Embed Size (px)
Citation preview
Cours Module L5-BH-05
Régulation de l’expression des génomes
Mercredi de 13h30 à 15h30 & Jeudi de 8h00 à 10h00 (sem. 0 à 5/6)
Université d’Orléans – UFR Sciences & Centre de Biophysique Moléculaire UPR4301
* 1
PLAN des COURS n°1 & n°2
1- Introduction1.1 pourquoi y-a-t-il régulation?1.2 niveaux de régulation1.3 quelques définitions1.4 notion d’opéron
2- Régulation de la transcription2.1 stratégies de contrôle de l’initiation de la transcription2.2 contrôles positif-négatif2.3 rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes
3- Opéron lactose3.1 organisation générale3.2 phénomène d’induction - inducteur3.3 lacZ - lacY - lacA3.4 mutants de l’opéron3.5 régulations
3.5.1 négative (répresseur)3.5.1.1 expérience Pajamo3.5.1.2 rôle du répresseur3.5.1.3 structure du répresseur3.5.1.4 opérateur
3.5.2 positive : répression catabolique3.5.2.1 diauxie3.5.2.2 AMPc3.5.2.3 scénarios3.5.2.4 structure-fonction CRP3.5.2.5 opérateurs
3.6 récapitulatif* 2
Introduction Pourquoi y-a-t-il régulation de l’expression des gènes ?
Pour répondre aux conditions changeantesde l’environnement immédiat
Sept mécanismes susceptibles de modifier la concentration à l’équilibre d’une protéine ;
Sites possibles de régulation :
1- synthèse du transcrit primaire2- maturation post-transcriptionnelle de l’ARNm3- dégradation de l’ARNm4- synthèse protéique5- modifications post-traductionnelles6- ciblage et transport des protéines7- dégradation des protéines
* 3
1
2 3
4
5
6
7
* 4
Quelques définitions
Les séquences codant des produits agissant en transLes séquences agissant en cis
Un locus agit en cis sur un autre locus s’il est sur la même molécule d’ADN ;
L’opérateur est un élément d’activation en cis car il fonctionne uniquements’il est fixé sur le gène dont il contrôle l’expression.
Un locus agit en trans s’il peut contrôler un autre locus, même à partir d’une molécule d’ADN différente.
Le gène du répresseur du lactose (lacI) agit en trans car il peut réguler l’expression de l’opéron lactose même s’il est enlevé du génome d’E. coli et placé sur un plasmide.
5
élément régulateur en cis : site pour une protéine de liaison à l’ADN, situé le plus souvent, en amont du gène régulé.
élément agissant en trans : protéine elle-même, qui diffuse dans la cellule depuis son site de synthèse jusqu’à son site de liaison sur l’ADN.
*
Quelques définitions (2)
Gène structural
gène qui code une protéine (ou un ARN)
Gène régulateur
gène structural qui code une protéine impliquée dans la régulation de l’expression d’autres gènes.
* 6
7
OPERONGènes structuraux organisés en groupes contenant des gènes codant des protéines dont les fonctions sont apparentées(gènes co-transcrits pour former une molécule d’ARN polycistronique)
À côté de ces gènes, on retrouve :- des séquences adjacentes requises pour la transcription (promoteurs, opérateurs)- des séquences impliquées dans la régulation.
Quelques définitions (3)
Exemple : Les gènes des enzymes successives d’une voie métabolique
*
Quelques rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes
l’ARN polymérase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester qui résulte d’une attaque du groupement 3’-OHdu dernier nucléotide de la chaîne sur le groupement 5-triphosphate du nucléotide entrant, ce qui s’accompagne d’une libération de pyrophosphate
la transcription comprend 4 étapes qui impliquent différents types d’interactions entre l’ARN polymérase et l’ADN :1- reconnaissance de la matrice2- initiation3- élongation4- terminaison
l’ARN polymérase copie en ARN un brin du duplex d’ADNune unité de transcription est une séquence d’ADN transcrite en un ARN unique,
qui débute au niveau du promoteur et se termine au terminateurla transcription a lieu dans une « bulle », à l’intérieur de laquelle l’ARN est synthétisé par appariement des bases
avec un brin d’ADN de la région transitoirement dérouléeau fur et à mesure de la progression de la bulle, le duplex d’ADN se reforme après son passage.
« Idées fortes »
le facteur σ contrôle la liaison à l’ADN de l’ARN polymérase.
la reconnaissance du promoteur dépend de séquences consensus.
il existe deux modes principaux de terminaison.
* 8
Promoteurs bactériens : organisation
9
ARN polymérase
Schematic representation of the major form of E. coli RNA polymerase bound to DNA.
β’ 155613
β 150618
σ 70263
α 36512
ω 10105
*
ARN polymérase : organisation - structure
10*
11
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF :
Répresseur : protéine qui empêche l’expression d’un gène.
Opérateur : site cible de la protéine répresseur.
Lorsque la protLorsque la protééine rine réépresseur se fixe presseur se fixe àà ll’’opopéérateur, lrateur, l’’ARN polymARN polymééraserasene peut plus initier la transcription ce qui empêche lne peut plus initier la transcription ce qui empêche l’’expression du gexpression du gèène.ne.
répresseurinducteur
répresseur inactif
REPRIME INDUIT
INDUCTION
En vert : gène régulateurEn bleu : gène structural
Cas du répresseur lac avec l’IPTG p.e.
*
régulation de la transcription
régulation de la transcription
CONTRÔLE NEGATIF DE LA TRANSCRIPTION
Répresseur inactifcorépresseur
répresseur actif
REPRIMEINDUIT
REPRESSION
* 12
régulation de la transcription
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF :
Un facteur de transcription doit assister l’ARN polymérase pour l’initiation au niveau du promoteur.
activateur inactifinducteur
activateur actif
REPRIME INDUIT
INDUCTION
Cas de la CRP associée au l’AMPc
ARN polymérase
* 13
régulation de la transcription
CONTRÔLE POSITIF DE LA TRANSCRIPTION
activateur actifcorépresseur
activateur inactif
REPRIMEINDUIT
REPRESSION
* 14
Opéron lactose
L’opéron lac : organisationL’opéron lac : organisation
3510 pb 780 pb 825 pb1040 pb
3 gènes structuraux: z, y & a- codant pour les enzymes impliquées dans le métabolisme du lactose- sont exprimés continuellement à faible taux- sont induits environ 1000 fois quand le lactose est présent- sont modulés par le taux de glucose du milieu
laci : un gène adjacent n’appartenant pas à l’opéron, codant pour le répresseur lac
* 15
Opéron lactose
Lactose Glucose
Lactose Glucose-6P glycolyse
Galactose
Galactose-1P Glucose-1P
Glucose
Croissance d’E. coli sur un mélange de glucose et lactose
* 16
Opéron lactose
Les enzymes du métabolisme du lactose sont inductibles
Cinétique d’induction de l’activité β-galactosidasechez E. coli
(d’après Cohn, M. J. Bacteriol. (1957) 21, 156)
82
ARNm
Temps (min)
* 17
Opéron lactoseLes inducteurs de l’opéron lac
• Lactose, (substrate de l’opéron), converti en son isomère (par transglycosylation), l’allolactose.• Allolactose, inducteur naturel (ou inducteur physiologique, isomère du lactose).• inducteur gratuit : induit l’opéron mais pas métabolisé.
Par exemple : isopropylthiogalactoside (IPTG)
O
OH
HOOH
OH
OO
HOOH
OH
OH
O
OH
HOOH
O
OH
OHO
HOOH
OHlactose
O
OH
HOOH
SCH
CH3
CH3
OH allolactose
IPTG ou isopropylthiogalactoside
* 18
lacZ
code l’enzyme β-galactosidase dont la forme active est un tétramère d’environ 500kDa
Réaction catalysée : coupe les β-galactosides et libère les sucres qui les constituent
Exemple : le lactose est hydrolysé en glucose et galactose
Opéron lactose
Equation de la réaction catalysée par la β-galactosidase
* 19
20
lactose
Ext. Int.
Membrane
H+ + lactoseE2 E1
H+
E2-H+-lactose E1-H+-lactose
CYCLE de TRANSPORT
*
E2 E1Opéron lactose
Opéron lactose
* 21
Opéron lactose
* 22
Opéron lactose
RECAPITULATIF
Les mutations de l’opérateur sont constitutives, car le promoteur est incapable de fixer la protéine répresseur;Ceci permet à l’ARN polymérase d’avoir libre accès au promoteur.Les mutations Oc agissent en cis, car elles ne touchent que les gènes structuraux qui leur sont contigus.
mutations Oc
Les mutations qui inactivent le gène lacI entraînent l’expression constitutive de l’opéron, car la protéine du répresseur mutant ne peut plus se fixer sur l’opérateur.
Les mutations constitutives du gène lacI sont récessives.
Les mutations non inductibles lacIS sont dominantes.
mutations du type lacI-
* 23
Quel est la nature du produit codé par le gène I ?Expérience PAJAMO (Pardee AB et al. (1959) J. Mol. Biol. 1, 173)
Conjugaison Hfr I+Z+ x F- I-Z-
On ne s’intéresse qu’aux cellules receveuses;les cellules donneuses sont tuées.
Démonstration de l’existence du répresseur lac : Expérience de conjugaison
Opéron lactose
* 24
Opéron lactoseFonctionnement de l’opéron lac d’E. coli en l’absence de lactose
La protéine répresseur se fixe à l’opérateur et empêche la transcription.L’ARN polymérase peut se fixer au promoteur quand le répresseur est présent sur l’opérateur mais il ne peut y avoir initiation de la transcription.
* 25
Opéron lactoseFonctionnement de l’opéron lac d’E. coli en présence de lactose
* 26
Opéron lactoserépresseur lac
Répresseur lac (suite)Le répresseur lac :
- un tétramère de sous-unités identiques de 360 résidus disposées selon 3 axes de symétrie d’ordre 2, mutuellement complémentaires(chaque sous-unité lie une molécule d’IPTG avec une constante de dissociation K = 10-6M)
1- en l’absence d’inducteur, liaison non spécifique du répresseur sous forme tétramérique à l’ADN double brin (K = 10-4M)
2- en présence d’inducteur, liaison spécifique du répresseur opérateur lac (affinité supérieure K = 10-13M).
Deux domaines fonctionnels pour chaque sous-unité :- un domaine N-terminal de 58 résidus : liaison à l’ADN (mais pas à l’IPTG)- le restant : liaison à l’IPTG.
Le répresseur lac trouve l’opérateur en se liant de façon non spécifique à l’ADN et en diffusant sur sa longueur selon une recherche à une dimension.
Le répresseur se fixe à un ADN double-brin contenant la séquence de l'opérateur lac de type sauvage. Le répresseur ne se fixe pas à un ADN de mutant Oc. L'addition d’IPTG in vitro libère le répresseur de l'ADN opérateur.
* 27
répresseur lac
Fixation à l’opérateurPièce maîtresse
Fixation de l’inducteurcœur
OligomérisationDomaine C-terminal
Opéron lactose
Structure de la sous-unité du répresseur lac.Il existe plusieurs domaines indépendants
dans la molécule.
* 28(Lewis et al. (1996) Science 271, 1247)
Opéron lactoserépresseur lac
IMPLICATIONS STRUCTURALES de l’INDUCTIONChangement de la structure du noyau par l’inducteur : les pièces maîtresses d’un répresseur ne sont plus dans une orientation qui permet la fixation à l’ADN.
En bleu : domaine de fixation à l’ADNEn rouge : hélices α impliquées dans la tétramérisationEn vert : sites de fixation de l’inducteurEn jaune: petites hélices de liaison
Structure d’un dimère du répresseur lac* 29
30
Séquence de l’opérateur
- l’opérateur lac occupe ~ 35 bp
- il est situé en aval du promoteur et couvre celui-ci
- il présente 2 séquences symétriques (séq. palidromique imparfaite)
- ~22 bp sont protégées des nucléases lors d’une expérienced’empreinte
- l’affinité du répresseur pour l’opérateur est 4x106 plus forte quepour une séquence d’ADN quelconque
Opérateur lac
opérateur
*
Opéron lactose
Interactions entre l’opérateur et le répresseuropérateur Opéron lactose
La séquence des bases de l’opérateur lac
* 31
Opéron lactose
résumé
Séquence nucléotidique de la région promoteur lac-opérateur lac d’E. coli, depuisla région C-terminale de lacI (à gauche) à la région N-terminale de lacZ.Les séquences palindromiques de l’opérateur et le site de liaison de CAP sont surlignéesou soulignées (d’après Dickson RC et al., Science 1975 187, 32)
Le répresseur et l’ARN polymérase se fixent sur des sites qui se chevauchent au niveau du point de départ de l’opéron lac.
* 32
Opéron lactoseopérateur
33
L’opéron lac comprend 3 sites de fixation pour le répresseur lac.
*
Opéron lactoseRépression catabolique : mis en évidence
Phénomène de diauxie
Le colibacille (E. coli) utilise le glucose du milieu comme source d’énergie.Si on remplace le glucose par du lactose, la croissance cesse.La croissance reprend rapidement lorsque les cellules ont produit les enzymes nécessaires à la conversion du lactose en glucose.
Quand deux sources de carbone particulière sont présentes ensembles dans le milieu de culture, la courbe de croissance est biphasique : phénomène de diauxie.
* 34
Opéron lactoseRépression catabolique
Cinétique de synthèse de l’ARNm de l’opéron lac suite à l’induction par l’IPTGpuis après addition de glucose.
Glucose : métabolite de choix d’E. coli
* 35
Production d’AMPc
Glucose
Glucose-6-phosphate
Entrée du glucose dans la cellule bactérienne
EN PRESENCE DE GLUCOSE
ACTIVATION de GENES
Opéron lactose
* 36
Répression cataboliqueOpéron lactose
CRP (cyclic AMP [cAMP] receptor protein), également appelée CAP (catabolite activator protein)
L’AMPc s’accumule quand le glucose est absent.
Quand le glucose est présent
- l’adénylate cyclase est inhibée
- AMPc phosphodiestérase est activée.
ATP
AMPc
AMP
Adénylcyclase
AMPc phosphodiestérase
-
glucose
+
glucose
* 37
Opéron lactoseRépression catabolique
Sucre(s) dans le milieu de culture
Quantité relative de β-galactosidase
Glucose 1
Glucose + lactose 50
Lactose 2500
induction répression
* 38
39
CAP est un régulateur positif et l’AMPc la molécule inductrice
Le produit du gène I (répresseur lac) est un régulateur négatif;le lactose ou l’IPTG la molécule inductrice.
*
Opéron lactose
Opéron lactoseCRP
CAP : CAP : cece ququ’’ilil fautfaut retenirretenir
1- active la transcription de plus de 100 promoteurs (facteur de transcription global).
2- protéine d’environ 45 kDa qui se fixe à l’ADN sous la forme d’un dimère (2 sous-unités identiques.
3- le 1er des activateurs transcriptionnels a avoir été isolé (1970) et le 1er pour lequel la structure 3D a été déterminée.
4- en présence d’AMPc, forme un complexe (CRP-AMPc) qui se fixe à une séquencecible de 22pb, située près ou au sein du promoteur qu’il contrôle
5- active la transcription du fait de contacts protéine-protéine avec l’ARNpolymérase
* 40
41
La protéine CRP : organisation structurale
*
Opéron lactose
Opéron lactose
42
Lac Repressor = tetramer
*
O1 O2
La fixation coopérative du répresseur lac entraîne la formation d’une boucle sur l’ARN.
Opéron lactoseCRP
Site de fixation de l’AMPc-CAP
-70 -60 -505’ATGTGAGTTAGCTCACACATT3’TACACTCAATCGAGTGTGTAA
A TT A
Mutations rendant le promoteurindifférent à CAP
Axe de symétrie
Nucléotides aux contacts de l’AMPc-CAP
43Promoteur
*
Opéron lactose
Positions et séquences des 3 opérateurs
44
Effets de mutations sur chacun des 3 opérateurs
*
Le Le rréépresseurpresseur laclac inhibeinhibe la transcription en formant la transcription en formant uneune boucle boucle dansdans ll’’ADNADN
DiffDifféérentsrents modmodèèlesles
Opéron lactose
45
1- région promotrice de l’opéron lac2- transcription3- répression : modèle 1 : fixation du répresseur en O1 & O3,
promoteur libre, site CAP toujours occupéARN pol. pas fixée au promoteur
4- répression : modèle 2 : fixation du répresseur lac en O1 & O2,site CAP toujours occupé,ARN pol fixée au promoteur mais pas de synthèse d’ARN car blocage de l’ARN pol. par le répresseur
*
Opéron lactose
Pour résumer
- en l’absence de lactose, une protéine tétramérique, possédant deux sites de fixation à l’ADN se fixe, en premier lieu, sur le principal opérateur O1 puis soit sur O2 soit sur O3.Deux des quatre sous-unités du répresseur reconnaissent O1; les deux restantes reconnaissant soit O2 soit O3.
- en général le répresseur se fixe en O1 & O3 provoquant la formation d’une structure en boucle de l’ADN entreles deux sites ce qui empêche l’ARN polymérase de se fixer au promoteur et donc d’initier la transcription.
- en fait la transcription n’est pas complètement bloquée : une faible transcription a lieu même en la présencedu répresseur fixé en ses opérateurs.
- en présence de lactose, la lactose perméase permet, dans un premier temps, l’entrée d’une petite quantité delactose, lequel est transformé en allolactose (un isomère structural du lactose) par la β-galactosidase.
- l’allolactose se fixe alors en des sites de la protéine répresseur provoquant un changement de conformation de celle-ci ce qui la rend incapable de se fixer aux séquences opérateur.
- ainsi, avec l’opérateur « libéré » du répresseur, l’ARN polymérase peut se fixer à la région promotrice et initierla transcription.
* 46
47
site actifα-peptide
lacZ
Protéine tétramériqueACTIVE
site actifα-peptide
lacZ’lacZ (∆M15)délétion de 90pb
α-complémentation α-peptideProtéine dimériqueINACTIVE
Protéine ACTIVE
*
