Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 1/10

CCO Médecine Moléculaire Anne DUMAY 20/12/17 de 13h30 à 15h30 Ronéotypeuse : Miléna Brochier

COURS N°9 : RÉPARATION DE L’ADN ET CANCER

La prof n’a pas donné ses diapos, ce qui n’est pas très pratique pour les exemples. J’ai conscience que sans exemple, ça n’est pas archi clair… J’ai fait de mon mieux en cherchant sur internet mais ça n’a pas toujours été concluant. De plus, beaucoup de répétitions dans ce cours.

73/134

Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 2/10

I. ALTÉRATION DE L’ADN A. Stress génotoxique B. Endommagement/Altération de l’ADN C. Mutations

II. MUTATIONS A. Prévention B. Arrêt du cycle cellulaire C. Réparation de l’ADN D. Tolérance E. Apoptose F. Voies de signalisation

III. DÉFICIENCE DE MÉCANISMES DE RÉPARATION DE L’ADN A. Xeroderma Pigmentosum – NER B. Syndrome de Lynch – MMR C. Lymphome folliculaire non hodgkinien – Recombinaison V(D)J

74/134

Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 3/10

I. ALTÉRATION DE L’ADN A. Stress génotoxique

Un agent génotoxique est un agent toxique pour le génome, responsable de l’altération de l’ADN pouvant conduire à la formation de mutation. Ils sont d’origine exogène ou endogène. Exemple d’agents exogènes (liés à l’environnement ou au mode de vie) : rayons UV, chimiothérapie, irradiation médicale, irradiation industrielle, rayons cosmiques (irradiation naturelle)… Exemple d’agents endogènes (liés à la cellule : radicaux libres) (ROS Reactive Oxygen Species) qui endommagent tous les constituants de la cellule, ainsi que l’activité métabolique de la cellule, cycle cellulaire.

B. Endommagement/Altération de l’AND : Ex des dommages/altération de l’ADN pouvant donner lieu, suite à la réplication, à des mutations : présence d’uracile dans l’ADN à cause de la désamination spontanée des cytosines, site abasique c’est à dire de l’ADN avec une base en moins, des oxydations de certaines bases comme les 8 oxoguanines, des dimères de pyrimidines, des cassures simples brins et doubles brins, des mésappariements Ex de mutations: mutations ponctuelles, insertions, délétions, des remaniements chromosomiques, des aneuploïdies. Ce stress génotoxique peut entraîner des endommagements sur l’ADN de différentes manières, ce qui peut causer des mutations. Une altération est réparable : il s’agit d’une modification chimique ou structurale des nucléotides, reconnue par la cellule, réparable et non héréditaire. Une fois qu’il y a eu une réplication, on parle alors de mutation. C’est une différence dans la séquence de nucléotides qui est transmissible et irréversible. De plus, les altérations ne sont pas héréditaires, contrairement aux mutations qui le sont. Cas de l’ADN POLYMERASE : Source d’endommagement de l’ADN car elle peut faire des erreurs qui peuvent provoquer des mésappariements (substitution, insertion). C’est donc un agent génotoxique. La mutation (ici la substitution) est la conséquence d’une altération (ici le mésappariement). Elle peut également déraper dans les régions microsatellites et peut recopier une répétition en trop ou même la sauter. De la même manière, si le dérapage n’est pas réparé, on peut obtenir une mutation à la réplication suivante.

Sur l’image, c’est un exemple d’un

mésappariement. Le mésappariement GA sera détectable et pourra alors être corrigé par le Système de Réparation des Mésappariements. (SRM) Le problème sera donc résolu. Mais en revanche, la paire CG existe, ce n’est pas un mésappariement et ne sera donc pas détecté et corrigé. C’est ce qu’on appelle une mutation. C’est irréparable.

75/134

Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 4/10

(Ce n’est pas l’exemple donné en cours, mais c’est pour vous faire comprendre que la mutation est la conséquence du mésappariement. Quand on est au stade du mésappariement, c’est réparable, mais au stade de la mutation, ça ne l’est plus.)

C. Mutations Malgré tout, les mutations confèrent des avantages : ce sont la base même de l’évolution. Mais elles peuvent également être source de maladie génétique (elles résultent d’une mutation) comme pour la drépanocytose (substitution d’un T par un A dans le gène codant pour la chaîne bêta de l’hémoglobine) et de cellules tumorales (suite à une accumulation de mutations).

II. RÉPONSE CELLULAIRE : les moyens de defense de la cellule face à un stress génotoxique

A. Mécanisme de prévention Par exemple :

- L’ADN polymérase : son activité correctrice exonucléasique 3’-5’ permet de relire et corriger le brin qu’elle vient de synthétiser s’il y a une erreur. Elle ne corrige pas toutes les erreurs mais permet de limiter le nombre d’erreurs.

- Les ROS sont surtout générés par la respiration de nos cellules. Certains sont créés volontairement par

la cellule mais beaucoup sont créés de manière accidentelle. Ils sont hautement réactifs vis à vis des constituants de la cellule. Les enzymes de la cellule et les antioxydants vont se defender et éliminer les ROS. Les antioxydants sont d’origine exogène (vit C, caraténoide) ou endogène (bilirubine, glutathion…)

- Comment on se protège des UV au niveau cellulaire ? Le bronzage est le résultat d’un pigment

synthétisé par la cellule qui filtre les UV. (pas développé). Mais la prévention n’est pas toujours suffisante…

B. Arrêt du cycle cellulaire La majorité de nos cellules sont quiescentes à G0 et attendent un signal afin de s’engager dans les différentes phases de la division cellulaire : G1, S, G2 et la mitose. Au cours du cycle cellulaire normal, il existe des points de contrôles dépendants des kinases (CDK) et de cyclines qui empêchent la cellule de passer à l’étape suivante si la cellule n’a pas fini les étapes précédentes (une cellule n’ayant pas fini sa phase S ne peut pas commencer la phase G2). Cela évite d’avoir des choses aberrantes. Il existe trois checkpoints qui sont utilisés physiologiquement : entre G2/M, G1/S et pendant S. Ils sont également utilisés lorsqu’il y a des dommages au niveau de l’ADN. Ils vont reconnaître d’une part si la cellule a toutes les protéines nécessaires pour pouvoir commencer à répliquer son ADN et d’autre part, vérifier s’il y a un quelconque dommage sur l’ADN. Grâce au FACS (Fluorescences-activated cell sorting) qui est une technique de cytométrie à flux, on marque l’ADN de nos cellules par un marqueur fluorescent et on va passer nos cellules, une par une, devant un laser qui va exciter ce marqueur. On obtient donc la quantité d’ADN (par corrélation avec la quantité de fluorescence) dans chaque cellule. Au début du cycle, on remarque que la majorité de nos cellules sont en G1 (2n chromosomes à 1 chromatide) et qu’au bout de 4h, elles passent en phase S. Puis, elles passent en G2 (2n chromosomes à 2 chromatides). Si on effectue la même expérience sur des cellules irradiées (UV+) : on remarque que ces cellules

76/134

Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 5/10

sont bloquées en phase G1 pendant 24h et passent petit à petit en phase S. En réponse aux UV, il y a donc eu un blocage du cycle entre G1 et S. L’arrêt du cycle permet l’arrêt de la réplication de l’ADN endommagé et permet aussi de donner du temps pour que les mécanismes de réparation agissent.

C. Réparation de l’ADN

Il existe plusieurs systèmes de réparation de l’ADN qui sont spécifiques de certains dommages et agissent avant qu’ils ne soient répliqués et qu’ils deviennent des mutations :

Système BER Excision de bases Reconnaît des petits altérations de base : (ex uraciles, sites abasiques, 8 oxoguanine…)

Système NER Excision de nucléotides pour les dommages plus important qui entraînent des distorsions au niveau de la double hélice d’ADN (ex : dimère de pyrimidine) Le seul qui répare les dimères de pyrimidines provoqués par les UV : des protéines reconnaissent le dommage, éliminent la région comprenant les dimères de pyrimidines, puis une ADN polymérase recopie le brin complémentaire et une ligase lie les extrémités

Système MMR Corrige les mésappariements soit les erreurs de réplications (généré par les dérapages de l’ADN polymérase dans les microsatellites)

Système de recombinaison homologue

Préviennent les cassures simples ou doubles brins.

Système NHEJ

Même si chaque système a ses spécificités, on retrouve des redondances. Par exemple, pour réparer les cases doubles brins, il y a la recombinaison homologue et le système NHEJ.

Ex du système BER : Les 8 oxoguanines sont des

guanines oxydées notamment suite à un stress oxydant. On a donc une altération de la base. Si on a réplication, en face de la guanine oxydée, on aura une adénine et non une cytosine. Et à la réplication suivante, en face de l’adénine, on aura une thymine. On débute donc avec une paire GC et on termine avec une paire TA. C’est une donc une mutation et plus précisément une substitution appelée une transversion. Avant la réplication, la cellule va essayer de corriger l’oxydation par l’intermédiaire du BER. Une enzyme de ce système l’ADN glycosylase va donc couper la liaison N-osidique entre la base et le sucre. Une fois la base retirée, soit on remplace le site abasique par un nucléotide, soit on supprime tout une portion de l’ADN et on resynthétise tout une portion . Si ce système suffit, il n’y aura pas de mutation.

77/134

Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 6/10

D. Tolérance des dommages La cellule peut également tolérer le dommage. Cela veut dire que le dommage initial est toujours là (on le tolère, il sera transmis dans la cellule fille en espérant qu’il sera enfin réparé plus tard) mais on peut finir la réplication. Imaginons que nous avons un ADN double-brin avec un dimère de pyrimidine. Devant ce dimère, l’ADN polymérase va s’arrêter transitoirement et redémarrer plus loin. A la fin de la réplication, on va donc se retrouver avec un brin d’ADN avec un dimère de pyrimidine et un autre brin avec une brèche simple -brin. Cette dernière peut être reconnue par le mécanisme de recombinaison homologue qui reconnaît également les brèches simple-brins. Cela permet de finir la réplication mais le dommage initial est toujours présent (il n’a réparé que le brin avec une brèche. L’autre brin porteur du dimère est toujours intact). Il existe un autre mécanisme appelé TLS (Synthèse d’ADN translésionnel) qui intervient : il existe toute une collection d’ADN polymérase qui peut intervenir en face d’un certain brin endommagé (exemple : brin avec un dimère de pyrimidine) en mettant à la place de la brèche des nucléotides « au hasard » : on a ici un brin endommagé + un brin non fidèle. Dans les deux cas, la réplication est faite jusqu’au bout, sans que pour autant le dommage ne soit transformé en mutation. On donne alors une seconde chance pour que le dommage soit réparé dans la cellule fille.

E. Apoptose L’apoptose est une mort cellulaire programmée qui va être caractérisée par une condensation/fragmentation de la chromatine, une modification de la composition lipidique de la membrane plasmique qui va être responsable d’un démantèlement d’elle-même en différents corps apoptotiques, nettoyés ensuite par phagocytose. Il s’agit d’une mort propre : elle n’induit pas d’inflammation. Ce mécanisme est induit si la cellule estime qu’elle a beaucoup de dommages et que les réparer lui coûterait beaucoup trop d’énergie. Donc, il vaut mieux qu’elle se « suicide » plutôt que prendre le risque de devenir une cellule dangereuse pour l’organisme. On peut également suivre les cellules en apoptose au cytomètre à flux. On remarque que pour une cellule humaine, il lui faut 24h pour faire un cycle complet. Quand on regarde des cellules UV+, en sub-G1 (avant la phase G1), on voit que les cellules sont en apoptose et décident donc de mourir face à l’irradiation des UV.

F. Voies de signalisation Nous avons donc vu que nos cellules, face à un stress génotoxique, ont des mécanismes de prévention, peuvent arrêter leur cycle cellulaire, tolérer ces altérations ou bien même provoquer l’apoptose. Mais on a besoin de contrôler tout cela : elles vont induire des voies de signalisation qui permettent de contrôler tous ces mécanismes en même temps.

78/134

Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 7/10

En réponse à des cassures doubles brins (CDB), il existe des senseurs comme ATM (kinase) qui va phosphoryler des protéines cibles comme H2AX ou encore p53 qui vont être impliquées soit au niveau de la chromatine, soit dans la réparation de l’ADN, l’apoptose ou le cycle cellulaire. Mais ces cibles ne vont pas être actives en même temps. Ces différents mécanismes de réponses se font de manière concertée et dans un certain ordre : ils font partis d’une même voie de signalisation. D’abord, ATM va activer des cibles impliquées dans l’arrêt du cycle cellulaire puis celles de la réparation de l’ADN. Tant que la CDB persiste, ATM continue d’être active. Une fois la CDB éliminée, ATM s’inactive et tout redevient normal. Si jamais les mécanismes de réparation ne réussissent pas à éliminer les CDB, ATM reste active et va finir par activer les protéines de l’apoptose.

III. DÉFICIENCE DE MÉCANISME DE RÉPARATION DE L’ADN A. Xeroderma Pigmentosum - NER

Le Xeroderma Pigmentosum est une maladie rare qui touche principalement les enfants (« enfants de la lune ») avec une extrême sensibilité cutanée aux rayons UV. Cela peut conférer des tumeurs oculaires et cutanées dès l’âge de 8 ans avec des décès précoces (entre 10 et 30 ans suite à un cancer de la peau). Cette maladie a été connue assez tôt (1870) mais les gènes impliqués dans cette maladie ont été découverts seulement en 1974-1975. Suite à des groupes de complémentation grâce à des cultures de fibroblastes (= fusions de fibroblastes deux par deux de 2 patients différents) de patients afin de voir si ces fibroblastes allaient être résistantes aux UV ou non. Les chercheurs ont obtenu 7 groupes de complémentarité (c’est-à-dire 7 gènes impliqués dans la maladie). On les nomme « gènes XP ». Il suffit d’avoir un gène XP pour avoir la maladie. Les patients sont donc sensibles aux UV émis par le soleil qui sont de trois sortes : UVA soit 5% de ceux qui nous touchent (générant des 8 oxoguanine), UVB soit 95% de ceux qui nous touchent et UVC, arrêtés par la couche d’ozone (générant tous les deux des dimères de pyrimidines.) Ces gènes XP sont impliqués dans le système NER, seul mécanisme pouvant exciser les dimères de pyrimidines provoqués par les rayons UV. Il y a deux types de dimères de pyrimidines : les cyclobutanes pyrimidines et les 6-4 photoproduits. Il y a donc un défaut du système NER. Selon une expérience, dans les fibroblastes atteints, au bout de 24h, il n’y a que 10% de cyclobutanes pyrimidines de réparés et aucun 6-4 photoproduit éliminé. Cette maladie n’est pas encore guérissable.

B. Syndrome de Lynch – MMR Le syndrome de Lynch est également nommé cancer colorectal héréditaire sans polypose (HNPCC Hereditary non-polypsis colon cancer). Il est provoqué par une mutation des gènes MLH1 et MSH2 (et aussi MSG6 ou PMS2/1) du MMR. Le colon étant en perpétuel renouvellement (tous les 3 jours), il est sujet à des erreurs de réplication dues à l’ADN polymérase. Puisque le système MMR est déficient, cela entraîne une instabilité génétique pouvant conduire à des cancers du côlon. En clinique, on ne va pas s’amuser à séquencer tous ces gènes pour voir s’ils sont bien mutés afin de confirmer le diagnostic. On fait en général une immunohistochimie afin de voir MLH1, MSH2, etc. Dans une cellule normale, on va voir que ces protéines sont bien exprimées. En revanche dans une cellule atteinte, on remarque que ces protéines le sont beaucoup moins, il y a un défaut d’expression des protéines impliquées dans le système MMR. Les microsatellites (répétitions de quelques nucléotides) sont aussi très sensibles aux erreurs de réplication dues à l’ADN polymérase. Si l’on a un défaut du système MMR, on peut orienter notre recherche en

79/134

Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 8/10

vérifiant s’il y a des instabilités au niveau des microsatellites (MSI). En temps normal, le système MMR, en cas de dérapage de l’ADN polymérase, est capable de détecter la boucle insérée en tant que mésappariement et est capable de l’éliminer. Si on regarde par PCR la région portant des microsatellites en trop, on a deux (car cellule diploide) bandes de certaine taille car il n’y a pas le même nombre de microsatellites dans chaque allèle d’un même chromosome. Chez un individu malade, la boucle ne sera pas réparée. A chaque fois que les cellules se diviseront, l’ADN polymérase risque de faire des erreurs avec un nombre de polymorphismes toujours plus grand ce qui peut provoquer des mutations. Par PCR, on aura une multitude de bandes correspondant chacune à dérapage non corrigé de l’ADN polymérase : c’est l’instabilité des microsatellites du syndrome de Lynch.

C. Lymphome folliculaire non hodgkinien Il va toucher les cellules LB dans les ganglions lymphatiques. Il est lié à une translocation chromosomique réciproque entre les chromosomes 14 et 18 notée t(14,18). On a un échange de parties de chromosome qui aura pour conséquence de mettre la région du gène BCL2 sous le contrôle d’une séquence Enhancer contrôlant le promoteur de la chaine lourde de l’immunoglobuline. Cela entraîne une surexpression de BCL2 et plus précisément exprimé mais de manière incontrôlée (qui est anti-apoptotique). Il s’agit d’un défaut de réparation de l’ADN qui va entrainer ce t(14,18) (explications ci-dessous). Les LB expriment des BCR (qui sont des immunoglobulines) qu’ils expriment après leur maturation en plasmocyte. Afin de pouvoir reconnaître un maximum d’antigènes potentiels, il faut un grand nombre de lymphocytes différents. Il existe 108 clones différents de LB capable d’exprimer qu’un seul type d’immunoglobuline. Mais le génome ne peut pas contenir 108 gènes : les immunoglobulines sont composées de chaînes lourde et légère, chacune codée par ungène. Ainsi, il suffit d’avoir 104 gènes pour la chaîne lourde et 104 gènes pour la chaîne légère afin d’avoir 108 clones différents. Mais 104 gènes dans le génome n’est toujours pas possible en raison de sa taille (il y a environ 30 000 gènes codants) Un southern blot des lymphocytes matures et des cellules souches d’un même individu : au niveau du génome tout est censé être identique. On a fragmenté l’ADN que l’on a fait migrer sur un gel par la technique d’électrophorèse. On a aussi récupéré l’ARN messager codant de la chaîne lourde de l’immunoglobuline à partir des lymphocytes matures. Il va servir de sonde : on l’hybride sur nos différents ADN et on attend à ce qu’il y ait le même profil dans le génome de la cellule mature et de la cellule souche. Mais on retrouve des profils différents : la formation des gènes codantes pour les chaînes lourdes/légères d’immunoglobulines était générée par un mécanisme de recombinaison appelée V(D)J. (welcome in UE5…) Initialement dans le génome de nos cellules souches, on possède des répétitions de région (soit V, soit D, soit J) qui, sur l’ADN, vont subir des réarrangements. L’ADN va subir des CDB volontaires et contrôlées par les enzymes RAG1 ou RAG2 entre des répétitions V et D ou D et J. Ensuite, un mécanisme de réparation des cassures doubles brins (mécanisme proche du NHEJ, appelé « recombinaison VDJ » va intervenir pour essayer de réparer ces cassures associant alors un segment V avec un segment D avec un segment J (grâce à une ligase). En somme, on « grignote » des nucléotides de part et d’autre de la cassure et recoller les extrémités. Elle va le faire au hasard, c’est-à-dire qu’elle va par exemple associer ensuite une région V avec une région J. Ensuite, il y aura épissage alternatif avec un assemblage aléatoire du segment VDJ avec un segment C. De plus, comme dans chaque lymphocyte, la réparation de la CDB sera différente, il y aura une multitude d’immunoglobulines différentes.

80/134

Ronéo 13 – CCO Médecine Moléculaire – Cours 9 9/10

Pour les chaînes lourdes, il existe : 51 segments V, 27 segments D, 6 segments J. => plus de 8000 combinaisons possibles Pour les chaînes légères, il existe environ 320 combinaisons possibles. � D’où la possibilité d’obtenir 2x106 immunoglobulines différentes Dans le cas du lymphome, la réparation des CDB par la recombinaison VDJ ne se fait pas correctement. : la recombinaison a lieu entre la chaîne lourde de l’immunoglobuline et le gène BCL2 du chromosome voisin, provoquant la survie anormale des lymphocytes B (et donc un lymphome). Le mot de la fin : “Une déficience dans un des mécanismes de réparations, c’est source d’instabilité génétique, c’est à dire de dommages, d’altérations de l’ADN qui ne seront pas réparés et qui vont être transformés en mutations et à force d’accumuler des mutations, on va obtenir des cellules cancéreuses et donc un risque accru d’avoir des cancers !” Encore une fois, si les diapos sortent, regardez-les, ça peut vraiment vous aider ! Je peux vous envoyer l’audio si vous voulez. Encore désolée de ce cours pas terrible mais passez quand même de bonnes fêtes <3

81/134

82/134