BIOCHIMIE, 1973, 55, 647-651.

Ddpolarisation de fluorescence du conjugu6 trypsine bovine- dimdthylaminonaphtal6ne- sulfonate

Franc i s RODIER.

L a b o r a t o i r e de B i o l o g i e P h y s i c o - C h i m i q n e , U n i o e r s i t d de P a r i s - S n d , C e n t r e d ' O r s a y - - 91405 O r s a y (France ) .

(28-7-1972).

S n m m a r y . - - The conjugate bovine t rypsin-dimethylaminonaphta lene-sul fonate is studied by the fluoreseence depolar izat ion method. It is shown that the label is hetero- geneous but one dansyl residue is strongly bound to the enzyme. After a first fluorescence l i fe t ime determinat ion we found that the t rypsin possesses a non-rigid structure. The analysis of the fluorescence deeay curve sho'wed us that this deeay can be described hy a sum of two exponentials. The second order mean decay t imes gives a higher value for the rotat ional re laxat ion t ime of the protein. The new results are consistent wi th a rigid structure and between pH 6 and 8 t rypsin can be assimilated to a rigid sphere.

I N T R O D U C T I O N .

Le t aux de p o l a r i s a t i o n de la f l u o r e s c e n c e 6mise p a r un c o l o r a n t fix6 su r une m a c r o m o l 6 c u l e d~- p e n d de l ' e f fe t de l ' ag i t a t i on b r o w n i e n n e su r les m o u v e m e n t s de r o l a t i o n du conjugu6.

La m e s u r e de ce t aux est un m o y e n d '~ tude de la f o r m e des p r o t 6 i n e s et de leurs c h a n g e m e n t s de c o n f o r m a t i o n [1, 2, 3J.

Le t aux dc p o l a r i s a t i o n d 6 p e n d de c i n q pa ra - m6t res : la dur6e de v ie de f l u o r e s c e n c e m o y e n n e du f l u o r o p h o r e et sa p o l a r i s a t i o n f o n d a m e n t a l e , le v o l u m e h y d r o d y n a m i q u e de la m a c r o m o l 6 c u l e 6tudi6e, la t e m p e r a t u r e et la v i scos i t6 de la solu- t ion .

Ces g r a n d e u r s son t l i6es p a r une r e l a t i o n e o n n u e sous le n o m de << f o r m u l e de P e r r i n )> [4] :

1 / p - 1 /3 = ( 1 / p o - 1/3) (1 q- RTx/Vn)

p : degr6 de p o l a r i s a t i o n Po : p o l a r i s a t i o n f o n d a m e n t a l e ob t enue p a r

e x t r a p o l a t i o n p o u r T / n = 0 R : c o n s t a n t e des gaz p a r f a i t s e x p r i m 6 e dans

le sys t6me c.g.s. T : t e m p 6 r a t u r e abso lue

Abr~viat ions nti l isdes : DNS - C1 : ehlorure de l 'aeide l-dimethylaaninonaphta-

16ne-5-sulfonique. DNSOH : aeide 1-dimethylaminonaphtal~ne-5-sulfo-

nique. DNS : r6sidu 1-dimethylaminonaphtal~ne-5-.sulfo-

nyl ou r~sidu dansyl. N P G B : p-nitroph~nyl-p '-guanidinobenzoate. L - B A N A : amide I~ naphtyl ique de la N-ct benzoyl-L-

arginine. BAEE : ester 6thylique de la N-a benzoyl-L-argi-

nine.

x : dur6e de v ie de f l u o r e s c e n c e m o y e n n e du co lo ran t , e x p r i m 6 e en secondes .

V : v o l u m e h y d r o d y n a m i q u e m o l a i r e du con- jugu6 en cma

~1 : v i scos i t6 en poise .

On peu t c a l c u l e r le v o l u m e h y d r o d y n a m i q u e V de la p r o t 6 i n e en m e s u r a n t << p >) p o u r diff6- r en tes va l eu r s du r a p p o r t T/~I. La r e p r 6 s e n t a t i o n 1/p - - 1 /3 en f o n c t i o n de T / n d o n n e une d ro i t e de p e n t e ( l /Po - - 1/3) R r / V . Le ca lcu l de V ne p e a t se f a i r e que si l ' on c o n n a i t la v a l e u r de x, dur6e de v ie de f l u o r e s c e n c e m o y e n n e du f luoro- p h o r e que l ' on d 6 t e r m i n e p a r une au t re m 6 t h o d e (5) (6). Q u a n d le f l u o r o p h o r e est li6 r i g i d e m e n t h la m a c r o m o l 6 c u l e , la v a l e u r V a ins i ca lcu l6e est l i6e au t emps de r e l a x a t i o n de d i f fus ion de ro ta -

t ion ~h.

L o r s q u e la p r o t 6 i n e est a s s imi l ab l e h un e l l i p so ide r i g ide , ~ est la m o y e n n e h a r m o n i q u e des t ro i s t emps de r e l a x a t i o n p r i n c i p a u x Ell . D ' a u t r e p a r t h p a r t i r de la masse m o l 6 c u l a i r e M~ de la m a c r o m o l 6 c u l e et de son v o l u m e p a r t i e l sp6- c i f ique , on p e u t c a l e u l e r son v o l u m e << s t a t ique >> Vo a u q u e l c o r r e s p o n d le t emps de r e l a x a t i o n stan- d a r d d6fini p o u r une mo l6eu l e s p h 6 r i q u e p a r la r e l a t i o n ~o = 3 Von/RT. P o u r u n e t e m p 6 r a t u r e de 25°C, et si on a d m e t un v o l u m e pa r t i e l sp6c i f ique de 0,74, ,% est 6gal h : Mw/1,23.10z ns.

Le r a p p o r t 9h/~o, appe l6 f~, est 6gal h V / V o ; il est p lus g r a n d que 1 l o r s q u e les p r o t 6 i n e s son t a s s imi l ab l e s h des e l l i p so ides r i g ide s [7, 8~, mats l o r s q u e l 'on a a f fa i re h des mol6cu le s pos s6dan t une f lex ib i l i t6 i n t e r n e due aux poss ib i l i t6s de ro ta - t ion de c e r t a i n s f r a g m e n t s les uns p a r r a p p o r t aux

648 Francis Rodier.

autres, ~ est inf6r ieur ~ 1 [9, 10, 11, 12, 113]. La d6- t e rmina t ion de :~ peut doric appor ter des rensei- gnements sur la s t ructure d 'une prot6ine.

Nous avons appl iqu6 cette m6thode d'6tude h la t rypsine. A. d 'Albis a montr6 par des mesures de pouvoir rotatoire que cet enzyme 6tait compact darts sa zone d 'act ivi t6 maximum. Le colorant que nous avons util is6 est le chlorure de l 'acide d im6thy laminonaphta l6ne sulfonique (DNS-C1). Nous avons 6tudi6 le conjugu6 fluorescent t ryps ine bovine-d im6thy laminonaphta l6ne sulfonate entre pH 4 et pH 7,8 en d6 te rminan t le temps de rela- xation de diffusion de rotat ion calcul6 ~ par t i r de la formule de Perr in . Le calcul de ce temps de relaxat ion n6cessite la connaissance de la dur6c de vie moyenne de fluorescence de l '6metteur. Nous avons constat6 que le d6clin de fluorescence du dansyl fix6 mesur6 par une technique d 'analyse par 6chant i l lonnage est complexe et peut ~.tre exprim6 par une somme de deux exponentiel les. On dolt a t t r ibuer l 'exis tence de deux temps au fair que le DNS fix6 se trouve darts deux envi ronne- merits diff6rents, c'est-/~-dire peut se fixer de deux facons diff6rentes. L'h6t6rog6n6it6 darts le mar- quage a 6t6 v6rifi6e par chromatographie sur couche mince d 'un hydrolysa t total du conjngu6 qui montre que deux aminoacides , la lysine et la tyrosine fixent le dansyl.

MATERIEL ET METHODES.

La t ryps ine bovine Wor th ington lyophilis6e, cristallis6e deux lois (EC 3.4.4.4) a 6t6 utilis6e sans pur i f icat ion suppl6mentaire . La chlorure de dansyl adsorb6 sur c61ite 6tait un produi t Calbio- chem.

Le conjugu6 dansyl - t ryps ine a 6t6 obtenu en incuban t 150 mg de t ryps ine avec 25 mg de DNSCL darts 3 ml de tampon b icarbonate de sodium 0,5 M contenant de la bu ty lamine 0,2 M, h pH 8, afin d '6viter l 'autolyse de l 'enzyme. Le m6- lange se fait sous agitation h 4°C pendan t une heure. La bn ty lamine et le chlorure de dansyl hydrolys6 qui n 'a pas r6agi sont 61imin6s sur une colonne de Sephadex G 25 61u6e par de l 'acide ch lorhydr ique 0,01 N. Les fract ions renfe rmant le conjugu6 con t i ennen t de la prot6ine d6natur6e, conjugu6e et non conjugu6e. Ces formes d6natu- r6es sont pr6cipit6es par le chlorure de sodium molaire ~ pH 2 [14]. Les concent ra t ions en dansy! et en t ryps ine sont calcul6es h par t i r des absor- bances respect ivement h 320 nm et 280 nm en tenant compte, h cette derni6re longueur d 'onde, de la con t r ibu t ion du colorant [15]. Le taux de marquage, c'est-h-dire le hombre moyen de DNS

par mol6cule de t ryps ine 6tait compris entre 0,7 et 0,8 pour une vingta ine de pr6parat ions.

Les mesures du taux de d6polar isat ion de fluorescence out 6t6 faites sur un apparei l or iginal const rui t au laboratoire (*) [16], une premi6re s6rie de d6terminat ions de dur6e de vie de fluorescence avait 6t6 faite sur le f luorimbtre h impuls ions commercia l TRW, en ut i l isant le si- mula teur de courbe type 32 A, mats il s'est av6r6 que ces mesures n '6 ta ient valables que pour un d6clin simple. Nous avons doric utilis6 une tech- nique d '6chant i l lonnage en ana lysant le signal du photomul t ip l ica teur de mesures avec un t i ro i r 6chanl i l lonnage Tektronix type 1S1. Les courbes exp6rimentales cor respondant au flash d 'excita- t ion F(t) et au produi t de convolut ion D(t) sont trac6es en temps diff6r6 sur un enregis t reur XY, puts d6pouill6es selon la m6thode de la courbe simul6e [17]. Les calculs out 6t6 fairs sur une calculatr ice Wang 370, 6quip6e de 3 lecteurs de carte et coupl6e h u n t616type [18].

Les analyses thermiques out 6t6 r6alis6es diff6rents pH, h une force ionique constante 6gale

0,1, en faisant var ier la temp6rature entre I°C et 40°C. Les concent ra t ions en conjugu6 t ryps ine- DNS 6taient suff isamment faibles (0,1 mg/ml) pour que l 'autolyse soit n6gligeable darts la zone alca- line.

Par la m6thode de titrage au NPGB [19] nous avons trouv6 un pourcentage de centres actifs de l 'enzyme 6gal ~ 85 p. cent.

RESULTATS.

La g randeur ~( V >) de la formule de Pe r r in peut 6tre consid6r6e comme une volume hydrodyna- mique h condi t ion que le marqueur f luorescent soit r6ellement un ind ica teur de diffusion de rotation. Aussi avons-nous cherch6 5 pr6ciser la nature de l ' in te rac t ion entre le colorant et son site de fixation. I1 6tait impor tan t d ' examiner si le marqueur avait une cer taine l ibert6 de rota t ion et si plusieurs r6sidus de na ture diff6rente pou- vaient fixer le dansyl. On sait que Hart ley et Massay out mesur6 une inh ib i t ion stcechiom6- tr ique de l 'activit6 de l ' a -chymotryps ine par fixation du DNS [20]. Nous avons mesur6 l 'affinit6 de l 'enzyme dansyl6 pour un pseudo-substrat de type ester, le BAEE et un pseudo-substrat de type amide, le L,BANA. Pour le BAEE h pH 8 et ~ 25°C nous avons trouv6 une valeur de K~, = 2.10-6 M, ce qui est tout h fair comparable h l 'affinit6 pour le BAEE de la t ryps ine non dansyl6e.

(*) Chaque valeur du taux de polarisation 6taut la moyenne de 10 /t 15 mesures.

BIOCHIMIE, 1 9 7 3 , 55 , n ° 6 - 7 .

C o n j u g u d t y r o s i n e - co lo ran t : f l u o r e s c e n c e . 649

P o u r le L-BANA, n o u s a v o n s t rouv6 une va l e u r de K m = 2,3.10 -4 M p o u r le con jugu6 et u n e va l eu r K m = 5.10 -2 M p o u r la t r y p s i n e n o n d a n s y l 6 e clans les m 6 m e s c o n d i t i o n s de p H et de t e m p 6 r a t u r e . F r a n k l i n et Les l ie on t o b t e n n des rdsu l t a t s a n a l o g u e s avec ce m 6 m e con jugu6 , m a i s avec des s u b s t r a t s d i f f b r e n t s [21].

Le m a x i m u m du s p e c t r e d ' 6 m i s s i o n de f luores - c e n c e du con jugu6 se s i tue h 520 nm. Chen a

k Fluorescence re la t ive

r o n n e m e n t du DNS de p o l a r i t 6 v o i s i n e de cel le de l ' d t h a n o l [22] (fig. 1).

La v a l e u r du p K de p r o t o n a t i o n du g r o u p e d i m 6 t h y l a m i n o du d a n s y l fix6 a 6t6 d 6 t e r m i n d e en p o r t a n t l ' i n t e n s i t 6 de f l u o r e s c e n c e du con jugu6 h 520 n m en f o n c t i o n du p H (fig. 2). Nous a v o n s t rouv6 un p K de 1,9 -- 0,1 h 20°C p o u r une f o r c e i o n i q u e de 0,1. Le p K de ce m 6 m e g r o u p e d a n s le cas du DNSOH est de 4,3. Ce d d p l a c e m e n t de pK i n d i q u e d6jh u n e i n t e r a c t i o n i m p o r t a n t e e n t r e le DNS et les g r o u p e s s i tu6s au v o i s i n a g e i m m d d i a t de son s i te de f ixa t ion . On p e u t 6 me t t r e l ' h y p o -

, y ,,ooo,

I I ] I J [ 250 300 350 400 450 500 550 600

Fluorescence

Fro. 1. - - Spectre d '6mission de fluorescence (E) et spectre d 'exci ta t ion (A) du conjugud Trypsine-DNS pH 2. Temp6rature : 20°C - - force ionique : 0,1 - - concentrat ion en protdine : 0,2 mg/ml .

Les spectres sont non corrigds.

m o n t r 6 que le m a x i m u m d ' 6 m i s s i o n de c o m p o s 6 s m o d b l e s c o m m e le d a n s y l DL t r y p t o p h a n e subis - sa i t un effet h y p s o c h r o m e q u a n d la po l a r i t 6 du s o l v a n t d i m i n u a i t . A ins i la p o s i t i o n du m a x i m u m d ' 6 m i s s i o n du con jugu6 c o r r e s p o n d h u n env i -

Fluorescence A ~ l a t i v e

3 5

30

2 5 _

2 0

15

10

5

I J I I I I

o I 2 3 4 5 6 I v

7 pH

Fro. 2. - - Variat ion de l ' intensi td de fluorescence du conjugnd h 520 nm en fonction du pH. Temp6rature : 10°C - - force ionique : 0,1 - - concentrat ion en pro- tdine : 0,2 mg/ml .

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 6-7.

Temps

0 10 20 30 40 50 60 70 ns

FIG. 3. - - Ddcomposition de la courbe de ddclin de fluorescence D (t) du conjugu6 trypsine-DNS, obtenue par une excitation reprdsentde par la courbe F (t). La courbe 2 est le produi t de convolut ion relat i f h la constante de temps de 15 ns. La eourbe 1 est obtenue en sous t rayant la courbe 2 de la courbe D (t), cette diffdrence correspondant h la constante de temps de 3 ns. Tempdrature 20°C. Excitat ion h 330 n m - pH 3,7.

th6se d ' u n e n v i r o n n e m e n t h y d r o p h o b e du DNS fix6 qui f a v o r i s e r a i t l ' e x i s t e n c e de la f o r m e d6pro -

ton6e [Z3].

P a r u t i l i s a t i o n du s i m u l a t e u r a n a l o g i q u e T R W 32 A, n o u s a v i o n s t rouv6 une v a l e u r g loba le de 8 ns _+ 0,5 ns p o u r la du r6e de v ie de f l u o r e s c e n c e du DNS fix6 su r la t r y p s i n e , ce t te v a l e u r ayan t 6t6 m e s u r 6 e ~ 20°C et /~ pH 8. L ' a n a l y s e de la c o u r b e de d6c l in de f l u o r e s c e n c e o b t e n u e p a r 6 c h a n t i l l o n n a g e n o u s a m o n t r 6 que le d6c l in p e u t 6tre d 6 c o m p o s 6 en u n e s o m m e de d e u x e x p o n e n -

650 Francis Rodier.

tielles de coefficients et de constantes de temps trbs diff6rents. Le d6clin le plus court est ind6- pendan t du pH e t a une valeur 6gale h 3 ns. Le d6clin le plus long passe d 'une valeur de 12 ns 'h pH 2, /L une valeur de 15 ns /~ pH 3,7 et h une valeur de 17 ns pour les pH 6gaux et sup6rieurs

5. Les coefficients des exponent ie l tes ne var ient pas avec le pH d 'une mani6re significative. En d6signant par I(t) la fonct ion repr6sentant le d6clin, nous avons obtenu les r6sultats suivanls :

pH 2 : I(t) = 0,815 e -t/12 + 0,185 e -t/3 (1) pH 3,7 : I(t) = 0,815 e -t/15 -4- 0,185 e -t/z (2) (fig. 3) pH 5 : I(t) = 0,815 e - t / i t + 0,185 e -t/s (3)

La dur6e de vie moyenne de la formule de Per r in est la moyenne d 'o rd re 2 et pour les pH de 5 h 7,82 nous avons utilis6 l '6galit6 [3], ce qui donne nne moyenne < T > 2 = 16,5 ns.

Nous avons r6uni dans un tableau les valeurs de Po, polar i sa t ion fondamenta le obtenue par ext rapola t ion de la droi te de Pe r r in pour T/~I = 0 (fig. 3) et les valeurs de ~ et ~', la valeur de co r respondan t h la dur6e de vie de 8 ns et la valeur de (5' co r respondan t /~ la moyenne d 'o rd re 2 des valeurs obtenues par 6chant i l lonnage (tableau).

TABLEAU.

pH ~'

4 5 5,5 5,96 7,24 7,82

eo

0,35 1,20 0,32 1,90 0,42 0,74 0,47 0,56 0,48 0,55 0,45 0,58

2,47 3,90 1,52 1,15 1,13 1,19

Selon A. Jablonski la polar isa t ion fondamenta le Po est reli6e h l ' an iso t ropie des oscil lateurs d 'absorp t ion et d '6mission du colorant [9.4] et Po est une valeur bien d6finie pour une exci ta t ion donn6e. Darts le cas du DNS la valeur l imite est 0,50.

La valeur Po obtenue par ext rapola t ion de la droi te de Pe r r in diff6re d 'autant plus de la va leur l imite que le colorant f luorescent poss6de une l ibert6 de ro ta t ion autour de son point de fixation sur la prot6ine.

D'apr6s les valeurs obtenues de Po pour les pH > 5,5 on volt que le DNS est r ig idement li6 h l 'enzyme. Cependant la d iminut ion de la polarisa- t ion fondamenta le h pH 5 ne dolt pas 6tre inter- pr6t6e comme une augmenta t ion de la libert6 du

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 6-7.

mouvement du colorant. Compte tenu de la forte valeur de 8' (8' -- 3,9) nous pensons que nous observons le ph6nom6ne d 'autoassocia t ion de la t ryps ine 6tudi6 par A. d 'Albis [25]. En effet, pH 5 l 'autoassociat ion de la t ryps ine est maxi- mum, ce qui signifie que l 'on se t rouve ell pr6- sence d'agr6gats por tant plusieurs r6sidus dansyl. D'apr6s Weber un coefficient ~ = 3,9 est carac- t6ris t ique d 'un rappor t axial de 8,5 [26]. Or on salt que la t ryps ine a un rappor t axial de 1,5. II est doric 16gitime de supposer que l 'on a affaire des agr6gats de t rypsine, agr6gats por tan t suffi- samment de r6sidus dansyl pour en t ra iner une d iminu t ion du taux de polar isa t ion fondamenta le par transferts , comme Font signal6 Andr6-Frey et Wahl darts le cas de la s6rum albumine bovine dansyl6e [27].

Bien que nous ayons fix6 s ta t is t iquement moths d 'une mol6cule de DNS par mol~cule d 'enzyme, nous obtenons un d6clin double. Ceci prouve qu' i l existe au moths deux sites de fixation du DNS. On peut 6mettre deux hypoth6ses :

1 °) le DNS se fixe sur deux anl inoacides diffS- rents par mol6cule de t ryps ine ;

2 ° ) le DNS se fixe sur des aminoac ides iden- t iques mats situ6s darts deux env i ronnements diff6rents. Ce r6sultat est a r a p p r o c h e r de celui obtenu par Wahl darts le cas du lysozyme dansyl6 off, pour un taux de marquage inf6r ieur /t 1, l ' au teur obtient deux constantes de temps pour le d6clin de f luorescence du conjugu6 [17].

L 'analyse par ch romatograph ic sur couche mince de Silicagel d 'un hydro lysa t total de conju- gu6 a montr6 que des lysines et des tyrosines out fix6 le dansyl, cependan t le hombre de ces r6sidus par mole d 'enzyme n'a pas pu ~tre d6termin6. En effet les quantit6s de e-dansyl lysine et de O-dansyl tyros ine recuei l l ies par cette m6thode sont si faibles et si peu reproduct ib les qu' i l est i l lusoire d ' e s s a y e r de calculer un pourcentage des lysines et des tyrosines marqu6es [28]. D 'autre part , la seule connaissance des coefficients des exponen- tielles des forulules [1, 2, 3] n 'est pas suffisante pour aff i rmer qne les lysines rcpr6sentent 18,5 p. cent et les tyrosines 81,5 p. cent. I1 est fort pro- bable que ces coefficients d6pendent h la fois de l ' ex t inc t ion stat ique et de l ' ex t inc t ion dynamique alors que les dur6es de vie ne d6pendent que du processus d ' ex t inc t ion dynamique [29].

I1 est int6ressant de r e c h e r c h e r l 'o r ig ine de ce d6clin double. En effet on salt que la t ryps ine fixe sur une ou plusieurs lysines un colorant fluores- cent, le 7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-l ,3 diazole dont la dur6e de vie de f luorescence est conrte, de l 'o rdre de 3,6 ns "h 20°C [30]. Par analogie on peut

C o n j u g u d t y r o s i n e - c o l o r a n t : f l u o r e s c e n c e . 651

p e n s e r que p o u r la t r y p s i n e - D N S , le d a n s y l h d6c l in c o u r t et p o s s 6 d a n t un p o i d s f a ib le (0,185) est s i tu6 h l ' e x t 6 r i e u r de la p r o t 6 i n e , d a n s un m i l i e u a q u c u x , s o u m i s h u n e e x t i n c t i o n d y n a - m i q u e p a r co l l i s i on avec les m o l 6 c u l e s du so lvan t . D o n c il do i t s ' ag i r du DNS fix6 h l ' e x t r 6 m i t 6 d ' u n r 6 s i d u lys ine , ca r les 6 tudes c r i s t a l l o - g r a p h i q u e s de la t r y p s i n e aux r a y o n s X on t m o n t r 6 q u ' u n e l y s i n e est e x t e r n e et p a r t i c u l i 6 r e m e n t r d a c t i v e [31].

Quan t au r6s idu d a n s y l h d6c l in long, il s ' ag i t v r a i s e m b l a b l e m e n t de ce lu i f ix6 s u r une t y r o s i n e d a n s un c n v i r o n n e m e n t h y d r o p h o b e pro t6g6 d ' u n e e x t i n c t i o n d y n a m i q u e .

A p a r t i r des va l eu r s de ~' du t ab l eau on p o u r r a i t d 6 d u i r e que la t r y p s i n e p o s s 6 d e u n e s t r u c t u r e s o u p l e e n t r e p H 5,5 et p H 7,82. Cet te f lex ib i l i t6 es t en r6ali t6 un a r t e f a c t de ca lcu l dfi au fair que la v a l e u r de dur6e de vie de f l u o r e s c e n c e m e s u r 6 e avec le f l u o r i m b t r e T R W est u n e va l eu r t r o p fa ible . En r6al i t6 la m o y e n n e d ' o r d r e 2 ca lcu l6e p a r t i r des c o e f f i c i e n i s et des c o n s t a n t e s de t e m p s de la f o n c t i o n I(t) d6f in ie p l u s h a u t nous c o n d u i t h u t i l i s e r une va l eu r de d u r 6 e de vie d e u x fois p lus g r a n d e que la va l eu r i n i t i a l e m e n t ut i l is6e.

D a n s le cas de la t r y p s i n e , le d a n s y l est un b o n i n d i c a t e u r de d i f f u s i o n de r o t a t i o n b r o w n i e n n e c a r tout se p a s s e c o m m e si l ' on o b s e r v a i t les p r o - pr i6 t6s d ' u n seul r 6 s idu d a n s y l li6 r i g i d e m e n t h l ' e n z y m e , en i n t e r a c t i o n 6 t ro i te avec son s i te de f ixa t ion .

On p e u t c o n c l u r e que la t r y p s i n e ne p o s s 6 d e pas une s t r u c t u r e d 6 f o r m a b l e d a n s sa zone d ' a c t i - vit6 e n z y m a t i q u e m a t s p e u t 6ire a s s imi l6e h u n e s p h 6 r e r ig ide . De p lus on c o n s t a n t e que l ' a p p l i - c a t i o n de la m 6 t h o d e de d 6 p o l a r i s a t i o n de f luores - c e n c e p e r m e t de m e t t r e en 6 v i d e n c e l ' a u t o a s s o c i a - t ion de la t r y p s i n e h des c o n c e n t r a t i o n s qui s o n t b i e n i n f 6 r i e u r e s h ce l les que l ' on p e u t 6 tud i e r p a r les m 6 t h o d e s p h y s i c o c h i m i q u e s h a b i t u e l l e s .

R~suM~.

Le conjugu6 t rypsine bovine-dimethyl aminonaphta - 16he sulfonate est 6tudi6 par la technique de d6pola- r isat ion de fluorescence. On montre que, pour un taux de marquage s ta t i s t iquement inf6rieur h 1, le d6clin de fluorescence du conjugu6 est complexe et peut ~tre exprim6 par une somme de deux exponentielles. Un des r6sidus est fix6 sur une lysine et l 'autre r6sidu est fix6 h une tyrosine dans un envi ronnement apolaire. Les variat ions des param6tres obtenus h par t i r des repr6sentat ions de Perr in mont ren t que la t rypsine est assimilable h une sph6re rigide entre pH 5,9 et pH 7,8: ce qui a 6t6 mis en dvidence par une autre technique physicochimique, la spectropolarim6trie.

Remerciements .

Nous tenons h remercier Monsieur le Professeur Jacques Tonnelat et le Docteur ,lean Lavorel pour leurs crit iques s u r e e travail .

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