Philippe Glaser

CRISPR-Cas9 pour la microbiologie synthétique et la lutte

contre l’antibiorésistance

Une reconnaissance du risque par les instances internationales

Des données alarmantes pour l’avenir

Les spécificité de la résistance aux antibiotiques

• Les bactéries pathogènes sont le plus souvent pathogène opportuniste présentes dans nos microbiomes

• Les bactéries s’échangent des gènes de résistance

Les parasites des bactéries

• Les bactériophages (virus)

• Les plasmides

• Les transposons conjugaifs

Ces éléments « parasites » sont apparentés

• Des phages s’intègrent dans les génomes comme les transposons conjugatifs

• Des phages se répliquent comme des plasmides

• Des transposons conjugatifs se répliquent comme des plasmides

• Des transposons et les plasmides peuvent passer de cellule à cellule par conjugaison

Tous ces éléments peuvent porter des gènes de résistance aux antibiotiques

Interactions bactéries – parasites

• Interaction complexe, les bactéries ont domestiqué certains de leurs parasites

• Ces éléments, en apportant des fonctions aux bactéries, peuvent favoriser leur dissémination

• La bactérie cherche à contrôler ces parasites

• Les parasite en particulier les bactériophages développent des stratégies pour les contourner

• Ces protections ciblent l’ADN

Les systèmes de restriction-modification

• 1er système de reconnaissance des ADN exogènes (non modifiés)

Met

Met

rep

Res

La base du génie génétique WernerHarber

CRISPR un système d’immunité Lamarckien (2007)

CRISPR

La diversité des systèmes CRISPRClass 1 Class 2

Origine des systèmes CRISPR - Cas

Les système CRISPR dériveraient d’intégrase d’éléments transposables appelés Casposons

Mécanime de coupure et d’identification de la cible

tracrRNA

Mécanime de coupure et d’identification de la cible

E. Charpentier J. Doudna

Homologous Recombination

NHEJ

Small indels

Point mutationGene insertion

etc.

No repair

Cell death

Cas9

Peut on utiliser CRISPR-Cas9 pour lutter contre les bactéries?

CRISPR comme outil biotechnologique

2014

2014

2019

CRISPR pour tuer spécifiquement des bactéries

Principe:• Introduire dans une bactérie:

• un gène exprimant Cas9 (la nucléase)• Un gène exprimant l’ARN guide ciblant la bactérie choisie:En fonction de l’espèceEn fonction de la résistance: un gène de résistance, un

plasmide

Problème: Utilisation d’OGMfaire rentrer ces ADN sans sélection avec une efficacité

proche de 100%Utilisation des éléments génétiques mobiles

Deux stratégies

Les bactériophages Les plasmides conjugatifs

Manipuler les phages pour injecter l’ADN construit Manipuler les plasmides

Deux difficultés: spécificité d’hôte et efficacité de transfert

CRISPR-Cas9 comme antibiotique

Elimination séquence-spécifique de S. aureus

pDB114

Bikard & al., Nat Biotech, 2014

Elimination par Cas9 de S. aureus

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 200 400 600 800 1000

KanR

KanS

Compétition avec des bactéries non-ciblées

OD

(6

00

nm

)

GFP

Time (min)

Bikard & al., Nat Biotech, 2014

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 200 400 600 800 1000

KanR

KanSO

D (

60

0n

m)

GFP

Time (min)

Compétition avec des bactéries non-ciblées

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 200 400 600 800 1000

KanR

KanSO

D (

60

0n

m)

GFP

Time (min)

Compétition avec des bactéries non-ciblées

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 200 400 600 800 1000

KanR

KanSO

D (

60

0n

m)

GFP

Time (min)

Compétition avec des bactéries non-ciblées

Décolonisation spécifique d’une souche résistante de S. aureus sur la peau de souris

Chad Euler, RockefellerVince Fischetti, Rockefeller

Applications

Traitement d’une infection

Décolonisation spécifiques pour les souches MDR

Resensibiliser des souches résistantes (en ciblant le plasmide)

Méthode d’appoint lors d’une antibiothérapie

Modification spécifique du microbiome

CRISPR-CAS9 pour manipuler le génome

• Transformation du pneumocoque

Dans les survivant le gène cible à été remplacé par une copie mutée

dCas9 pour réguler l’expression génétique

• dCas9 est une version mutée sans activité nucléase

• dCas9 va se fixer sur l’ADN sur une cible correspondant à l’ARN guide

Peut aussi réprimer plusieurs gènes simultanémentAnalyse des gènes essentiels, d’épistasies

Le potentiel de systèmes connexes à CRISPR

• Transposase dirigée par un système CRISPR-Cas

Application : diriger l’intégration d’un fragment d’ADN

Remerciements

David Bikard