiellement carcinognes!Diffusion du prcipit (prcision)


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Anticorps spcifiques de la matrice extracellulaire :

Collagne de type IV

Magnification : x20

Y

X

IHC IF


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Anticorps dirigs contre des protines intracellulaires

Keratin 6

Novotec

Ki67

Novotec


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biotine

anticorps II biotinyl

avidine

complexeABC

ABC

chromogne

anticorps I

biotine

tissu

anticorpsII

phosphatase

anticorps anti-

phosphatase

APAAP

AG

tissu

chromogne

anticorps I

Couplage de lanticorps secondaire avec un complexe :

peroxydase-anticorps anti-peroxydase (PAP),

enzymatique (Alcalin Phosphatase Anti Alcalin Phosphatase, dite technique APAAP)

avidine-biotine conjugu un systme de rvlation

AG

PAP

tissu

anticorps I

anticorps II

proxydase

chromogne

AG

Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Amplification du signal


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. Avantages :

- Liaison biotine-streptavidine irrversible (covalente)

_ Amplification considrable possible

. Inconvnients :

_ Augmentation du bruit de fond

_ Biotines endognes

Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Amplification du signal


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! Sassurer que la technique a fonctionn "Importance des contrles

1. Spcificit du marquage, bruit de fond ?

Fixation non spcifique de lanticorps primaire ou secondaire

Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Analyse de la technique

Solutions :- Blocage des sites aspcifiques : BSA

- Pr-incubation avec un srum isotypique de lanticorps secondaire- Utilisation de dtergents (Tween) #enlve les interactions non spcifiques


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! Sassurer que la technique a fonctionn "Importance des contrles

2. Chromogne = substrat denzymes endognes : proxydase

Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Analyse de la technique

Solutions :- Pr-incubation avec un inhibiteur de proxydase endognes "H2O2.


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Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :Les contrles

1. Les contrles positifs!Incubation de lAc sur un tissu renfermant obligatoirement lAg.!Utilisation dun autre anticorps primaire fonctionnant sur le mme

tissu.

2. Les contrles ngatifs

!sans incubation avec lAc spcifique : omission

!Incubation avec le srum correspondant lanticorps primaire!Incubation de lAc sur un tissu ne renfermant pas lAg.


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. Objectif : Dtecter une squence dacides nucliques (ARN) dintret dans une prparation

cellulaire ou tissulaire

HYBRIDATION IN SITUEtude de la distribution histologique et cytologique

d un acide nuclique

. Principe :Hybridation entre une sonde et un fragment dARN :

$acide nuclique marqu : sonde

$acide nuclique recherch : squence-cible

sonde squence-cible

AP

ARNm

Sonde ARN couple de ladigoxignine

Substrat (NBT/BCIP)

Prcipit color

Anticorps anti-DIG coupl laphosphatase alcaline


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1.Partie Biologie Molculaire :Synthse des sondes

HYBRIDATION IN SITU


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HYBRIDATIONIN SITU

Les diffrentes sondes

. Nature des sondes :

!ADNc double brin!ADNc simple brin!ARN

!Oligonuclotides

. Spcificit : choix de la squence

Dterminer laide des banques de squences (Pubmed) et des logicielsdalignements (ClustalW)

* Introns/Exons, homologie, squences codantes/non codantes

* Taille de la sonde : Compromis entre une bonne stabilit de lhybride(taille suffisante) et une bonne pntration dans les tissus (petite taille).

HYBRIDATION IN SITU


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ADNc dj clon dans un plasmide

Amplifies par PCR

Avantages :

- Stabilit, obtention en grande quantit possibleInconvnients :

- Ncessite sa dnaturation avant utilisation- Possibilit de rhybridation sur elle-mme- Squence longue (prtraitements, Tm leve) donc bruit de fond

RT-PCR(fibroblastes en culture)

Col I

GAPDH

Amorce spcifique / ARN

Col I (491pb) / GPDH (453pb)

HYBRIDATIONIN SITU

Les sondes ADNc double brin

HYBRIDATION IN SITU


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HYBRIDATIONIN SITULes sondes ADNc simple brin

. Obtention par PCR asymtrique

Avantages:

- Stabilit des sondes ADN

- Ne ncessite pas de dnaturation- Pas dhybridation intersonde- Marquage lors de la synthse par PCR

HYBRIDATION IN SITU


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HYBRIDATIONIN SITU

Les sondes ARN

Produit PCR clon dans un plasmide contenant deux promoteurs virauxdARN polymerases

Avantages :

- Grande quantit

- Marquage au cours de la synthse

- Sondes trs marques sens + anti-sens- Hybridation trs stable (ARN-ARN)

Inconvnients :

- Hybridation haute temprature

- Grande taille de la sonde: pntration difficile- Sensible aux Rnases: prparation et stockage plus dlicats

HYBRIDATION IN SITU


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HYBRIDATIONIN SITU

Les sondes

oligonuclotidiques

ADN monocatnaires de synthse dont la squence est complmentaire delacide nuclique cible.

Rgles pour choisir un oligo :!Squence complmentaire de lacide nuclique recherch!Choisir dans la squence codante

!Taille comprise entre 20 et 50 nuclotides!Pourcentage de GC #50-55%!Pas de squences rptes ni palindromiques!Pas de G aux extrmits!Pas de squence poly T

Avantages :- Choix prcis de la squence hybrider : trs spcifique- Stabilit- Facilit dutilisation- Bonne pntration dans les tissus- Pas dassociation possible entre les molcules de sondes- peu onreuxInconvnients :- Sondes peu marques

-Dtermination de la temprature dhybridation dlicate- La squence choisie peut tre difficile daccs (structure secondaire, masquage par des protines)

HYBRIDATION IN SITU


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Etude des gnes dintrt /dtermination des amorces

Amplification par PCR des gnesdintrt et purification

Ligation dans un vecteur de clonage ettransformation bactrienne

Extraction ADN plasmidique

Digestion plasmidique etpurification

Synthse des sondes etpurification

Etape 1

Etape 2

Etape 3

Etape 4

Etape 5

Step 6

Point cl

Etude de la distribution histologique et cytologiqued un acide nuclique : ralisation des sondes

Optionnelselon lessondesutilises

Procedures of RNA probesh i

HYBRIDATION IN SITU


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# Find the sequences of interest genes in bankshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/ !Homo sapiens collagen, type I, alpha 1 (COL1A1), mRNA (NM_000088, 5927 bp)

!Mus musculus collagen, type I, alpha 1 (Col1a1), mRNA (NM_007742, 4709 bp)

# Performed to alignment with a specific software :ClustalW

http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalwan.html

1stSTEP : Primers design to specific gene amplification

(For example : human pro-"1(I))

2. Probes length between 300 and 800

bp (optimal ~ 500 bp).

3. Primers with a hybridization temperature

(50C


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HYBRIDATIONIN SITU

Techniques de marquage des sondes

Agent de marquage :

!marquage radioactif 32P, 35S, 3H "sondes chaudesAttention : les sondes radioactives prsentent de nombreux inconvnients:1. ncessit de se protger contre le rayonnement mis, maniement des sondes inconfortable2. dcroissance rapide du 32P, d o besoin de marquer les sondes frquemmentAvantage: grande sensibilit

!marquage froid : Le nuclotide portant le marqueur est incorpor directement, aucours de la synthse du fragment dADN.

- direct : nuclotide modifi par un fluorophore : Fluoresceine, Cy5, Cy3,

Rhodamine, Texas red,

- indirect : nuclotide marque par un reporter qui sera repr par unemolcule affine : la digoxygnine

Selon la nature de la sonde :

* ADNc : random priming ou PCR

* ARN : transcription in vitro

* Oligonuclotide : 3 tailing

HYBRIDATION IN SITU


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HYBRIDATIONIN SITU

Techniques de marquage des sondes :Random priming

(longation damorce au hasard)

HYBRIDATION IN SITU


59/100

HYBRIDATIONIN SITU

Techniques de marquage des sondes : PCR

+ nuclotide(s) marqu(s)

HYBRIDATION IN SITU


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HYBRIDATIONIN SITU

Techniques de marquage des sondes :ARN

transcription

Produit PCR du gne dintrt clon dans un plasmide contenant deuxpromoteurs viraux

Aprs squenage et linarisation du plasmide, T7/T3 RNAtranscription avec nuclotides marqus


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1.Partie Histologie :La technique dhybridation in situ

HYBRIDATIONIN SITU proprement dit


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p p

Les principales tapes

Prtraitement tissulaireAccs de la sonde : protinase K

Pr-hybridationDiminution de laccrochage non

spcifique

Hybridationentre la sonde et la squence

nuclotidique dintrt

Lavages(supprimer lhybridation non

spcifique)

Rvlation

Facteurs influenant lhybridation : nature des

acides nucliques, composition en base GC,

longeur de la sonde, force ionique, pH de la

solution, prsence dagent stabilisant comme

le formamide, quantit de cibles en prsence,

dure de la raction.



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Fixation des tissusConservation de la morphologie

Fixateurs prcipitants ou fixateurs aldhydiques

Tissu fraisConglation rapide

Efficacit de lhybridation

Coupes des tissusParaffine : prservation des structures morphologiques

Cryostat : sensibilit

p p

La prparation du matriel biologique

La prparation des tissus la technique dhybridation in situ estessentielle. Elle doit seffectuer obligatoirement en condition RNAsefree : matriels autoclaver, port de gants, tampon strile,



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Tampon dHybridation :

pH compris entre 5 et 7

Temprature dhybridation :

Pour les sondes ADNc : hybrider entre 37C et 42C (50% formamide)Pour les sondes ARNs : hybrider entre 50C et 70C

Limitation du bruit de fond :

Sperme de saumon

ARNtDenhardt

Augmentation de lefficacit dhybridation : sulfate de dextran

p p

Lhybridation



65/100

Dilution de la sonde :

Sonde radioactive : 1nMSonde non radioactive : 10 mM

Incubation :

La nuit , en chambre humide

p p

Lhybridation



66/100

Lavages :

Elimination de la sonde non hybride, dure et stringence adapter

Reprage des hybrides :

Sondes radioactives : autoradiographieSondes non radioactives : ractions ICC

p p

Lavages et reprage des hybrides



67/100

- les ARNs faiblement concentrs dans le cytoplasme des cellulesne sont pas dtects.

- les ARNs peuvent tre masqus par des protines qui leur sontassocies.

p p

Problmes lis lHIS

Problmes techniques :

- choix du tampon et de la temprature de dnaturation.- choix de la temprature dhybridation- travailler en condition RNAse free

Problmes de visualisation :

-sondes sur un plan focal diffrent : utilisation dumicroscope confocal



68/100

contrle de la qualit de la sonde : tissu + et tissu

contrle du matriel : hybridation avec sonde htrologue

hybridation avec sonde sens

p p

Contrle de la spcificit dhybridation



69/100

p p

Hybridation in situ in toto

In toto sur desembryons depoissons zbre(PAGNON-MINOT et al., 2008)

Sur coupes congelesdembryons de poissons zbre(PAGNON-MINOT et al., 2008)



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Peau humaine

Magnification : x63

Hybridation in situ sur coupe paraffine

Collagne de type I



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ISH

X

d

eCol1a1

IF

X

de

d

e

X

Collagen I Collagen I

IHC

Hybridation in situ sur coupes paraffine

HYBRIDATIONIN SITU


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$Technique sensibleet semi-quantitative.$ Qui rpond aux questions : O, quand et comment ?$ Hybridation in situ+ IHC = techniques complmentaires:

- HIS : localisation des ARNs transcrits- IHC: localisation des protines traduites

$ Hybridation in situ + PCR quantitative = Techniques complmentaires- HIS : localisation des ARNs transcrits = semi-quantitative- PCRq : Expression des ARNs transcrits = quantitative

Conclusions

La Microscopie : observation des marquages


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! Les marquages peuvent tre observs de nombreuses faons :

" Microscope photonique/optique : 3 systmes de lentilles (condenseur, objectif,oculaire) ; grandissement maximum x1500.

" Microscope optique avec systme additionnel :- microscope contraste de phase,- polarisant,- pipolarisation

" Microscope fluorescence ou confocal" Microscope lectroniqueGnralits :

Sources lumineuses : lumire visible, ultra-violette, rayon X ou faisceau dlectrons

Pouvoir sparateur : il = 0.1mm ; lumire visible = 0.2 %m ; lumire ultra-violette =0.1 %m ; lectrons = 0.1 nm

p q g

Le microscope optique simple et systmes


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additionnels

Principe : Le microscope optique est un instrument d'optique munid'un objectif (lentille 1) et d'un oculaire (lentille 2) qui permet de grossir l'image d'un

objet de petites dimensions (ce qui caractrise son grossissement) et de sparer lesdtails de cette image (et son pouvoir de rsolution) afin qu'il soit observable parl'il humain.

Le microscope optique simple et systmes


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additionnels

Les dpts colors des ractions immunoenzymatiques ou les dpts rouges, verts ou

noirs, d'or et d'argent collodaux s'observent l'aide d'un microscope optique ordinaire(microscope en fond clair).

Des systmes additionnels permettent de mieux voir les ractions de faible intensit oufaiblement contrastes :&contraste de phase et contraste interfrentiel&

vido-microscopie: le signal est amplifi lectroniquement.& pi-polarisation, utilise dans le cas de faibles marquages l'or et l'argent. Laprparation est claire travers l'objectif par une lumire polarise : le mtal rflchit

et dpolarise la lumire. Lobservation se fait travers un filtre polariseur crois ; lemarquage apparait sous forme de points brillants comme on peut le voirsur la figure ci-dessous :

Cellules vgtales marques par unanticorps anti-tubuline ; rvlationpar un anticorps secondairemarqu lor collodal et amplifi largent. A gauche, observation enfond clair, droite mme champobserv en pipolarisation.

Le microscope fluorescence


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Principes :

La fluorescence est la proprit que possdent certains corps d'mettre dela lumire aprs avoir absorb des photons de plus haute nergie. Lamicroscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par dtection

de cette lumire mise.



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Ce sont des microscopes prvus pour tre quips d'une ou plusieurs sourcesde lumire (lampe arc, lampe au xnon, laser, LED) et de filtres permettant deslectionner les longueurs d'onde d'excitation et dmission des traceursfluorescents utiliss.

Ce type de microscope la faveur des immunohistochimistes pour plusieurs raisons :

! la simplicit et la rapidit des marquages fluorescents : pas dtape de rvlation oud'intensification ncessaire comme dans les techniques immunoenzymatiques ou l'orcollodal ;

! la grande sensibilitde nombreux traceurs fluorescents, bien meilleure que lestraceurs enzymatiques ;

! le contraste lev des images ;!un vaste choix de traceurs de couleurs diffrentes ;



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Les inconvnients :

!un prix dachat et un cot de fonctionnement plus levs

!la difficult que l'on avait d'obtenir de bonnes photographies

argentiques noir et blanc (N&B) ou en couleur cause de la luminosit souvent

faible du signal.

!l'affaiblissement du marquage fluorescent au cours du temps. Lespathologistes qui ont l'obligation d'archiver les rsultats de leurs analyses

prfrent utiliser des marqueurs enzymatiques donnant des dpts colorsstables dans le temps.

Le microscopie confocal


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Principes :

Le microscope confocal, ou microscope balayage laser, est un microscope fluorescence particulier

Un microscope confocal est un systme pour lequel l'illumination et la dtectionsont limites un mme volume de taille rduite.L'image confocale (ou coupe optique) est ensuite obtenue par le dplacement dece point de focalisation de la lumire d'excitation dans les trois dimensions del'chantillon XYZ.



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Fibroblaste


Marquage des fibres musculaires rapides dans

des embryons de poisson-zbre

Le microscope lectronique transmission


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Principe :

Analyser la structure dune cellule ou dun tissu grce un microscope lectroniqueAnalyser la structure et lorganisation cellulaire au sein dun tissu ...

Avantage : Augmentation de la rsolution

Limites : Trs fortes contraintes techniques

Taille des chantillons : biais dchantillonnage +++

Choix du fixateur : analyse structurale : glutaraldhyde

analyse molculaire

in situ: paraformaldhyde

Choix du milieu dinclusion : rsines plastiques : rduction de lextractibilit +++

Colorations : Mtaux lourds (citrate de plomb et actate duranyle)




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Analyse des rsultats : analyse qualitative


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Analyse des rsultats : analyse qualitative

Analyse des rsultats : analyse semi-tit ti


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quantitative

-Comptage de structures marques par units desurface

- Apprciation de lintensit de marquage

Foie subnormal Foie cirrhotique

Analyse des rsultats : analyse semi-tit ti


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quantitative

-Compteur + grille (quadrillage) : comptage cellule/cellule

- Sur une zone pralablement choisie (la plus marque, ..)- Sur lensemble de la prparation

Analyse des rsultats : analyseur dimage


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y y g

-Standardisation :

- Mme paisseur de coupe- Mme restauration antignique- Mme condition de marquage : temprature, dilutions, tempsdincubation.

Quantification en analyse dimage :C l i


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Conclusions

-Bien rflchir ce qui doit tre mesur-Russir sa coloration ou son marquage

-Calibrer lanalyseur dimages

Chirurgie


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Analyses macroscopiques

Prlvements des chantillons / biopsies

10 15jours

2 mois 2 ans

2 5 jours

Inflammation Epithlialisation Novascularisation/vascularisation

Remodelagematriciel

Interactionpiderme/derme


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1. Observations macroscopiques et analyses de la rtractation des implants

J0 Greffe

2M

3M prlvement

0

0,2

0,4

0,6

0,8

11,2

1,4

1,6

0d 7d 14d 28d 91d

Surface

area

Time after grafting (days)

Variation of the surface area of X and Y Bilayer Living

Construct during the healing

Substitut X

Substitut Y

Observations macroscopiques :- Aspect gnral de la cicatrice : transparence, rgularit, - Rtraction/contraction- Vascularisation- Tissu de granulation

!A. Pagnon-Minot et al.,, 2010 _ In situ hybridization to evaluate the wound healing process of a bilayered living cell-based construct (Apligraf) in a nude mice model. TERMIS-EU 2010 Meeting- 13th 17th june 2010- Galway(Ireland). (abstract slectionn pour communication)!A. Pagnon-Minot, C. F. Rousseau, F. Thillou, S. Guerret, D. J. Hartmann, V. Ronfard- In Situ Hybridization to evaluate the wound healing process of a bilayered living cell-based construct (Apligraf) in a nude mice model.Organogenesis Inc. Meeting- 22th-26th August 2008- Canton, Massachussetts (US).

Comment seffectue la cicatrisation cutane ?Chirurgie


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2 5 jours

Inflammation


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2. Inflammation

Observations :- Clot de fibrine- Dgradation/ncrose- Type de cellules inflammatoires :

. Polynuclaires

. Lymphocytes

. Macrophages/Cellules gantes

J7

J7

J7

HESHES

MTG



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10 15jours

2 5 jours

Inflammation Epithlialisation


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3. Epithlialisation

X and Y epidermis size evolution

X

YJ0

J28

J14

6M

6MJ7

Involucrin

Involucrin

K6 K6

K6 K6

3M

Couche

spineuse



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10 15jours

2 5 jours

Inflammation Epithlialisation Interactionpiderme/derme


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4. Jonction dermo-pidermique

JO

Collagne type VIICollagne type IV

J14

3M

Observations :- Continuit/discontinuit de lalame basale

- Rseau matriciel souspidermique

- Composition :"Utilisation de marqueursspcifiques des lames

basales (laminine, collagne

de type IV, collagne detype VII)"Utilisation de marqueursde la jonction dermo-

pidermique (collagne detype V, fibronectine,lastine)

Collagne type IV



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10 15jours

2 mois 2 ans

2 5 jours



Exemple de cicatrisation cutane :


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Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de labiodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierietissulaire.

5. Novascularisation/vascularisation

Observations :- Rpartition des no-vaisseaux dans lestissus.

- Expression de facteurs de croissancepar hybridation in situ : Qui, quand etcomment ?

MTG 'SMA



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Prlvements des chantillons /biopsies

10 15jours

2 mois 2 ans

2 5 jours


Remodelagematriciel


Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de labiodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierie


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tissulaire.6. Remodelage matriciel

"Analyse structurale

"Analyse ultrastructurale

J7

3M

3M

Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de labiodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierie


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tissulaire.6. Remodelage matriciel

"Analyse gnique"Analyse protique

Collagne de typeIII

J14

Collagne de typeIII

J14

Documents

Cours Histologie Et Immunohistochimie