Cours n°7 : Radicaux libres : genèse et détoxification

Ronéo 4 – UE1 – Cours 7

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UE1 : Biochimie biologie moléculaire Pr Peoc’h Le 15/10/19 de 15h30 à 17h30 Ronéotypeur : Sirine Metadjer Ronéoficheur/ Ronéolecteur : Léa Michaud

Cours n°7 : Radicaux libres : genèse et détoxification

La prof a accepté de relire la ronéo, les points importants sont évoqués dans les objectifs du cours.

ROS : Espèces réactives à l’oxygène

ERO : Espèce réactive à l’oxygène

ERN : Espèce réactive à l’azote


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Plan du cours :

I. Stress Oxydant : Origine et Définition A. A. Généralités B. ROS et défense contre les micro-organismes C. Adaptation au stress oxydant D. Rôle du stress oxydant dans la signalisation E. Méfaits des ERO et ERN

II. Espèces réactives de l’oxygène ou ROS

A. Acteurs du stress oxydant B. Origine des espèces radicalaires C. Cytochrome P450 du réticulum endoplasmique

III. Impact en physiopathologie A. Acteurs du stress oxydant B. Défauts de l’athérosclérose C. Cytochrome p50 du réticulum endoplasmique

IV. Mécanismes de protection

A. Les lignes de défenses B. Les apports alimentaires C. Protection par enfermement des radicaux libres D. Enzymes de défenses anti oxydantes E. Intoxication au paracétamol

V. Exploration


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I. Stress Oxydant : Origine et Définition

A. Généralités

L’air dans notre monde est constitué d’O2 qui est nécessaire. Chez les individus aérobies, l’oxygène est indispensable, son absence constitue une situation d’anoxie qui est mortelle. Cette anoxie provoque une chute de l’ATP et donc une mort tissulaire en quelques minutes à quelques heures. En effet, sans oxygène le cerveau est détruit en 3 minutes, le foie, le rein et le myocarde en quelques heures, certains organes comme le muscle, la peau et les phanères résistent mieux, c’est-à-dire quelques heures et quelques jours.

L’oxygène est nécessaire au transfert d’électrons couplé aux phosphorylations oxydatives qui est la source principale d’énergie et qui a lieu dans la mitochondrie. Cependant il peut y avoir des fuites mitochondriales qui vont permettent la libération d’un flux d’électrons incontrôlé qui sera à l’origine en grande partie du stress oxydatif. Ce transfert d’électrons va conduire à la production par les cellules aérobies d’espèces réactives de l’oxygène qui seront neutralisées par les antioxydants.

Il y a un équilibre entre les agents pro-oxydants, les espèces réactives à l’oxygène qui sont sous forme radicalaire ou très oxydés et les antioxydants (surtout des enzymes). L’organisme va essayer au maximum de se rapprocher de l’équilibre.

Dans certaines situations il y a une augmentation de la formation d’espèces pro- oxydantes comme ERO et ERN avec notamment la présence de xénobiotiques (ensembles d’éléments extérieurs comme les médicaments, polluants...) ou une inflammation qui est un climat pro-oxydant. L’équilibre n’étant pas respecté, cela entraine des effets délétères sur les lipides, l'ADN et les protéines.


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B.ROS et défense contre les micro-organismes

Le stress oxydatif peut ne pas être délétère et avoir une utilité notamment pour les globules blancs. En effet, ils utilisent l’O2 pour tuer les bactéries phagocytées via NADPH oxydase et iNOS qui sont des enzymes pro-oxydantes. Ce mécanisme permet de créer des dommages dans les bactéries. Les monocytes et polynucléaires neutrophiles créent des radicaux libres oxygénés via la NADPH oxydase et la myélopéroxydase comme défense non spécifique contre les antigènes.

Le Monoxyde d’azote (NO) produit par les cellules endothéliales intervient dans la transduction du signal. Étant un gaz (avantage : il passe d’un type cellulaire à un autre de manière parfaitement diffusible), il permet donc la diffusion inter-cellulaire. Il a la possibilité de se transformer en un radical, c’est-à-dire devenir une forme associée à un électron libre. Ce radical libre est issu de l’oxydation enzymatique du noyau guanidinium de l’arginine en présence d’oxygène et de NADPH, par NO synthase qui est constitutive dépendante du Calcium (second messager) et inductible.

Le NO via des modifications post-traductionnelles, modifie certaines protéines par nitrosylation ou par S-nitrosylation selon le radical sur lequel il se fixe.Ilse fixe principalement sur les résidus soufrés. Ces nitrosylations ont un impact sur la fonction des protéines.

Les mécanismes pro-oxydatif existent de manières physiologiques mais ils dépendent de la concentration en molécules pro-oxydantes. Un petit stress oxydant est responsable de la croissance, différentiation et la prolifération. Au contraire un trop grand stress oxydant est à l’origine d’une mort cellulaire par apoptose ou nécrose.

Ce NO active les guanylyl-cyclases cytoplasmiques ce qui permet un relâchement des cellules musculaires lisses : vasodilatation, hypotension.


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C. L’adaptation au stress oxydant

L’adaptation est nécessaire contre les effets délétères (toxicité envers l’ADN, l’ARN, les lipides et protéines) via un mécanisme de défense contre l’accumulation d’espèce très réactives. Cette défense se fait en induisant des gènes ou antioxydants et qui favorisent la réparation ou en réprimant des gènes producteurs d’enzymes productrices des ERO.

L’’injection d’une grande quantité d’H2O2 (qui est pro-oxydante) induit une mort cellulaire, tandis que si on en injecte une plus petite quantité cela permet de sensibiliser la cellule et donc de conduire à la survie cellulaire. On « immunise » les cellules grâce à une petite quantité d’agent oxydant qui induisent des enzymes qui répriment les agents oxydants. C’est l’hormésie : réponse biologique favorable en réponse à l’exposition à de faibles doses de toxiques.

D. Le rôle du stress oxydatif dans la signalisation

Le stress oxydatif induit une modification réversible des groupements thiols des cystéines des protéines. Certains éléments impliqués dans le stress oxydatif jouent le rôle de messagers secondaires (notamment le NO et l’H2O2)

Les étapes intermédiaires du stress oxydatif sont liées à la thiolase qui un dérivé soufré avec un électron libre. Cette thiolase interagit avec le glutathion (agent antioxydant) qui le neutralise. Il interagit avec des agents pro-oxydants (h2o2) qui donne des intermédiaires : l’acide sulfurique, l’acide sulfénique puis de l’acide sulfonique ce qui provoque des effets délétères. Le stress oxydatif fonctionne essentiellement par des modifications post traductionnelles et des modifications de structures.


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Les cibles des mécanismes d’oxydation des cystéines sont :

-Phosphatases : Inactivées - Kinases : activées ou inactivées - Protéases : activées ou inactivées -Caspases (enzymes protéolytiques de l’apoptose qui sont inhibées par H2O2 et NO) -Métalloprotéinases (activées par H2O2 et NO) -Régulation des facteurs de Transcription-NKB activés par H2O2, inactivés par NO

E. Méfaits des ERO et des ERN En plus des modifications des cystéines on retrouve aussi :

• Mutations de l’ADN • Peroxydations lipidiques • Altération des protéines • Anomalies de la transduction des signaux • Modulent les gènes et les protéines de stress régulant prolifération, différenciation cellulaire et

apoptose La toxicité de ces ERO et ERN touche également : - l’ADN, c’est la génotoxicité -> Mutagenèse - l’ARN : oxydation et altération - Les lipides : peroxydation, toxicité des produits oxydés -> anomalie signalisation, athérosclérose ? -Les protéines avec l’oxydation des acides aminés (Cys, Met…) la nitrosylation (NO), Carbonylation, la dénaturation (protéines chaperonnes) --- > agrégation, maladies dégénératives ? -Les glucides : glycation et dérivés -> Diabète La 8 hydroxyguanine est un exemple de modification de base de l'ADN. En effet les ROS interagissent avec les bases et peuvent induire des mutations par mésappariement qui mène jusqu’à la mort cellulaire. Les ROS peuvent également avoir des effets sur les lipides via l’acide arachidonique avec la formation de l’isoprostane, qui est un composé Prostaglandine-like, elle mime les effets de la prostaglandine. Les ROS peuvent également oxyder les aldéhydes. Cela induit l’apparition de dérivés toxiques pour la cellule. La modification des protéines ne touche pas seulement la cystéine, les acides aminés aromatiques qui ont des doubles liassions sont très sensibles au stress oxydatif.

Il y a des molécules inductrices telles que les radiations, les exercices physiques (car forte consommation d’O2) … Ils entrainent des oxydations sur les cystéines et des modifications de certaines enzymes et donc l’expression de certains gènes. En réponse, certaines enzymes antioxydantes vont être produites telles que la péroxydase.


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II.ESPÈCESRÉACTIVESDEL’OXYGÉNEOUROS

A. Acteurs du stress oxydant

Les acteurs du stress oxydant sont réactifs à l’oxygène et à l’azote. Ce sont les suivants :

Les radicaux libres sont des espèces chimiques avec un électron non apparié, ils ont une existence indépendante ('libre'). Le radical libre se note avec un point : R°. , ils sont électriquement neutres ou chargés : radicaux cationiques r.+ et anioniques R-.Ils ont une réactivité particulière avec d’autres atomes ou molécules et sont soit oxydant ou réducteur.

B. Origine des espèces radicalaires

1) Le transfert des électrons

Ces formes radicalaires viennent du transfert des électrons liés au métabolisme cellulaire O2+e-→O2-(anionsuperoxyde)

Ces deux formes interviennent dans le stress oxydant.

On classe les molécules en fonction de leur potentiel redox, l’O2 est l’archétype du maximum d’effet oxydant. La forme la plus réduite de l’O2 est l’H2O. On passe de l’O2 a l’H2O via l’O2 qui gagne un e- pour devenir un radical qui gagne à son tour un e- pour devenir un H2O2. Ce peroxyde d’hydrogène(H2O2) (produit via la réaction de Felton) devient OH°…Ce sont donc des espèces intermédiaires qui correspondent à la réduction progressive de l’O2. Lutter contre le stress oxydatif revient à essayer de se rapprocher le plus de la formation de l’H2O.


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Outre la production de radicaux par la mitochondrie par l’intermédiaire de la chaine respiratoire ou encore par le cytochrome p450, certaines enzymes localisées dans des compartiments spécifiques participent à la formation du stress oxydatif. Notamment les NADPH oxydases qui sont dans les globules blancs. La NO synthase qui est produite à partir de l’arginine, génère de la citrulline et du NO. Il y a deux grandes voies de production des radicaux : le transfert des électrons (qui est liée au métabolisme cellulaire) et la scission homolytique de liaisons covalentes (qui nécessite de l’énergie).

Beaucoup d’enzymes participent à la formation des ERO (les oxygénases, des cytochromes…). Certaines espèces sont protectrices (SOD, catalase, peroxydase). Certaines espèces produitent par la NO oxydase notamment sont oxydés et à la fois riche en azote, ils participent à la balance du stress oxydatif. Savoir identifier les enzymes qui luttent contre le stress oxydatif et celles qui favorisent le stress.

La respiration cellulaire participe à la formation des radicaux via des fuites d’e- qui se produisent au niveau de la membrane mitochondriale On a environ 5% de fuites, ce qui permet de former des radicaux libres en dehors de la membrane.


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Exemple du rôle du stress oxydatif dans les phagocytes :

Le stress oxydatif a un rôle dans l’inflammation et l’immunité innée. Les phagocytes internalisent des bactéries et l’enzyme NOX intervient par l’intermédiaire de l’oxygène, en fabriquant des résidus radicalaires qui vont attaquer chimiquement les micro-organismes. La NOX protège donc l’organisme contre les bactéries. Il existe plusieurs NOX dans différents types cellulaires qui ont un rôle de défense, de différenciation et de senescence. Dans cette immunité non spécifique on retrouve aussi la myélopéroxydase qui permet l’incorporation de Cl- dans l’H2O2 pour produire le HOCL qui est potentiellement toxique.

La scission homolytique La scission homolytique est la deuxième voie de production des radicaux, elle est du à une rupture des liaisons qui ne se font pas de manière homogène, on a une séparation du pool d’e- . Cela nécessite un apport énergétique induit par la lumière ou par les radiations ionisantes. La formation des radicaux libres est moins importante par cette voie car elle demande de l’énergie

L’eau est irradiée par les radiations ionisantes, ce qui produit des radicaux libres. La lumière entraine par photolyse la production de radicaux libres. Ce sont des facteurs environnementaux. Ils existent également des facteurs endogènes qui favorisent le stress oxydatif. Parmi ces facteurs endogènes on retrouve ischémie/reperfusion que l’on retrouve en transplantation. C’est la rupture d’un vaisseau ou un vaisseau bouché qui provoque un déficit en O2. On apporte une quantité importante d’O2 pour faire face à ce déficit, mais cet apport entraine des effets liés au stress oxydatif. Trop d’oxygène libéré rapidement entraine donc aussi des effets délétères.


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III. Impact en physiopathologie Ils existent des pathologies chroniques et aigues liée au stress oxydatif cependant la question se pose encore de savoir si ce stress en est la cause ou la conséquence.

Lors d’une intoxication au monoxyde de carbone, le CO va se fixer sur l’hémoglobine donc l’O2 ne peut plus se fixer dessus. L’affinité du CO pour l’hémoglobine est supérieure à celle de l’O2. On va donc exposer le patient à de grandes quantités de dioxygène pour « chasser » le CO ce qui produit du stress oxydatif.

A. Exemple de l’athérosclérose :

L’oxydation de certaines lipoprotéines est liée à la génération de l’athérosclérose. Au niveau des vaisseaux on a une entrée de monocytes capables de produire des ERO qui participent à l’oxydation des LDL. Les LDL oxydés rentrent plus facilement dans les macrophages et forment des cellules anormales, les Foam cell. Ces cellules anormales seraient à la base de la formation de l’athérosclérose car elle se regroupent et prolifèrent ce qui bouche les vaisseaux.


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Certains facteurs de risques de la maladie coronarienne induisent une augmentation de la concentration d’isopentane :

B. Défaut d’ischémie/perfusion

Le défaut d’ischémie perfusion est liée à la chaine respiratoire mitochondriale. En cas d’ischémie c’est-à-dire en cas d’apport insuffisant d’O2, on a un découplage avec un excès d’électrons produits par la matrice mitochondriale et donc des fuites plus élevées. Il existe des mécanismes compensateurs qui vont permettre l’induction de l’enzyme Xantine oxydase. Au moment de la reperfusion, on a une libération massive O2 donc on crée du stress oxydatif et une toxicité cellulaire.

Diapo non abordée


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C. Cytochrome P450 du réticulum endoplasmique

Les cytochromes P450 sont des enzymes importantes dans la détoxification des xénobiotiques. Elles permettent une meilleure hydrophilie des molécules extérieures (notamment les médicaments) ce qui va permettre leur élimination et donc la détoxification. Ce sont des oxydases et des hémoprotéines, l’interaction du fer de l’hème avec les espèces de l’oxygène va participer à la genèse du stress oxydatif. Les toxiques environnementaux vont favoriser le stress oxydatif en induisant ou en inhibant ce cytp450, ce qui produit des effets indésirables majeurs. Les interactions avec le cytp450 sont à l’origine d’interactions médicamenteuses. Il existe une grande diversité des cytochromes avec des métaboliseurs lents et d’autres rapides, ce qui explique les différents types de réponses. Par exemple, la caféine provoque des effets différents chez les individus, cette caféine est métabolisée par l’intermédiaire d’un cytochrome(cyp1A2), les métaboliseurs rapides exprimeront beaucoup plus ce cytochrome comparé aux métaboliseurs lents.

IV. Mécanismes de protection

A. Les lignes de défenses

-1ère ligne (phase aspécifique immédiate capte un certain nombre de radicaux) Présence dans l’organisme de molécules antioxydantes : GSH, Vit C, Vit E, biliverdine, Ac urique, Hème …. -2ème ligne (mécanisme enzymatique) Induction ou répression des gènes Activités enzymatiques anti-oxydantes: GPx, Cat,SOD, Hox… Activités enzymatiques pro-oxydantes : CYP, oxydases… Induction de gènes de réparation : ADN, protéines (Trx, Trx réductase, chaperon) -Dernière ligne Apoptose (suicide cellulaire)


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B. Les apports alimentaires

Diapo à titre d’exemple : intérêt des tanins du vin rouge dérivés des flavonoïdes qui sont des facteurs protecteurs relatifs (anti-oxydants), ils captent des radicaux.

C. Protection par enfermement des radicaux libres

Un des moyens pour lutter contre la diffusion massive des radicaux libres dans l’organisme est d’enfermer ces radicaux au sein d’organites. C’est un confinement en organelles pour protégerl’ADN et les protéines des effets délétères du stress oxydant. Il existe des protections spécifique ou non spécifique.

On lutte contre le stress oxydatif en l’enfermant, ces organites de confinements contiennent beaucoup d’enzymes oxydantes :

-Mitochondrie

COX, certaines oxydases

Sensibilité de l’ADN mitochondrial donc le stress oxydatif excessif sur cet ADN induit des effets délétères

-Peroxysomes

Contiennent de nombreuses oxydases

Catalases et peroxydases


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Les péroxysomes ont de nombreux rôles,

• Métabolisme des peroxydes, des ERO et ERN

• Synthèse des plasmalogènes

• b- et a-oxydation des acides gras

• Métabolisme du glyoxylate

• Métabolisme des acides aminés (dégradation des isomères D des acides aminés, catabolisme de la L-lysine, dégradation des polyamines)

D.Enzymes de défense antioxydante

Les enzymes inductibles antioxydantes qui sont impliquées dans le stress oxydatif sont la catalase (CAT), le glutathion péroxydase et la superoxyde dismutase (SOD) elles ont un rôle dans le catabolisme des radicaux libres. La SOD transforme l’O2-(sous forme radicalaire) en H2O2 (également pro-oxydante) mais qui pourra être dégradé par la CAT en H20 ce qui permet la détoxification de l’H2O2. Le glutathion peroxydase favorise la transformation de l’H2O2 en H2O. Ces 3 enzymes forment un système enzymatique de défense.

Ils existent d’autres protéines antioxydantes :

Les métaux ont un rôle dans la formation de radicaux libres, leur séquestration permet donc de limiter le stress oxydatif.


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On trouve également des antioxydants de bas poids moléculaires qui luttent contre le stress oxydatif :

Certains ont une origine endogène :

-glutathion (synthèse via N-acétyl cystéine) -acide urique : 1O2, LOO° -bilirubine: : 1O2,LOO° -acide lipoïque : .OH, LOO°, HOCL, ONOOH -coenzyme Q10 : LOO° D’autres sont apportés par l’alimentation ils ont donc une origine exogène :

-vitamines C (c’est pour cela que l’on retrouve la vitamine C dans tous les éléments transformés puisqu’ils sont anti-oxydant) -Vitamine E -Caroténoïdes -Polyphénols, flavonoïdes

Le glutathion a un rôle majeur dans la lutte oxydative car il a un très fort potentiel réducteur. C’est un tripeptide (glycine, glutamate, cystéine), on le retrouve dans toutes les cellules à des concentrations élevées. Sa forme réduite possède un groupement –SH qui est capable de céder des H et sa forme oxydée à 2 tripeptides qui se lient de manière covalente (S-S, pont disulfure). Sa forme réduite a un rôle antioxydant. 2 atomes d’H libérés : H2O2--> 2H2O.La forme réduite (GSH) maintient l’état réduit normal de la cellule.

Plusieurs vitamines sont antioxydantes et ont donc un rôle essentiel contre le stress oxydatif. Certaines sont des vitamines hydrophiles comme l’acide ascorbique (vitamine C) ou liposolubles comme les vitamines A et E.


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E. Intoxication au paracétamol

L’intoxication au paracétamol est courante, surtout depuis la diminution des AINS et de l’aspirine. Cependant il a une action importante hépato-toxique, ce qui entraine des hépatites fulminantes (destruction du foie). Il existe des facteurs favorisant comme la prise concomitante d’alcool. La toxicité hépatique du paracétamol est induite par la production importante de ROS. Le traitement contre cette intoxication est la N-Acétyl cysteine (mucomyst) qui favorise la restauration du stock de glutathion.

V. Exploration

Pour explorer le stress oxydant plusieurs éléments peuvent être dosé (diapo passé rapidement pour notre culture) :

Isoprostanes qui sont dérivés de la famille des prostacyclines les Isoprostanes, dont la 8-epi PGF2 alpha.

Peroxydation de l’acide arachidonique, indépendante de l’action des enzymes cyclooxygénase et lipooxygénase

Hydroperoxydes lipidiques notamment certains Aldéhydes stables comme le Malondialdéhyde (MDA) et les 4 hydroxyalkenals comme le 4 HNE (4hydroxynonenal)

Glutathion : contre le stress oxydant, on calcule le rapport glutathion réduit/glutathion oxydé.

Dosage des défenses : acide ascorbique, a-tocophérol, b-carotène, ubiquinol, …

Total antioxydant status

mesure la capacité totale antioxydante du plasma

Marqueurs de la peroxydation des protéines

Protein adducts on protéines carbonylées.

Marqueurs de la peroxydation des acides nucléiques

8-0H-deoxyguanosine.

Marqueurs de l’activation des PN

Dosage de la myeloperoxydase, de la Lactoferrine et de l’elastase.

Dosages d’enzymes anti oxydantes la SODs, la Glutathion peroxydase selenium dept ou indept, la catalase


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Conclusion :

Il existe aujourd’hui une nouvelle définition du stress oxydant en plus du déséquilibre entre pro et antioxydant. On a aussi des anomalies de la signalisation. Ce n’est plus seulement un problème quantitatif.L’homéostasie redox est un équilibre entre production d’espèces réactives et la lutte contre ces espèces. Le stress oxydant a un impact positif dans la défense antimicrobienne. Il a un rôle dans la signalisation et l’adaptation cellulaire. Il a un impact en physiopathologie : cause ou conséquence ?

Objectifs du cours (points importants +++) :

- Citer les principaux acteurs du stress oxydant - Définir un radical libre - Décrire l’origine de ces marqueurs - Citer les principales cibles des espèces réactives - Citer différentes pathologies impliquant le stress oxydant - Citer les principales méthodes d’exploration

Take home message :

Il existe des espèces radicalaires de l’oxygène et de l’azote qui ont un rôle physiologique et un rôle pathologique. Il y a une importance de l’équilibre redox, sinon cela provoque l’induction d’un stress oxydant. Pour lutter contre ce stress on retrouve un important arsenal de protection : spécifique (Enzymatique+++) et aspécifique. Le stress oxydatif est peu exploré en pratique clinique quotidienne.

Pour aller plus loin :

• C Migdal et M Serres, Espèces réactives de l’oxygène et stress oxydant, 2011, Med. Sci.

• S. Benhabbouche et al, Base des phénomènes d’ischémie reperfusion et de la protection myocardique, Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 30 (2011)


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Cours n°7 : Radicaux libres : genèse et détoxification