DE ANNOSUM - Library and Archives Canadacollectionscanada.gc.ca/obj/s4/f2/dsk2/ftp02/NQ43109.pdf · Line Asselin, Martine Blais, Robert Blais, Martine Cormier et André Dansereau

GENEVIEVE ROY

D~VELOPPEMENT D'UN AGENT DE LUTTE BlOLOGIQUE CONTRE

HE TEROBASIDION ANNOSUM

Thèse présentée

& la faculté des études supkrieures de I'Universitk Laval

pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Département des sciences du bois et de la forêt FACULTE DE FORESTERIE ET DE GÉOMATIQUE

UNIVERSITE LAVAL QUEBEC

SEPTEMBRE 1999

O Geneviève Roy, 1999

National Library B+1 of Canada Bibliot heque nationale du Canada

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395 WeUington Street 395, rue Wellington OItawaON K1AON4 Onawa ON K1A ON4 canada Canada

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L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.

AVANT PROPOS

J'aimerais remercier mes directeurs de recherche Dr. Michel Dessureault et Dr. Gaston

Laflamme pour les encouragements et les conseils judicieux qu'ils m'ont prodigués tout au

long de ces études. J'adresse un merci tout spécial a M. Guy Bussières pour son support

professionnel et personnel. Je remercie également le Conseil national de recherche

scientifique, le Service canadien des forêts, le Centre de recherche en biologie forestière et

l'université Laval pour leur support financier.

Plusieurs personnes m'ont apporte une aide technique et je leur en suis très reconnaissante :

Line Asselin, Martine Blais, Robert Blais, Martine Cormier et André Dansereau. Je

remercie également M. Sylvain Boisclair et Mme Michele Bernier-Cardou pour leurs

conseils dans l'analyse statistique de mes résultats. Je ne pourrais pas oublier de remercier

M. René Cauchon pour l'identification des champignons.

Je tiens à remercier le Dr. Richard Hamelin du Service canadien des forêts de m'avoir

conseillé scientifiquement dans la réalisation du chapitre 4 qui a été publié en 1997 dans le

Journal Canadien de Botanique (Can. S. Bot. 75,2097-2104).

Se remercie également la Compagnie Premier Tech pour mon emploi actuel qui me permet

de poursuivre la recherche sur le développement d'agents de lutte biologique.

Finalement, a mes amis et parents Hélène, Marie, Javier, Paûick, Pierre et Dina qui m'ont

encouragé à persister jusqu'a la fin; à mon copain Denis et a sa fille Mélanie qui ont été à

mes côtés pour terminer la rédaction de la thèse et qui ont assumé les soirs et les fins de

semaines de non disponibilité, je dis spécialement merci.

TABLES DES MATIÈRES

RÉSUMÉ COURT ............................................................................................................. I

RÉSUMÉ LONG ............................................................................................................... II

................................................................................................................ AVANT-PROPOS III

TABLE DES MATIERES ........................................

........................................................................................... LISTE DES FIGURES ........JX

LISTE DES TABLEAUX .................................................................................................... XI

~NTRODUCTION GÉNÉRALE ......................................................................................... 1

.......................................................................................................................... Références .6

CHAPITRE 1 - BIOLOGICAL CONTROL OF HETEROBASIDION ANNOSUM BY

PHAEOTHECA DIMORPHOSPORA. 1. IN VITRO INVESTIGATION

STUDlES .................................................................................................. 15

RÉSUMÉ ........................................................................................................................... 1 s

................................................................................................... 1 .1 MTRODUCTION .16

................................................................................. 1.2 MATERIAL AM) METHODS 1 8

............................................................................*.............. ....**....* 1.2.1 Fungal culture ... 1 8

....................................................................................................... 1.2.2 Wood material 18

................................................................................................. 1.2.2 Bi-Iayer assay 1 8

1.2.3 Direct confrontation on wood .................... .... ............................................... 19

1.3 RESULTS ............................. ... .......... ........-21

.......................................................................................................... 1.3.1 Bi-Iayer assay 21

................................................................................. 1.3.2 Direct confrontation on wood 21

1.4 DISCUSSION ............................................................................................................. 27

1.5 REFERENCES ........................................................................................................... 31

CHAPITRE 2 . BIOLOGICAL CONTROL OF HETEROBASLDION AMVOSW BY

PHAEOTHECA DIMORPHOSPORA . II . FIELD INVESTIGATION

..................................................................................................... 2.1 DJTRODUCTION 37

................................................................................. 2.2 MATERIAL AND METHODS 39

........................................................................................................... 2.2.1 Fungal strains 39

2.2.2 Study sites ................................................................................................................ 39

2.2.3 Inoculum preparation ............................................................................................... 39

2.2.4 Log treatments ..................................... ... ................................................................. 40

2.2.5 Sampling method and assessrnent of colonization ..................................... ...... ....... 40

2.2.6 Statisticat methods ................................................................................................ 41

2.3 RESULTS .................................................................................................................. 42

2.4 DISCUSSION ............................................................................................................ 5 5

2.4.3 Rye grain controls ............................................................................................. 59

2.4.4 Mycodiversity .......... .. ......~.......................~.........~............................................ 60

2.5 CONCLUSION .............. ....... .................................................................................. 62

VI

........................................................................................................... 2.6 REFERENCES 64

CHAPITRE^ . ÉTUDE DE LA MYCOFLORE DES SOUCHES DE PIN ROUGE:

COLONISATION NATURELLE ET COLONISATION SUITE AU

.................................................... . TRAITEMENT AVEC P GIGANTEA 71

........................................................................ 3.1 MTRODUCTION ......................... .. 72

3.2 MATERIEL ET METHODE * ..............................................*...............**..............**...... 75

........................................................................................... 3 2 . 1 Culture du champignon 75

3.2.2 Sites d'essais ........................................................................................................... -75

........................................................................................... 3.2.3 Traitement des souches 75

............................................... 3.2.4 Méthode de récolte et évaluation de la colonisation 77

................................................................................ 3.3.1 Composition de la mycoflore 79

3.3.1.1 Après deux mois d'exposition ...........................................*........................4.... 79

.............................................................................. 3.3.1.2 Après 1 2 mois d'exposition 83

............................................................................. 3.3.1.3 Après 24 mois d'exposition 88

.............................................................................................. 3.3.2 Pénétration verticale 91

................................................................................ 3.3.2.1 Aprés 2 mois d'exposition 91

........................................................................... 3.3.2.2 Après 12 mois d'exposition 91

3.3.2.3 Après 24 mois d'exposition ............................................................................. 94

..................................... 3.3.4 Composition des groupes taxonomiques de champignon 94

........................ 3.3.4.1 Après 2 mois d'exposition ... ............................................... 96

3.3.4.2 Après 12 mois d'exposition ......................... .. ............................................... 98

.............................................................................. 3 .3.4.3 Après 24 mois d'exposition 98

3.5 DISCUSSION ........ .. ............................................................................................ 101

...................................................................... 3 .5 . 1 Inventaire de la mycoflore naturelle 102

.................................................. . 3 S.2 Mycoflore des souches traitées avec P gigantea 108

........................................................................................................ 3.6 CONCLUS ION 1 1 0

3.7 RÉFÉRENCES ....................................................................................................... I I i

CHAPITRE 4- COMPARISON OF RAPD TECHNIQUE AND SOMATIC

NCOMPATIBILITY TESTS FOR THE IDENTIFICATION OF

....................................................................... P . GIGANTEA STRAINS 117

RESUME ........................................................................................................................... 117

4.1 INTRODUCTION ......................................................................................... 1 18

............................................................................. 4.2 MATERIALS AND METHODS 120

................................. ...................................... 4.2.2 Somatic incompatibility testing .. 1 2 0

............................................................................ 4.2.3 DNA extraction .............. .... 1 2 2

........................................................................................... 4.2.4 DNA amplification 122

............................................................................................... 4.2.5 RAPD analysis 1 2 3

4.3 RESULTS ............................................................................................................ 124

..................................... 4.3.2 RAPD analysis ... ........................................................... 126

........................................................................................................... 4.4 DISCUSSION 132

4.5 REFERENCES ............... ................ ... .......... ................................................... 136

vm I I

CONCLUSION GENERALE ....... . .................... ...... ........ ... .................. . ................ ...... .... ... 142

Réfkences . . . . .. .. . . . . .. . . . . . ... . . . . . . .. . . . ... ...... .. . .. ..... .. . . .. . . ..... . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

LISTE DES FIGURES

CHAPITRE 2

Figure 2.1. Occurrence of Heterobasidiun annosum one month after red pine log

treatment ....................................................................................................... 43

Figure 2.2. Occurrence of Heterobasidion annosum two months after red pine log

treatment.. ........ .. ......................................................................................... 44

Figure 2.3. Relative occurrence of each taxonomic group in red pine logs one month

after treatmcnt on site A (a) and B (b).. .................................................... 53

Figure 2.4. Relative occurrence of each taxonomic group in red pine logs wo months

....................................................... afier treatment on site A (a) and B (b).. 54

CHAPITRE 3

Figure 3.1.

Figure 3.2.

Figure 3.3.

Figure 3.4.

Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons

.................................. après 2 mois d'exposition dans les souches témoins. 97


après 2 mois d'exposition dans les souches traitdes avec Phlebiopsis

gigantea. ..................................................................................................... 97


après 12 mois d'exposition dans les souches témoins. ............................... 99


après 2 mois d'exposition dans les souches traitées avec Phlebiopsis

....................................................................... gigantea ............................... 9 9

Figure 3.5. Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons

après 24 mois d'exposition dans les souches coupées au mois de mai selon le

traitement .................................................................................................... 1ûû

CHAPITRE 4

Figure 4.1. Pairings among strains of P. gigantea afier three weeks on 1% malt extract

agar. (A) Somatic compatibility between P367 and PO37 as indicated by

intmingling mycelia. (B) Somatic incompatibility as showed by formation

of a reaction line between PO79 and P037. ................................................ 12 1

Figure 4.2. Gel electrophoresis of RAPD profiles of the test strains (Pl 04, P079, P037)

obtained with primers OPC-06 (A), OPJ-05 (B), and OPE09 (C).. ......... 128

LISTE DES TABLEAUX

CHAPITRE 1

Table 1.1. Growth inhibition of four strains (P and S types) of Heterobasidion annosum

caused by Phaeotheca dimorphospora on a g a and wood discs fiom the bi-

............................................................................................. layer assay. 2 2

Table 1.2. Isolation of Phaeotheca dimorphospora and Heterobasidion annosum (P and

S strains) from wood discs. ...................................................................... 2 3

Table 1.3. Logistic regression andysis and contrasts (C) of atternpted isolations of

Heterobasidion annosum ( P and S strains) fiom wood discs .................... ... 26

CHAPITRE 2

Table 2.1.

Table 2.2.

Table 2.3.

Table 2.4.

Table 2.5.

Frequencies (F) and occurrences (O) of Phlebiopsis gîgantea in r d pine logs

over the two sampling periods. ....................... .......... ............................... 46

Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fùngi in red pine logs

on site A afier one month. ......................................................................... 4 7

Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fun@ in red pine logs

on site B after one month. ............................................................. 48

Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fun@ in red pine logs

on site A afier two months. ....................................... .- Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant h g i in red pine log~

on site B after two months. ................ ............ ............ ....... ...................... 50

XII

CHAPITRE 3

Tableau 3.1 .

Tableau 3.2.

Tableau 3.3.

Tableau 3.4.

Tableau 3.5.

Tableau 3.6.

Tableau 3.7.

Tableau 3 3 .

Tableau 3.9.

Description des trois sites expérimentaux. .......................................... 7 6

Fréquence (F) et abondance (A) des principales especes de champignons

dans les souches de pin rouge témoins après deux mois d'exposition. ........ 8 1


dans les souches de pin rouge traitées avec P. gigantea dans les plantations

de Bristol et Grenville après deux mois d'exposition. ................................. 82

Fréquence (F) et abondance (A) des principales espèces de champignons

dans les souches de pin rouge témoins après 12 mois d'exposition. ........... 85


dans les souches de pin rouge traitées avec P. gigantea après 12 mois . . ................................................................................................ d'exposition. .87

Fréquence (F) et abondance (A) des principales espèces de champignons

dans les souches de pin rouge témoins après 24 mois d'exposition pour la

coupe du mois de mai ................................................................................... 90

Fréquence (%) des souches de pin rouge colonisées par niveau pour les

principaux champignons après 2 mois d'exposition. ................................... 92

Fréquence (%) des souches de pin rouge coloniskes par niveau pour les

................................. principaux champignons après 12 mois d'exposition. 93

Fréquence (%) des souches de pin rouge colonisées par niveau pour les

principaux champignons après 24 mois d'exposition pour la période . . d'éclaircie de mai. .................................................................................. 95

CHAPITRE 4

Table 4.1. Number of strains of P. gigantea showing compatible reaction and identical

RAPD Gngerprint to the introduced test strains P037, PO79 and P l 04. .... 125

Table 4.2. RAPD pattern of P. gigantea for OPC-06 primer. ................................... 129

Table 4.3. RAPD patterns of P . gigantea for OPJ-05 primer ..................................... 129

Table 4.4. RAPD patterns of P . gigcntea for OPJ-09 primer ...................... ..... ....... 129

Table 4.5. RAPD profiles of P . gigcntea strains used in stmp inoculations and of

strains fiom the nahiral population prior to inoculation ............................. 130

Table 4.6. RAPD profiles and somatic incompatibility interactions with test straias of

P . gigantea strains fiom the population collected one year after inoculation .

INTRODUCTION G $ ~ M ~ U E

La maladie du rond causée par le champignon Heterobasidion annomm (Fr.) Bref.

(=Fumes annosus (Fr.) Karst.) est depuis longtemps considérée comme un problème

dévastateur dans les plantations résineuses à travers le monde principalement dans les

forêts tempérées et boréales de l'hémisphère Nord (Hodges 1969; Woodward et al. 1998).

Dans l'Est du Canada, elle a été rapportée pour la première fois dans le sud de l'Ontario en

1955 (Hord et Quirke 1955). Depuis, la maladie a été observée a plusieurs endroits dans

cette province, particulièrement au sud de celle-ci (Whitney 1988). Elle affecte

principalement les plantations de pin rouge (Pinus resinosa Ait.) mais également de pin

sylvestre (Phus sylvestris L.) et de pin blanc (Pinus strobus L.). Au Québec, la première

mention vérifiée de la présence de cette maladie est beaucoup plus récente et date de 1989

(Laflamme et Blais 1995). Ce premier foyer d'infection connu est localisé dans une

plantation de pin rouge située près du Lac LaBlanche dans la région de l'Outaouais.

Depuis, de nouveaux sites d'infection ont été détectés au Québec (Laflamme et al. 1998).

Cette maladie qui cause une pourriture des racines des arbres vivants est particulièrement

insidieuse car elle peut se propager dans un peuplement longtemps avant l'observation des

dégâts (Punter 1968). L'âge relativement jeune des plantations de pin rouge au Quebec a

permis, jusqu'a présent, d'éviter une situation similaire a ce qui se passe ailleurs dans le

monde. Toutefois, dans les prochaines années, l'augmentation de la fréquence des éclaircies

risque d'aggraver la situation actuelle.

Dans le monde, il existe actuellement un besoin croissant de remplacer les méthodes

traditionnelles de lutte chimique contre les maladies des plantes par des m&hodes plus

naturelles qui n'affectent pas I'envimmement. Ce besoin est devenu évident par la

présence de problèmes considérables d'accumulation de résidus toxiques dans les sols et

dans l'eau (Coderre et Vincent 1992). Cela a incite les gouvernements canadien et

québécois à établir des stratégies de protection des forêts visant 1'6limination complète de

l'usage de pesticides en milieu forestier (Anonyme 1992; Anonyme 1994). Le

dbveloppement d'une approche de lutte biologique pour le contrôle de K. annosum dans

les plantations de pin rouge au Québec correspond a un moyen pouvant être utilisé ii

f'échetle forestière sans pour autant affecter l'environnement. De nombreux micro-

organismes ont été testés pour lutter contre cet agent pathogène (Holdenrieder et Greig

1998). Malgré tous les travaux, le seul véritable succès obtenu à ce jour consiste ê inoculer

des souches fraîchement coupées de pins avec le champignon Phlebiopsk gigantea (Fr.) Jül

(=Peniophora gigantea (Fr.) Massee.) afin de prévenir l'infection par le champignon

H. annosum (Rishbeth 1963). Il est actuellement utilisé de façon opérationnelle dans

quelques pays européens (Greig 1976; Korhonen et al. 1994; Sierota 1997).

Des travaux récents ont laissé entrevoir la possibilité d'utiliser un autre agent biologique, le

champignon deutéromycète Phaeotheca dimorphospora DesRochers & Ouellette, une

nouvelle espèce isolée a partir du bois d'orme (Umus urnericana L.) (DesRochers et

Ouellette 1994; Yang et al. 1993). Ce champignon a présente une activité antifongique

contre un bon nombre de champignons pathogènes d'arbre lors d'expériences réalisées Ni

vitro et in vivo (Bernier et al. 1996; DesRochers, 1992; DesRochers et Ouellette 1988;

Yang et al. 1993; Yang et al. 1994; Yang et al. 1995a, b). Son principal mécanisme

d'action comme agent de lutte biologique est relié a la production de métabolites

antifongiques. Ces substances ont fortement inhibé la croissance de H. annosum in vitro

(Yang et al. 1993). Cependant, la capacité de production des metabolites antifongiques par

P. dimorphospora dans le substrat naturel est encore inconnue. Trop souvent, les agents de

lutte biologique démontrent une efficacité dans des tests effectués sur un milieu gdosé qui

ne se manifeste pas sur le substrat naturel à traiter même sous des conditions contrôlées

(Bruce et al. 199 1 ; Cook et Baker 1983; Holmer et al. 1994; Nicolotti et Varese 1996;

Schoeman et al. 1996; Srinivasan et al. 1992). Ce matdriel est trop fiQuemment déficient

en éléments nutritifs essentiels a la production des substances toxiques. De même, les

résultats obtenus dans un substrat naturel sous des conditions contrôlées peuvent être

différents de ceux obtenus sous des conditions naturelles sur le terrain. Cette variabilité et

les succès limites sont relies à des facteurs tels les conditions environnementales, l'état du

substrat (pH, humidité) ainsi que la compétition avec les autres micro-organismes (Bruce et

King 1986; Ejechi et ûbuekwe 1994; Etheridge 1972; Morell et Sexton 1990; Nelson et

Thies 1985). Il est reconnu que les agents de lutte biologique agissent par parasitisme,

compétition pour la niche ou production de substances inhibitrices. indirectement, ces

mécanismes peuvent s'avérer efficaces en modifiant la composition de la microflore

naturelle et les interactions entre les organismes (Schoeman et al. 1996; Yang et al. 1995a).

Inversement, la compétition par d'autres espèces peut interférer sur le taux de colonisation

par l'agent de lutte (Meredith 1960; Roll-Hansen et Roll-Hansen 1980). Tous ces facteurs

peuvent avoir un impact sur le succès de l'utilisation d'un agent de lutte biologique et sont

donc à considérer au cours du développement du produit.

Malgré le succès de P. gigantea dans le traitement des souches de pins dans les pays

européens, son potentiel d'utilisation dans les plantations de pin rouge du Québec et de

l'Ontario est encore peu connu. Des travaux de Myren et Punter (1972) ont démontré

l'inefficacité du traitement des souches de pin rouge avec P. gigantea contre H. annosum

en Ontario. Cependant, ils n'ont pas fait mention du succès de la colonisation des souches

par P. gigantea qui est un facteur essentiel à l'efficacité du traitement. Phlebiopsis gigantea

est un saprophyte communément associé au processus de dégradation du bois dans les

forêts résineuses boréales et tempérées a travers le monde (Holdenrieder et Greig 1998;

Korhonen et al. 1998). En Angleterre, il est l'un des champignons les plus fréquents de la

colonisation primaire des souches de pins (P. sylvestris, Pinw nigru var calubrica Schneid)

qu'il dégrade rapidement (Meredith 1959; Meredith 1960; Rishbeth 1963). Puisque

l'introduction d'isolats exotiques d'un agent de lutte biologique dans l'écosystème peut

prbsenter un risque potentiel, l'utilisation de souches indigènes est plus appropriée. Sous les

conditions environnementales prévalant dans l'Est du Canada, il existe peu d'information

sur P. giguntea, et encore moins sur son écologie sur le pin rouge. Basham (1957) a

ultérieurement fait mention de sa présence fréquente dans les troncs de pin blanc, de pin

rouge et de pin gris (Pinus banhiana L.) dans les quelques annbes suivant un feu.

L'utilisation massive et efficace de P. gigantea requiert donc de nouvelles connaissances

concernant son écologie sous nos conditions environnementales. Pour les raisons déjà

exprimées, il serait également intéressant d'étudier son effet sur la diversite des myc&es

dégradant les tissus de pin rouge. Cette étude petmettrait d'entrwoir les effets secondaires

reliés a l'utilisation massive de P. gigantea.

Afin d'obtenir une information plus juste sur les performances de P. gigantea sur le terrain,

il serait utile de développer des méthodes permettant de discriminer les souches introduites

artificiellement de la population naturelle. Ces méthodes permettront de confirmer

l'établissement des souches introduites et de suivre leur devenir dans l'environnement.

Plusieurs études ont comparé le potentiel de méthodes classiques, particulièrement les tests

d'incompatibilité somatique, mais aussi des méthodes plus &entes utilisant les marqueurs

moléculaires pour distinguer les souches d'une méme espèce (Holmer er al. 1994; Jacobson

et al. 1993; Kohn et al. 199 1 ; Meijer et al. 1994; Mueller et al. 1996; Eüuo et al. 1995;

Rodrigues et al. 1995; Sen 1990; Stenlid 1985). Nous avons sélectionné deux méthodes. La

première, les tests d'incompatibilité somatique, repose sur le mécanisme de rejet entre deux

individus qui se caractérise par la formation d'une zone d'interaction entre les deux

lorsqu'ils sont confrontés sur un milieu gélosé. C'est une mdthode simple qui a et6 utilisée

pour déterminer la distribution de la population et les mécanismes de dispersion de

plusieurs champignons décornposeurs de bois mais aussi comme un outil pour identifier des

dicaryons (Adams et Roth 1967; Adaskaveg et Gilbertson 1987; Lewis et Hansen 1991;

Rayner et aL 1984; Wilson 199 1). La deuxième, l'amplification au hasard d'ADN

polymorphe (RAPD), est une méthode moléculaire particulièrement avantageuse

puisqu'elle ne nécessite pas de comaissances préalables de la génétique de l'organisme

visé pour la production de profils (Williams et al. 1990). Les marqueurs RAPD ont été

utilisés dans plusieurs études pour distinguer des espèces, des souches, des races et des

pathotypes de champignons (Garbelotto et al. 1993; Gosselin et al. 1995; Guthrie et al.

1992; Hamelin et al. 1996; Jungehiilsing et Tudzynski 1997; Raina et al. 1997; Smith et al.

1992).

Le but principal de la présente recherche est de développer un moyen de lutte biologique

efficace contre H. annosum dans les plantations de pin rouge au Québec. Plus

spécifiquement, nous voulons 1) vérifier la capacitb de P. dimotphospora h inhiber la

croissance de H annosum in vitro sur milieu gélosé et sur rondelles de bois (chapitre 1); 2)

comparer l'efficacité de P. dimotphospora et de P. gigantea à prévenir l'infection de

bûches de pin rouge par H. anrrosum sur le terrain et leur influence sur la colonisation

naturelle par les champignons (chapitre 2); 3) effectuer l'inventaire de la mycoflore

indigène des souches de pin rouge, acquérir des comaissances sur l'écologie de P. gigantea

et déterminer l'impact de son introduction artificiel (chapitre 3); développer une méthode

pour distinguer les isolats de P. gigantea introduits de la population naturelle (chapitre 4).

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CHAPITRE 1

Biological control of Heterobasidion annosum by Phaeotheca diniorphosporrr.

1. In vitro investigation studies.

Le champignon antagoniste Phaeorhecu dimolphosporn a été teste in vitro, sur milieu

gélosé et sur des disques de bois irradiés, pour évaluer son efficacité contre des souches de

type P (Est du Canada) et S (Finlande) de Heterobasidion annosum. La technique en double

couche a démontré la production de substances antifongiques difhsibles sur un milieu

gélosé ainsi que dans des disques de bois de pin rouge et d'épinette de Norvège. Les

métabolites ont inhibé la croissance de l'agent pathogène sur les deux types de substrat.

Parallèlement, des confrontations directes effectuées dans des disques de bois ont montre

que l'application de P. dimo*phospora 7 jours avant annosum assure une protection

complète alors qu'elle n'est que partielle si I'antagoniste ne dispose que d'une seule

journée d'avance. L'inhibition de la croissance a été supérieure pour les isolats de type S

sur l'épinette de Norvège. La méthode de confrontation directe sur bois s'est avérée plus

sensible que celle en double couche car elle a décelé des différences significatives entre les

résultats obtenus pour les deux isolats de type P sur les rondelles de pin rouge. Les résultats

in vitro ont donc démontré que P. dimorphospora colonise les tissus du pin rouge et de

l'épinette de Norvége et y utilise les composés présents dans le bois pour la production de

substances antifongiques.

1.1 INTRODUCTION

Heterobasidion annosum (Fr.) Bref is an imporiant root and butt rot disease of many

conifers throughout the northem hemisphere (Woodward et al. 1998). This pathogen is

characterized b y at least three different intersterility groups, named P (pine), S (spruce) and

F (fir), depending on host preferences and differential pathogenicity (Capretti et al. 1990;

Garbelotto et al. 1996; Korhonen 1978). Each group has its own physiological,

epidemiological and ecological characteristics (Korhonen and Stenlid 1998). in eastern

Canada, H annomm has been present in Ontario since 1955, and only recently (1989) in

Québec, where it has been exclusively found in red pine (Pinus resinosa Ait.) plantations

(Hord and Quirke 1955; Laflamme and Blais 1995). Research into potential biological

controls to prevent the spread of this pathogen in eastern Canada has recently been

stimulated to develo p environrnentall y safe al tematives to replace chemical products. S ince

the pioneering work done by Meredith (1959) and Rishbeth (1963), many organisms,

mainly fungi, have been studied for their potential as biological control agents against

H. annosum on pine, spnice and fir species (Holdenrieder and Greig 1998). Until now, the

only real successfÙ1 one, the basidiomycete Phlebiopsis giga~tea (Fr.:Fr.) Jül., is presentiy

being used at an operational scale in a few countries (Greig 1976; Korhonen et al. 1994;

Sieiota 1997).

In earlier experiments conducted in vitro, the deuteromycete Phaeotheca dimorphospura

DesRochers & Ouellette, a recently desaibed species isolat4 fiom white elm (Ulmus

americana L.), has shown antagonistic activity against a wide range of fungi causing tree

diseases (DesRochers and Ouellette 1994; Yang et al. 1993). In more specific studies,

P. dimorphospora reduced the severity and the rate of development of leaf spot (Septuria

musiva Peck) on poplar cuttings (Yang et ai. L994), shoot blight (Gremmeniella abietina

( Lagerb.) Morelet) (Yang et al. 1 99913, and damping-o ff (Cylindroc/udiim scopanùm

Morg.) on red pine seedlings (Yang et al. 1995a); as well as Dutch elm disease

(Ophiostuma ulmi (Buism.) Nannf) on white elm seeâlings (Bernier et al. 1996).

Phaeotheca dimophospoa opefates as a biologîcal control agent mostiy by the production

of antifungai met abolites. In vifro assays showed that these antifungai compounds strongl y

inhibited the mycelial growth of H. annosum (Yang et al. 1993). Thus, P. dimorphospora

appears to be a promising biological control agent against this pathogen. However, W e r

investigation is necessary to ascertain its potential and obtain a better understanding of its

effect against H. annosum.

Production of antifungal cornpounds by P. dimorphospora have been demonstrated on agar

and in liquid media (DesRochers and Ouellette 1988; Yang et al. 1993). However, treated

material in the field is fiequently deficient in essential nutrients, consequently limiting

production of antifungal metabolites (Bruce et al. 1991). Thus, production of such

substances in natural substrates by P. dimorphospora has yet to be demonstrated. A large

number of potential biocontrol agents have too often shown promising potential afier

primary screening in agar test systems and failed to succeed when tested on natural

substrates under control conditions or in the field (Bruce et al. 199 1 ; Cook and Baker 1983;

Schoeman et al. 1996; Srinivasan et al. 1992).

The aims of the present study were to venfy the production of antifungal metabolites by

P. dimorphospora in red pine and Norway spruce (Picea abies L.) stem discs, as well as to

establish the capacity of P. dimorphospora to colonize wood in viho and to rapidly

suppress the infection caused by H. annosum (P and S types). Two different methods were

used. The first method, the bi-layer test has proved to be a rapid and relevant method for

screening potential control agents of wood decay (Etheridge and Craig 1973; Schoeman et

al. 1994). This technique allows for the production of antifùngal metabolites in wood and

makes it possible to compare with production on agar. In a second method, direct

confrontation between fungi on wood discs was used to mimic interactions o c c h g in the

field. This test has been successfulIy used with other antagonistic agents (Lundborg 1986;

Rose et al. 1980).

1.2 MATERML AND METHODS

1.2.1 Fungal culture

The Phaeotheca dimorphospora strain (QFB 19795) was isolated fiom an e h tree in

Québec city (DesRochers and Ouellette 1988). Four strains of H. annosum were used in

this study. Two P type strains were recovered nom h i t bodies found on red pine stumps

from Lac LaBlanche, Québec (Ha014) and Larose Forest, Ontario (Ha044). They were

selected for their site of origin. Two S type cultures fiom Finland were provided by Dr.

Korhonen (92 119 and 92033). All strains were maintained in test tubes on 3% malt agar

(MA) at 4OC.

1.22 Wood material

Stem discs, 7 to 8 cm in diarneter and 1 cm in thickness, were cut from about 10 year-old

living red pine and Norway spruce trees near Quebec city. Bark was removed and discs

were stenlized by gamma irradiating with 3 Mrads (25 KGy) for 6 h p r e s e ~ n g the

biochemical features of the wood. They were then stored at -20°C until used.

1.2.2 BCIayer assay

Inhibition of mycelial growth of H annosum by antagonistic metabolites produced by

P. dimorphospora was evaluated by a modified bi-layer technique (Schoeman et al. 1994).

Tests were carrieci out on agar and wood discs simultaneously to compare the results and

estimate the relevance of agar tests. The antagonist fùngus was first cultured in 125-mL

Erlenmeyer flasks containing 50 mL of 2% Difco potato dextrose broth (PDB). The

cultures were incubated for two weeks at room temperature (ca. 22OC). The flasks were

hand shaken twice a week. Mycelium fiom the flasks was harvested by filtration, washed to

removed nutrients and exudates, and blended with sterile distilled water. The concentration

of the colony forming unit (cfù) suspension, composed of hyphal and microsclerotial

fragments, was adjusteci to 1.5 x 106 cWmL of water. Two milliliters of suspension was

spread uniformly on the surface of 3% MA in Petri dishes (90 x IS mm) or on wood discs

that were previously put on top of a wet filter paper matman, no 2), to maintain a high

relative humidity, in deep glass Petri dishes (100 x 20 mm). A total of 7.0 x 10' cfii/cm2

were applied on both agar and wood discs. Al1 Petri dishes were wrapped with parafilm and

incubated in the dark at 24OC for one week to allow for growth of the fungus and the

production of antifungal metabolites.

Following incubation, plates or wood discs were overlaid with a 10 mL aliquot of 2% water

agar, cooled to about 45OC. AAer the agar had set, seven mycelial plugs, cut with a 5 mm

cork borer fiom actively growing colonies of the four H. annosum strains, were placed

facing d o m on the fresh agar surface of each plate or disc. One plug was put into the

centre and the other six at equal distances from each other, 1 .O cm from the margin. The P

strains were put ont0 red pine discs and the S strains, onto Norway spruce discs. After a

fiirther 48 h incubation, H. annosum growth was evaluated with the aid of a dissection

microscope. B a d on work done by Schoeman et al. (1994), inoculum plugs were assessed

according to six distinct categories: 0 = no mycelial growth; 1 = presence of a few

dispersed mycelial bristles (short filaments) coming out of the plug; 2 = cuntinuous growth

of mycelial bnstles around the plug periphery; 3 = plug completely covered with myceliurn

but no growth ont0 the adjoining aga; 4 = mycelial growth on the piug and extending

linearly up to 1 cm ont0 the bi-layer surface; 5 = mycelial growth extending to more than

1 cm beyond the plug ont0 the bi-layer surface. A randomized comptete block design was

used for the factorial experiment with two substrate levels and four H. annomm strain

levels. Each block consisted of a shelf inside an incubator. Each treatmeat combination

included five replicates. Data were treated by analysis of variance (ANOVA) uskg the

GLM procedure (SAS 1989).

1.2.3 Direct confrontation on wood

Direct confrontation on wood discs was pedomed to detetmine the potential of

P. dimorphospora to colonize wood and to restrict the level of infecfion caused by conidia

of H. annosum. A propagule suspension (1.5 x 1 o6 cWmL of water) of P. dimophospora

was prepared and 2 mL was spread over the surface of the imdiated wood discs (red pine

and Norway spmce) as described for the bi-layer assay. In the Petri dishes, maIl glas b a h

were put between the filter paper and the disc to avoid any over moistening of the latter.

Control discs to be only treated with H. annosum were spread with 2 mL of sterile distilled

water. The wood segments were incubated in the dark at 24T.

Afler an incubation period of either one or seven days, discs were treated with H. annosum.

Conidial suspensions ( 1.1 x 1 o3 conidialml) of the four strains (HaOi4, Ha044, 92 1 19 and

92033) were prepared by washing the surface of 2-week-old actively growing colonies

grown on 1.5% Difco malt extract agar (MEA) with stede distilled water. Two milJiliters

of suspension was spread uniformly over the surface of the wood discs. A total of

50 conidia/m2 were poured. The P strains were put ont0 red pine discs and the S strains,

ont0 Norway spruce discs. Control discs to only contain P. dimorphospora were c o v d

with 2 mL of sterile distilled water. Discs were placed back in the incubator at 24OC. Petri

dishes were lefi unwrapped for 24 h after H. anriosum inoculation to allow for better

germination. Colonization of the wood by both fimgi was evaluated five weeks afier 1s t

inoculation of the pathogen. Discs were split in six parts through the center and wood chips

(ca. 2 x 2 x 1 mm) were aseptically taken from 15 positions, 12 in sapwood and three in

heartwood, at 5 mm from the upper surface of the disc. Samples were put ont0 1.5% MEA,

and grown at room temperature (ca. 22OC) for one week.

A randomized cornplete block design was used for the factorial experiment with four

H annosum strain levels, two P. dimorphospora levels, and two days of pre-inoculation

leveIs. Each block consisteci of a shelf inside an incubator. Each treatment combination

included six replicates. A total of 96 wood discs were treated. Data fiom attempted

isolations (presence or absence) of H. annosum in wood chips were treated by logistic

regression analysis using the CATMOD procedure (SAS 1989). Conûasts were performed

to generate the probabilities of differences between types (P, S) and between sûains within

the same type.

1.3 RESULTS

13.1 Bi-Iayer assay

The results obtained for the bi-layer technique showed the production of antagonistic

metabolites by P. dimorphosporu. Both agar and wood discs allowed for sufficient growth

of the h g i for effective antagonistic action. Growth of P. dimorphospora on the surface

of agar and wood was visually observed within 24 h after the inoculation, showing a rapid

colonkation. Presence of P. dimorphospora on these substrates restricted the mycelial

growth of dl four strains of H. annosum in the two systems (Table 1.1). Most often the

growth was restricted to a few scattered mycelial brides on the plugs. This should be

considered as evidence for the presence of antifbngal substances. Statistical analysis

showed no significant (P=0.05) interactions nor differences between the four strains nor

between agar or wood discs. However, we observed that on wood discs, there was almost

no reduction of the growth of H. annosum (results reached category 4) for plugs put over

the centre. This was not the case for those put in the centre of the agar system where growth

of P. dimorphospora was uniform. In the absence of P. dimorphospora, type of substrate or

shains had no influence on H. annosum growth (data not shown). No inhibition (category

5) of the myceiial growth was observed except for plugs put over the centre on red pine

discs where the growth was often scored in category 4.

13.2 Direct confrontation on wood

For al1 spruce and red pine discs not inoculated with H. annosum, P. dimorphospora

occurred in more than 83% (1 2.W 5) of the samples (Table 1.2). Lower success in isolating

the antagonist was associated with high presence of the pathogen inside the red pine discs.

Thus, less isolations of P. dimorphosporo were obtained in red pine discs, when Ha014

(lO.Ul5) and Ha044 (7.3115) were inoculated only one day afier the antagonist. Presence

of both b g i on the same sample only happened once on both red pine, and Norway spruce

discs. Isolation of P. dimorphospora was extremely variable within each treatment, so no

statistical analysis was done. The antagonist was isolated h m al1 parts of the wood discs.

Table 1.1. Growth inhibitiona of four strains (P and S types) of

Heterobasidion annosum caused by Phaeotheca diniorphospora on

agar and wood discs fiom the bi-layer assay.

-

H. annosum Substratum

(isolates)

Ha0 14 (P)

Ha044 (P)

92033 (S)

92 1 19 (S)

Values in table are the average scores for five agar plates or wood discs. Each score is the mean of seven plugs, Maximum inhibition = O, no inhibition = 5.

Red pine and Norway spnice discs were used for P and S saains respectively. No significant interactions nor differences were observed (ANOVA,

P=0.05).

Table 1.2. Isolation of Phaeoiheca dimorphospora and Heterobasidion annosum

(P and S strains) fiom wood discs.

Treatment Pre-inocuIation Isolation (n= 15)'

(days) P. dimorphospora H annowrn

H. annosum (Ha0 14 , P)

P. dimorphospora + H. annosum (Ha0 14 , P)

H. annosum (Ha044, P )

P. dimorphospora -1- H. annosum (Ha044 P)

H. annosum (92033, S )

P. dimorphospora + H. annosum (92033, S )

H. annosum (92 1 19, S)

P. dimorphospora + H. annosum (92 1 19, S)

P. dimorphospora (P. resinosa)

P. dimorphospora 1 12.5 (P. abies) 7 14.3

' Values in table are the mean for six wood discs.

(-) indicates that the fungus was neither inoculated nor isolated.

Most of the the, a yellow colour was produced almost dl over the disc for red pine.

Spnice discs reacted differently, the yellow pigment was resûicted to the periphery of the

dis% corresponding to a very dense sapwood. Wood sarnples taken close to the centre

almost never exhibited the pigmentation. The yellow wood samples were mainly associated

with the presence of P. dimorphospora, whereas the fungus was present even if &ere was

no pigmentation. No isolation of the pathogen was made in coloured samples.

Presence of H. annosum was first detected by visual observations on the upper surface of

control discs not inoculated with P. dimorphospora. Red pine control discs were entirely

covered by a myceliurn layer of H. annosum in seven days, while it took between 10 to 15

days on spruce discs. Isolation attempts of the pathogen fiom the control discs were

successfûl. They yielded an average isolation rate of l4/ 15 (93.3%) for red pine discs, and

13.74 5 (9 1 .O%) for spnice (Table 1.2). The protective effect of P. dimorphospora was

clearly observed in this experiment. Wood discs inoculated with the antagonist seven days

before K. annosum were not colonized by the pathogen at all. This treatment did not reveal

any visual growth of the pathogen on the surface of both tree species discs. However, a one

day incubation was not sufficient to completely inhibit the pathogen. More red pine discs

(83% for both strains) conditioned for one day with the antagonist were colonized on the

surface by the pathogen than spruce discs (17% for 921 19; 33% for 92033) (data not

shown). The surface ma colonized by strain Ha014 was about IO%, while 25% was

covered by strain Ha044 We estimated that less then 5% of the surface of spruce discs was

colonized by the S strains.

Logistic regression analysis was undertaken to determine if the reduction in the isolation of

H. annosum was dependent on the presence of P. dimorphospora, the strains of

H. unnosum or the number of days of pre-inoculation (Table 1.3). For the analysis, the

mode1 could be fitted well (iikelihood ratio not significant at PSO.05) excluding the three

factor interaction and the "strains x days" interaction. Heterobasidion unnosum strains had

a significant (P10.01) impact on îhe isolation. However it was influenced by the presence

of the antagonist as demonstrated by a significant (PSO.01) ''strains x P. dimorphosporu"

interaction. A significant (PSO.05) contrast showed that in the presence of

P. dimorphospora, both types (P, S) gave different results. When discs were conditioned

with the antagonist, type P strains had greater decrease in the isolation of H. annosum than

S type strains. Contrasts also showed a significant diffaence (PS0.05) between strains

Ha0 14 and Ha044 in interaction with the presence of P. dimorphospora. The pathogen was

detected in 67% of the discs for strain Ha014 and only 50% for Ha044 No difference in

isolation was observed between the two S strains on spruce discs. Strain 92033 was

isolat& only fiom one disc and strain 921 19 could not be isolated at al1 even if it was

visually detected on the disc surface. The nurnber of days of advanced growth by the

antagonist pnor to the application of H. unnosum affected the presence of the pathogen

significantly (PS0.0 1). However, this effect depended on the presence of the antagonist as

demonstrated by a significant (PS0.05) "days x P. dimorphospora" interaction. Seven day

growth by P. dimorphospora caused the greatest decrease in the isolation of H annosum in

wood tissue compared with one day. No decrease was observed in control discs (without

P. dimorphospora).

Table 1.3. Logistic regression analysis and contrasts (C) of attempted isolations of

Heterobasidion annosum ( P and S strains) fiom wood discs.

Source of variation d f Chi-Square P

Btocks

S trains

C 1 : Ha0 14-Ha044 vs 92033-92 1 19 C2: Ha014 vs Ha044 C3: 92033 vs 921 19

P. dimorphospora

Strains x P. dimorphospora

Cl x P. dimorphospora C2 x P. dimorpliospora C3 x P. dimorphospora

Da YS

Days x P. dimorphospora

Likelihood ratio - - - - - - -

Note: df, degrees of freedom; ns, not significant at PS 0.05. * significant at P 5 0.05 ** significant at P S 0.01 *** significant at P S 0.00 1

1.4 DISCUSSION

In previous in vitro dual culture tests on agar, presence of an important inhibition zone

suggested that the antagonistic factor was a product of actively p w i n g mycelium of

P. dimorphospora (Yang et al. 1993). Results obtained by the bi-layer technique in this in

vitro study demonstrated the production of fùngitoxic diffisible substances by

P. dimorphospora in a nanual substrate. This method was used by Schoeman et al. (1994)

to show the production of metabolites by Trichodema spp. Contrary to other hngi studied

as biocontrol agents, P. dimophospora displayed similar activity on agar and wood

systems in vitro (Ejechi and Obuekwe 1994; Holrner and Stenlid 1994; Lundborg and

Unestam 1980; Nicolotti and Varese 1996). Agar media contain an abundant sugar source

that does not necessarily represent the nutritional statu of wood (Srhivasan et al. 1992).

This might affect fungal growth rate and interactions between the antagonist and the

pathogen (More11 and Sexton 1990). The importance of media composition for the

production of antifungal metabolites by P. dimorphospora has been demonstrated by

DesRochers (1992). In the present study, this antagonist was able to use compounds

present in the wood, probably non-structural carbohydrates such as simple sugars, to

produce inhibitory substances.

Results from agar tests are in agreement with those obtained by Yang et ai. (1993), where

hyphae and conidia of H. annosum were very sensitive to metabolites produced by

P. dimorphospora, and lysis was obtained within 24h in vitro. In the present investigation,

50 growth occurred on the second layer of agar on both substrates, suggesting that lysis

and death of hyphae occurred through contact with diffisible metabolites except on the

plugs put over the centre. This may be due to toxic compounds found in heartwood tissues

that could inhibit the growth of P. dimorplrospora. Afier seven days, growth of

P. dimorphospora seemed to be reduced in that part of the disc associated with heartwood

tissues. However, isolation atternpts made after five and six weeks of growth revealed

colonization of the wood tissue close to the centre. Phaeotheca d i ~ h i o s p o r a must have

outgrown it afkr the first week. Further investigation would be needed to clearly

dernonstrate this.

In the direct confrontation test, propagules (ch) from the suspension grew on the surface

and into the wood tissue. The capacity of P. dimorphospora to colonize the wood

suggested by the hi& yield of isolation, was associated with antagonistic activity. An

advantage of this method over the bi-layer technique is the possibility to observe the achial

competition between both fun@ for nutrients. This type of competition is unlikely to occur

on agar, a rich medium (Lundborg and Unestam 1980). Reduction in the colonization

incidence by the antagonist on red pine discs when H. annosum was applied after ody 24h

strongly suggests competition for substrate between both fungi. This indicates the

importance of tests allowing for direct confrontation. Furthemore, results revealed that the

bi-layer method is not as sensitive as the direct confrontation on wood. Indeed, the latter

allowed to discriminate between tree species and even between P strains. Faster

germination and growth of the different H. annosum strains on wood or better resistance to

the antifungal substances could explain these results. However, previous dual culture on

MA (3%) had not demonstrated significant differences between the two P sûains

(un pu blis hed data). Moreover, those two were not signi ficantl y di fferent fkom the S strains.

This seems to confinn the sensitivity of the technique, and supports the need to reproduce

conditions similar to field situations in the laboratory. In addition, it reflects the fact that

several factors are involved for the antagonistic effect in a natuml substrate. As we saw by

the different degree of control for the two P strains in stem discs it is clear that an

evaluation of more strains of both types would be required. Reaves and Crowford (1994)

underlined the importance of screening numerous antagonistic isolates against several

isolates of the target fun@ to detemine which are most effective. For P. dimorphospora

only one isolate has been identified until now. Work aimed at finding new isolates is

presently being canied out.

The presence of a yellow pigment in wood tissue of both tree species is probably

associated to the release of difîùsible metabolites by P. dimorphospora. These metabolites

were composed of antifùngal compounds as demonstrateci by the bi-layer assay. The

production of the pigment was much more important in red pine discs. This must be relatai

to the differences in the characteristics of woody tissues between the two species. Despite

this difference, control of H. annosum was better on spnice discs for a one day

conditioning. Inhibition was induced even in many non coloud wood portions.

Suppression of H. annosurn by other uncoloureà antifungal substances or simple

cornpetition for nutrients and space could also explain these results.

For both techniques and substrates, seven days of conditioning with P. dimorphospora

were sufficient for completely inhibiting the growth of H. annosum. However, one day

provided only partial control particularly on red pine discs. Success on Nonvay spnice

might be a consequence of, as it appeared visually, the slower growth rate of S strains on

the wood discs. In light of these results, P. dimorphospora can be seen as an agent of

prevention not as a cure. This is dso in agreement with results obtained by Bernier et al.

(1996) using this fungus against 0. ulmi. Despite this, it still causes a strong inhibition of

H. annosum growth especially on spruce. Control of H. annosum when it is already present

in a plantation is difficult since it can spread by root-to-root contacts. The Québec situation

actually allows to focus on preventative means to inhibit air-bome stump infection

(Laflamme and Blais 1995).

Even if P. dimorphospora was isolateci fiom an e h tree, it can colonize red pine and

Norway spnice, to use the naturd substrate for antifungal metabolite production, and

survive in the wood for at least six weeks under controlled conditions. Colonization

incidence and survival of the antagonistic agent are two important factors which cm limit

the success in controlling the pathogen (Bruce et al. 1991; Ejechi 1997; Lundborg and

Unestam 1980). It is believed that H. annosuni can enter into fiesh stumps and infect

tissues only in the first two weeks after cutting (Hodge 1969). Survival of

P. dimorphospora over a long period appeared not to be absolutely necessary as long as

other organisrns dso wlonized the stumps. The use of stem discs provided a suitable

mode1 to study the interaction between the two h g i . nie success on wood discs in vitro is

an indication for the potential use of P. dimorphospora in the field. Its ability to grow and

to survive long enough for restricting the penetration of H. annosum in a natural

environment where temperature, humidity and corn petit ion wi th other organisms are not

controlled, still has to be verified.

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11. Field investigation study.

Des essais réalisés sur le terrain sur des bûches de pin rouge partiellement enterrées ont

indiqué que le meilleur traitement pour inhiber l'infection par Heterobusidion annomm est

l'application de Phlebiopsis gigantea. Ce dernier a complètement inhibé la colonisation par

l'agent pathogene principalement en occupant abondamment et rapidement les tissus du

bois. L'application de Phaeotheca dimorphospora sous forme d'une suspension liquide n'a

démontré aucune efficacité, elle a même favorise la colonisation des tissus par H. annosum

aprés les deux mois d'exposition. Cependant, le traitement à L'aide de grains de seigle pré-

colonisés par P. dimorphospora a, quant à lui, réduit l'infection. La production de

métabolites antifongiques dans les grains et une meilleure colonisation des tissus ont été

observées avec cette formulation. La colonisation naturelle par les champignons a varié en

fonction du traitement, du site, de la période de coupe et du temps d'exposition. C'est en

favorisant la présence de nombreux zygomycètes et deutt5romycètes que le traitement

témoin à base de grains de seigle a réduit la présence de H. annosum après le premier mois

d'exposition. Les principales espèces qui colonisent les bûches de pin rouge sont

Homonema sp., MortierelLa spp., Mucor hiemaIis var. hiemalis. Nechia sp., Pesotunt sp.,

P. gi'ntea, Tympanis sp. 1, Tympanis sp.2, Tnchodennn spp. et un basidiomycéte inconnu

B9.

2.1 INTRODUCTION

The pathogenic fungus Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. causes major problems of root

and butt rot disease of many conifers throughout the Northem hernisphere (Woodward et

al. 1998). This pathogen has recently been spreading in red pine plantations in Québec

(Canada) to a point where prevention treatrnents are needed (Laflamme and Biais 1995).

Many biological control mesures to prevent conifer stump infection have been studied in

the past forty years, but until now the basidiomycete Phlebiopsis giguntea (Fr.:Fr.) Jül. has

been the only successfùl one. It is being used in few countnes for pine snimp treatrnents

(Greig 1976; Korhonen et al. 1994; Sierrota 1997). Recent experiments conducted in vitro

showed the promising use of an other fungus, Phaeotheca dimophospora DesRochers and

Ouellette, as a biological control agent against H. annomm (Chapter 1 ) . The antagonistic

potential of this deuteromycete against this pathogen was well demonstrated in vitro on

agar as well as on red pine (Pinus resinosa Ait) and Norway spmce (Picea abies L. Karst)

wood discs. Inhibition appeared to be primarily due to antifungal metabolites. Phaeotheca

dimophospora has demonstrated, in vitro and in greenhouse experiments, potential for the

control of a wide variety of forest pathogens, including Ophiostoma ulrni (Buism.) Nannf.,

Gremmeniella abietina (Lagerb.) Morelet, Cylindtocludium scoparium Morg. and Septoriri

musiva Peck (Benller et ai. 1996; Yang et al. 1993; Yang et al. 1994; Yang et al. 1995a, b).

Relative to the extent of experimental work conducted, few biological control products are

available on the market. This is mainly related to the fact that, for many biocontrol agents,

results obtained in field testing are ofien not correlated with those fiom controlled

environments (Cook and Baker 1983; Morell and Sexton 1990; Schoeman et al. 1996).

Variable results and limited success are due to factors such as environmental conditions,

substrate statu (nutrient, pH) and competition with other miaosrganisms (Bruce and

King 1986; Ejechi and Obuekwe 1994; Etheridge 1972; Morell and Sexton 1990; Nelson

and Thies 1985). The mode of action of biocontrol agents include mywparasitism,

competition, and the production of diffusible toxic compounds. However, they can also be

effective by altering microfloral interactions and composition allowing for the growth of

beneficial or non beneficial organisms (Schoeman et al. 1996; Yang et ai. 1995a). in

addition, cornpetition from other fùngi might interfere with colonization success (Meredith

1960). Al1 these factors have a substantial impact on the efficacy of a biocontrol agent,

hence they have to be considerd

In spite of the significant reduction of H annosum growth by P. dimorphospora under

controlled conditions, its potential in the nahird environment has yet to be demonstrated

(Chapter 1). More information is needed on how well this antagonist will lirnit colonization

by H. annosum in the field. The main objectives of the present study were to 1) detemine

the effectiveness of P. dimorphospora in a natural environment, 2)compare

P. dimorphosporu treatments with P. gigantea treatments, and 3) investigate the effect of

the two biocontrol agents on the indigenous fùngal community colonizing rd pine logs.

For this, field testing was carried out using tieshly cut red pine logs. This approach was

used by Coates and Rayner (1985) for snidies on b g a l development of populations and

communities in decaying beech wood. The main advantage of this systern is to allow rapid

observations of the succession in the decaying process including penetration of tissues by

H. annosum.

2.2 MATERIAL AND METHODS

2.2.1 Fungal strains

Phaeotheca dimorphospora, strain QFB 19795, was isolated fiom a white elm (Ulmus

americonct L.) branch during a survey for Dutch elm disease in Québec city (DesRochers

and Ouellette 1994). Phlebiopsis gigrintea, strain P 104, was isolated fiom a red pine stump

in the southwestern part of Québec (Canada) and selected for its ongin and its oidial

production capacity. The H. annosum strain (Ha044) was isolated fiom a red pine stump on

site B from the Larose Forest (Ontario). Al1 strains were kept at 4°C on 3% Difco malt agar

(MA)*

22.2 Study sites

The two experimental sites (A and B) were located in the Larose Forest, 40 Km east of

Ottawa (Ontario) in a approximately 50-year-old red pine plantation. Sites were about 1 km

apart. On both sites, experimental plots were established in a H. annosum infected area. A

thinning was performed on site B few months before the experiment.

The experiment included two types of inoculum for P. dimorphosporo. The first inoculum

was prepared as described previously in chapter 1 with slight modifications. The mycelial

mat was harvested, but no filtration or cleaning was done, and it was blended in the filtrate.

The concentration of the suspension was adjusted with distilled tap water to inoculate 7.0 x

10' cfu/cm2. For the second inoculum, 5 kg of rye grains were mixed with 37.5 g of CaCOl

and 1.25 L of distilled water until complete absorption (about 30 min.) o c c u d . One

hundred and seventy gram of rye grains were put in bags into which 120 mL of water was

added. Bags were autoclaved twice for 45 min. An interval of 24h was lefk between cycles.

Then, they were kept at 4OC for one week in the dark. AAer that period, half the bags were

inoculated with 2 mL of a P. dirnophosopa suspension (c. 1.5 x 106 cWmL). The other

half (control bags) were inoculated with 2 mL of sterile distilled water. The fungus was

allowed to grow for four weeks at 24OC in the dark. Grains in the bags were mixed once a

week. in the field, one bag was used for each block. For the P. gigantea aqueous

suspension inoculurn, oidia were harvested by washing out the surface of Cweek-old

cultures on 2% Difco malt extract agar (MEA). The concentration was adjusted to apply

200 living oidia/cm2. Finally, a conidial suspension of H. annosum was prepared with

conidia collected from 2-week-old culhues on MA (3%). Concentration was adjusted to

apply 50 conidia/crn2. AI! suspensions were prepared the day of the inoculation using tap

water. The total arnount of liquid sprayed ont0 the log section was 30 mL.

2.24 Log treatmeats

Treatments were designed to evaluate the potential survival and efficiency of two types of

inoculum of P. dimorphospora, and to compare it with P. gigantea. In Septernber 1994,

about 25 red pine trees of approximately 15 to 20 cm in diameter were felled. Within 48 h,

they were cut with a chah saw into 300 logs 40 cm long that were buried upright into the

ground to 10 cm on both sites. On each site, a randomized complete block design with five

replicates was used for the expenment. Thirty logs were placed 50 cm apart one from

another within each experimental block (2.0 x 2.5 m) containing five rows. Logs were

treated few hom a b cutting. Treatments consisted oE 1- tap water (control); 2-

P. gigantea liquid suspension; 3- P. dimorphospora liquid suspension; 4- colonized

P. dimorphospora rye grains; 5- rye grain control. Suspensions fkom treahnents 1,2 and 3

were inoculated with a sprayer evenly over the aerial cut surface. Inoculum fiom treatrnents

4 and 5 were applied to cover the entire cut surface of the log. To ensure that infection by

the pathogen would reach the minimum level, a conidial suspension of H. annosum was

spread over the section of al1 logs 30 min after the first inoculation. Al1 treatments were

included six t hes within each block and were randomly assigneci to sampling periods.

22.5 Sampiing method and assessrnent of colonization

One and two months after inoculation, sUnace slices (15 cm thick) of 50 logs (2 sites x 5

treatments x 5 replicates) were removed h m the field and taken back to the laboratory for

fùngaî isolations. The remaining logs were not sampled. Discs were stored for up to 12

months at -20°C in plastic bags until examined. At the time of isolation, wood sections

were split in four through the center with a hatchet. Isolations were done at 0.2, and 1 .O cm

fiom the surface, every 1 .O cm fkom each other (same level) dong the two diameters. Small

pieces of wood (ca. 2 x 2 x 1 mm) were removed aseptically and put ont0 1 25% MEA

culture medium arnended with penicillin-G (50 ppm) and chlortetracycline (40 ppm) as

well as 1.5% MEA amended with benornyl(1 ppm). Benomyl was incorporated into MEA

to prevent the growth of severai common imperfect h g i such as Tnchoderma spp. and

Penicillium spp. but allowed for normal growth of basidiomycetes (Maloy 1974). Plates

were incubated at room temperature (ca. 22°C) for up to three weeks. Each h g a l colony

was transferred to ffesh media for identification.

To determine the efficacy of the different treatments occurrences of H. annosum into the

logs were assessed. Occurrence represented the percentage of wood chips colonized by the

fungus. The ability of P. gigantea and P. dimorphospora to penetrate and survive in the

wood tissue, were evaluated by two parameters, occurrence and frequency. Frequency

represented the percentage of logs colonized by the fimgus. Both parameters wae

calculated by the addition of the results from the two levels and fiom two diagonals.

Concurrently, colonization by the natural mycoflora was evaluated with the same

parameters allowing for information to be obtained on the influence of the treatments on

fungal populations. For a global understanding of the n a d colonization, relative

occurrences of the diffaent taxonomie groups were evaluated.

2.2.6 Statistical methods

Treatment success was evaluated by the occurrence of H. annomm. Data expressed in

percentages were corrected for uneven distribution by arcsine transfomation. For each

sampling period, an anaiysis of variance (ANOVA) was cwed out on the transformed

values using the SAS cornputer program (SAS Institute hc. 1989). Means were then

compareci and ranked by the Waller-Duncan multiple range test. Differences were judged

significant at P4.05.

2.3 RESULTS

Statistical analysis showed no difference between sites A and B for the efficacy of

treatment against H annosam one month after inoculation (P=0.05). Occurrence of the

pathogen was significantly (P=0.05) reduced by al1 treatments compared to the control

(Fig. 2.1). All the control logs were infected by H. annosum on both sites with an average

occurrence of 10.9%. The pathogen was not detected in logs treated with P. gigantea and

P. dimophospora pre-inoculated rye grains (Pd/R) with the sarnpling method used. These

treatments did not significantly (P=0.05) differ fkom the rye grain (Rye) control treatment

that allowed a lX annosum occurrence of 1.4%. Water suspension of P. dhorphospora

significantl y (P=0.05) limited the infection (6.2%) b y the pathogen compared to control.

While treatments applied in the two sites presented similar results after one month

exposure, overall results differed significantly (P=0.05) between sites after two months.

Logs treated with oidia of P. gigantea cornpletely inhibited H. annosum on both sites

(Fig. 2.2). Pd/R treated logs presented an important reduction in the occwence of

H. annosum, less than 2%. This reduction was significantly (P=0.05) different fkom the

controls oniy on site B. The Rye treatments significantly (P=0.05) reduced the occurrence

of H. annosum only on site A. Results fiom site B were not significantly diffixent (P=0.05)

fiom the controls. Treatments with the P. dimorphospom suspension significantly (F0.05)

promoted the presence of H. annosum on both sites with occurrences of 15.4 and 17.4% for

site A and B, respectively.

Figure 2.1. Occurrence of Heterobasidion annosum one month afier red pine log

treatment. Each colurnn represents the mean of the two sites as they were not significantly

di fferent (P>0 .OS). Treatments w ith different letters were si gni ficantl y di fferent (P=0.05)

using Waller-Duncan multiple range test. (Pg, P. gigantea; Pd, P. dimorphospora

suspension; Pd/R, P. dhorphospora pre-colonized rye grains; Rye, rye grain control)

Treatments

Figure 2.2. Occurrence of Heterobasidion annosum two months a f k red pine log

treatment. Each column represents the mean of five blocks in each site. Within each site,

treatments with different letters were significantly different (P=0.05) using Waller-Duncan

multiple range test. (Pg, P. gigantea; Pd, P. dimorphospora suspension; Pd/R,

P. dimorphospora pre-colonized rye grains; Rye, rye grain control)

Artificial application of the basidiomycete P. gigantea completely inhibited the penetration

of tissues by H. annosum. This was strongly associated with the high level of colonization

by this biocontrol agent (F=100%). AAer one rnonth, occurrences of 70% were obtained for

P. gigantea on both sites (Table 2.1). AAer two months, occurrence of P. giguntea in these

logs was 38.4 and 60.3% on site A and B, respectively. Naturd colonization was also

observed especially on site B with a relatively high level (F280%, 0224.8%) in the controls

during both periods. Treatments Pd/R and Rye limited the naturai colonization by

P. gigantea. The reduction was particularly important on site A (FS20%, 010.4%).

Attempts to recover P. dimorphospora were not very successful. This antagonist was

isolated h m tissues only after one month and mostly in treatment Pm, with occurrences

of 9.4 and 2.0% for site A and £3, respectively. Even if low rates were obtained,

P. dimorphospora was still present in 100% of the logs on site A for this treatment. For the

P. dimotphospora suspension treatment, occurrences were only 0.9% for site A and zero

for site B. This fungus was not recovered in any other treatment.

Natural tùngal composition varied with sites, periods, and treatments. Detailed results for

frequencies and occurrences of individual fun@ for the dominant species of each site and

penod are shown in Tables 2.2, 2.3, 2.4 and 2.5. After one month exposure, the aerial cut

d a c e of most of the logs took on a black-blue coioration mainly due to the presence of

blue stain fungi like Pesotm sp. (wnidial state of Cemtocystis sp.), Homonema sp.,

CIadosporium spp., and a few other Dematiaceous fùngi. Logs treated with the pre-

colonized grain inoculum, presented a surface stauied with a yellow colour exuded from the

grains. This coloration was present d o m to 1.0 cm. We also noticed that parts of the log

surface treated with control rye grain treatment becarne pi& This colour was associated

with the presence of Fusarium sp. We did mt observe the formation of hi t ing bodies over

the two-month period.

Table 2.1. Frequencies (F) and occurrences (O) of Phlebiopsis gigantea in red pine

logs over the two sampling periods.

1 month 2 months

Treatrnen ts Site A Site B Site A Site B

Control 80 5.9 1 O0 24.8 80 5.4 100 30.1

pg 1 O0 69.8 100 70.0 1 O0 38.4 100 60.3

Pd 80 3.2 1 O0 13.6 80 6.4 100 19.6

P d / R 20 0.4 O O O O 20 O. 8

R Y ~ 20 O .4 80 6.8 20 0.4 100 10.8

Note: Pg, P. gigantea; Pd, P. dimorphospora suspension; Pd/R, P. dimorphospora pre-colonized rye grains; Rye, rye grain controL

Table 2.2. Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant h g i in red pine logs on site A after one month.

Treatmeat

Control P. gigantea Pd Pd/ R R Y ~

F O F O F O F O F O

Zygomycetes

Mortierella kabellina Mortierelfa parospora Mortierella vinacea Mucor hiemalis var hiemalis Total Zygomycetes

Ascomycetes

Hyalorhiocladie fla sp. Nectrr'a sp. Pesotum sp. Tympanis sp. 1 Tympanis sp ,2 Unlaiown A l Total Ascomycetes

Basidiomycetes a

Udcnown B9 U h o w n 820 Unknown B24 Unknown B22 Total Basldlomycetes

Deu teromycetes

Altemaria alternata CIadosponirm cladosporoides Epicoccum nigmm Fusunùm spp. Honnonema sp. Penicilliirm spp. RhimcludieIIa atrovirem Trichodema spp Total Deuteromycetes

Total Unidentifid

60 1.7 40 1.0

- 20 0.4 80 3.0

- 80 10.8 20 0.5 40 1.8 100 9.7 20 0.8 100 23.6

60 3.1 40 0-9 80 3.7 - *

100 14.9

- - 60 1.4 40 0.9 - - 100 6.9 80 4.9 40 0.8 20 0.5 100 173

LOO 53

Total sterüe chips 100 43.2 100 26.5 100 58.8 100 37.7 100 49.4 Note: Results are exprcssed as percentage. Pd, P. dimorphospora suspension; PdR, P. dimorphospora pte- colonized rye grains; Rye, rye grain control.

8 For P. gigantea values see Table 2.1.

Table 23. Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant f'ungi in red pine log on site B after one month.

Mortierelfa &abelfina Mortiereh parospora Mortierella vinucea Mucor hiemalis var hiemalis Total Zygomycetes

Ascomycetes

Hyalorhiocladiella sp. Nectria sp. Pesotum sp Tympanis sp. 1 Tympanis sp.2 Unknown A 1 Total Ascomycetes

Basidiomycetes * Unknown B9 Unknown B20 Unknown B24 Unknown B22 Total Basidiomycetes

Deuteromycetes

Alfernario altemaru Cladosporium clcrdosporoides Epicoccum nigrum Fusarium spp. Hormonema sp. Penicillium s pp. RhinocladieZZa atro virens Trichodema spp. Total Deuteromycetes

Total Unidentified

40 1,4 20 0,s - - 40 0,7 80 2,6

100 5,3 80 1,8 100 16,8 LOO 4,4 IO0 8, l - - 100 36,4

40 2,4 20 0,4 40 2,5 60 1,s 100 30,7

20 0,3 * - - - -

80 3,8 100 5,7 - - 20 0,4 100 12,s

80 3.6

60 1,8 -

40 L,1 80 6,9 100 9,8

- 20 1,o 100 12,4 - -

40 0,9 - 100 14,7

- 40 1,4 20 0,7 30 2,4 100 6,9

20 0,s - - - - 20 I,5 100 4,4 LOO 12,3 20 0,3 60 1,7 100 29J

100 11.8

Totai sterile chips 100 49.1 LOO 203 100 50.9 100 52.9 100 45.3 Note: Results are expressed as percentage. Pd, P. dimorphospora suspension; Pd& P. dimorphospora prc- colonized rye grains; Rye, rye grain control.

a For P. gigantea values see Table 2.1.

Table 2.4. Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fiingi in r d pine logs on site A after two months.

Zy gomycetes

Mortierella irube~hluz Mortierella parospora Mortiere/la vinacea Mucor hiemalk var hiemalis Total Zygomycetes

Ascomycetes

Hyalorhiocfadiella sp. Nectria sp. Pesotum sp Tympanis sp. 1 Tyrnpanis sp.2 Unhown A 1 Total Ascomycetes

Basidiomycetes a

Unknown B9 Unknown B20 Unknown 824 Unknown B22 Total Basidiomycetes

Deuteromycetes

Alternaria alternata Cladosporium cladosporoides Epicoccum nigrum Fusanhm spp. Honnonema sp. PeniciIIium spp. Rhinocladiella atrovirens Trr'chodema spp. Total Deuteromycetes

Total Unidentified

80 60 40 60 100

20 20 60 20 - LOO

- -

80 - 80

- - - - - 100 20 1 00 100

100

Total sterüe chlps 100 65,8 100 524 100 48,8 100 58,I 100 54,s Note: Results are expressed as percentage. Pd, P. dimorphospora suspension; Pd/& P. dimorphospom pre- coionized rye grains; Rye, rye grain control.

For P. gigantea values see Table 2.1.

Table 2.5. Frequencies (F) and occurrences (O) of the dominant fun@ in red pine logs on site B afier two months.

Trea tment

Zygomycetes

Mortierellu isu bellina Mortierella purospora Mortierelfa vinacea Mucor hiemalis var hiemalis Total Zygomycetes

Ascomycetes

Hyalorhiocludiefla sp. Nectria sp. Pesotum sp. Tympanis sp. 1 Tympan& sp.2 Utiknown Al Total Ascomyce tes

Unknown B9 Unknown B20 Unknown B24 Unknown B22 Total Basidiomycetes

Deu terornycetes

Altemariu alfernata CIadosporium cladosporoida Epicoccum nigmm Fwarium spp. Hormonema sp. Penicillium spp. Rhinocladiella afrovirens Trichodema spp. Total Deuteromycetes

Total Unidentifïed

80 1,s -

60 1,9 80 4,9 100 9,4

- 20 0,4 100 14,2

- -

100 18,3

20 1,O 60 1,I 80 1,8 60 1,l 100 8,5

- - 40 1,l 20 0,3 - - - -

LOO 9,l 20 0,3 100 6,9 100 19J

100 1SJ

Totai steriie chips 100 46,8 100 25,s 100 49,4 100 S1,l 100 49,l Note: Remlis are expressed as percentage. Pd, P. dimorphospora suspension; Pd/R P. dimorphospora pre- colonized rye grains; Rye, rye grain control,

8 For P. m n t e a values see Table 2.1.

Despite variations, the results indicated some trends. Overall the most common species

recovered from wood samples were : Penicillium spp., Tnchoderma spp., Mortierellu

isabellina Oudem, Mucor hiemalis Wehmer f. hiemalis, Nectria sp., Tympanis sp. 1, and

Tympanis sp.2 (Tables 2.2, 2.3, 2.4 and 2.5). Trichodema spp. mainiy compnsed three

species, T. hanianum Rifai, T. vîride Pers. Ex. Gray and T. pseudo-konngii Rifai. Another

very common h g u s mostly specific to site B, was Pesotum sp. This fungus was present in

relatively high number (F=100%, 2.4% S O < 33.4%) in al1 treatments except for those

treated with P. gigantea (F=80%, O 5 8.5%) on site B (Tables 2.3, 2.5). We also noticed

that the black yeast fungus Hormonema sp. colonized most of the logs (Fr 80%) after one

month except for the P. gigantea treatment with a relatively high occurrence (O 2 3.8%)

(Tabies 2.2, 2.3). Penetration by fùngi was mostly concentrated at the 0.2 cm level, except

for P. gigantea and a few other fùngi like Pesotum sp, Tympanis sp.1, Nectria sp., A.

alternata, E. nigrum, Penicillium spp. and Trichudenna spp.

As we already mentioned, differences between the natural mycoflora fiom each site were

observable. On site A, only the mould, PeniciIhm spp., occurred in more than 20% of the

chips while more species (Penicillium spp., Pesotum sp., and Trichodenna spp.) were

obtained on site B (Tables 2.2, 2.3). Moreover, we did see more colonization by three

deuteromycetes [Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissl., Epicoccum nigrum Link and

Cladosporium cladosporoides (Fresen.) GA. De Vries] after one month (5% S O 5 15%) in

the controls fiom site A,

Treatment effects on the mycoflora were also noticeable. Besides Iow colonization by

Pesotm sp., logs treated with P. gigantea excluded any other basidiomycetes except for

site B afier a two month exposure. One of the most common species associated with that

treatment after one month was Peniciïliuni spp. (=-O%, 4.3 % S O I 1 3.3%), and after two

months, Trichodema spp. (F280%, 0 2 3.4%) (Tables 2.2, 2.3). However, after one

month, occurrences of Penicillium spp. were the highest in logs treated with Pd/R (O 2

12.3%) and Rye (O 221.1%). We aiso noticed that inoculation with a suspension of

P. dimorphospora seemed to have favoured the presence of Tympanis sp.2 for both sites

and periods (F280%, 2.4 % 2 O 2 9.7%). Rye treatments showed the highest presence of

M. isabellina (F260%, 5.4 % 2 O 2 14.1%). Afier one month, about half of the wood

samples from al1 treatments except the P. gigantea one were not colonized by fungi. mis

treatment allowed for a high colonization, leaving 26.5% and 20.3% for site A and B

respectively of non-colonized wood sarnples (Tables 2.2, 2.3). Sirnilar results were

obtained for site B after No months exposure (Table 2.5). However, site A showed a

higher level of wood sample without fun@, including the P. gigantea treatment (Table 2.4).

The relative occurrence of each taxonomie group is illustrated in Fig. 2.3 and 2.4. Controls

were mainly colonized by basidiomycetes and deuteromycetes both with relative

occurrences over 30%, except for site A, after two months, where the ascomycetes,

basidiomycetes and deuterornycetes groups were almost equally represented. One of the

most important observations on the mycoflora, regarding the treatmenb, was the low level

of total basidiomycetes obtained with PdIR and Rye beatrnents. For both sites and periods,

they were replaced by higher rates of zygomycetes, particularly in logs treated with control

Rye grain. However, we noticed a reduction in the relative occurrence of the zygomycetes

after two months in site B (Fig. 2.4). Another common group stimulateci by the Pd/R

treatment was the deuteromycetes (rO225%). The highest relative occurrences of

ascomycetes were obtained following treatment with the P. dimotphospora suspension.

This was also associated with a low level of zygomycetes and deuteromycetes. In general,

presence of basidiornycetes was higher afier two months except for the controls on site A

and overall P. gigantea treatments.

Figure 2.3. Relative occurrence of each taxonomie group in red pine logs one

month after treatment on site A (a) and B @). C, control; Pg, P. giganteu; Pd ,

P. dimorphospora suspension; Pd/R, P. dimorphospora pre-colonized rye grains;

Rye, rye grain control.

Figure 2.4. Relative occurrence of each taxonomie group in red pine logs two

months after treatment on site A (a) and B (b). C, control; Pg, P. gigantea; Pd,

P. dimorphospora suspension; PdR, P. dimorphospora pre-colonized rye grains;

Rye, rye grain control.

2.4 DISCUSSION

Previous greenhouse studies have shown the effectiveness of P. dimophospora as a

biological control agent against G. abietina (Yang et al. 19951>), S. musiva (Yang et al.

1994), 0. ulmi (Bernier et al. 1996) and C. scoparium (Yang et al. 1995a). In these

investigations, results obtained in laboratory expetiments tended to correspond to in vivo

studies. In another in vitro study perfomed on wood discs, P. diniorphospora colonized red

pine tissues, produced antifungal metabolites, and inhibited the growth of H. annosurn

(Chapter 1). In the present work, conducted in a natural environment, P. dimorphospora did

not have the expected eficiency in preventing infection by H. annosum. It was obsened

that the P. dimorphospora fomulated as a liquid suspension was the least effective

treatment causing an increase in colonization of tissues by the pathogen after a two month

exposure. However, P. dimorphospora formulated as pre-colonized rye grains did control

H. annosum. Even if this formulation inhibited the growth of the pathogen, mostly by the

difision of antagonistic metabolites, this treatment had limited penetration potential (no

more than 1 cm into the log). Moreover, it did not offer important coverage of log tissues. It

might be better having P. dimorphospora growing inside the log and producing the

antibiotic substances.

In vitro, P. dimorphospora had demonstrated the ability to colonize red pine tissues for at

least six weeks (Chapter 1). In the present field test, survival of the inoculum might have

been limited by environmental factors such as temperature and wood moistute content.

These factors are known to contribute to the effectiveness of a biological control agent by

influencing its colonization and inhibition capabilities (Butcher 1968; Nelson and Thies

1985; Nelson and Thies 1986; Nicolloti and Varese 1996). In the field, log moisture content

was definitively lower than in the discs used in the in vitro tests that were almost saturated.

Weather conditions at the time of inoculation might not have been optimal for this

antagonist. in north-eastern Canada, to control H. annusum, the biocontrol agent has to be

effective in the fat1 period when the pathogen is actively growing and spodating.

DesRochers (1992) showed reduction in the growth and production of antifungal

metabolites by P. dimorphospora at temperatures under 15°C. The effect of temperature

and moisture content of the wood on the antagonist needs m e r study.

Presence of high incidence of the natural mycoflora at the surface of the log might also

have contributed to the failure of P. dimorphospora to develop. Microbial competition is

one of the factors affecting the spread of most fun@. Labotatory experiments are mostly

conducted in a closed system, excluding interference from other fungi. Abundant sources of

nutrient sugars in different types of agar media, like malt extract agar, generaily allow the

antagonist and pathogen to grow without competition compareci to what occurs in wood

tissues (Morell and Sexton 1990; Nicoloni et al. 1994). This competition phenornenon

might affect their growth rates and interactions. Cornpetition between Neciria fickeliana

Booth, Ascocoryne cylichnium (Tul) Korf, yeast like fungi and bacteria had limited the

spread of Stereum sanguinolentum (Alb. and Schw.: Fr.) Fr. in the stem of a healthy 80-

yearsld P. abies (Hallaksella 1993). Presence of T. hanianum had been shown to

influence interactions between basidiomycetes (Schoeman et al. 1996). Results obtained by

Yang et al. (199%) showed the ability of P. dimorphospora to sunive in soil in a closed

systern (Petri dishes), free of any other organism for six weeks, but it did not survive in

soil, in a greenhouse experirnent aAer one month. It was instead replacecl by a high

concentration of T. harzianum. in our study, P. dimorphospora did not enhance the

presence of Trichuderma spp. in log tissues. However, it did have an influence on the

mycoflora by generally limiting colonization by zygomycetes and deuteromycetes, thus

potentially excluding beneficial organisms.

Low colonization rates on red pine logs are not necessarily surprising as P. dimorpiiospora

was isolated fiom an elm tree (DesRochers, 1992). Better colonization muld be reached

with a formulation that is less susceptible to environmental factors. Fermented barley grain

inoculum of T. Mride proved to be an excellent inoculum to replace the pathogen Phellinus

weirii (Murr.) Gilb in Douglas fir (Pseudostuga menziesii (Mirb.) Franco) stumps (Nelson

and Thies 1985). This corresponds to our finding were P. dimorpliospora pie-inoculated on

rye grains was a better treatment for survival and efficiency of control.

In previous tests conducted in viîro, P. diniorphospora produced a yellow pigment in wood

tissues considered to be antifungal metabolites (DesRochers 1992). in the present study, no

pigmentation was observed in logs treateà with the suspension of P. dimorphospora

probably due to the limited colonization of tissues by the antagonist. High colonization

rates corresponded to strong coloration of red pine wood tissues in vitro (Chapter 1). On the

other hand, pre-colonized grains were impregnated with the yellow pigmentation and, by

difision, the first centimeter of the surface on most of the treated logs was coloured. Rye

grains provided adequate nutritional factors to support the growth of the antagonist and to

allow for production of antifungal metabolites. In vitro tests perfiormed on agar plates

demonstrated the antagonistic effect of the pigment exuded fiom the colonized grains

against H. annosum (data not shown). In addition, it appeared to have been toxic inside

wood tissues to other basidiomycetes like P. gigantea as low levels of this group were

obtained. This partly explains the effectiveness of that treatment and confims at least some

attributes of P. dimorphospora as a biocontrol agent. AntifÙngal metabolites produced by

P. dimorphospora have been shown to be antagonistic on agar to many fungi including

H. annosum, causing hyphal lysis and inhibition of spore germination (Yang et al. 1993).

Application of metabolites instead of the fungi can be considered as an alternative.

Metabolites produced by the h g u s and P. dimoiphospora itself had presented similas

effects in treatrnents of poplar cuttings against S. muriva (Yang et al. 1994). More research

is needed to explore the efficiency and composition of the antifungal compounds for their

utilisation. Tests will be required to explore the effectiveness of the antifùngal metabolites

alone on wood. Presence of the fùngus itself might be necessary. Metabolites produced by

T. virens (GliogardTM, W.R. Grace and Co, Ct) were effective on agar but not on wood

(Highley 1997). This suggests the need for the presence of living mycelium to reach

sufficient concentrations of hngitoxic compounds.

Tests conducted in vitro demonstrated the preventive effect of P. dimorphospora but this

antagonist was less effective when applied only one day before H. annosum compared to a

seven day pre-inoculation (Chapter 1). In the field, the pathogen was applied 30 minutes

after the P. dimorphospora treatment; this can also explain the results. The antagonist did

not have the time to colonize tissues before the pathogen. Rapid colonization by the

biocontrol agent is an important factor for the success of the treatment (Lundborg and

Unestam 1980). This biological control agent bas to be regarded as a preventative

treatment; and this is parily due to the fact that it is a slow growing fungus. Other studies

had shown its potential as preventing agent against O. ulmi (Bernier et ai. 1996) and

S. musiva (Yang et al. 1994), but that it was less effective when applied at the same time as

the pathogen. This indicates a need for a conditioning period before the attack by the

pathogen.

Not surprisingly, the most effective treatment was the one with P. gigantea. In contrast to

P. dimotphospora, this fungus is a fast coloniter and is well adapted to out-compete

H. annosum. The strain used in this field study showed a great potential as far as

colonization capability and biocontrol efficiency are concemed. Field expenments on red

pine stumps also demonstrated the colonization potential of the strain (Chaptre 3,

Dansereau 19%). Success of this basidiomycete in preventing aerial infection of fiesh pine

stumps by H. annomm has been demonstrated in many studies (Greig 1976; Rishbeth 1963;

Sierota 1997; Korhonen et al. 1994; Soutrenon et al. 1998). A drop in the occurence of

P. gigantea observed after two months was partly associated to a rapid downward spread of

the fungus. It was detected down to 5 cm nom the cut surface (data not shown). in

cornparison, naturd colonization by P. gigantea did not go deeper than one centimeter.

Only a few other species were isolated fiom these levels and at very low rates. This

confïrms the advantage of artificial inoculation evm if the fungus is naturally present.

Massive introduction of the biocontrol agent allowed for a faster and more uniform

colonization than the lower naturd infeçtion which needed a longer period to get

established. This type of inoculum can more easily exclude cornpetitors. In our field test,

P. gigantea limited the colonization of tissues by other fiinpi. Similar conclusions have

been drawn by Meredith (1959) and Rishbeth (1963) with P. gigantea on pine shimps.

Competition with the pathogen is bound to occur not only on the surface but also deep in

stump tissues. Thus, deep penetration dlows P. giguntea to get fast access to uncolonized

resources giving the fiingus a signifiant competitive advantage. At the same time, rapid

decay prevents the stump from becoming a disease reservoir. In addition, it limits

secondary infection from wounds which can allow H. annoswn to penetrate the newly

exposed tissues of the stump. Fast decay also improves site access for future management

operations.

Non negligible natural coîonization by P. gigantea occuned in most of the treatments,

especially on site B, where a thiming operation was done a few months before Our study.

On this site, basidiocarps of the fungus were cornmonly observed in the surrounding area

on logs left on the ground. This corroborates results obtained from treated stumps in red

pine plantations where natural stump colonization was more important in the previously

thimed site (Roy et al. 1997). In the present study, almost al1 isolates recuperated frorn logs

treated with P. gigantea were somatically compatible with P 104 implying that they were

the sarne (data not shown). This method was show to be as effective as random amplified

polymorphic DNA (RAPD) for discriminating P. gigantea isolates (Roy et al. 1997). This

indicates that the inoculated strain had not been replacecl by indigenous strains. Similarly,

Hallasksella (1 993) observed low replacement of the inoculated strain a h successful

treatment with the basidiomycete S. sanguinolentum. In contrast, P. giguntea isolates

recuperated fiom other treatments were, except for a few cases, different nom P 104 as they

demonstrateci somatic incompatibility with this straùl. More than one indigenous strains

were found in the untreated logs. This study provided evidence for the naturai air-borne

dissemination of P. gigantea in the plantations.

2.43 Rye grain controls

Rye seed controls also reduced the Section by H annosuni after the first month but lost

theu efficiency afler two montbs on site B. Efficiency of this mtment was attn'buted to the

presence of a high number of zygomycetes like M. isabelina and M. hiemalis f hiemulis,

and aiso imperfect fiingi like Penicillium spp. These microfùngi occupied the niche and

prevented the growth of the pathogen. Mucor hiemalis, one of the dominant species in

surface colonization of Norway spruce stumps, has show marked in vitro antagonism

against H. annosum but failed in wood discs (Nicolotti and Varese 1996). Ability of

PeniciIiium sp. to antagonize wood decay organisms has been reported (Ejechi and

Obuekwe 1994). AAer one month on site B, we obsened the disappearance of the rye grain

control inoculum on the surface of the logs from the five blocks. We assumed they were

eaten by birds or small mammals. This resulted in the ineffectiveness of the treatment in

that site afier the two month penod. Reduction of total zygornycetes could have been the

reason why more ascomycetes and basidiomycetes were obswed. Colonization by

naturall y occumng P. gigantea increased but as in the water control treatment , colonization

was not sufficient enough to inhibit H. annosum. Low levels of basidiomycetes following

treatments with rye grain cont~ols as well as pre-colonized ones by P. dimorphospora may

result in a slower decay process and eventually an inefficient treatment. As we mentioned

earlier, rapid decay of sturnps provides advantages for the biological control agent.

2.4.4 Mycodivenity

Extensive colonization by the namal mycoflora was observed. With oniy few exceptions,

qualitative fùngal succession of the logs was similar on both sites. Differences in the

occurrences of species and in the relative importance of the different groups observed

between sites reflect local variations in naturai inoculum potential. Basham (1966a)

observed different heartwood flora in Jack pine (Pinus bankîiana Lamb.) between two

plots only 3.2 km apart. Common natural surface mycoflora found in red pine logs are

similar to those found on stumps of the same species (Chapter 3). Most of them were

reported to be isolated fiom conifen (Butcher 1968; Meredith 1960; Schoeman et al. 1994;

Varese et ai. 1998). Even if lots of bacteria and yeast were present in tissues they were not

identified. These microorganisms are also part of succession in the wood decay process.

Furthermore, we 0th observeci more than one species on the same wood sample. Some

chips containai over four species. This has also been obsmed in Norway spruce afier

green pnining (Metzler 1997). The use of benomyi amended medium allowed for isolation

of basidiomycetes in presence of Trichoderma spp. which oflen obscures the presence of

slower growing fun@ (Butcher 1968; Maloy 1974). Otherwise it would have been

sometimes dificult to isolate them.

In our study, Trichoderma spp. were an important part of the natural mycoflora. It has o f h

been evaluated as a biocontrol agent against h g i with variable results. It has been a

popular choice in agriculture and forestry due to the variety of mechanisms by which it

antagonizes fùngi: production of toxic metabolites, mycoparasitism, fast growth, and

cornpetition for the niche (Bruce et al. 1996; Chet and Inbar 1994). Some stuâies showed

the potential of Trichodenna spp. against H. annosum. Driver and Gims (1969) observed

that the relative increase in natural presence of Trichodema spp. was associateci to a

decrease of infection and colonization by H. annosum in Slash pine (Pinus elliotti var

elliotti Engelm) stumps. Moreover, invasion of spruce stumps by H. annosum was Iimited

by Trichodenna spp. (Kallio and Hallaksela 1979). However, Rishbeth (1963) observed

that these fun@ did not colonize freshly cut stump surfaces of Scots pine (Pinus sylvestris

L.) enough to compete with the pathogen. This seems to be generally true for other

microfùngi including Peniciffium spp. in our field experiment, natural Tnfhodenna spp.

did not seem to have any impact on the colonization by the pathogen.

Another group of fùngi, which are part of the first step of the succession in wood decay, are

the blue stain fun@ (Meredith 1959). This group was encountered in al1 sites and for al1

periods, and was represented mostly by the ascomycete Pesotum sp., and the

deuteromycetes Homonemu sp. and Cfadosporium spp. Presence of these fùngi varid

qualitatively and quantitatively depending on the site. Populations of Pesohm sp. were

more important on site B, and increased with time. Homonema sp., fiequent after one

month, did not grow deeper into the tissues compared to Pesotum sp. This species belongs

to the Ceratocystis group well known for its characteristic staining of the wood and for

being an early colonist (Meredith 1960). ûther ascornycetes present were Nectriu sp.,

Tympanis sp.1 and Tympanis sp.2. Species of Necma have been found in other conif=

wood, Iike Nfickeliana on Noway spruce (Huse 198 1, Metzler 1997). Tynrpanis

hypopodiu N y1 was antagonistic against Fomes pini (Fr.) Lloyd on malt agar and Jack pine

wood sampies (Basham 1966b). In our study, Tymponis sp.2 did not show any activity

against H. annosum since it was present in hi@ levels in logs treated with

P. dimorphospora suspension, the lest effective treatment. Besides the P. grgantea

treatment, basidiomycetes were more comrnon in the ineffective treatments such as water

alone (control) and P. dimorphospora suspension. Similar observations were made by

Kallio and Hallaksela (1 979) on Norway spruce stump treatments. Besides P. gigantea,

three other basidiomycetes were commonly isolated, unknown species B9, B20 and 824.

We were unable to identiw them by mycelial characteristics. They are assumed to be decay

pioneers like P. gigantea. It has been shown that some decay fun@ (basidiomycetes) also

have the ability to be pioneers (primary saprotrophs) occupying canifnifer trees or stumps

(Holmer et al. 1997; Roll-Hansen and Roll-Hansen 1980).

2.5 CONCLUSION

Results of this study combined with those obtaiaed fiom tests conducted on red pine

sturnps (Chapter 3, Dansereau 1996) tend to confirm the potential of P. gigantea as a

preventative control agent against H. annosum in red pine plantations. This biological agent

is well adapted to Québec and northeastem Ontario regions (eastern Canada). It would be

very useful in unthianed plantations not infecteci by H. annosum. The fungus

P. dimorphospora in suspension did not thoroughiy colonize wood nor compete with the

indigenous mycoflora to exert antagonistic actions against H. annosum. This field test

revealed the uselessness of this h g u s for field conditions when applied as a suspension.

Obviously, in vitro assays performed before going out in the field were not appropnate for

determinhg the biocontrol effect. Observations made on the success of P. dimorphosporo

in this investigation confirm the necessity to use bioassays that reproduce similar

conditions to the field situation. It also demonstrates the need to use a formulation that will

keep the antagonist dive in woody tissues by, for example, keephg high humidity on the

sturnp. Even if preîolonized and control rye grain treatments provided excellent protection

afler one month, they started to be less effective afier the two-month period. They showed

more variable results compared to P. gigantea treatment that was stable between sites and

periods. They were more dependent on the natural microflora and environmental

conditions. Development of an adequate formulation that will allow for survival, growth

and metabolite production into tissues by P. dimorphospora could be useful. Conclusions

drawn by this study must be applied with caution to stump treatments. Newly cut surfaces

of red pine stumps exude hi& quantities of resin which modifies wood status like its

moisture content. High resin content of pine stumps (Pinus sylvestris L., Pinus nigra var.

calabrica Schneid.) has been correla ted wi th increased resistance to infection (Meredith

1959).

Al1 treatments have been found to have an influence on the structure of the natural

mycoflora in red pine logs. This corresponds to the findings of Varese et al. (1998)

suggrsting the influence of biological treatments on the naturally occumng mycoflora of

Norway spruce stumps. The method used in this field test is a suitable mode1 for quickly

testing cornpetition effect on the success of a biological agent as qualitative f'ungal

populations present in logs are similar io ones found in stumps (Chapter 3). Evaluation of a

biocontrol agent should include tests to evaluate the impact of the treatment on the natual

rnicroflora of wood tissues or soi1 where it is to be applied. As we o b s e d , succession is a

complex system comprised of many different organisms. A better understanding of the

microflora is one of the first steps for the successful use of microorganisms. Some fun@

found in this study should be evaluated for their potential use as biocontrol agents.

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CHAPITRE 3

Étude de la mycoflore des souches de pin rouge : colonisation naturelie et colonisation

sui te au traitement avec Phfebiopsis gigantea

Dans cette étude sur la mycflore impliquée au début du processus de dégradation des

souches de pin rouge, seulement sept especes se sont avérées communes : Homonema sp.,

Tympanis sp 1 ., un basidiomycète inconnu B9, P. gigantea, Nectria sp., Trichodema spp. et

Rhinocladiella atrovirens. Des variations locale et saisonnière importantes dans la quantitb

et la variété des especes ont été observées. Les deutéromycètes ont dté retrouvés en plus

grande proportion que les autres groupes taxonomiques lors des phiodes d'échantillonnage

de 2 et 24 mois après la coupe. Les ascomycètes ont été importants dans le site de

Mulgrave. Les basidiomycètes, tout particulièrement l'incomu B9 et P. gzgantea, ont été

très présents lors de I'échantillonnage après une exposition de 12 mois et ce, de maniike

plus importante, pour la période de coupe de septembre. La présence naturelle de

P. gigantea a été remarquable dans la plantation de Bristol où la presque totalité des

souches ont été colonisées. Le traitement des souches avec ce champignon n'a pas changé

qualitativement la mycoflore mais a modifie la fréquence et l'abondance des autres espèces.

L'application artificielle a augmenté et a assuré la présence de P. gigantea partidiérement

dans les tissus en profondeur. Eue a &galement accé1M le processus de dCgradation des

souches qui s'est reflété par l'augmentation de la colonisation par Trichodemu spp. et

R. atrovirens.

3.1 INTRODUCTION

Le champignon Heterobasidion annosum (Fr.) Bref, considéré comme l'un des

champignons pathogènes les plus dévastateurs des plantations résineuses à travers le

monde, a été rapporté pour la première fois en 1955 dans l'Est du Canada, au sud de

l'Ontario (Hord et Quirke 1955; Woodward et al. 1998). Son aire de dispersion a progressé

vers le nord pour atteindre le sud du Québec, où il affecte principalement les plantations de

pin rouge (Pinus resinosa Ait.) (Laflamme et Blais 1995; Whitney 1988). Le nombre de

plantations infectées demeure encore très limité au Québec, justifiant ainsi une approche

préventive de lutte par le traitement des souches ûaîchement coupées, principale porte

d'entrée pour l'infection primaire d'un site (Laflamme et al. 1998; Rishbeth 195 1). Il existe

actuellement une méthode biologique, a la fois efficace et sécuritaire pour l'environnement,

pour lutter contre cette maladie. Il s'agit de I'utilisation du basidiomycète Phlebiopsis

giguntea (Fr. :Fr.) Jül. L'efficacité de cet agent de lutte est démontrée principalement sur

les souches de pin et il est déjà utilisé de façon opérationnelle dans quelques pays

européens pour limiter l'infection des souches de conifëres (Greig 1976; Korhonen et al.

1 994; Sierota 1 997).

En 1993, des travaux de recherche ont été entrepris dans l'Est du Canada, plus

spécifiquement au Québec, pour vérifier l'efficacité de souches indigènes de P. giganteu h

limiter l'introduction de H. annosum dans les plantations de pin rouge. Les rhltats

obtenus jusqu'à présent tendent à démontrer son potentiel comme agent de contrôle

préventif (Dansereau 1996; Chapitre 2). Phlebiopsis gigantea possède une distribution

mondiale mais il se retrouve tout particulièrement dans les forêts rdsineuses de

l'hémisphère Nord (Holdenrieder et Greig 1998; Korhonen et al. 1998). En Angleterre, il

est l'un des champignons les plus communs dans la colonisation primaire des souches de

pins (Pinus syfvestris L., Pinus nigra var calabrica Schneid) qu'il degrade rapidement

(Meredith 1 959; Meredith 1 960; Rishbeth 1963). Puisque I'introduction d'isolats exotiques

d'un agent de lutte biologique dans l'écosystème peut présenter un risque potentiel,

l'utilisation de souches indigènes est plus appropriée. Sous les conditions

environnementales prévaiant dans l'Est du Canada, il existe peu d'information sur

P. gigantea, encore moins sur son écologie sur le pin rouge. Basham (1957) a

ultérieurement fait mention de la présence fréquente de P. gigantea dans les troncs de pin

blanc (Pinus srrobus L.), de pin rouge et de pin gris (Pinus banksiana L.) dans les quelques

années suivant un feu. L'utilisation massive et efficace de cet agent de lutte biologique

requiert donc de nouvelles comaissances concernant son écologie sous nos conditions

environnementales. L'étude de la présence naturelle de P. gigantea se fera par le biais de

l'étude de la mycoflore indigène colonisant les souches de pin rouge fraîchement coupées

en prélevant des copeaux de bois de sections de souche à différents moments.

Un autre facteur a considérer pour l'utilisation efficace d'un agent de lutte biologique est la

présence de la mycoflore indigène colonisant le substrat. Un bon agent de lutte doit être

cornpetitif envers la mycoflore naturelle (Etheridge 1972). La présence de certaines espèces

peut compromettre le succès de la colonisation des tissus du bois (Schoernan et al. 1996;

Roll-Hansen et Roll Hansen 1980a). Mais à l'inverse, l'application artificielle d'un agent

peut engendrer des modifications du processus naturel de dégradation. Peu de travaux ont

démontré l'impact du traitement biologique des souches de conifëres sur la colonisation

naturelle par les micro-organismes (Meredith 1960; Varese et al. 1998). Nous avons

observé que l'application artificielle de P. gigantea réduisait la colonisation des bûches de

pin rouge par les autres espèces sans toutefois modifier la nature de la rnycoflore (Chapitre

2). il est donc intéressant de vérifier l'impact du üaitement P. gigantea sur la diversité des

mycètes dans les souches de pin rouge. De plus, peu de travaux ont fait l'étude descriptive

de la mycoflore indigène associée au processus de dégradation des souches de pin

(Meredith 1959; Meredith 1960). Cette étude amènera des kléments aidant a la

compréhension du phénoméne de succession lors de la dégradation et peut-être a la

découverte de nouveaux agents de lutte efficaces. Cette étude permettra également

d'entrevoir les effets secondaires reliés a l'utilisation massive de P. gtgantea.

Cette étude vise à acquérir des connaissances essentielles à l'utilisation de P. gigantea dans

les plantations de pin rouge de l'Est du Canada. Les objectifs spécifiques poursuivis sont

1) de déterminer la composition des mycètes indigènes impliqués dans la phase initiale de

dégradation des souches de pin rouge; 2) d'observer la présence naturelle de P. gigantea;

3) de déterminer l'impact de l'application artificielle de P. gigantea sur la mycoflore.

3.2.1 Culture du champignon

Une souche de P. gigantea, soit la Plû4, sélectionnée pour son potentiel de production

d'oïdies et son lieu d'origine, est utilisée lors des inoculations. Elle a &té isolée a partir

d'une hctification sur une souche de pin rouge dans une plantation du sud-ouest du

Québec (canton Harrington). La souche est conservée à 4OC sur un milieu gélosé a base

d'extrait de Malt (3%) (MEA) jusqu'au moment de son utilisation.

3.2,2 Sites d'essais

Les essais sont établis dans trois sites expérimentaux localisés dans des plantations de pin

rouge situées dans le sud-ouest du Québec soit la région de l'Outaouais. Les paramètres

principaux qui caractérisent les sites d'essais sont présentés au tableau 3.1.

3.2.3 Traitement des souches

Suite à des travaux d'éclaircie réalisés en 1993 dans chacun des sites d'dtude, des souches

saines sont sélectionnées pour les essais. Les interventions sont effectuées à trois périodes

diffhentes, soit en mai, juillet et septembre. Des périodes différentes de coupe sont testées

afin d'obtenir une idée plus complète sur la diversité des cbampignons et de vérifier la

présence de P. gigantea selon la saison. Afin de permettre la récolte de disques de bois, la

hauteur des souches a été d'environ 25 cm. Dans les 24 heures suivant I'abattage, deux

traitements sont appliqués, témoin (eau) et P. gigantea. L'inoculation du P. gigantea est

réalisée par l'application d'une suspension aqueuse d'oïdies sur la surface fhîchement

coupée des souches. La suspension est préparée en récoltant les oidies sur la surface de

plats de Pétri (MEA, 2%) d'une culture âgée de quatre semaines. La concentration est

ajustée afin d'appliquer 200 oïdies viables/cm2. Le traitement témoin consiste a vaporiser

de i'm sur les souches. Cg traitements se font à l'aide d'un vaporisateur manuel. Le volume

Tableau 3.1. Description des trois sites expérimentaux.

Site Latitude Longitude Zone Âge Densité D.H.S ' écologique (ans) (plantdha) (cm)

-

Bristol 45038'2St1 76O23'37" 2a 35 4450 18

Grenville 45O43'43" 74'42'06" 2a 26 1800 25

Mulgrave 4S044'1 5" 75O20'30" 2a 65 nd 30

- -- - - p. - - - - - - p.

' diamètre moyen a hauteur de souche b ad = non déterminé

total de liquide utilisé est déteminé en fonction du diamètre moyen des souches traitées

(Tableau 3.1). Le volume doit permettre de recouvrir la surface coupée. Le volume est de

30 mL pour les souches des sites Bristol et Grenville, puis 60 mL pour les souches du site

Mulgrave.

3.2.4 Méthode de récolte et évaluation de la colonisation

Pour déterminer la composition de la mycoflore dans les souches, la colonisation par les

champignons est évaluée 2, 12 et 24 mois après la coupe. Un dispositif aléatoire en bloc

complet, comprenant cinq blocs est utilisé dans les trois sites. Les rondelles, environ 10 cm

d'épaisseur, sont découpées des souches à la tronçonneuse et rapportées au laboratoire. De

nouvelles souches sont utilisées à chacune des récoltes. Les rondelles sont conservées a une

température de -20°C dans des sacs de plastique jusqu'au moment de l'examen. À ce

moment, la rondelle est d'abord fendue en deux suivant un diamètre déterminé au hasard a

l'aide d'une hache désinfectée, en partant de la surface inférieure pour éviter les

contaminadons. Par la suite, des copeaux de bois (1,s x 1'5 x 2'0 mm) sont retirés de la

nouvelle surface stérile à l'aide d'un scalpel sous une hotte a flux laminaire. Pour

l'échantillonnage après les périodes d'exposition de 2 et 12 mois, les prélèvements sont

effectués sur une face longitudinale le long du diamètre ii 02, I ,O et 3,O cm de profondeur.

Nous avons ajouté des prélèvements ê 5,Q cm pour les rondelles de 24 mois. A chacun des

niveaux, des copeaux sont pris à 0,2 cm de l'écorce, à 1,O cm, puis approximativement à

tous les deux centimètres jusqu'au centre. Le même scénario se répète sur le rayon opposé.

Le nombre de prélèvements varie en fonction du diamètre de la rondelle. Les prélèvements

sont effechés sans tenir compte du bois d'aubier ou de cœur. Une moyenne de 9, 11 et 14

prélèvements sont faits par niveau dans les plantations de Bristol, Grenville et Mulgrave

respectivement. Au total, nous avons effectué 6505 prélèvements dans 173 souches. Les

morceaux prélevés sont directement mis en culture sur deux milieux : MEA (2%) + 1 ppm

bénomyl (Maloy 1974) et MEA (2%) + 50 ppm pénicilline + 40 ppm chlortétracycline. Les

boîtes de Pétri sont conservées a la température de la pièce et sont observdes régulièrement

sur une pénode de trois semaines. La présence ou l'absence de micro-organismes est

relevée pour chacun des copeaux. Tous les champignons sont séparb, puis mis en culture

pure dans des tubes (MEA, 3%) et conservés à 4OC jusqu'au moment de l'identification.

Deux paramètres sont mesurés pour évaluer la colonisation, soient la fréquence (F) et

l'abondance (A) de chacun des champignons isolés. La fréquence équivaut au pourcentage

de souches dans lesquelles le champignon est isolé. L'abondance représente le pourcentage

d'isolements où le champignon est détecté par rapport au nombre d'isolements totaux

effectués pour tous les niveaux et milieux confondus. Une moyenne de l'abondance est

calculée pour chacun des sites. Nous avons également évalue la pénétration verticale des

principaux champignons à chacune des récoltes afin d'observer le comportement des ces

espèces. Pour ce, nous avons établi la moyenne des fréquences obtenues pour les trois sites

combinés en séparant chacun des niveaux de prélèvements. Finalement, pour une

compréhension globale de la colonisation, nous avons déterminé l'abondance relative (Ar)

de chacun des groupes taxonomiques. Elle correspond au pourcentage de l'abondance totale

d'un groupe sur le total des abondances des groupes pour tous les niveaux et milieux

confondus.

3.3.1 Composition de la mycoflore

Les patrons généraux de la fluctuation dans la présence des principales espèces isolées des

souches traitées ou non avec P. gigantea sont présentés pour les temps d'exposition de

deux mois (Tableaux 3.2 et 3.3), 12 mois (Tableaux 3.4 et 3.5) et 24 mois (Tableau 3.6). La

tiéquence et l'abondance y sont présentées pour chacun des sites, chacune des périodes de

coupe et d'échantillonnage. Globalement, nous remarquons que seules quelques espèces

sont isolées systématiquement au travers des périodes et des sites. il s'agit de

Hormonema sp., P. giganrea, inconnu B9, Tympanis sp. l et Nectria sp. A cette liste

s'ajoutent quelques espèces communes mais plus spécifiques à un site, une période de

coupe ou d'échantillonnage : Peniophora pseudo-pini Weres. & Gibson, Schizophylhm

commune Fr., Rhinocladiella atrovirens Nannf., Trichoderma spp., i n c o ~ u D2 et inconnu

Ms5. Nous constatons la présence accrue de P. gigantea dans les souches traitées avec la

suspension d'ordies en même temps qu'une diminution de certaines especes. L'analyse des

résultats est concentrée sur ces principales espèces fongiques. D'autres espèces, peu

abondantes, sont inclues dans la section sur les groupes taxonomiques.

3.3.1.1 Après deux mois d'exposition

Les prélèvements effectués dans les souches témoins soumises a la colonisation naturelle

révèlent que le deutéromycète Hormonema sp. est le champignon le plus commun

(Tableau 3.2). 11 est isole dans la totalité des souches et dans toutes les situations avec une

abondance variant entre 8,7 et 25,6%. Il est associé à une coloration gris bleu des tissus de

surface. A l'exception de la période de coupe de septembre, il est plus abondant dans les

souches provenant de Grenville et de Mulgrave que de Bristol. Le deuxième champignon, à

la fois fréquent et abondant, tout spécialement pour les périodes de coupe de mai et juillet,

est I'ascomycète Tympanis sp. 1. Ii est beaucoup plus commun dans la plantation de

Mulgrave où nous l'isolons dans la totalité des souches de mai et juillet avec une

abondance de 241 et 19,7% respectivement. Ceci est nettement supérieur aux données

obtenues dans les plantations de Bristol (A7,3%) et de Grenville (AS3,6%). Dans ces deux

plantations, il est globalement plus fréquent (F180%) dans les souches de la coupe de

juillet. Au troisième rang en importance, nous retrouvons un deuxième ascomycète, soit le

Nectria sp. Ii est Fréquent dans les sites de Grenville et de Mulgnwe pour la coupe de mai

(F260%) mais surtout de juillet (F280%). il est presque absent dans les souches de Bnstol.

Nous observons ensuite deux basidiomycètes d'égale importance : P. gigantea et inconnu

B9. Le premier est ûès commun à Bristol, surtout dans les souches de la coupe de mai

(F=100%, A=9,2%). II est moins abondant dans les deux autres sites. L'inconnu B9, quant

à lui, est plus commun dans les souches coupées en mai pour les plantations de Bristol

(F=60%, A=5,3%) et de Mulgrave (F=60%, A=3,6%). Dans la plantation de Grenville, il a

colonisé plus uniformément à chacune des trois périodes de coupe mais c'est dans les

souches coupées en juillet (F=60%, A=5,2%) qu'il est le plus commun.

Nous constatons aussi que certaines espèces sont spécifiques à un site ou à une période de

coupe. À Bristol, nous observons l'importance de P. pseudo-pini pour la coupe de juillet

(F=60%); alors qu'a Mulgrave, S. commune est fréquent dans les souches coupées en mai

(F=80%). De plus, nous remarquons que les Trichoderma spp. colonisent abondamment les

souches de Grenville coupées en juillet (F=80%, A= 10,4%). ils sont peu présents dans les

deux autres sites. Il s'agit majoritairement de Tnchoderma viride Pers. : Fr. et un peu de

Trichodema hanianum Rifai aggr. Globalement, nous observons une diminution de la

colonisation pour la coupe de septembre pour la majorité des espèces. Ce phénomène est

particulièrement observable pour le Nectria sp. (FG0%, MO,5%). Finalement, nous

notons qu'une gmde majorité des prélèvements ne sont pas colonisés, entre 49,6 et 78,9%.

Dans les souches traitées avec P. gigantea, la tendance démontre que Homonema sp. est

toujours l'espèce la plus commune (Tableau 3.3). Dans les souches de la plantation de

Bristol, nous remarquons une augmentation de son abondance par rapport aux thoins pour

les périodes de coupe de mai (A=26,9%) et de juillet (A=24,2%). Dans la plantation de

Grenville, nous dénotons plutôt une baisse. La deuxième espèce dominante est P. giganteu.

Tableau 3.2. Fréquence (F)a et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge témoins aprés deux mois d'exposition.

Bristol Grenviile Mulgrave

Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre

Zygornycetes

Mortierdlu isobeliina 20 0,7 O 0,0 O 0,O 20 0,7 Mortierella vinacea 20 0,7 O 0,O O 0,O O 0,O

Ascomy cetes

Ceratacystis spp, O 0,O O 0,O O 0,O 40 4,7 Necttiu sp. O 0,0 20 2,2 O 0,O 60 2,O 7)mpancS sp, 1 60 7,3 80 6,2 60 2,l 40 1,O Qmpanis sp.2 O 0,O O 0,O 20 0,7 O 0,O

Bisidiomycetes

Phlebiopsis giguntea 100 9,2 40 3,4 40 2,3 20 0,8 inconnu B9 60 5,3 20 0,8 O 0,0 20 1,O Inconnu B 1 0 O 0,O O 0,O O 0,0 O 0,0 Peniophorapseudo-pini O 0,O 60 3,1 O 0,O O 0,O ScAizophyIum commune O 0,O 20 1,1 O 0,O O 0,O

Deu t tromycetes

Acremoniumlfusidioides 40 2,3 O 0,O O 0,O O 0,0 Honnonema sp, 100 13,5 100 12,3 100 13,2 100 16,2 Penicillium spp. 40 2,4 O 0,0 60 3,9 20 0,s Rhinocladiella atmvirens 20 0.7 O 0,O O 0.0 20 0,8 mehodema spp. O 0,O O 0.0 O 0,O 40 1,9

Isoltments st&rües 100 72,8 100 75,6 100 78,9 100 73,6

Note : Les Ertquences et abondances sont exprimdes en pourcentage. Pour chacun des sites I périodes, n=5 Exccp(ion, n=4

Tableau 3.3. Fréquence (FIa et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge traitées avec P. gigantea dans les plantations de Bristol et Grenville après deux mois d'exposition.

Bristol Grenville

Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre

Zygomycetes

Mortierella kabellina Mortierella vinacea

Asco myce t es

Ceratocysris spp. Necfnà sp. M p a n i s sp. 1 TympanW sp.2

Basidiomycetes

Phlebiopsis gigantea Inconnu B9 inconnu B 10 Peniophora pseudo-pini SchizophvItr ni commune

Deu teromyce tes

Acremonium juidioides Honnonema sp. PeniciIIium spp. Rhinocladiella atrovirens Trichodema spp.

Isolements stériles

O O,o O 0,o O 0,o LOO 26,9 LOO 24,s 100 13,l 60 2,3 O 0,0 20 0,8 O 0,O 20 0,8 O 0,O O O,o O 0,o O 0,o

Note : Les tiéquences et abondances sont exprimdes en pourcentage, a Pour chacufl des sites / ptriodes, n=S

nt = non teste

Sa population augmente autant en fréquence qu'en abondance. Il est même très commun

dans les souches de Grenville pour la coupe de juillet (F=80%, A=10,4%) alors qu'il est

complètement absent dans les souches soumises à la colonisation naturelle. Tout comme

dans les souches témoins, nous observons une réduction importante de l'abondance de

P. gigantea pour la coupe du mois de septembre (A11,7%). Cette augmentation de la

présence de P. gigantea a Grenville est associée à une diminution de la présence de

l'inconnu B9, de Nectria sp. et de Tympanis sp. 1, alors que nous constatons une présence

plus appréciable des Trichoderma spp., Penicillium spp. et R. atrovirens. Ce phénomène

n'est pas observé à Bristol. Nous y remarquons plutôt l'augmentation importante de

N e c m sp. surtout dans les souches de la coupe de mai (F=100%), tandis que la population

de l'inconnu B9 et de Tympanis sp. l ne change que très peu. Un autre fait remarquable est

l'absence de tout autre basidiomycete commun. L'impact est très visible a Bristol pour la

coupe de juillet avec l'absence de P. pseudo-pini. Tout comme dans les souches témoins,

une forte proportion de copeaux, entre 48,O et 84,7%, n'est pas colonisée. Cependant, dans

la plantation de Bristol pour les coupes de mai et de juillet, nous observons moins de

morceaux stériles que dans les souches témoins.

3.3.1.2 Après 1 2 mois d'exaosition

Une première constatation est l'augmentation globale de la fiéquence et de l'abondance des

différentes espèces de champignon comparativement à deux mois d'exposition (Tableaux

3.4 et 3.5). Le nombre d'espèces avec une abondance supérieure à 3% est également plus

élevé. De plus, les souches autant témoins que traitées sont plus colonisées. Cela se traduit

par un nombre plus faible de copeaux de bois stériles, entre 15,7 et 46'2%. Dans les

souches témoins, le champignon le plus Fréquent et abondant demeure Hormonema sp.

(Tableau 3.4). 11 est présent dans la totalité des souches avec une abondance variant entre

16'1 et 28,8%. Son abondance est supérieure dans la plantation de Bristol. Le deuxième

champignon très commun est l'inconnu B9, il colonise la presque totalitk des souches à

l'exception de celles coupées en juillet. Dans les trois sites, la péiiode de coupe de

septembre favorise l'abondance (&16,9%) de ce champignon. L'ascomycète

Tympanis sp.1 occupe le troisiéme rang en importance. Ii est moins abondant dans les

souches coupées en septembre peu importe le site. Tout comme après deux mois, Mulgrave

est le site où il colonise le plus les souches (F=100%, k10,6%). Deux champignons se

partagent le quatrième rang. Le premier, P. gigantea. est particulihnent û6quent et

abondant dans la plantation de Bristol (F280%, A21 1,0%). Sa présence augmente dans les

souches de Grenville et de Mulgrave comparativement a ce qui a été observé après deux

mois d'exposition. Tout comme pour l'inconnu B9, il est plus abondant dans les souches

coupées en septembre pour tous les sites. Le deuxième à occuper le quahème rang,

l'ascomycète Nectria sp., colonise les souches avec une fréquence supérieure à 80 et 60%

pour la coupe de mai et de juillet respectivement, et ce pour tous les sites. Pour ces

pénodes, son abondance varie entre 5,2 et 22,4%. Il est beaucoup moins fréquent et

abondant dans les souches coupées en septembre (FS4O%, A12,2%).

D'autres champignons, un peu moins communs tout en étant plus spécifiques à certaines

périodes de coupe ou plantations, attirent tout de même l'attention (Tableau 3.4). D'abord,

le P. pseudo-pini demeure assa spécifique à la plantation de Bristol pour la coupe de juillet

(F=80%, A=17,0%). Nous constatons aussi que le Tympanis sp.2 colonise de manière plus

appréciable les souches coupées en mai et septembre. Il est plus commun à Mulgrave. De

plus, nous remarquons encore la forte présence des Trichdenna dans les souches de

Grenville pour la coupe de juillet (F=100%, A=17,9%). Leur fréquence augmente

également à Mulgrave (F240%). Une des différences avec la période d'exposition de deux

mois est la présence appréciable de R. atrovirens qui se retrouve jusque dans 80% des

souches de Grenville coupées au mois de mai. Nous remarquons aussi une augmentation

des champignons classes parmi les Ceratocystis (Pesotum sp., Hialocladiella sp.)

particulièrement dans les sites de Grenville et de Mulgrave. Ils ont été la plupart du temps

associés à des colonnes longitudinales noires. Nous avons également isolé Leptographium

procerum (Kendrick) M . J . Wingfield et Leptographium abietinum (Peck) M.L Wingfield et

un Phornopsis sp. A partir de ces colonnes.

Tableau 3.4. Fréquence (FIa et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge témoins après 12 mois d'exposition.

Bristol Grenville Mulgrave

M a i Juillet Septembre M a i Juillet Septembre Mai Juillet Septembre

F A F A F A F A F A F A F A F ~ A F A

Zygomycetes

Mortierella isabellina Mortierella vinacea

Ascomy cetes

Ceratocystis spp. Nectria sp. l)mpanis sp. 1 TjwJpanis sp.2

Phlebiopsis gigantea Inconnu B9 Inconnu B 10 Peniophora pseudo-pini &hizophylurn commune

Dtuttromycetes

Acmonium jicsidioides Honnonema sp. Penicillium spp. Rhinoc/adie/la atrovirens Tnchodema spp.

Isolements stérNes

Note : Les fréquences et abondances sont exprimées en pourcentage, Pour chacun des sites / périodes, n=S Exception, n=4

La mycoflore des souches traitées avec P. gigantea présente des ressemblances et des

différences avec celle qui est présente dans les souches témoins (Tableau 3.5). D'abord, le

Hormonema sp. demeure le champignon le plus commun. Il est présent dans toutes les

souches avec une abondance variant entre 13'6 et 36,1%. A Bristol et à Mulgrave, il est

plus abondant dans les souches traitées que dans les souches témoins. La différence

principale observée entre les deux traitements est l'augmentation générale de la fkéquence

et de l'abondance de P. gigantea qui se classe au deuxième rang des champignons les plus

communs. Ce phénomène est très remarquable a Grenville (F=100%, H I , 6 % ) . Tout

comme dans les traitements témoins, il est plus abondant dans les souches coupées en

septembre dans tous les sites. L'inoculation artificielle des souches du mois de mai à

Mulgrave n'entraîne pas une bonne colonisation de P. gigantea (F=4O%, A=2,6%). Elle est

tout de même supérieure a celle observée dans les souches témoins. Dans les autres

périodes et sites, l'abondance de P. gigantea varie entre 13,9 et 32,5%. Au troisième rang,

nous retrouvons le Tympanis sp. 1. Sa présence est essentiellement la même que pour les

souches témoins mais elle a augmenté beaucoup par rapport a une exposition de deux mois.

L'augmentation de P. gigantea est associée à deux baisses marquées (Tableau 3.5). La

première est celle de la présence de l'inconnu B9, particulièrement dans les souches des

sites de Grenville et de Mulgrave pour les coupes de mai et de juillet (&3,3%). Les

résultats sont plus variables dans les souches de Bristol. Nous y dénotons plutôt une

augmentation de sa présence, sauf pour la période de septembre. Néanmoins, il demeure

plus abondant dans les souches coupées en septembre pour tous les sites. La présence et la

diversité des autres basidiomycètes changent peu par rapport a celles des souches témoins.

il faut se rappeler qu'ils étaient absents dans les souches traitées après deux mois

d'exposition. La deuxième baisse constatée avec le traitement des souches est celle de la

présence de Neciria sp., tout spécialement dans la plantation de Grenville (FS60, k3,3%).

Dans les souches de Bristol, la baisse est importante pour la coupe de mai (A=4,7%).

Tableau 3.5. Fréquence (F). et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge traitées avec P. gigontea après 12 mois d'exposition.

Bristol Grenville hlulgrave

Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre Mai Juillet Septembre

Mortierella isabellina 20 1,s Mortierella vinacea O 0,O

Ceratocystis spp. O 0,O Necina sp. 60 4,7 Qmpanis sp. 1 80 6,9 Mpanis sp.2 40 3,4

Basidiomycetes

Phlebiopsis gigantea 100 13,9 Inconnu B9 60 13,3 Inconnu B 1 O 20 1,O Peniophora pseudo-pini O 0,O Schuophylum commune 20 0,O

Deuteromycetes

Acremonium ficsidioides O 0,O Homonema sp. 100 27,8 Penicillium spp, 20 1,5 Rhinocladiella atmvirens 40 3,2 lkichodewna spp, 20 7,7

Isolements stiriles 100 33,3

Note : LeJ wuences et abondances sont exprimées en pourcentage. ' Pour chacun des sites / périodes, n=5

nt = non testé

Une autre différence remarquable observée dans les souches traitées est l'augmentation de

plusieurs deutéromycètes, soit Acremnium ficsidiodes (Nicot) W . Gams, R. atrovirens et

Trichoderma spp. (Tableau 3.5). Cette augmentation est évidente dans la plantation de

Grenville. Comme dans les souches témoins, les Thkhodenna y sont principalement

représentés par le T. viride et le T. hanianum. A Mulgrave, nous obtenons égaiement du

Trichoderma pseudo-kongii Rifai. Dans les souches de Mulgrave, nous dénotons la

présence importante du Tympanis sp.2 pour la coupe de septembre (F=100%, A=9,0%). Il

était complètement absent des souches après deux mois d'exposition. Une autre

caractéristique qui est observée est la diminution de la présence des Ceratocystis spp. dans

les souches de Grenville et de Mulgrave alors que dans les souches de Bristol, ils

apparaissent. Finalement, il est clair qu'il y a moins de morceaux de bois colonisés dans les

souches coupées au mois de septembre que dans celles des deux autres périodes de coupe.

Ce phénomène n'est pas remarqué dans les souches témoins. De plus, il y a toujours moins

de copeaux stériles a Bristol comparativement aux deux autres sites.

3.3.1.3 Après 24 mois d'exposition

Les résultats obtenus dans les sites de Bristol et de Grenville proviennent des isolements

effectués dans les souches de la coupe du mois de mai jusqu'au niveau 5'0 cm de la surface

des rondelles (Tableau 3.6). Dans les souches témoins, Homunemu sp. et Tympanis sp. 1

sont les espèces les plus fréquentes (F=IOO%) et abondantes (A15,4%). Trois champignons

se partagent le troisième rang. Le premier, l'inconnu B9, est isolé dans les trois sites avec

une frequence d'au moins 80% et une abondance supérieure à 9%. Le second, P. gigantea,

est plus Fréquent et abondant dans les souches de la plantation de Grenville (F=100%,

A=14,0%) que dans celles de Bristol (F=60%, A=4,7%). Le troisième, R. atrovirens,

colonise 80% des souches avec une abondance supérieure a 8%. Plusieurs autres espèces

sont aussi fréquemment isolées: A.jusidioides, PhiaIuphoro lagerbergii, un

deutéromycètes inconnu D2 (surtout à Grenville) et un mycélium stérile inconnu Ms5. Ces

champignons étaient beaucoup moins communs après une exposition de 12 mois. Nous

remarquons également la faible présence de l'ascomycète Nectria sp. dans les souches

témoins. Finalement, l'abondance des prélèvements stériles est beaucoup plus 6levée dans

les souches de Grenville (A=42,6%) que de Bristol (A=28,6%). Une observation semblable

a été faite après 12 mois d'exposition.

Dans les souches traitées avec P. gigantea, la présence de Homonema sp. (FQ80%,

A2 10'7%) et de Tympanis sp. 1 (F280%, A210,6%) demeure supérieure aux autres espèces

(Tableau 3.6). Tout comme dans les souches témoins, la présence de P. gigantea, de

l'inconnu B9 et de R. afrovirens est sensiblement la même. Mais à ces trois espèces,

doivent s'ajouter les Trichoderma spp. Les deux sites étudiés démontrent un comportement

inverse quant à la présence de P. gigantea et de l'inconnu B9 dans les souches traitées.

Dans la plantation de Bristol, leur présence y est plus remarquable que dans les souches

témoins tandis qu'à Grenville nous constations une baisse. Nous n'observons pas

l'apparition de nouvelles espèces de basidiomycètes de manière importante. La

caractéristique la plus évidente qui est observée dans les souches traitées est l'abondance

élevée de plusieurs deutéromycètes, tout particulièrement R arovirens (A2 14,3%) et

Trichodema spp. (A218,2%). Ils sont tous plus abondants dans les souches traitées que

dans les souches témoins. C'est également le cas pour l'inconnu D2 et Ms5. Pour ce qui est

du Neciria sp., il est presque absent. Finalement, nous remarquons que l'abondance des

pr6lèvements stériles est moins élevée dans les souches traitées que dans les souches

témoins.

Tableau 3.6. Fréquence (F). et abondance (A) des principales espèces de champignons dans les souches de pin rouge témoins après 24 mois d'exposition pour la coupe du mois de mai.

Témoin P. gigantea

Bristol Grenville Bristol Grendie

Zygomyce tes

Mortierella isabellina Mortierella vhcea

Ascomycetes

Ceratocystis spp. Nectria sp. Tympanis sp. 1 Qmpank sp.2

Basidiomycetes

Phlebiopsh gigantea Inconnu B9 inconnu B 10 Peniophora pseudo-pini

Deuteromycetes

Acremonium fisidioides Homonemu sp. Penicillium spp. P hialophora lagerbergii RhinocfadiefIa atrovirens Trichodema spp, I n c o ~ u D2

Mycéiium stérile

COMU MU M s ~

Isolements stériles

Note : Les fidquences et abondances sont exprimées en pourcentage. a Pour chacun des sites / périodes, n=5

3.3.2 Pénétration verticale


Après deux mois d'exposition, nous constatons que les champignons sont présents

majoritairement au niveau 0,2 cm à la fois dans les souches témoins et traitées dans tous les

sites confondus (Tableau 3.7). Quelques-uns, Homonemasp., Nechia sp. et

Tympanis sp. 1, colonisent assez fréquemment le niveau 1 ,O cm dans les souches témoins

pour les périodes de mai (F226,7%) et de juillet (F242,9%). Dans les souches traitées, nous

remarquons généralement moins de Hormonema sp. à L,O cm et 3,O cm de la surface que

dans les souches témoins. En plus de ces champignons, nous observons que P. giguntea et

Trichloderma spp., ce dernier pour juillet uniquement, colonisent considérablement le

niveau 1.0 cm des souches traitées. De manière générale, très peu de champignons

colonisent les tissus à 3,O cm de la surface (F120%).

3.3.2.2 Après 1 2 mois d'exposition

Après 12 mois d'exposition, la colonisation par les champignons est assez uniforme sur les

trois niveaux (Tableau 3.8). Les champignons colonisent principalement les niveaux 0,2 cm

et 1,O cm. A la fois dans les souches témoins et traitées, nous remarquons la nette

proportion de Hormonema sp. B 0,2 cm avec une fréquence d'au moins 90%. Le

basidiomycète P. gigantea est aussi fréquent au niveau 0,2 cm que 1 ,O cm. Toutefois, il est

plus fréquent dans les niveaux 1,O et 3,O cm dans les souches traitées par rapport aux

souches témoins. L'inconnu B9 voit sa fréquence diminuée de beaucoup pour les niveaux

1,0 et 3,O cm dans les souches traitées (O%SFS33%) comparativement aux souches témoins

(14%IFS80%). Finalement, les Necnia sp., Tympanis sp.1 et R. atmvirens colonisent plus

abondamment les niveaux 1,O et 3,O cm autant dans les souches tho ins que traitées.

Tableau 3.7. Fréquence (%) des souches de pin rouge colonisées par niveau

pour les principaux champignons aprés 2 mois d'exposition.

Niveau Témoin P. gr'gantea (cm) M J S M a J S

Hormonema sp.

Phleblopsis gîgunrea

Inconnu 89

Nectria sp.

Tympanis sp.1

Rhinuciadieia atmvirens

Tràchoderma spp.

Nombre total de souches

Note : Les résultats repdsentent la combinaison des données des trois sites expérimentaux (Bristol, Grenville, ~ b l ~ r a v e ) dans le cas du traitement tdmoin et des sites de Bristol et Mulgrave pour le traitement P. giganrea, pour les périodes de mai (M), juillet (J) et septembre (S).

a Exception : site de Bristol uniquement

Tableau 3.8. Fréquence (%) des souches de pin rouge colonisées par niveau

pour les principaux champignons après 12 mois d'exposition.

Niveau Témoin P. gigPnteu (cm) M J S M J' S

Horrnonerna sp.

Phlebhpsis gigantea

Inconnu B9

Necma sp.

Tympank sp.1

Rhinocladieila uîrovirens

Triciioderma spp.

Nombre total de souches

Notes : Les résultats représentent la combinaison des donnkes des trois sites expérimentaux (Bristol, Grenville, Mulgrave) pour les @riodes de mai 0, juillet (J) et septembre (S).

a Exception : sites de Bristol et de Grenville uniquement

3.3.2.3 Après 24 mois d'exwsition

Après 24 mois d'exposition, nous constatons que la présence de Hormonema sp. est

pratiquement restreinte au niveau 0'2 cm, alors que la plupart des autres champignons sont

repartis sur les quatre niveaux (Tableau 3.9). Le Hormonema sp. est donc beaucoup moins

isolé dans les tissus en profondeur comparativement à une exposition de 12 mois. Les

P. gigantea et inconnu B9 sont eux aussi plus fréquents à 0,2 cm (F270%). Tout comme

nous l'avons observe après 12 mois, la fréquence de P. gigantea en profondeur (1, 3 et

5 cm) est plus élevée dans les souches traitées que dans les souches témoins. Nous

remarquons le même phénomène pour les Trichodema spp. Ces derniers sont plus

abondants au niveau 0,2 cm dans les souches témoins alors qu'ils sont répartis sur les

quatre niveaux dans les souches traitées. Aux niveaux 3,O et 5,O cm, nous observons

l'importance de la présence de Tympanis sp. l (F~40%) et de R. atrovirens (F>60%). Ils

sont légèrement plus fréquents dans les souches traitées. Par rapport a l'exposition de 12

mois, R. atrovirens et Trichoderma spp. sont beaucoup plus présents dans les tissus en

profondeur. Finalement, le Necnia sp. est plus fréquent au niveau 1 ,O cm dans les souches

témoins que dans les souches traitées où il est presque absent.

3.3.4 Composition des groupes taxonomiques de champignon

Les isolements effectués à l'intérieur du bois ont permis la détection de plusieurs espèces

de champignons et l'observation de leur comportement individuel. Pour amener une vision

globale de la colonisation, les différentes espèces sont regroupées ensemble selon leur

classement taxonomique et les résultats sont analysés en fonction de ces groupements.

Nous avons regroupé un certain nombre d'espèces secondaires sous le groupe mycélium

stérile » sans avoir cherché à pousser leur identification. L'abondance relative (Ar) de

chacun des groupes est présentée pour les périodes d'échantillonnage de 2 mois (Fig. 3.1 et

3.2), 12 mois (Fig. 3.3 et 3.4) et 24 mois (Fig. 3.5). Les résultats permettent d'observer une

variation selon la période d'échantillonnage, le site et la période de coupe.

Tableau 3.9. Fréquence (%) des souches de pin rouge

colonisées par niveau pour les principaux champignons après

24 mois d'exposition pour la période d'éclaircie de mai.

Niveau Témoin P. giguntea (cm)

Hormonema sp. 092 100,O 90,O 190 10,O 30,O 390 0,o 0,o 590 090 0 8

Phlebiopsk gigantea 42 80,O 70,O IBO 50,O 30,O 3,o 20,o 50,o 5 0 10,O 40,O

Inconnu B9

Neciria sp.

TympanCs sp.1

Tnkhoderma spp. 092 50,O 60,O 20,O 60,O

3.0 10,O 30,O %O 20,O 30,O

Nombre total de souches n=fO n=IO

Notes : Les résultats représentent la combinaison des données pour les sites de Bristol et de Grenville.

3.3.4.1 Aprés 2 mois d'exmsition

Le groupe des deutéromycètes est généralement celui qui domine dans les souches témoins

après deux mois d'exposition représentant un minimum de 35% des isolements (Fig. 3.1).

La seule exception vient de la plantation de Mulgrave pour la p6iiode de juillet où les

ascomycètes colonisent plus abondamment les souches (A~48,8%). La proportion

maximale occupée par les deutéromycètes est obtenue pour la période de septembre

(Ar163,5%). Elle s'associe à une diminution des ascomycètes (ArS13,6%). Dans les

souches des sites de Grenville et de Mulgrave, nous retrouvons très peu de basidiomycètes

(Ar112,7%) comparativement aux autres groupes peu importe la période de coupe. A

Bristol, cette proportion (Ar225,8%) est toutefois plus élevée, particulièrement en mai et en

juillet, les classant au deuxième rang. Dans tous les sites, la proportion des zygomycéies est

pratiquement négligeable (Ar<4,7%). Finalement, moins de 20% des isolements n'ont pu

être classés. Plusieurs des espèces composant ce groupe ne sont isolées qu'une seule fois.

Dans les souches traitées avec P. gigantea, nous observons essentiellement les mêmes

résultats sauf pour une diminution importante des ascomycètes en juillet dans les

plantations de Bristol (AS1 5'2%) et de Grenville (ArS4,9%) (Fig. 3.2). Cette baisse est

assodée à une augmentation de la proportion des deuteromycètes (Ar255,9%).

L'abondance relative des ascomycètes et des basidiomycètes varie d'un site ou d'une

période à l'autre mais ils sont toujours moins abondants que les deutbromycétes. La

proportion de basidiomycètes en mai a Bristol diminue par rapport aux témoins mais leur

abondance demeure plus importante dans ce site qu'à Grenville. Les zygomycètes, quant a

eux, occupent une proportion un peu plus élevée (1'5%-8,8%) dans les souches traitbes

que celle observée dans les souches témoins. Finalement, pour la coupe de septembre,

beaucoup de champignons sont isolés en très petit nombre et ne peuvent pas être classés

(&37,4%). Cependant, pour la période de juillet, moins de 2% des isolats ne peuvent être

classés.

Figure 3.1. Abondance relative des différentes groupes taxonomiques de champignons

après 2 mois d'exposition dans les souches témoins. (M=rnai, I=juillet, S=sep tembre).

M J S M J S M J S Bristol Grenville Mulgrave

Figure 3.2. Abondance relative des différents groupes taxonomiques de champignons après

2 mois d'exposition dans les souches traitees avec Phlebiopsis gigantea. (M=mai, J=juiiîet,

S=septembre, nmon testé)

hl J S M J S Bristol Grenville


Les prélèvements effectués dans les souches après 12 mois d'exposition révèlent beaucoup

de variation dans l'abondance relative des différents groupes selon les sites (Fig. 3.3 et 3.4).

Malgré tout, l'élément le plus frappant est la forte proportion occupée par les

basidiomycètes pour la coupe de septembre dans les trois sites autant dans les souches

témoins (Ar236,9%) que traitées (A222,5%). Ceci est nettement supérieur aux abondances

relatives obtenues après deux mois d'exposition. De plus, une diminution globde des

deutéromycètes est constatée (25,5%-6,4%). Il y a eu peu de différences entre les

souches témoins et traitées sauf pour une proportion légèrement supérieure de

deutéromycètes dans ces dernières. Dans les souches traitées de Bristol et de Grenville, les

coupes effectuées en mai et en juillet favorisent d'abord la colonisation par les

deutéromycètes, suivie des basidiomycètes et finalement des ascomycètes (Fig. 3.4). Les

résultats obtenus dans les souches de la plantation de Mulgrave pour la coupe du mois de

mai sont différents par le fait que ce sont les ascomycètes qui dominent

(21,3%<A646,3%). Tout comme apres deux mois, la proportion de zygomycètes est

négligeable (A&4,5%). Dans les deux traitements, nous obtenons moins de 15% de

champignons à mycélium stérile.

3.3.4.3 Avres 24 mois d'exposition

Après 24 mois d'exposition, l'abondance relative des deutéromycètes est la plus &levée

(Ar242,0%), autant dans les souches thoins que traitées (Fig. 3.5). Celle des autres

groupes varie beaucoup. De façon générale, les basidiomycètes sont moins abondants

qu'après 12 mois. A Grenville, ils sont plus importants dans les souches témoins

(Ar=25,2%) que traitées (Ar=9,3%), alors que dans la plantation de Bristol, ils sont

comparables. Les ascomycètes sont moins abondants (-6,3%) que les deutéromycétes.

Les zygomycètes sont peu présents avec une abondance légèrement plus élevée dans les

souches traitées (ArX3,9%), comme nous l'avons observé également après une exposition

de deux mois. Pour terminer, les champignons non classés représentent moins de 20% des

isolements.


12 mois d'exposition dans les souches témoins. (M=mai. I=juiIIet. S=septembre)

Mycelium stérile

O DeutBromycètes

Basidiomycètes O Ascomycétes 0 Zygomycètes


Figure 3.1. Abondance relative des differents groupes taxonomiques de champignons après

2 mois d'exposition dans les souches traitées avec Phlebiopsis gigantea. (M=mai, J=juillet,

S=septembre. nt=non testé)

Mycél ium stérile O Deutérornycétes

CP Basidiornycétes O Ascomycètes

O Zygomycètes



23 mois d'exposition dans les souches coupées au mois de mai selon le traitement.

U Mycélium stérile 0 Deutéromycètes

II) Basidiomycètes

O Ascomycètes

Bristol Grenville Bristol Grenville Témoin P. gigantea

3.5 DISCUSSION

Nous avons observé des variations locales et saisonnières importantes dans la quantité et la

variété des especes qui colonisent les souches de pin rouge. Des variations semblables sont

rapportées dans la littérature et se manifestent autant entre difTérents sites d'étude qu'à

l'intérieur d'un site (Basham 1965; Meredith 1959). La production et la distribution des

spores dans l'air, la compétition entre les champignons dans les tissus du bois fraîchement

exposés, les conditions physico-chimiques des tissus et les conditions météorologiques sont

tous des facteurs à considérer pour expliquer cette variation (Ginns et Driver 1970; Kallio

et Hallaksela 1979; Roll-Hansen et Roll-Hansen 1980b). La quantité limitée de souches

examinées ainsi que la méthode d'isolement utilisée ne permettent pas d'avoir une vision

entièrement représentative de la composition de la communauté fongique indigène

responsable de la dégradation des souches de pin rouge et l'impact de l'introduction

artificielle de P. giganrea. Cette vision correspond plutôt à des clichés figés dans le temps

et l'espace.

Malgré tout, le choix de la méthode d'isolement a été judicieux puisque, a l'exception de

quelques colonnes noires, du bruissement des tissus et d'indices de dégradation, il y avait

peu de zones caractéristiques dans le bois qui auraient pu nous permettre de détecter

différentes especes. De plus, seules des hctifications de P. gigantea et de S. commune ont

été observées sur les souches. La méthode de prélèvement a donc permis d'isoler des

champignons qui seraient passés inaperçus autrement. Chapela et Boddy (1988) ont

démontré que les isolements à partir de copeaux de bois permettent d'étudier la

composition du bois en champignon de manière plus fiable, surtout au début de la

colonisation de branches de hêtre attachées. D'autres travaux ont plutôt démontré

l'avantage de I'observation directe après incubation (Rayner 1 977). Cette technique a

toutefois le désavantage de révéler uniquement les espèces qui sporulent. Dans notre étude,

plusieurs espèces n'ont pas sporulé sur milieu MEA (3%) et méme sur des rondelles de pin

rouge stériles. Cependant, une des principales limites de notre méthode d'isolement est

d'avoir effectué des prélèvements uniquement sur un diamètre. Ainsi, nous avons fort

probablement passé a côté de certains champignons. Cette perte d'information ne semble

pas, par ailleurs, avoir affecté une description qualitative de la colonisation des souches de

pin rouge ni empéché d'entrevoir certaines tendances qui pourraient éventuellement faire

I'objet d'études plus approfondies.

3.5.1 Inventaire de la mycoflore naturelle

Les résultats obtenus dans cette étude confirment la sélectivité des tissus des souches

fiaichement coupées de pin (Rishbeth 1975). Seulement sept espèces se sont avérées

communes d'un site ou d'une période a l'autre : Hormotiema sp., Tvmpanis sp.,

inconnu B9, P. gignntea, Nectria sp., Trichuderma spp. et R. airovirens. Ce qui correspond

assez bien aux principales espèces obtenues dans les bûches de pin rouge (Chapitre 2). Sur

certains points, comme la présence de P. giganrea, de champignons causant le bleuissement

des tissus et de plusieurs espèces de champignons imparfaits, la mycoflore indigène

ressemble à celle obtenue par Meredith (1959, 1960) sur des souches de pin en Angleterre

et sur des souches d'épinette de Norvège (Picea obies L. Karst) en Italie par Varese et al.

(1998). Cette dernière association est principalement dû au fait que les auteurs ont

concentré leur étude sur I'isolement de champignons microscopiques. Une différence

importante entre ces études et la notre est la faible présence de Stereum sanguinolen~ttm

(Alb. & Schw.: Fr.) Fr. dans les souches de pin rouge.

Le deuteromycète Hormonema sp. est le plus commun des champignons isolés dans notre

étude. Le niveau d'inoculum est essentiellement le même dans les trois plantations mais au

départ il a semblé plus lent à coloniser les tissus dans la plantation de Bristol. Ce qui peut

probablement s'expliquer par la forte compétition exercée par P. gigantea. Au cours des

deux années d'observations, Hormonema sp. demeure essentiellement en surface. Roll-

Hansen et Roll-Hansen ( 1980b) ont fait une observation similaire avec Hormonema

dematioides Lagerb. & Melin; celui-ci colonisait principalement la région autour de la

blessure chez l'épinette de Norvège sans pénétrer plus profondément dans les tissus.

Comme le Hormonema sp. est prélevé principalement près de la surface de la découpe, il

est probable que la méthode d'isolement utilisée a entraîné une surévaluation de la

proportion occupée par ce champignon. En effet, il est possible qu'une partie des

champignons isolés trop près de la surface ne soit pas en phase active (Butcher 1968). Cela

expliquerait pourquoi nous avons isolé jusqu'à six espèces différentes sur le même copeau

de bois. Ce phénoméne se présente aussi quelques fois dans les prélèvements effectués à

proximité de l'écorce. À l'intérieur des tissus, rarement plus de deux espèces sont isolées

sur le même copeau. Malgré le fait que Hormonema sp. soit tres commun, au premier abord

il présente peu de potentiel comme agent de lutte biologique puisqu'il ne colonise que les

tissus situés à la surface des souches. Éventuellement H. annosum pourrait coloniser les

tissus en profondeur. C'est ce que laissent envisager des observations faites sur des bûches

de pin rouge (Chapitre 2). Des essais sur des souches devraient toutefois être réalisés pour

te démontrer.

Dans le groupe des basidiomycètes, deux espèces sont tres communes, le P. gigantea et

l'inconnu B9. Après 12 mois, les tissus ont montré des signes de dégradation (écorce se

détachant, coloration brunâtre des tissus) reliés au passage de ces champignons. Ces deux

basidiomycètes ont la capacité de coloniser les tissus profondément. La plus forte

colonisation observée dans les souches coupées en septembre après une exposition de 12

mois est vraisemblablement liée à la présence d'un inoculum naturel aérien très élevé à

cette période de l'année. Nous pouvons expliquer la faible proportion obtenue apres deux

mois d'exposition pour cette période par des conditions défavorables comme une

température moyenne trop basse pour permettre une colonisation suffisante des tissus

(Dansereau 1996). La majorité des champignons présente cette caractéristique. Ce qui

explique aussi le faible taux de copeaux colonisés a cette période. L'inoculum de l'inconnu

B9 est relativement uniforme dans les trois sites, ce qui signifie que ce champignon est très

commun dans notre environnement. L'utilisation de l'inconnu B9 comme agent de lutte

biologique contre H. annosum mérite d'être étudiée car il présente une écologie similaire au

P. gigantea. Le fait qu'il ne hctifie pas pourrait cependant limiter son efficacité a long

terme. Malheureusement nous n'avons pas pu identifier l'inconnu B9 jusqu'a présent. II n'a

hctifié ni sur les souches ni sur les débris environnants, ce qui en aurait facilité

l'identification. 11 semble donc que ce ne soit pas un champignon qui hctifie beaucoup

contrairement au P. gigantea qui, des le quatrième mois, commence à hctifier sur les

souches colonisées (données non présentées). Notre étude démontre qu'un inoculum naturel

de P. gigantea est présent de mai a novembre. 11 faut cependant être prudent avec la

concentration détectée car les plantations utilisées étaient, en plus de notre étude, des sites

d'essai pour comparer la capacité de colonisation de cinq isolats de P. gigantea (Dansereau

1996).

Quatre autres espèces de basidiomycètes, moins communes, démontrent une spécificité

pour un site ou pour une période: P. pseirdo-pini, inconnu B10, S. commune et

S sangtrinuienrim. Ces derniers ainsi que P. gigantea sont des saprophytes primaires de

coniféres qui, en colonisant la surface vierge fraîchement exposée, participent à la première

étape de dégradation des tissus (Basham 1965; Boyce 1966: Frankland 1998; Holmer er al.

1997; Vasiliauskas er al. 1996). Étant donné le comportement similaire observé pour

l'inconnu B9, nous pouvons l'inclure a cette liste de basidiomycètes pionniers. A ces

espèces pionnières vont succéder au cours des années d'autres basidiomycètes plus

performants dans la dégradation des tissus (Holmer et al. 1997; Renvall 1995). La

colonisation par ces nouvelles espèces se fait généralement à partir des racines ou des

parties enterrées à la base de la souche. Dans les souches de pin en dégradation, Meredith

(1960) a observé qu'à partir de la troisième année Hypholoma fascicuh.zre (Huds.) Fr. et

Tricholoma tutilans (Schaeff.) Fr. succèdent aux P. gigantea et S. sangrrinolentum. Nos

résultats tendent à confirmer le remplacement de P. gigantea. Après 24 mois, de nouvelles

espèces de basidiomycètes non identifiées commencent a coloniser les tissus déjà altérés et

nous observons une diminution de la présence de P. gigantea. Cependant, leur très faible

présence ne permet pas d'établir une hypothèse de succession. 11 faut noter qu'aucun isolat

de H. annosum n'a été prélevé dans cette étude même dans la plantation de Mulgrave ou

quelques foyers d'infection étaient connus.

Deux ascomycètes, Tvmpanis sp. 1 et Nectria sp., démontrent une présence importante. Ils

sont particulièrement communs dans les souches de Mulgrave mais également dans celles

de Bristol dans le cas du Tympanis sp.1. Ce dernier possède par ailleurs la capacité de

coloniser rapidement les tissus de pin rouge puisqu'il est déjà assez abondant après

seulement deux mois d'exposition. Étant donné que Tvmpanis sp. 1 et Nectria sp. colonisent

davantage les souches coupées en mai et en juillet, les maxima de présence aérienne de

spores sont probablement atteints a ces périodes. La faible colonisation obtenue lors de la

coupe du mois de septembre s'explique soit par une baisse d'inoculum ou soit par la

compétition trop forte exercée par d'autres champignons. Néanmoins, nous constatons

qu'une troisième espèce, le Tvmpanis sp.2, est présent presque essentiellement dans les

souches des éclaircies de mai et de septembre après 12 mois d'exposition. Il est possible

que d'un point de vue écologique, elle remplace les autres ascomycetes au mois de

septembre par une compétitivité supérieure envers les basidiomycètes, par un niveau

d'inoculum aérien très élevé ou encore par une meilleure adaptation aux conditions

environnementales prévalant à cette période. L'absence ou la présence réduite d'un

champignon a une période ou dans un site donné peut être reliées à la trop forte abondance

d'une autre espèce ou à des conditions environnementales non favorables (Kallio et

Halfaksela 1979; Meredith 1959).

Les Tvmpanis sp. 1 et Nectrici sp. sont de bons colonisateurs des tissus internes des souches

mais ils ne sont pas associés à des tissus dégradés. Les ascomycetes ne sont généralement

pas reconnus comme des dégradeurs de tissus de bois comme il a été démontré avec

Nectria fickliona Booth sur l'épinette de Norvège (Roll-Hansen et Roll-Hansen 1980b;

Vasiliauskas et al. 1996). Dans notre étude, le Tympanis sp.1 est l'un des rares

champignons à avoir colonisé les tissus du bois de cœur situés près du centre. Basham

(1 965) rapporte la colonisation du bois de cœur de pin gris par Tympanis hypopodia Nyl. en

Ontario. Très commun, il y causait principalement une coloration rouge des tissus sans être

associé à des tissus très dégradés. La très forte colonisation par les ascomycètes dans les

souches de Mulgrave s'explique peut-être par le fait que les arbres y sont plus âgés que

dans les deux autres plantations. La proportion occupée par le bois de cœur dans les

souches était généralement plus élevée que dans les autres sites (Dansereau 1996). La

présence de souches en décomposition provenant d'une éclaircie précédente pourrait

également être une hypothèse. Seule une analyse approfondie de ces souches aurait permis

de la valider.

Comme nous l'avons vu, les deutéromycètes très communs après deux et 24 mois, voient

leur présence diminuer après un an d'exposition. La seule exception est pour la période de

coupe de juillet où leur population demeure appréciable. Cela peut s'expliquer par la

présence moins importante des basidiomycètes à ce moment. Nous poumons en conclure

que les deutéromycètes sont moins compétitifs que les basidiomycètes. En plus du

Hormonema sp. qui colonise abondamment la surface, les deutéromycètes sont représentés

par un grand nombre d'autres espèces. Chacune de ces espèces possédant ses

caractéristiques écologiques propres, il n'est donc pas surprenant d'observer des variations

très importantes dans le temps et l'espace. Au début, la majorité des especes (Alternaria

sp., Cladosporiirm sp., Epiccocunl sp., Fusari~rm sp., Plzomopsis sp.) colonisent

essentiellement la surface des tissus de la souche. Peu d'entre elles pénètrent réellement à

l'intérieur. Ce sont, pour la plupart, des ubiquistes colonisateurs de substrats en

décomposition et dont les spores produites en très grande quantité germent rapidement

(Chapela et Boddy 1985). Toutefois, avec la progression du processus de dégradation des

tissus, certaines espèces ( R oirovirens, A. jiisidioides. inconnu D2, Trichoderrna spp.)

deviennent très communes h l'intérieur des tissus de la souche. La plupart de ces

champignons sont incapables de dégrader la lignine et la cellulose. Il est fort probable

qu'ils peuvent coloniser les tissus suite au passage des décomposeurs, P. gigantea et

l'inconnu B9, qui a permis de libérer des sucres facilement assimilables.

11 est reconnu que l'activité des décomposeurs primaires modifie les propriétés physico-

chimiques du bois, permettant la colonisation par de nouvelles espèces (Holmer et al. 1997;

Rayner et Todd 1979). Meredith (1960) a démontré que plusieurs champignons imparfaits

(Gfiocladirim spp, T. viride, Penicilliitrn spp.) ainsi que des zygomycètes (Mzicor spp.)

colonisent les tissus des souches de pin dégradés par P. gigantea et S. sanguinolenium mais

pas les tissus fraîchement exposés. Les Trichodema spp. sont également plus souvent

isolés dans les tissus de sapin Douglas (Pseiidotsliga menziesii (Mirb.) Franco) dégradés

par Phellinus weirii (Murr.) Gilb. que dans les tissus sains (Nelson et Thies 1985). Trois

espèces de Rhinocladiella NannE ont été rapportées par Rayner (1976) comme

colonisatrices des zones d'interaction observées dans les tissus de souches de feuillus. Ce

sont des zones foncées peu dégradées entre des régions beaucoup plus dégradées. Elles sont

le produit d'une réaction antagoniste entre des mycéliums de différents champignons

décomposeurs (Rayner 1977). Dans le cadre de notre étude, nous n'avons pas observé de

telles zones. 11 est probable que cela est relié au fait que la dégradation n'est encore qu'au

stade initiai. Il est intéressant aussi de remarquer que Basham (1965) a isolé R. afrovirens

dans le bois de cœur de pins gris vivants.

Les zygomycètes, le groupe le moins important, n'ont occupé qu'une très faible proportion

des tissus. Ils sont représentés essentiellement par deux espèces, soit M. isabellina Oudem

et M. vinacea Dixon-Stewart. Elles colonisent presque exclusivement les tissus près de la

surface ou de l'écorce. Il est dommage qu'elles colonisent peu les souches puisqu'elles ont

démontré un potentiel a limiter l'infection par le H. annosum dans des bûches (Chapitre 2).

II s'agissait d'un effet indirect relié au traitement des souches avec des grains de seigle.

Nous avons Fréquemment remarqué la présence de M. vinacea sur les hctifications de

P. gigantea lors de la récolte d'une banque d'isolats. Par ailleurs, ces deux espèces de

Moitiei*ella ont Fréquemment été isolées a partir de morceaux de bois d'épinette de

Norvège en même temps qu'un basidiomycète (Holdenrieder 1994; Metzler 1997).

En plus de la coloration gris bleu de la surface coupée de la souche, associée en majeure

partie a la colonisation par H m o n e m a sp., nous avons observé des colonnes

complètement noires colonisées par d'autres espèces de champignons de bleuissement qui

comprennent à la fois des ascomycètes et des deutéromycètes (Ceratocystisspp.,

Leptographium spp. et Phomopsis sp.). Ces colonnes étaient plus fréquentes dans les

souches de la plantation de Mulgrave pour l'éclaircie de juillet. Les températures plus

élevées durant cette période pourraient facilement en être une des causes. Roll-Hansen et

Roll-Hansen (1980a) ont montré la relation positive qui existe entre les périodes chaudes et

le transport de spores de Ceratocystis spp. par les insectes.

Comme nous venons de le voir, chacun des sites présente des caractéristiques propres au

niveau de la mycoflore naturelle. Une des caractéristiques de la plantation de Bristol est la

présence naturelle considérable de P. gigantea. Des débris et troncs laissés au sol lors

d'éclaircies antérieures ont favorisé une augmentation importante de I'inoculum naturel

(Boyce 1966; Chapitre 2). Ce champignon était très peu présent dans la plantation de

Mulgrave. Les conditions prévalant dans la plantation de Grenville ont facilité la

colonisation par les deutéromycètes, surtout les Trichoderma spp. Finalement, la plantation

de Mulgrave dont les arbres sont plus àgés que dans les deux autres sites présente une forte

colonisation par les ascomycétes. Le cours de la succession semble donc bien déterminé

dés le début par la quantité et le type d'inoculum présent initialement, ainsi que les

conditions environnementales.

3.5.2 Mycoflore des souches traitées avec P. gigantea

Le traitement des souches ne change pas qualitativement la mycoflore mais modifie la

fréquence et l'abondance des espèces. Des résultats comparables ont été obtenus dans des

essais réalisCs sur des bûches de pin rouge (Chapitre 2). D'autres études portant sur le

traitement des souches de conifères avec des inoculations artificielles de P. gigantea

présentent des conclusions similaires (Kallio et Hallaksella 1979; Meredith 1960). Un des

effets illustrés par notre étude est l'augmentation de la présence de P. gigantea dans les

souches, particulièrement dans les tissus en profondeur. La pénétration rapide des tissus

oftie un avantage compétitif important. L'inoculation artificielle permet d'assurer un

niveau suffisant d'inoculum surtout dans le cas de faible présence naturelle du champignon

comme nous avons pu le constater à Grenville pour l'éclaircie effectuée au mois de juillet.

Les trois périodes d'inoculation permettent d'obtenir une bonne colonisation des souches

par P. gigantea mais la période de septembre semble, au premier abord, plus favorable.

Deux hypothèses pourraient expliquer ce phénomène. L'hypothèse la plus évidente serait

celle d'une augmentation du taux de colonisation reliée a une présence naturelle élevée

pendant cette période. Cependant, sur la base d'observations faites après une exposition de

six mois sur des souches coupées en mai, il est plus juste de considérer une deuxième

hypothèse (données non-présentées). Celle-ci veut que P. gigantea ait déjà envahi les tissus

au-delà du niveau de $0 cm dans les souches traitées au mois de mai et juillet tout en étant

remplacé par d'autres champignons dans les niveaux inférieurs. Cela est relié à une

colonisation plus rapide au cours de la première année. Nous n'avons malheureusement pas

évalué la colonisation à une profondeur supérieure à 5,O cm qui aurait pu confirmer notre

hypothkse. Plusieurs facteurs présents dès la coupe peuvent expliquer le retard dans la

colonisation des souches coupées en septembre. Les températures fraîches à cette période

ralentissent la croissance de P. gigantea limitant ainsi son pouvoir compétitif puisque les

spores de nombreuses espèces s'accumulent en même temps sur les tissus de surface. La

force de cet agent de lutte est son pouvoir compétitif associé à une colonisation rapide des

tissus Fraîchement exposés.

Tout comme nous l'avions observé dans les bûches de pin muge, des tests d'incompatibilité

somatique ont indiqiié que presque tous les isolats provenant des souches traitées de

Grenville et de Mulgrave correspondaient à la souche appliquée (Chapitre 2; Roy el al.

1997). La seule exception observée dans la plantation de Grenville correspond à la période

de coupe de septembre où nous avons déterminé que certains des isolats provenant des

souches traitées ne correspondaient pas a la P 104 (données non-présentées). Pour le site de

Bristol, une bonne partie des isolats provenant des souches traitées ne correspondait pas au

P 104. Cela est sans aucun doute, comme nous l'avons déjà mentionné, la conséquence de la

forte concentration d'inoculum naturel. La grande majorité des isolats provenant des

souches témoins étaient différents de la souche P 104 utilisée dans le traitement.

La présente étude montre également l'impact important du traitement des souches avec

P. gigantea sur la colonisation des tissus par l'inconnu B9. La compétition entre les deux

champignons est très visible après une exposition de 12 mois ou la présence plus

considérable de P. gigantea dans les tissus entraîne une baisse de celle de l'inconnu B9.

Curieusement, l'effet est moins évident dans les souches de la plantation de Bristol ou le

P. gigantea est fortement présent naturellement. Il est probable qu'un équilibre naturel

établi entre les deux champignons en est l'explication ou encore qu'il y règne des

conditions plus favorables à la colonisation par l'inconnu B9. Néanmoins, ce dernier

colonise abondamment les souches traitées une fois la diminution de la présence de

P. gigantea observée après 24 mois. Cette disparition de P. gigantea est un phénomène déjà

expliqué précédemment et il est normal de l'observer au cours du processus de dégradation,

Par ailleurs, certaines espèces, principalement R. atrovirens et Trichuderma spp., sont

devenues beaucoup plus communes dans les souches traitées que dans les souches témoins.

Ce résultat suppose une dégradation plus avancée des souches traitées permettant a ces

champignons de coloniser les tissus plus rapidement. Les résultats obtenus plus rapidement

dans les souches traitées se comparent à ceux obtenus avec le temps dans les souches

témoins. Le traitement des souches amène donc une accélération du processus de

dégradation.

3.6 CONCLUSION

Cette étude a permis d'établir les bases de la compréhension du processus de dégradation

des souches de pin rouge. Il existe une grande diversité de rnycètes impliqués dans la phase

initiale du processus. Cependant, seulement quelques espèces sont retrouvées en forte

proportion. Cette diversité varie beaucoup en fonction des conditions environnementales et

de l'historique des sites d'études. La présence naturelle importante de P. gigantea ainsi que

ses effets sur la colonisation naturelle démontrent que son application artificielle ne nuirait

pas aux étapes subséquentes de dégradation mais accélérerait le processus. Ceci apparaît

comme un net avantage pour une utilisation efficace de P. gigantea. L'inoculation

artificielle des souches est nécessaire pour assurer un minimum d'inoculum. Elle est

particulièrement importante dans les plantations n'ayant subies aucune éclaircie mais

également lors des périodes où le niveau d'inoculum naturel n'est pas assez élevé. Cela

confirme des observations faites sur d'autres espèces de coniferes lors de l'application

artificielle de P. gigantea (Greig 1 976; Rishbeth 1963; Rishbeth 1975). Ces résultats

combinés à ceux du chapitre 2 laissent entrevoir le succès de cet agent de lune biologique

dans les plantations de pin rouge de l'Est du Canada. Il faudrait en confirmer l'efficacité

contre H. annosum par des tests réalisés sur des souches en y appliquant aussi le

champignon pathogène.

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CHAPITRE 4

Cornparison of RAPD technique and somatic incompatibiiity tests for the

identification of Phiebiopsis gigunteri strains.

L'incompatibilité somatique et l'amplification au hasard d'ADN polymorphe (RAPD) ont

été comparées pour réaliser le suivi de Phlebiopsis gigantea, un champignon utilisé comme

agent de lune biologique pour le contrôle de la maladie du rond causée par Heterobasidion

annosum. Dans l'ensemble, il y a eu concordance des résultats entre les deux méthodes. La

totalité des isolats incompatibles ont présenté des profils d'amplification différents tandis

que les isolats compatibles, à l'exceptions de deux, ont présenté des profils identiques. Les

essais d'incompatibilité et les profils d'amplifications générés par trois amorces dont nous

avons retenus 11 marqueurs ont p m i s de distinguer les trois souches testées sur le terrain

des 60 isolats provenant d'une population récoltée au Québec et en Ontario. Les deux

techniques ont également permis de démontrer clairement la présence des isolats inoculés

un an après le traitement. L'utilisation combinée des deux approches ofie un outil précieux

pour distinguer des isolats de P. gigantea afin de réaliser des études épidémiologiques sur

le devenir de cet organisme dans l'environnement.

4.1 INTRODUCTION

For the past thirty years, Phlebiopsis gigantea (Fr.) JÜl. has been used as a biological

control agent against the pathogenic fungus Heterobasidiun annosum (Fr.) Bref, which

causes a root and butt rot disease of conifers in temperate and boreal forests throughout the

northem hemisphere (Greig 1 976; Hodges 1 969). Heterobasidion annosum was first

reported in eastem Canada in 1955 infecting red pine (Pinus resinosa Ait.) plantations in

southern Ontario (Hord and Quirke 1955). The pathogen was first detected in Québec in

1989 in a thinned red pine plantation in the Outaouais region close to the Ontario border

(Laflamme and Blais 1993). The number of infected sites has since inmeased (Laflamme

and Blais 1995).

The basidiomycete P. gigantea is a very common saprophytic pine decay fimgus. It is a

strong cornpetitor and is one of the few successful biological controls used on a large scale

(Cook et al. 1 996). It is currently applied to conifer stumps afier logging in England (Greig

1976; Rishbeth 1975), Finland (Kurkela and Lipponen 1993), and Poland (Rykowski and

Sierota 1983) to prevent penetration of H annosum through the cut surface. Results from

field trials on red pine stumps have confirrned the potential use of P. gigantea as a

biocontrol agent against H. annosum in eastem Canada (Dansereau 1996).

Phlebiopsis gigantea is easily recognized in pure culture by the presence of oidial chains,

encnisted upright a e d hyphae, and multiple clamp connections (Stalpers 1978). However,

to get more pertinent infomation about its field performance, it is important to develop

techniques allowing the discrimination between introduced strains and naturally occwing

populations. This will allow confirmation of the establishment of introduced strains and the

monitoring of spread within the environment. A classical approach for identifjing different

fungal individuals is the use of somatic incompatibility (SI) testing. This test relies on a

selflnon-self rejection mechanism which is characterized by the formation of a reaction Iine

(barrage zone) between two different fungal straias when contionted on artificial media. SI

is a simple method used to trace the movement, population distribution and dispersal

mechanisms of many wood decay fùngi, and as a tool for identiwg individual dikaryon

genotypes (Adams and Roth 1967; Adaskaveg and Gilbertson 1987; Lewis and Hansen

199 1; Rayner et al. 1984; Wilson 199 1). Heterokqons of P. gigantea exhibit this reaction

under laboratory conditions (Korhonen and Kauppilla 1988).

More recently, the use of molecular markers has been investigated to diffeienciate between

individuals. Cornparison studies between SI systems and different molecular techniques

have been reported for several hngal species (Holmer et al. 1994; Jacobson et al. 1993;

Kohn et al. 1 99 1 ; Meijer et al. L 994; Mueller et al. 1996; Rivo et al. 1995; Rodrigues et al.

1995; Sen 1990; Stenlid 1985). The generation of DNA fingerprints using the randornly

amplified polyrnorphic DNA technique (RAPD) is particularly usefil since no prior genetic

knowledge of the target organism is required (Williams et al. 1990). RAPD markers have

been used by many authors to distinguish fungal species, races, pathotypes, and strains

(Garbelotto et al. 1993; Gosselin et al. 1995; Guthrie et al. 1992; Hamelin et al. 1996;

Jungehülsing and Tudzynski 1997; Raina et al. 1997; Smith et ai. 1992).

The objectives of this study were: 1) to distinguish introduced strains of P. gigantea fiom

the nanirally occuring population by SI tests, 2) to identify sets of genetic markers allowing

the discrimination of P. gigantea strains, and 3) to compare SI tests and RAPDs for their

potential use in monitoring the establisment and survival of introduced strains.

4.2 MATERIALS AND METHODS

4.2.1 Fungal strains

Three P. gigantea strains (P037, PO79 and P 104) collected in Québec were tested as

biological control agents in red pine plantations in the spnng of 1993 (Dansereau 1996).

They were compared to P. gigantea strains from three different populations. The first one

was composed of 60 strains randomly choosen fiom a naîural population collected in 1992

in Québec and Ontario. These dikaryotic cultures were obtained by plating clean

basidiocarp tissue fragments on to 2% Difco malt extract agar (MEA) amended with

benomyl (1 mg/L), penicillin-G (50 mg/L) and chlortetracycline (40 mg/L). AAer five days

of incubation under arnbient laboratory conditions (20-25'C), subcultures were made on

fiesh MEA and stored in test tubes at 4OC. The two other populations were collected one

year after the selected strains (P037, PO79 and P 104) had been applied. They comprised 20

and 21 strains isolated from wood chips collected fiom different stumps in two red pine

plantations located in the Grenville and Bristol cantons (Outaouais region, Québec)

respectively.

4.2.2 Somatic incompatibüity testing

Two 5 mm diameter inoculum plugs of each unknown dikaryon culture were cut fiom the

margins of actively growing colonies. The disks were placed 3 cm apart near the center and

to one side of a 9 cm Petri plate containhg MEA (1%). Two plugs fiom the test strains

(either P037, PO79 or P 104) were placed on the opposite side of the plate, 3 cm apart fiom

the first one (Fig. 4.1). Self-crosses (compatibility reaction) served as controls. Each

confrontation was repeated once and replicates of ten randomly chosen pairs were c b e d

out. Plates were incubated for three weeks at room temperature (20-2S°C), and mycelid

interactions were noted. Strains were classified as somatically incompatible if a reaction

line forrned between them (Fig. 4.1). This zone varied 60m very sttong to light. Paired

strains that did not form such a zone and whose mycelia grew ûeeIy together were

designated as compatible.

Figure 4.1. Pairings among strains of P. giguntea der tbtee weeks on 1% malt extract

agar. (A) Somatic compatibility between P367 and PO37 as indicated by intermingling

mycelia. (B) Somatic incompatibility as showed by forniaton of a reaction line between

PO79 and P037. Petri dishes (9 cm diameter) were used.

4.2.3 DNA extraction

Fungal stniins were grown in liquid culture at ambient temperature (20-25°C) in 250-mL

Erlenmeyer flasks containing 50 rnL of glucose media (6% glucose, 2% yeast extract). The

cultures were harvested three weeks afier inoculation. Each culture was filtered, washed

with sterile distilled water and lyophilized. The harvested and dned mycelium was ground

to a fine powder in liquid nitrogen using a mortar and pestle.

DNA was extracted using a modified version of the protocol developed by Zolan and

Pukkila (1986). Five hundred microliters of extraction buffei (700 mM NaCl, 50 m M Tris-

HCI (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% CTAB, 1% 2-mercaptoethanol) was added to

approximately 50 pL of dry powdered myceliurn and mixed to produce an homogenous

solution which was incubated at 60°C for 30 min, then mixed by vortex for 2 sec. The

mixture was emulsified by adding an qua1 volume of chloroform:isoamyl alcohol (24:1),

vortexing and centrifuging for 5 min at 12000 x g. Nucleic acid was precipitated fiom the

supernatant by adding an equal volume of isopropml (400 (IL). The precipitate was

pelleteci, then resuspended in 350 PL TE (1 0 rnM Tris-HCl (pH 8.0), 1 .O m M EDTA) and

re-extracted with an equal volume of chloroform:isoamyl alcohol (24: 1 ), vortexing and

centrifiiging for 5 min at 12000 x g. Finally DNA was precipitated by adding 150 pL of 7.5

M ammonium acetate followed by 900 pL of cold absolute ethanol and centrifùged. The

resulting pellet was washed with 70% cold ethawl, dried and resuspended in 50 PL of TE.

The concentration of extracted DNA was estirnated by comparing the band intensity of

samples on a 0.8% agarose gel to DNA standard.

4.2.4 DNA amptification

Amplifications were cmied out in volumes of 12.5 pL containing 10 mM Tris-HC1 (pH

8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgC12, LOO pM of each dNTP (Pharmacia), 0.5 units of Taq

DNA polymerase (Boehringer Mannheim Biochernica, Mannheim, Gerrnany),

approximately 10 ng of genomic DNA and 0.2 pM of oügonucleotide primas (10-mer kit

A, C or J, Operon technologies, Alameda, CA). Amplifications were pedormed in a Perkin

Elmer DNA thermal cycler (GeneAmp PCR System 9600) programmed for 45 cycles

following the method of Perron et al. (1995). Each cycle consisted of a denaturation step of

15 s at 94OC, followed by an annealing step of 15 s at 35°C with an extension step of 90 s at

72OC. The extension step of the last 25 reactions was progressively extended at a rate of 5 s

per cycle. The last cycle was completed with a 10 min extension at 72OC. Amplification

products were seperated by electrophoresis on gel containhg 0.5% Synergel and 1%

agarose in TPE buffer. The gels were stained with ethidiurn bromide and photographed

under UV light.

4.2.5 RAPD analysis

We screened 47 primers to identify polymorphic RAPD fragments that permitted

discrimination between the test strains (P037, PO79 and P104). Primers OPC-06 (5'-

GAACGGACTC3'), OPJ-05 (5'-CTCCATGGGG-3') and OPE09 (5'-TGAGCCTCAC-

3') (Operon technologies, Alarneda, CA) generated reproducible polymorphisms and were

retained. RAPD fragments were identifiai by the name of the primer and the size of the

DNA amplification product. Polyrnorphisms were scored as presence or absence of the

amplified fiagxnent. interpretation of banding patterns did not include band intensity. It was

assumeci that comigrating fiagxnents were homologous. Al1 RAPD amplifications were

repeated at least twice. The three test strains were included as positive controls in most

amplifications.

4.3.1 Somatic incompatibility

All pairings between dikaryotic cultures of P. giganteu from the natural population

(Québec/Ontario) sampled prior to inoculation and test strains (P037, PO79 and P104)

showed incompatible reactions characteristic of distinct genotypes (Table 4.1). A

continuum of interaction lines was observed. These varied fiom strong demarcation lines,

characterized by a dense myceliurn (sometimes yellow), to a diffuse zone without mycelia.

Some pairings exhibited a double line reaction. For this study, al1 of the various types of

interaction lines were regarded as dernonstrating incompatibility. Afier one week, most of

the incompatible reactions appeared macroscopically as a clear zone with a line lacking

mycelial growth. AAer three weeks, dense mycelia started to accumulate in the interaction

zone (Fig. 4.1). Al1 self-pairings were somatically compatible, characterized by non-

antago nistic intermingling colonies where the mycelia mixed fkeel y.

In conûast to the natural population studied, 14 strains originating from stumps that had

been inoculated in the Grenville plantation and 8 fiom the Bnstol plantation were

somatically compatible with one of the three test strains suggesting that they were

genetically identical (Table 4.1). Compatible pairings occured between al1 5 strains fiom

inoculated stumps in the Grenville plantation and the original cultures PO37 or P 104, and 4

out of 5 pairings for strains fiorn sturnps inoculated with P079. Strains 6om the Bristol

plantation showed fewer compatibility reactions: 2 out of 5 for P037, 1 out of 3 for PO79

and 5 out of 9 for P104. At both sites, strains from uninoculated (control) sturnps were

incompatible with al1 three test strains.

Table 4.1. Numbei of strains of P. gigantea showing compatible reaction and identical

RAPD fingerprint to the introduced test strains P037, PO79 and P 104.

SI RAPD

Treatment PO37 PO79 Pl04 PO37 PO79 Pl04

Grenville T37

T79

Tl04

Control

Bristol T37

T79

Tl04

Control

Note: Number of suains tested are in parenthesis. RAPD cornparisons were canied out using 9 markers for PO37 and 1 1 markers for PO79 and P 104.

4.3.2 RAPD analysis

Of the 47 primers tested OPC-06, OPJ-05 and OPJ-09 produced clear and reproducible

bands that allowed the three test strains to be distinguished from the 60 strains fkom the

nahiral population (Fig. 4.2). Three amplified DNA fragments for primer OPC-06, 3 for

OPJ-05 and 5 for OPJ-09 were selected as discriminating bands (Tables 4.2, 4.3 and 4.4).

Fragment OPJ-090.65 was monomorphic whilst the remaining 10 were polymorphic. The

primers produced 7 (A-G) distinct RAPD profiles for both OPC-06 and OPJ-05, and 8 (A-

H) for OPJ-09. To ensure that between-strain differences in RAPD profiles wcle not the

result of artefacts such as somatic mutations i n c d during liquid culture or passage in the

field, eight strains were inoculateci on to red pine wood discs under sterile conditions and

reisolated after four weeks. RAPD profiles and results fiom SI tests were identical before

and after passage in wood (data not shown).

While most markers were stable between repetitions, two were amplified in only a portion

of the repetitions. Markers OPJ-51.90 and OP~-090,80 were present in 75% and 80%

respectively of the amplifications for P037, and were considered unstable for that strain.

Thus, OPJ-05 pattern C or G and in the same manner for OPJ-09 pattern A or D were

considered to be equivalent for distinguishing PO37 (Tables 4.3 and 4.4). The other 9

markers were stable for the three strains. Al1 i 1 markers were stable between repetitions

and were used to differentiate PO79 and P 104.

None of the 60 strains obtained from the naturai population pnor to inoculation showed the

same banding pattern as the three test strains (Table 4.5). Combination of the three primers

allowed the 60 strains io be divided into 21 RAPD groups each containing 1 to 12 strains

with the same profile. The hi& number of diff'ent patterns revealed a great degree of

DNA polymorphism within the population. Combination of two profiles, J5-B and J9-F (8

markers), were sufficient to distinguish PO79 fiom al1 other strains, and profles C6-F

combined with J9-H (8 markas) ailowed Pl04 to be distinguished fiom the remaining

strains. Finally, it appeared that either profile I5-C or 1543 (3 markers) were sufficient to

distinguish PO37 fiom the population studied.

The DNA fingerprints obtaind for strains collected h m the Grenville and Bristol control

sturnps did not match any of the three test strains (Table 4.6). Fingerpnnts of PO79 and

P 104 were obtained from al1 strains compatible with them. Most of the strains that were

compatible with PO37 had identical RAPD patterns. However, the two unstable markers

(OPJ-5 1.90 and OPJ-90.go) present in the banding pattern of PO37 were always absent in the

profile of two compatible strains, P387 and P367 respectively (Table 4.6). A consmative

approach taking into account only 9 markers classed P387 and P367 as identical to P037.

Furthemore, only two strains, P409 and P467, that were incompatible with PO37 showed

the combination of markers OPJ-O5 1-48 and OP J-05 1 ~ 0 , represented by J5-C or J5-G

profiles (Table 4.6). These two strains could be separated 60m PO37 on the basis of their

banding patterns using OPC-06 and OPJ-09.

Figure 43. Gel electrophoresis of RAPD profiles of the test strains (PlW, P079, P037)

obtained with primers OPC-O6 (A), OPJ-05 (B), and OPJ-09 (C). The numbers on the left

are length of the bands considered in the analysis. Lanes "M" are 100 Base-Pair Ladder

(Pharmacia Biotech) molecular marker.

Table 4.2. RAPD patterns of P. gigantea for OPC-06 primer. - -- - - -

RAPD pattem Fragment size

A B C D E F G

Note: The presence or absence of a fiagrnent is specified by 1 or O respectively.

Table 4.3. RAPD patterns of P. gigantea for OP$-05 primer.

RAPD pattem Fragment size

Note: The presence or absence of a fragment is specified by 1 or O respectively.

Table 4.4. RAPD patterns of P. gigantea for OPJ-09 primer.

Fragment size RAPD pattern

A B C D E F G H

- -- --

Note: The presence or absence of a hgment is spccincd by 1 or O rcspcctively.

Table 4.5. RAPD profiles of P. gigantea strains used in shimps inoculations and of

strains from the natural population pnor to inoculation.

. -

RAPD profile

Stmin No.

Note: For banding pancms sec Tables 4.2,4.3 and 4.4. To simpliS, the table, "P" was omined fiom in front of each strain number.

"trains u s d in the initial inoculation.

Table 4.6. RAPD profiles and somatic incompatibility interactions with test

strains of P. gigantea strains from the population collected one year after

inoculation.

RAPD profile

Strain No. None PO37 PO79 Pl04

Note: For banding patterns see Tables 4.2,4.3 and 4.4. Strains with n u m b commcricing with 3 or 4 were obtained from stumps in the Grenville and Bristol plantations respectivdy. Strains tcrminating in 0, 5, 6 or 9, or 7 were obtained fiom control (watm), P079, Pl04 or PO37 trcatcd stumps respectively. To simpliQ the table, "P" was omitted fiom in front of each strain n u m k .

'(x) somatic compatibility, (-) somatic incompatibility.

Strajns showing identical pattern to PO79

Strains placed in the s m c group as PO37 when a more conservative approach was used (SCC

text).

* Strains showing identical pattem to P037.

Stntins showing identical paîtern to P 104.

4.4 DISCUSSION

Somatic incompatibility tests were easily carried out and were totally reproducible. A

similar interaction zone has been obsewed between pairing of heterogenic dikaryons of

other wood decay f'ungi (Adaskaveg and Gilbertson 1987). However, reaction lines did not

always display the same intensity of expression as in other basidiomycetes (Meijer et al.

1994). This phenomenon may be due to allelic difference at the vegetative-loci

(Anagnostakis 1982). For the purpose of ihis study, intensity was not taken into

consideration.

The formation of a demarcation line between fungal individuals is considered as supportive

evidence of distinct biologic entities (Rayner and Boddy 1986). Since no strains from the

natural population sampled pnor to inoculation (Québec/Ontario) were compatible with the

test strains P037, PO79 and P 104, it can be assumed that the strains used in our inoculations

represent unique or rare genotypes. In contrast, compatible reactions suggested that many

strains collected h m stumps inoculated in the Grenville and Bristol plantations were

probably identical to the test sûains. The presence of a high level of endemic P. giganfea in

the Bristol plantation following precommercial thinning could explain the lower nurnber of

compatible strains obtained £iom treated stumps compared to the Grenville plantation. Our

results imply that natural colonization occured in treated stumps. Morever, a high number

control stumps naîurdly colonized were obtained in the Bristol plantation compared to the

Grenville plantation where no previous thiMings had been carried out (Dansereau 1996).

These results are supported by observations made by Boyce (1966) in loblolly pine (Pinus

taeda L.) plantations in Georgia (U.S.A.). The author proposed the cutting of scattered

understory pines several months before a reguiar thinning to achieve a natural increase in

P. gigantea inoculum, and thus provide a control against H. annosum.

Although RAPD analysis and SI tests are as& to be based on unrelated genetic Cntetia,

in our study they yielded similar resuits. Incompatible strains had distinct RAPD profiles,

and the majority of compatible strains had identical profiles. The only exceptions were two

strains compatible with P037. These showed different RAPD profiles but only when non-

stable markers were considered. It is possible that these non-stable markers represent PCR

artefacts. Band instability may be caused by factors including poor discrimation by primers

between alternative priming sites of slightly different nucleotides sequences (mismatches),

DNA quality (presence of a contaminant) or concentration, and reaction components or

temperature conditions during amplifications (Tommerup et ai. 1995; Williams et al. 1990).

However, constant absence of the unstable bands in the profile of these two strains could

also imply some differences in their genome. Compatible reaction only indicates that the

strains have identical alleles at the vegetative loci but they may differ at other loci (Hansen

et al. 1993). in contrast, RAPD reflects the presence of polymorphic sequences in the entire

genome and provides more information on genotype relationships between strains

(Mazurier et al. 1992). This was demonstrated in work on the ectomycorrhizal fungus

Suillus granulatus (L. ex Fr.) Kuntze (Jacobson et al. 1993). The authors used RAPD

profiles to show that somatically compatible strains were often not genetically identical.

This situation may result when a population is composai of closely related individuais with

identical SI alleles but different background genotypes. In such cases, the use of SI testing

rnay be invalid when attempting to distinguish between di fferent genotypes. Unstable bands

must be considered carefulty since their interpretation can alter the conclusions drawn.

Additional markers are required to establish if the two strains are really distinct from P037.

This underlines the importance of primer choice and its impact on the value of the analysis.

Cornparison between other molecular techniques and SI tests also demonstrated a

correlation between methods. Mueller et al. (1 996) found complete concordance between SI

and amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis for symbiotic îüngi cultureci

by the fungus-growing ant Cyphomyrmex minutus (Attini: Formicidae). Polymerase chah

reaction analysis for Phellinzu tremulae (Bond.) Bond. & Borisov. (Holmer et al. 1994),

DNA restriction length polymorphisms markers for Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary

(Kohn et al. 1991), proteîn electrophoresis for Inonofus tomentoms (Fr.: Fr.) S . Teng

(Lewis and Hansen 199 l), and isoyme pattern for S u i l h spp. (Sen 1990) and H. annosum

(Stenlid 1985) also correlated with SI tests.

The markers used in the present study were selected to diffaentiate test strains fiom the

natural popuiation. Therefore, they may not necessarily provide an adequate representation

of the genome. Nevertheless, RAPDs demonstrated that the P. gigantea population prior to

inoculation was composeci of a large number of genetically distinct individuals. Similari ty

coefficients were calculated between RAPD groups using Jacquard's coefficient (Rohlf

1987). They revealed a higher similarity between strains P409 and PO37 (83%), than

between P409 and Pl04 (40%) ((results not shown). This was easily observeci by the

presence of P037-specific combination of markers in the RAPD profile of P409. These

results are possibly due to an error in the inoculation process or by mating behveen oidial

spores of the applied strain with P037, indigenous or other test strains. Propagules

contained in the oidial suspension originating fiom one heterokaryotic mycelium could

have been either hetero- or homokaryotic (Korhonen and Kauppila 1988). The latter may

have compatible mating types and therefore the capacity to form heterokaryons identical to

the onginal one. However, mating with member of the indigenous population and formation

of a different heterokaryon may also occur. Analysis of progeny fiom these heterokaryons

would provides answers to questions regarding their origin and be useful in ascertaining the

identity of inoculated P. gigantea used for biocontrol.

This study showed that both RAPDs and SI are useful techniques and that their combination

offers a valuable tool allowing discrimination betwecn different P. giguntea strahs and the

monitoring of the persistence and spread of introduced strains within the environment. This

is important in the research and developmental process prior to commercial use of

biocontrol agents (Cook et al. 1996). SI is a simple, f a reliable, and inexpensive, method

for discriminatîng between P. giguntea strains. It can be used as a rapid screening test to

separate distinct strains. However, it cm not be used to measure relatedness between

individuals and is not as powerful as RAPD for estirnating the degree of genetic variation

within a population. The development of strain-specific DNA markers would provide a

qui& diagnostic assay al10 wing faster identification of P. gigantea strains than SI. Both

methods allowed us to show clearly the presence of inoculated strains one year afier

treatment and the important colonization by naturally occuring isolates. This confirms that

the fungus P. gigantea is an effective and a highly cornpetitive primary colonizer, and may

explain its successful use as a biocontrol agent.

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CONCLUSION GÉNÉRALE

Dans cette recherche sur le développement d'un agent de lutte biologique contre

H. annosum, nous avons vérifié le potentiel de deux champignons : P. dimorphospora et

P. gigantea. Ce sont deux espèces bien différentes quant à leur écologie et leur mécanisme

d'action comme agent de lutte biologique. La première agit principalement par antagonisme

et la seconde par competition pour la niche écologique. Malgré l'efficacité de

P. dimorpiiospora démontrée in vitro et in vivo contre plusieurs agents pathogènes d'arbre,

bien peu était connu sur son potentiel d'utilisation contre H. annosuni (Yang et al. 1993).

Notre étude a montré que, sous des conditions contrôlées in vitro, P. dimorphospora inhibe

la croissance du champignon pathogène en colonisant les disques de pin rouge et d'épinette

de Norvège pour une période d'au moins six semaines et en y produisant des substances

antifongiques. Une application préventive de quelques jours assure une meilleure

performance. Ce qui correspond a des observations faites par Bernier et al. (1996) dans des

essais sur son potentiel d'utilisation pour lutter contre 0. ulmi. Comme le succès d'un agent

de lutte biologique repose sur plusieurs critères tel la capacité de coloniser le substrat à

traiter et d'y produire les métabolites inhibiteurs dans le cas d'un antagoniste, il semble que

P. dimorphospora possède les caractéristiques pour être un agent de lutte efficace.

Dans le test réalisé sur le terrain, P. dintorphospora applique sous forme d'une suspension

aqueuse de spores et de mycélium broyé n'a pas inhibé la colonisation par H. annosum de

bûches de pin rouge enterrées. Une mauvaise colonisation des tissus due à des conditions

environnementales défavorables à sa croissance ou à la compétition des micro-organismes

indigènes en sont les raisons principales. 11 a déjà et6 démontré que la cornpetition avec

d'autres espèces peut nuire au succès de la colonisation et, par le fait même, à l'efficacité

d'un agent de lutte biologique (Bruce et King 1986; Etheridge 1972; Merdith 1960;

Nelson et Thies 1985; Schoeman et al. 1996). Cependant, l'application de grains de seigle

pré-colonisés par P. dimorphospora a réduit de manière importante l'infection par

H. annosum après le premier mois d'exposition. Ces résultats s'expliquent surtout par la

production préaiable de substances antifongiques dans les grains qui ont par la suite diffus6

dans les tissus. L'efficacité a diminué au cours du temps faute d'une bonne croissance de

P. dimorphospora à l'intérieur des tissus et d'une production adéquate de métabolites.

L'utilisation d'une formulation appropriée favorisant une meilleure colonisation ainsi que

la production de substances antifongiques à l'intérieur des tissus s'avèrent nécessaire pour

une utilisation éventuelle efficace de ce champignon. Ces résultats laissent entrevoir la

possibilité d'utiliser les composés antifongiques comme moyen de contrôle.

Contrairement au P. dimorphospora, P. gigantea a montré une excellente adaptation aux

conditions envimnnementales qui prévalent dans l'Est du Canada. L'isolat utilisé a colonisé

rapidement les tissus de pin rouge; autant ceux des bûches que ceux des souches. Il a

également complètement inhibé la colonisation des bûches par H. annosum. Dans une autre

étude, quelques isolats de P. gigantea ont aussi démontré leur potentiel a coloniser les

souches (Dansereau 1996). Nous pouvons donc supposer que, suite à une bonne

colonisation des tissus, P. giganteu préviendrait 1 'infection aen e ~ e des souches par le

champignon pathogène. Certains travaux effectués sur des souches de pins ont démontré

cette relation (Greig 1976; Meredith 1960; Rishbeth 1963).

La comparaison de la méthode d'incompatibilité somatique et des marqueurs RAPD, a

indiqué que la première est une méthode moins dispendieuse et plus rapide pour

discriminer les différentes souches de P. gigantea, par le biais de la formation d'une zone

d'interaction caractéristique. Cependant, deux individus ne formant pas cette zone

pourraient tout de même être différents génétiquement. Dans l'éventualité d'une étude plus

approfondie sur la population de P. gigantea, la méthode moléculaire serait toutefois plus

appropriée car elle permettrait d'évaluer les variations génétiques entre les individus. Ces

deux méthodes combinées sont des outils utiles pour effectuer des études sur le devenir des

souches de P. gigantea introduites dans l'environnement. C'est un élément important du

processus de développement commercial d'un agent de lutte biologique (Cook et al. 1996).

Les tests d'incompatibilité somatique ont révélé la forte présence d'inoculum naturel de

P. gigantea autant dans les bûches que dans les souches. Tout comme l'avait observé

Boyce (1966)' la présence de débris au sol issus d'une coupe antérieure augmente la

population naturelle du champignon.

Fait non surprenant, des variations locales et saisonnières importantes dans la quantité et la

variété des especes qui colonisent les souches de pin rouge ont été observées. Certaines

especes se sont avérées très communes: Homonema sp., Tympanrî sp., i n c o ~ u B9,

P. gigantea, Nectrin sp., Tnchoderma spp. et R. ntrovirens. Des observations similaires ont

été faites pour les bûches à la différence que nous y avons isolé également un grand nombre

de zygomycètes (Mortierella spp., M. hiemalis). Les différences entre les deux types de

tissus de pin rouge s'expliquent essentiellement par l'état physiologique et le niveau

d'humidité différents des tissus à coloniser. Les tissus des bûches sont morts alors que

certaines portions des souches demeurent vivantes même après deux ans grâce aux greffes

entre les racines. Les especes isolées ont montré une écologie spécifique autant au niveau

de la colonisation que de la période où elles colonisent. Une des caractéristiques les plus

évidentes correspond à la colonisation abondante par la plupart des basidiomycètes suite à

la coupe effectuée au mois de septembre. Cela correspond sûrement à une forte quantité de

spores aériennes appartenant à ce groupe taxonomique durant cette période. Certaines

caractéristiques des sites ont semblé influencer la colonisation. La plantation de Bristol

s'est distinguée par une population élevée de P. giganteu occasionnée, comme nous l'avons

déjà mentionné, principalement par la présence de débris au sol recouverts de

fhctifications du champignon. Nous avons aussi constate que les conditions prbvdant dans

la plantation de Grenville ont favorise la colonisation par les deutéromycètes, surtout les

Trichoderma spp. Finalement, la plantation de Mulgrave dont les arbres étaient plus âgés a

présente une forte colonisation par les ascomycètes. Le cours de la succession semble donc

fortement influencé par la quantité et le type d'inoculum présent initialement, ainsi que par

les conditions enviromementales. Pour bien comprendre le processus de dégradation, il

serait préférable de réaliser une étude plus approfondie car les résultats obtenus avec la

technique utilisée correspondent plutôt à des clichés figés dans le temps et l'espace.

Les différents traitements appliqués sur les bûches ou les souches ont eu une influence sur

la colonisation des tissus. ils n'ont pas changé la nature de la mycoflore mais ont modifié la

fréquence et l'abondance des différentes espèces. Dans certains cas, cette modification a eu

un impact sur l'efficacité du traitement. Par exemple, l'application de grains de seigle pré-

colonisés par P. dimorphospora a réduit la présence de l'ensemble des basidiomycètes

incluant P. gigantea et l'inconnu B9. Cet impact est principalement associé à la présence

plus importante des deutéromycètes et des zygomycètes. L'inoculation artificielle de

P. gigantea a, bien entendu, augmenté la population de ce dernier mais en même temps a

réduit la présence des autres espèces, particulièrement dans les bûches. L'inoculation

artificielle assure un niveau suffisant de colonisation pour empêcher l'infection par

H. annosum (Greig 1976; Rishbeth 1963). Le traitement des souches avec P. gigantea

serait donc très utile dans les plantations de pin muge particulièrement celles qui ne sont

pas déjà infectées par H. onnosum. De plus, ce traitement a accéléré le processus de

dégradation des souches qui s'est reflété par une augmentation de la présence, entre autre,

de plusieurs deutéromycètes tels Trichoderma spp. et R. atrovirens. Étant donné que

P. gigantea est présent naturellement, son application artificielle ne nuirait pas aux étapes

subséquentes de dégradation des souches de pin rouge mais accélérerait le processus. 11

apparait donc comme le traitement le plus approprié au stade actuel de développement d'un

agent de lutte biologique contre la maladie du rond sur le pin rouge.

Quelques questions sont soulevées suite à ces travaux de recherche réalisés dans le but de

développer un moyen de lutte biologique efficace contre E t annosum. Elles pourraient faire

l'objet d'études plus approfondies :

1) Développer une formulation adéquate pour l'utilisation efficace de P. dimorphospom;

2) Évaluer le potentiel d'utilisation des substances antifongiques comme méthode de lutte;

3) Confirmer l'efficacité de P. giganteu a inhiber l'infection de H. annosum sur les

souches;

4) Développer une formulation pour assurer la colonisation par P. gigantea lors de pendes

moins propices à sa croissance.


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DE ANNOSUM - Library and Archives Canadacollectionscanada.gc.ca/obj/s4/f2/dsk2/ftp02/NQ43109.pdf · Line Asselin, Martine Blais, Robert Blais, Martine Cormier et André Dansereau