Définition de la Biotechnologie Lutilisation dorganismes, de cultures tissulaires, de cellules vivantes ou denzymes cellulaires pour fabriquer un produit

Définition de la BiotechnologieDéfinition de la Biotechnologie

L’utilisation d’organismes, de cultures tissulaires, de cellules vivantes ou d’enzymes cellulaires pour fabriquer un produit défini.

Source: Evens, R. P., Witcher, M., Source: Evens, R. P., Witcher, M., Therapeutic Drug MonitoringTherapeutic Drug Monitoring 1993; 15:514-520 1993; 15:514-520

BiothérapieBiothérapie

• Définition : Utilisation des produits de biotechnologie pour le diagnostic ou le traitement des maladies

– Corriger les déficits de substances endogènes

– Stimuler les processus physiologiques naturels

– Bloquer les protéines ou les acides nucléiques non fonctionnels

1953

Découverte de la structure de l’ADN

’73 ’75

Productiond’anticorps

monoclonaux

’82

Approbation de l’insuline recombinante

’61–’65

Identification du code génétique

A T

C

T

A

T

C

T

G

G

A

G

T

G

T

G

A

A

C

C

’77

Introduction

de la PCR

’86

Produits biologiques approuvés

pour l’utilisation

clinique

Fin des années 80 et 90

Petitesmolécules

Chimie combinatoire

Génomique

Thérapiegénique

Clonage d’un gène humain

CT A G GC

G T A A T

T G C T A

Evolution de la BiotechnologieEvolution de la Biotechnologie

Clonage de l’ADN

MédicalMédical RechercheRecherche AgricultureAgriculture EnvironnementEnvironnement IndustrieIndustrie

Impact de la Biotechnologie sur la sociétéImpact de la Biotechnologie sur la société

11

Cellule Cellule humaine et humaine et noyaunoyau

ChromosomesChromosomes

–– 23 maternels, 23 maternels, 23 paternels23 paternels

–– Femmes : XXFemmes : XX

–– Hommes : XYHommes : XY

4646

3 MILLIARDS3 MILLIARDSde paires de de paires de nucléotidesnucléotides

30.00030.000à à

100.000100.000gènesgènes

Chromosomes, Gènes, ADNChromosomes, Gènes, ADN

Le principe fondamental :Le principe fondamental :L’ADN fabrique l’ARN qui synthétise la protéineL’ADN fabrique l’ARN qui synthétise la protéine

TraductionTraduction

TranscriptionTranscription

ProtéineProtéine

Protéine complèteProtéine complète

RibosomeRibosome

Acidesaminés

GlycosylationGlycosylationPliagePliageCross-linkingCross-linking

ADNADNcellulairecellulaire ARNmARNm

NoyauNoyau

ARNmARNt

SécrétionSécrétion

UUU Phe UCU SerUUC Phe UCC SerUUA Leu UCA SerUUG Leu UCG Ser

CUU Leu CCU ProCUC Leu CCC ProCUA Leu CCA ProCUG Leu CCG Pro

AUU Ile ACU ThrAUC Ile ACC ThrAUA Ile ACA ThrAUG Met ACG Thr

GUU Val GCU AlaGUC Val GCC AlaGUA Val GCA AlaGUG Val GCG Ala

UAU Tyr UGU CysUAC Tyr UGC CysUAA Stop UGA StopUAG Stop UGG Trp

CAU His CGU ArgCAC His CGC ArgCAA Gln CGA ArgCAG Gln CGG Arg

AAU Asn AGU SerAAC Asn AGC SerAAA Lys AGA ArgAAG Lys AGG Arg

GAU Asp GGU GlyGAC Asp GGC GlyGAA Glu GGA GlyGAG Glu GGG Gly

ARNmARNm TRADUCTIONTRADUCTION ProtéineProtéine

Le code génétiqueLe code génétique

A U C C G A A U AAGGG A U A A C G U A GC

IIe

Arg

IIe

Arg

Arg

Gly

Asn

Asp

““Gène” sur le Gène” sur le chromosome (ADN)chromosome (ADN)

ChromosomeChromosome

ARNmARNm

pré-ARNmpré-ARNm

ProtéineProtéine

TranscriptionTranscription

TraductionTraductionSéquence de têteSéquence de tête

Intron 1Intron 1 Exon 3Exon 3Exon 2Exon 2Exon 1Exon 1 Intron 2Intron 2

SplicéosomeSplicéosomeSéquence de terminaisonSéquence de terminaison

Introns et Exons dans la transcription Introns et Exons dans la transcription des gènesdes gènes

Principales techniques de la Principales techniques de la BiotechnologieBiotechnologie

• Technologie de l’ADN recombinant

• Anticorps monoclonaux

• Blocage des nucléotides (anti-sens)

• Thérapie génique

• Amplification en chaîne par polymérase PCR

• Chimie combinatoire

• Modelage moléculaire

• Chimie des hydrates de carbone

• Génomique

• Chimie des petites molécules

1. Isolement 2. Clonage 3. Production du gène et expression de protéines

Plasmide Clones

Enzymes de restriction Milieux de culture

Ligase Fermenteur

Promoteur/amplificateur Flacons cylindriques

Lieur (DNA linker) Chromatographe

Cellule hôte

Outils de la technologieOutils de la technologiede l’ADN recombinantde l’ADN recombinant

Gène

Transcriptase inverse

Polymérase

Sonde d’ADN

Site de coupure par l’enzyme

Escherichia coli

Haemophilus aegyptius

Thermus aquaticus

Desulfovibrio desulfuricans

Providencia stuarti

Microcoleus stuarti

Origine de l’enzyme

EcoRI

Hae III

Tag I

Dde I

Pst I

Mst II

Nom de l’enzyme Ex. de digestion par EcoRI

GG

CC

AA

TT

AA

TT

TT

AA

TT

AA

CC

GG

GG

CC

GG

CC

CC CC

GG GG

TT

AA

CC

GG

GG AA

CC TT

CC

GG

TT

AA

NN AA

NN TT

GG

CC

CC

GG

CC

GG

TT NN

AA NN

AA

TT

GG

CC

GG

CC TT GG CC AA GG

GG AA CC GG TT CC

Endonucléases de restriction : Endonucléases de restriction : Des enzymes qui coupent l’ADN au niveau de sites spécifiquesDes enzymes qui coupent l’ADN au niveau de sites spécifiques

GG

CC TT TT AA AA

GGCC

TTTT

AAAA

Eco

RI

Eco

RI

Pst I

EcoRIHind II

Sma II

Polylieur

Site de clonage

Opérateur

Promoteur

Origine

Résistanceà l’ampicilline

Plasmides : Vecteurs pour le clonage Plasmides : Vecteurs pour le clonage et l’expression des gèneset l’expression des gènes

Bam HIRésistance

à latétracycline

Transcriptase inverse

Bibliothèquegénomique

Séquençage des acides

aminés

Gène souhaité

Protéine

ARNm

Sonde d’ADN

ADN

Option 1

Option 2

Option 3

Synthèsede l’ADN

Etape 1 : Isolement du gèneEtape 1 : Isolement du gène

Plasmides

Enzymes de restriction

Amplificateur/promoteur

Protéine souhaitée

ADN ligase

1. Gène souhaité incorporé dans le vecteur

2. Transfert du vecteur dans la cellule-hôte

Lien d’ADN

Gène

3. Clonage/expression de la protéine souhaitée

Etape 2 : Clonage et ExpressionEtape 2 : Clonage et Expression

Inoculat

Culture cellulaire

Purification

Formulation Galénique

Banque cellulaireFlacon en T

Flacon agitateur Fermenteur

Flacons cylindriques d’inoculat

Flacon cylindrique Phase de croissance

Changement de milieu

Cycle 1 de production

Changement de milieu Récolte 2


Récolte 1

Concentration/diafiltration Protéine bruteen vrac

Chromatographie sur colonneProtéine brute décongelée Filtration stérile

Protéine purifiéeen vrac

Ampoules prêtes à l’emploi


Tampon et stabilisateurs

Etape 3 : Production de protéine Etape 3 : Production de protéine Cellules de MammifèreCellules de Mammifère

Banque cellulaireFlacon en T

Flacon agitateurFermenteur

Inoculat





CentrifugationPâte cellulairebrute en vrac

Pâte cellulairebrute en vrac

Chromatographiesur colonne

Filtration stérile



Tampon et stabilisateurs Ampoules prêtes à l’emploi

Inoculat

Culture cellulaire

Purification

Formulation Galénique

Destruction des cellules

DestructionDes vacuoles

Etape 3 : Production de protéine Etape 3 : Production de protéine Souche microbienneSouche microbienne

Banque cellulaire

Flacon en TFlacon agitateur Fermenteur

Flaconscylindriques

d’inoculat

Etape 3a : InoculationEtape 3a : Inoculation

Flacon cylindriquePhase de croissance


Cycle 1de production

Changement de milieu Récolte 2


Récolte 1

Concentration/diafiltration Protéine bruteen vrac

Etape 3b : Culture cellulaireEtape 3b : Culture cellulaire

Chromatographie sur colonne

Protéine brutedécongelée

Filtration stérile


Etape 3c : PurificationEtape 3c : Purification

Ampoules prêtes à l’emploi

Protéine purifiée en vrac

Tampon et stabilisateurs

Etape 3d : FormulationEtape 3d : Formulation

8+ tests8+ tests

Par exemple : Par exemple : Caryotype, Caryotype,

criblage criblage d’infectiosité/ d’infectiosité/ oncogénicité, oncogénicité,

stabilité stabilité du gènedu gène

20+ tests20+ tests

Par exemple : Par exemple : Séquence Séquence

Amino-acide, Amino-acide, cartes de cartes de

peptide, CLHP, peptide, CLHP, SDS-PAGE, SDS-PAGE,

dosage dosage radio-radio-

immunologique, immunologique, dosagesdosages

biologiquesbiologiques

10+ tests10+ tests

Par exemple : Par exemple : RechercheRecherche

d’endotoxine, d’endotoxine, provocationprovocationpar protéine,par protéine,rendement rendement en protéineen protéine

30+ tests30+ tests

Par exemple : Par exemple : Analyse réitéréeAnalyse réitéréede la protéine,de la protéine,

pureté,pureté,contamination de contamination de

l’ADN, tests del’ADN, tests destabilité :stabilité :

Plasmides et Plasmides et cellules-hôtescellules-hôtes

ProduitProduiten vracen vrac

Validation Validation du processusdu processus

Lots de produitLots de produitfinalfinal

Etape 4: Contrôle qualitéEtape 4: Contrôle qualité

– – congélationcongélation– – chauffagechauffage– – dénaturationdénaturation– – pHpH

1. Souris immuniséecontre l’antigène d’intérêt

2. Cellules B productrices d’anticorps extraites de

la rate

3. Cellules B fusionnées avec les cellules

myélomateuses(hybridome)

4. Sélection des hybridomes capablesde produire des anticorps monoclonaux

5. Culture du meilleurhybridome

6. Récolte et purification des anticorps monoclonaux Cellulesmyléomateuses

Technologie des anticorps Technologie des anticorps monoclonauxmonoclonaux

• Corriger un déficit héréditaire

• Corriger un déficit génique acquis

• Programmer une cellule

pour exprimer de nouvelles propriétés

Objectifs

• Lymphocytes

• Fibroblastes

• Cellules endothéliales

• Kératinocytes

• Hépatocytes

• Myocytes

• Epithélium bronchique

• Cellules-souches médullaires

Cellules cibles

ThérapieThérapieGéniqueGénique

Maladie de Gaucher, obésité, neuropathie de Charcot-Marie-Tooth

Cancer familial du côlon, stérilité

Rétinite pigmentaire, syndrome de von Hippel-Lindau

Maladie de Huntington

Polypose colique familiale

Hémochromatose, ataxie spino-cérébelleuse,bec de lièvre et fente palatine

Exostoses multiples, syndrome de Werner, Syndrome de Langer-Gideon

Mucoviscidose, syndrome de Williams

Mélanome malin, ataxie de Friedriech

Néoplasie endocrinienne multiple de type 2

Anémie falciforme, syndrome du QT long

Phénylcétonurie, diabète de type 2, syndrome de Stickler

Rétinoblastome, BRCA2, syndrome de Wilson

Dystrophie musculaire, adrénoleucodystrophie, hémophilie, syndrome de Barth

Neurofibromatose de type 2

Syndrome de Down, sclérose latéraleamyotrophique, maladie d’Alzheimer

Déficit en ADA, syndrome d’Alagille

Hypercholestérolémie familiale, dystrophie myotonique, BCL3

Amyloïdose, groupe sanguin kidd

Polykystose rénale, BRCA1

Polykystose rénale, fièvre méditerranéenne familiale

Maladie de Tay-Sachs, xeroderma pigmentosum

Maladie d’Alzheimer, porphyria variegata

X

Y

8

7

6

12

3

4

5

9

10111213

14

22

15

21

19

20

18

17

16

Cibles de la thérapie géniqueCibles de la thérapie génique

Objectifs Objectifs

Créer une carte Créer une carte physique physique

Séquencer toutes les Séquencer toutes les paires de base paires de base

Créer des informations, Créer des informations, des outils, des forums et des formationsdes outils, des forums et des formations

1

2

3

4

MarqueursMarqueurs

ClonesClones

...ACGTAATTCATGCCCCGG......ACGTAATTCATGCCCCGG...

Créer une carte Créer une carte génétique génétique

Projet du génome humainProjet du génome humain

Cibles potentielles :VirusCancersMaladies auto-immunes

Mécanisme en présence devirus ou d’oncogènes : Anti-sens

biologique(anti-ARNm)

ARNm cible(filament sens)

La liaison complémentaire

bloque la traductionde l’ARNm protéines

responsables de pathologies non

synthétisées

Vecteur(virus ou lipide)

Blocage des nucléotides : Blocage des nucléotides : Thérapie anti-sensThérapie anti-sens

1. Récolte d’ovocytes fertilisés de souris

2. Gènes du cancer du sein isolés, copiés, injectés dans les ovocytes

3. Ovocytes contenant les gènes du cancer

transplantés chez la mère

4. Environ un tiers de la portée est transgénique, avec présence des gènes du cancer dans toutes les cellules

Source: Biotechnology for the 21st Century, 1995.

Souris transgénique

Créer des animaux transgéniquesCréer des animaux transgéniquescomme modèles de maladiescomme modèles de maladies

Développement HoméostaseActivation

inappropriéeInhibition

inappropriée

Rôles physiologiquesRôles physiologiques Rôles pathologiquesRôles pathologiques

dans le membre foetal dans la division rapide des leucocytes

dans la maladied’Alzheimer

dans l’infection virale

expression des gènesanti-apoptose

mutationßêta-amyloïdesensibilité aux toxines

bone marrow

ApoptoseApoptose

* Bone marrow : Moelle osseuse

Moelleosseuse

SenescenceSenescence

Adapted from Science, 1994.

Sénescence cellulaire, télomères et Sénescence cellulaire, télomères et vieillissementvieillissement

Sénescence

Télomères

Cellules cancéreuses Télomérase

Maladie du viellissement

Immortalité cellulaire

Ajoute des télomères

Cellules somatiquesnormales

Facteurs de croissancehématopoïétiques

Cellule soucheCellule souchepluripotentepluripotente

Blaste CFUBlaste CFU

Ligand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3 SCFSCF




CFU-GEMMCFU-GEMM Cellule souche lymphoïdeCellule souche lymphoïde Précurseur NKPrécurseur NK

SCFSCFIL-3IL-3

Ligand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3

MGDF/TPOMGDF/TPOSCFSCFIL-3IL-3

SCFSCFIL-3IL-3

SCFSCFIL-3IL-3

SCFSCFIL-3IL-3

SCFSCFIL-3IL-3

SCFSCF Ligand flk-2/flt-3Ligand flk-2/flt-3

IL-7IL-7

SCFSCFLigand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3

IL-7IL-7

IL-3IL-3GM-CSFGM-CSF

G-CSFG-CSF

SCFSCFIL-3IL-3

GM-CSFGM-CSFIL-11IL-11IL-6IL-6

MGDF/TPOMGDF/TPO

SCFSCFIL-3IL-3

GM-CSFGM-CSFEPOEPO


BFU-EBFU-E CFU-MegCFU-Meg CFU-GMCFU-GM CFU-EoCFU-Eo CFU-BaCFU-Ba CFU-MastocyteCFU-Mastocyte Cellule pré-BCellule pré-B Cellule pré-TCellule pré-T

CFU-ECFU-E

MégacaryocyteMégacaryocyte

CFU-GCFU-G CFU-MCFU-M

ProplaquettesProplaquettes

PlaquettesPlaquettes

RéticulocyteRéticulocyte

HématieHématie


EPOEPO

BasophileBasophileMacrophageMacrophage Cellule NKCellule NKPlasmocytePlasmocyte


G-CSFG-CSF


M-CSFM-CSF

IL-7IL-7


IL-3IL-3 IL-3IL-3SCFSCF

IL-6IL-6 IL-2IL-2IL-7IL-7

SCFSCFIL-2IL-2

Lymphocyte BLymphocyte B

Lymphocyte TLymphocyte TNeutrophileNeutrophile EosinophileEosinophile Mastocyte tissulaireMastocyte tissulaire

GM-CSFGM-CSFM-CSFM-CSF

MonocyteMonocyte

Augmentent Augmentent la masse la masse et la force et la force musculairesmusculaires

Comment les neurotrophines pourraientComment les neurotrophines pourraient

agir dans les maladies agir dans les maladies

du neurone moteurdu neurone moteur

Neuropathie périphériqueNeuropathie périphérique

Neurones sensorielsNeurones sensoriels

Neurones sympathiquesNeurones sympathiques

Neurones parasympathiquesNeurones parasympathiques

Sclérose latérale amyotrophique (SLA)Sclérose latérale amyotrophique (SLA)Neurones moteursNeurones moteurs

Maladie d'AlzheimerMaladie d'Alzheimer

Neurones cholinergiques du Neurones cholinergiques du

cerveau antérieurcerveau antérieur

Neurones néocorticauxNeurones néocorticaux

Maladie de ParkinsonMaladie de Parkinson

Neurones dopaminergiquesNeurones dopaminergiques

NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5NGF, FGF-2NGF, FGF-2CNTFCNTF

CNTF, BDNF, NT-4/5, IGF-1,CNTF, BDNF, NT-4/5, IGF-1,GDNFGDNF

Relations avec les troubles neurologiques

Favorisent la Favorisent la survie des survie des neurones neurones moteursmoteurs

Favorisent la Favorisent la régénération régénération axonaleaxonale

2

1

4

Induisent le Induisent le bourgeonnement des bourgeonnement des plaques terminales plaques terminales motricesmotrices

3

Barrière Barrière hémato-méningéehémato-méningée

Récepteursspécifiques

Actionsspécifiques

NGFNGFBDNF, NT-3, NT-4/5BDNF, NT-3, NT-4/5

GDNF, BDNF, NT-4/5, GDNF, BDNF, NT-4/5, FGF-1, FGF-2, IGF-1FGF-1, FGF-2, IGF-1

Facteurs NeurotrophiquesFacteurs Neurotrophiques

BDNF NT-3

TrkB TrkC

Membrane cellulaire

Développementd’un vaccin classique

Développementd’un vaccin recombinant

Clonage du gène de l’antigène viral dans une cellule de levure

Antigène viral non-infectieux

Pool de plasma humain

Purification

Inactivation Purification

Vecteurs viraux

Maladies infectieusesMaladies infectieuses

VIH, HSV, CMV, hépatite B, VIH, HSV, CMV, hépatite B, grippe, rotavirus, grippe, rotavirus, coqueluche, maladie de coqueluche, maladie de Lyme, Lyme, Campylobacter Campylobacter jejuni, Chlamydia jejuni, Chlamydia trachomatistrachomatis

CancerCancer

Mélanome, sein, côlon, Mélanome, sein, côlon, ovaire, col utérin, prostateovaire, col utérin, prostate

Sclérose en plaquesSclérose en plaques

Polyarthrite rhumatoïdePolyarthrite rhumatoïde

PsoriasisPsoriasis

ContraceptionContraception

VaccinsVaccinsà base d’ADN recombinantà base d’ADN recombinant

En cours de En cours de développementdéveloppement

Vaccin recombinantsVaccin recombinantsComment sont-ils fabriqués ?Comment sont-ils fabriqués ?

Problèmes pratiques concernant la Problèmes pratiques concernant la manipulation des matériaux biologiquesmanipulation des matériaux biologiques

• Conservation– réfrigération habituellement nécessaire– la congélation/décongélation et la chaleur peuvent dénaturer la protéine

• Stérilité– absence habituelle d’agent de conservation

• Préparation– une agitation excessive pendant la reconstitution peut dénaturer la protéine– l’utilisation d’un diluant approprié est essentielle– peuvent adhérer au plastique ou au verre– calculs des doses basés sur les unités d’activité vs les unités pondérales (micro

grammes)– administration habituellement parentérale (SC ou IV)

• Problèmes concernant l’administration à domicile– Transport– Conservation– Auto-administration– Formation du patient

Documents

Définition de la Biotechnologie Lutilisation dorganismes, de cultures tissulaires, de cellules vivantes ou denzymes cellulaires pour fabriquer un produit