Cours M1 - 2012

Introduction aux techniques de biologie

moléculairePartie 2

Western-blot

Extraction des protéinesEchantillon d’origine:

Tissu (foie, cœur, etc…)

Cellules (cultures primaires, lignées cellulaires)

Extraction des protéines:

Tampon - PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases

- Tris-HCl

Séparation fraction/extraits totaux

- Centrifugation

- Ultracentrifugation

Débris cellulaires

Surnageant = Protéines

Western-blot

Dosage des protéines

- Méthode du Biuret: - Méthode de Lowry:Réduction du Cu2+ en Cu+ Réduction du Cu2+ en Cu+Réaction avec Trp, Tyr, Cys Réduction du réactif de Folin Couleur bleue, pic abs 550 nm (phénolique: jaune en bleue), pic abs 750 nmPeu sensible 2-100 µg, zone de linéarité étroite

- Méthode de Bradford:Bleu de Coomassie (se lie à Arg, Tyr, Trp, His, Phe)Rouge (abs 470 nm) et bleu lorsque lié aux protéines (abs 595 nm)Très sensible (0,2 – 20 µg), très rapide, interférence avec certains détergents

- Méthode BCAAcide bicinchoniqueFormation complexe coloré avec Cu+Couleur violette, pic abs à 562 nmTrès sensible, rapide, compatible avec les détergents

Western-blot

Dosage des protéines: exemple

Solution d’Albumine bovine à 1 mg/mL

Dilution en séries

Mesure au spectrophotomètre

Concentration

DODroite étalonnage

DO échantillon

Conc échantillon

Echantillon à doser Distribution

Western-blot

Dépôt et migration des échantillonsGel SDS-page

Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis

Gel de séparation (pH 8,8) 5-15% acrylamide

Gel de concentration (pH 6,8) 5% acrylamide)

Sens de migration

+ pourcentage est élevé+ densité réseau est élevée+ mailles sont serrées

Dépôt et migration des échantillons

Solution de dépôt:

- Tampon HCl pH 6,8 Idem gel de concentration

- Bleu de bromophénol Suivi de la migration

- Glycérol Densifier l’échantillon

Western-blot

Séparation selon le poids moléculaire des protéines

Western-blot

Coloration du gel Contrôle de l’homogénéité de la migration

Vérification de la présence de protéines

Bleu de Coomassie (coloration homogène)

Nitrate d’Argent (plus sensible, parfois moins homogène)

Western-blot

Transfert sur membrane

- Pression, application d’un courant

- Fixation des protéines de façon non-spécifique:

- Interactions ioniques

- Interaction hydrophobes

- Membranes nitrocellulose / PVDF

Western-blot

Coloration de la membrane

Contrôle de l’efficacité du transfert

Contrôle de l’homogénéité des dépôts

Coloration réversible

Les fluorochromes

Immunocytochimie

Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation Sont caractérisés par: - un spectre d’absorption

- un spectre d’émission

Ex: Fluorescéine

Absorption des radiations bleues (max 490 nm)

Émission d’une fluorescence verte (max 520 nm)

Les fluorochromesDiagramme de Jablonski

Immunocytochimie

S0État fondamental

S1État excité

Niveau d’énergie des

électrons d’une

molécule fluorescente

LaserAbsorption

Fluorescence

Emission

Étude des facteurs de transcriptionElectrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

Gel retard

Facteur de transcription

activé

Recrutement du complexe d’activation de

la transcription

ADNSéquence de

fixation spécifique

GèneTATA box

Étude de la fixation d’un facteur de transcription sur sa séquence cible

Principe (1)

Gel retard

Retard de migration dans un gel natif de polyacrylamide de duplexes d'oligonucléotides de séquences courtes (15 à 30 nucléotides) en présence de protéines (ou de complexes protéiques) ayant la propriété de reconnaître spécifiquement la séquence d'intérêt.

Marquage radioactif au P32 des sondes nucléotidiques.

Spécificité de reconnaissance des sondes marquées testée par l'ajout en excès du même duplexe non radioactif qui entrent en compétition avec la forme radioactive.

Présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être mise en évidence par l'ajout d'anticorps spécifiques qui permettent un retard plus important sur le gel appelé " supershift ".

**

Sonde libre

Principe (2)

Gel retard

**

**

**

Sondes spécifiques marquées au P32

+

Protéines nucléaires extraites

- Fixation de la protéine sur sa séquence cible- Élimination des autres

Dépôt sur un gel natif

** *

**

*

**

Sonde + protéine

**

Sonde + protéine + Ac= « Super-Shift »

Résultats

Gel retard

Extraits nucléaires de cellules Hela

Inconvénients: - Extraction de protéines nucléaires

- Manipulation de la radioactivité

Le microscope à fluorescence

Immunocytochimie

Filtre correspondant au fluorochrome utilisé

Filtre d’excitation (2): permet de sélectionner les

radiations absorbées par le fluorochrome (fluorescéine:

490 nm)

Miroir dichroïque (3): ne réfléchit que les radiations

absorbables vers l’échantillon et ne laisse passer par

transmission que les radiations vertes

(fluorescéine: > 500 nm)

Filtre d’émission (6): ne laisse passer par

transmission que les radiations vertes

(fluorescéine: > 500 nm)

1-lampe à arc 2-filtre d'excitation

3-miroir dichroïque 4-objectif

5-préparation 6-filtre d'émission

7-oculaire

Le microscope à fluorescenceEx: Fluorescéine

Immunocytochimie

Le filtre d'excitation sélectionne les

radiations spécifiques du fluorochrome...

...qui sont réfléchies par le miroir et

éclairent l'échantillon...

...celui-ci émet les radiations de fluorescence

qui seules atteignent l'oculaire.

small interfering RNA (siRNA)

siRNA

ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique

conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en

protéine

Mécanisme très spécifique

Permet l’étude des gènes

RNA interférence

siRNA

ARN double brin introduit dans la cellule (siRNA)

DICER

Complexe RISC (RNA-Induced Silencer Complex)

Elimination d’un des brins du siSNA, dit « passager »

Ciblage des ARNm de la cellule possédant une séquence complémentaire

DICER Ribonucléase qui clive l’ARN double brin toutes les 21 à 25 pb

Clivage de l’ARNm cible par RISC

- Nécessité d’une complémentarité parfaite entre le siRNA et sa cible Mécanisme très spécifique

- Possibilité de choisir un siRNA capable de cibler un ARNm porteur d’une mutation ponctuelle sans affecter l’ARNm sauvage

RNA interférence

siRNA

- Introduction du siRNA 24h avant le début de la manip

- Vérification par western-blot de l’extinction de la protéine

Frede et al., 2005Anand et al., 2007

Extraction d’ARN Molécules très fragiles

- Matériels stérile, RNAses et DNAses free

- Travail sur glace

- Port de gants

- Pointes avec filtre

Extraction Phénol/Chloroforme

Utilisation du Trizol® : - Phénol = isole les ADN et ARN

- Isothiocyanate de guanidium = dénaturation protéines

- Anti-RNases

Extraction d’ARN