CYTOSQUELETTE et MOBILITE

Master Physiopathologie Cellulaire et Moléculaire

Option Cancérologie

Eric GUERIN

Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire - Hôpital de Hautepierre

EA 4438 Physiopathologie et Médecine Translationnelle - UdS

Marqueurs Moléculaires de Progression Tumorale et de Sensibilisation aux Drogues Anticancéreuses

Le processus métastatique

� Profondes modifications dans les mécanismes d’adhérence et de migration cellulaire� Sous-tendues par des remaniements importants du cytosquelette (mobilité)

Dissociation cellulaireModification phénotypique (EMT)Franchissement Membrane Basale

Dégradation de la MEC

� Toutes les cellules eucaryotes possèdent un cytosquelette

� Formé de 3 réseaux protéiques - les microfilaments

- les filaments intermédiaires

- les microtubules

Cytosquelette - Généralités

Cytosquelette - Généralités

Microfilaments (actine) en rouge

Microtubules (tubuline) en vert

Cytosquelette - Généralités

Fonctions du cytosquelette

Forces de tension Motilité cellulaireDéplacements cellulaires

Endo et exocytose

Forme et polaritécellulaire

Ancrage des organiteset des structures cellulaires

Mouvements des organiteset des chromosomes

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments

� Structure

– Fins filaments de 5 à 9 nm de diamètre, composés de 2 chaînes enroulées en hélice

– Polymères d’une protéine globulaire = actine

– Actine = une des protéines les plus abondantes de la cellule, très conservée durant l’évolutiongénéralement de 5 à 10% des protéines totalesjusqu’à 20% dans les cellules musculaires

– 3 classes d’actine, présentant de très fortes homologies de séquenceactine α = majoritaire dans les cellules musculaires (muscles striés et lisses)

actine β et γ = majoritaires dans les autres types cellulaires

Ø 5 à 9 nm

Molécule d’actine

Microscopie électronique

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments

� AssemblageL’assemblage monomère actine G (globulaire) � polymère actine F (filament) se fait en 3 phases

Nucléation– Phase 1 = Nucléation

Formation du noyau initial = trimère

Equilibre dynamiquedes microfilaments

– Phase 3 = Equilibre dynamique

Microfilament de taille constanteavec équilibre entre les monomères qui s’accrochent et se détachent dumicrofilament

Extrémité +

Extrémité -

– Phase 2 = ElongationCroissance du microfilamentAjout de monomères aux 2 extrémités

Extrémité + � croissance rapide

Extrémité – � croissance lente

Extrémité –

Croissance lente

Extrémité +

Croissance rapide

Microfilamentpolarisé

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments

� Equilibre dynamique

– L’actine est une molécule qui lie l’ATP

– Au sein du microfilament, l’ATP est hydrolysé de façon spontanée � actine-ADP

– Conséquences : changement de conformation de l’actine

� des forces de liaisons avec les sous-unités voisines � dépolymérisation

Extrémité –

Croissance lente

Actine-ADP prédomine

Vitesse addition actine <

Vitesse hydrolyse ATP

A l’équilibreFlux net = dépolymérisation

des sous-unités

Extrémité +

Croissance rapide

Vitesse addition actine >

Vitesse hydrolyse ATP

Actine-ATP prédomine

A l’équilibreFlux net = polymérisation

des sous-unités

Phénomène du tapis roulant = treadmilling

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments

� Equilibre dynamique

Mise en évidence du treadmilling

Extr + Extr -

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

Cofiline Forte affinité pour l’actine-ADPDépolymérise les filaments d’actine à partir de l’extrémité moinsInduit des cassures dans les filaments d’actine

– Plusieurs protéines de liaison à l’actine régulent in vivo cette dynamique des microfilaments

� Rôle +++ dans le remodelage du cytosquelette lors de la migration

Profiline Stimule l’échange ADP/ATP � Régénération de monomères actine-ATP pour la polymérisation

ARP2/3 Induit la nucléation in vivo à partir de monomères libresSe fixe sur des filaments déjà existants � branchements (formation d’un réseau de microfilaments)

1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

– Plusieurs toxines interfèrent avec la dynamique des microfilaments d’actine

� Outils utilisés en Biologie Cellulaire

1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments

� Les cytochalasines D ou B se lient à l’extrémité + des microfilaments d’actine

bloquent l’addition de nouveau monomères

dépolymérisation à l’extrémité - � disparition des microfilaments

� La latrunculine A se lie aux monomères d’actine G (globulaire)

inhibe la polymérisation des microfilaments

� La phalloïdine se lie latéralement aux filaments d’actine F polymérisée

stabilise les microfilaments

couplée à un fluorophore � visualisation des microfilaments

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

3 types d’arrangements selon la nature des protéines associées

a. Les faisceaux parallèles serrés

– Dans les filopodes (fines projections cytoplasmiques)

émis sur le bord des cellules en migration

Marquage de l’actine F (polymérisée) en rouge (Phalloïdine-TRICT)

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

3 types d’arrangements selon la nature des protéines associées

a. Les faisceaux parallèles serrés

– Dans les filopodes (fines projections membranaires)

émis sur le bord des cellules en migration

Faisceau de filaments d’actine

– Dans les microvillosités intestinales

– Filaments orientés avec la même polarité

– Faisceaux serrés car reliés par des protéinesintercalaires de petite taille (villine, fimbrine)

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

b. Les faisceaux contractiles

Dans les sarcomères = unités contractiles du muscle strié

2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

Dans les ceintures d’adhérencereliant les jonctions adhérentesprésentes au pôle apical descellules épithéliales

Contraction � Cohésion tissulaire

Dans l’anneau contractiledes cellules en division

Contraction � Cytodiérèse (séparation cellulaire)

2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

b. Les faisceaux contractiles (suite)

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

Dans les « fibres de stress » au niveau des plaques d’adhésion focales à la matrice extracllulaire

Contraction � force de tension (adhérence et migration)

2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

b. Les faisceaux contractiles (suite)

Marquage de l’actine F (polymérisée) en vert(Phalloïdine-FITC)

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

– Disposition lâche car reliés par un dimère d’α-actinine de grande taille

– Insertion possible d’un complexe bipolaire de plusieurs molécules de myosine II

activation de la myosine II � force de contraction entre filaments d’actine

2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

b. Les faisceaux contractiles (suite)

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

L’activation de la myosine II dépend de la phosphorylation de ses chaînes légères

DEPHOSPHORYLATION

BY MLC Phosphatase

� Activation de la Myosine Light Chain Kinase (MLCK) (voie Ca2+ - calmoduline)

� Inhibition de la MLC Phosphatase (voie impliquée dans la régulation du cytosquelette lors de la migration)

2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

b. Les faisceaux contractiles (suite)

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

c. Les réseaux formant des mailles

– Dans les lamellipodes (larges extensions membranaires) émis sur le bord des cellules en migration

2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE

c. Les réseaux formant des mailles

– Dans les lamellipodes (larges extensions membranaires) émis sur le bord des cellules en migration

– Dans le réseau d’actine corticale sous-membranaire

– Filaments en disposition +/- orthogonale

stabilisés par la filamine

2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE3°) Principales fonctions des microfilaments d’actine

� Rôle architectural

� Contraction du muscle squelettique strié

� Séparation des cellules après la mitose (anneau contractile)

� Repliement des feuillets embryonnaires en tubes (tube neural)

� Maintien de la cohésion tissulaire (ceinture d’adhérence)

� Transport de vésicules, via la myosine de type I

� Transport intracellulaire de virus et bactéries (Listeria, …)

� Phagocytose

� Migration cellulaire

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration

a. Le modèle de migration cellulaire sur un support 2D

Au bord avant : Formation de filopodes et de lamellipodesliés à une polymérisation dirigée de l’actinequi pousse la membrane sur le bord avant

Adhésion : Formation de nouveaux contacts focaux

Translocation du corps cellulaire Mise en jeu des forces contractiles actine-myosine

Rétractation avec dissolution des mécanismes d’adhésion à l’arrière de la cellule

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration

b. Mise en évidence du rôle des petites protéines G monomériques (Rho GTPases)

Cdc42Formation de filopodes

RacFormation de lamellipodes

RhoFormation de fibres destress et contacts focaux

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration

c. Que sont les petites protéines G monomériques de la famille des Rho GTPases ?

Forme active liée au GTPForme inactiveliée au GDP

Activation = Fixation GTP

Stimulée par protéinesde type GEF

Guanine nucleotide Exchange Factor

Inactivation = Hydrolyse du GTP

Stimulée par protéines de type GAPGTPase Activating Protein

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration

d. Quels sont les signaux activateurs des RhoGTPases ?

RhoGTPases sousforme activeliée au GTP

Chemoattractants � Activation de la voie Pi3K � Production de PiP3 � Activation des GEF(parmi d’autres …)

I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration

e. Quels sont les effecteurs des RhoGTPases au cours de la migration cellulaire ?

Au front de migration cellulaire � Emission de filopodes et lamellipodes

Cdc42Se lie DIRECTEMENTet active des protéines

de la famille WASP (N-WASP)

Activation du complexeARP2/3

Nucléation et polymérisationde l’actine dans les

filopodes

Active une kinase intermédiaire

PAK

Active la kinaseLIMK

Phosphoryle etINACTIVEla cofiline

Stabilisela polymérisation

de l’actine

RacSe lie INDIRECTEMENT

et active d’autres protéines de la famille WASP (WAVE)

Activation du complexeARP2/3

Nucléation et polymérisationde l’actine dans les

lamellipodes

Rho

A l’arrière de la cellule � Forces contractiles myosine-dépendantes pour la traction cellulaire

Active une kinase intermédiaire

ROCK

Phosphoryle etINACTIVE

Phosphatase de la MLC

Chaîne légèrede la myosine

PHOSPHORYLEE

Activation de lamyosine II et

force de contractile

II - LES MICROTUBULES1°) Structure, assemblage et dynamique des microtubules

� Structure

Ø 25 nm Microscopie électronique

– Longs cylindres creux de 25 nm de diamètre

– Polymérisation de sous-unités = dimères de tubulines α et β, (protéines globulaires)

– Chaque tubuline peut s’associer au GTP, mais seule la tubuline β peut hydrolyser/échanger son GTP

II - LES MICROTUBULES1°) Structure, assemblage et dynamique des microtubules

� Assemblage

(10 à 15)

(classiquement 13)

Extrémité +

Croissance rapide

Extrémité –

Croissance lente

Microtubulepolarisé

II - LES MICROTUBULES1°) Structure, assemblage et dynamique des microtubules

� Instabilité dynamique

Les MT sont caractérisés par une très grande instabilité dynamique

Alternance de cycle de croissance – décroissance � positionnementdynamique des organites cellulaires transportés par les MT

II - LES MICROTUBULES2°) Organisation intracellulaire des microtubules

In vivo, le centrosome est le centre organisateur des MT

L’extrémité – de tous les MT est enchassée dans le centrosome

Extrémité + : s’étend à la périphérie de la cellule

Centrosome = 2 centrioles perpendiculaires (9 triplets de MT STABLES)

II - LES MICROTUBULES2°) Organisation intracellulaire des microtubules

Duplication du centrosome dans les cellules en division

Formation des MT du fuseau mitotique

La protéine APC participe à la fixation des MT du fuseaumitotique sur les chromosomes

� Si APC muté : Anomalie de ségrégation des chromosomes

II - LES MICROTUBULES3°) Les protéines associées aux microtubules

Rôle structural d’organisation et de stabilisation du réseau des MT

II - LES MICROTUBULES3°) Les protéines associées aux microtubules

Transport antérograde -→ +

Transport rétrograde + → -

II - LES MICROTUBULES4°) Cibles d’agents anticancéreux

1. Agents DÉSTABILISATEURS des microtubules

� Vinblastine (Velban®), Vincristine (Onvovin®), Vinorelbine (Navelbine®)

vinca-alcaloïdes dérivés de Pervenche

se fixent sur les sous-unités de β-tubuline à l’extrémité +

bloquent la polymérisation des microtubules (interphase/mitose : poisons du fuseau)

2 classes de composés

Cellules contrôles Cellules traitées avec vinblastine

II - LES MICROTUBULES4°) Cibles d’agents anticancéreux

� Combretastatines : CA-4-Phosphate (Zybrestat®) = AGENT ANTI-VASCULAIRE

se fixent préférentiellement sur les dimères α/β-tubuline le long des microtubules

inhibent l’association latérale des protofilaments formant les microtubules

2 classes de composés

Cellules endothéliales contrôles Cellules traitées avec CA-4-P

1. Agents DÉSTABILISATEURS des microtubules

II - LES MICROTUBULES4°) Cibles d’agents anticancéreux

� Taxanes : Paclitaxel (Taxol®) et Docetaxel (Taxotere®)

se lient aux microtubules polymérisés sur la face interne du MT

stabilisent les MT en « redressant » la conformation de la β-tubuline liée au GDPinhibition de la dépolymérisation des MT (interphase/mitose avec blocage division cellulaire)

2 classes de composés

2. Agents STABILISATEURS des microtubules

Cellules contrôles Cellules traitées avec Taxol®

Paquets de MTstabilisés

II - LES MICROTUBULES4°) Cibles d’agents anticancéreux

� Epothilones : ixabepilone (Ixempra®)

se lient aux microtubules sur un site proche de celui des taxanes

stimulent la polymérisation de la tubuline en microtubule

2 classes de composés

2. Agents STABILISATEURS des microtubules

III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES

Assemblage de plusieurs tétramères bout à bout

Protofilament

8 protofilaments superenroulés

III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES

La spécificité tissulaire d’expression des FI est en anatomie-pathologie pour déterminer l’histogenèse des tumeurs (nature du tissu d’origine des cellules tumorales)

Desmosmes et hémidesmosomes

III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES

Les filaments intermédiaires confèrent

aux cellules leur stabilité mécanique