Diagnostic bactériologique de la tuberculose

38 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - FÉVRIER 2013 - 449 BIS

Diagnostic bactériologique de la tuberculoseVéronique Vincenta,*

a Cellule d’intervention biologique d’urgenceInstitut Pasteur25, rue du Docteur-Roux75724 Paris cedex 15

* [email protected]

1. Épidémiologie

de la tuberculose

1.1. Au niveau mondialLa tuberculose reste un problème majeur de Santé publique au niveau mondial. On estime à 8,8 millions le nombre de nouveaux cas par an et à plus de 1,4 million le nombre de décès dus à cette maladie [1]. Les décès s’élèvent à 1,1 million dans la population VIH-négative et à 0,35 million chez les patients atteints de sida. L’impact de la tuberculose au niveau mondial a été récemment revu en s’appuyant sur de larges enquêtes nationales et le renforcement des méthodes de surveillance. Les esti-mations de la charge de la morbidité ont été actualisées grâce aux données de consultations menées principale-ment en Chine, en Inde et dans 17 pays africains. Ainsi, il est permis de conclure que le nombre absolu de cas de tuberculose a baissé depuis 2006 alors que les esti-mations des années précédentes montraient une lente augmentation. De même, le taux d’incidence a baissé depuis 2002, c’est-à-dire 2 ans plus tôt qu’estimé pré-cédemment, et les estimations du nombre annuel de décès ont été revues à la baisse. En particulier, la Chine est parvenue à réduire de façon spectaculaire le nombre de cas de tuberculose et de décès. En 20 ans de 1990 à 2010, les taux de mortalité ont baissé de 80 % et les taux d’incidence de 3,4 % par an. Mais c’est en Chine et en Inde que l’on retrouve toujours le plus grand nombre de patients avec plus de 40 % des cas mondiaux (plus de 3,5 millions de nouveaux cas par an). L’Afrique sub-saharienne compte plus de 2 millions de cas, soit plus du quart de la charge mondiale. L’incidence dans cette sous-région est 2 fois plus élevée qu’en Asie et dépasse les 350 cas pour 100 000 habitants. Enfin si la majorité des décès dus à la tuberculose surviennent en Asie, le taux de mortalité le plus élevé au monde est toujours en Afrique sub-saharienne. Le rôle de l’épidémie de sida est majeur dans ces statistiques puisque un tiers des nouveaux cas diagnostiqués parmi les jeunes adultes (15-39 ans) du sous-continent sont co-infectés par le VIH. Au niveau mondial, la co-infection VIH touche environ 13 % des cas de tuberculose.

1.2. Au niveau européenLes données européennes montrent une situation très contrastée avec une augmentation d’ouest en est [1]. En Europe de l’Ouest, l’incidence moyenne est de 11 cas pour 100 000 habitants avec une tendance générale à la diminution depuis 1995. Dans les pays où l’incidence a augmenté (Danemark, Royaume-Uni, Norvège), la ten-dance est due à l’augmentation des cas nés à l’étranger. La diminution annuelle du nombre de cas est plus forte chez les nationaux (-7,6 %) que chez les patients d’origine étrangère (-3,3 %). Dans les pays de l’Europe du centre, l’incidence moyenne est de 41 cas pour 100 000 habi-tants. La tendance est à la diminution ou à la stabilité sauf en Bulgarie et en Roumanie où les taux d’incidence ont augmenté de 5 % par an. Dans les pays d’Europe de l’Est (ex-Union soviétique), les taux sont élevés avec une moyenne de 92 cas pour 100 000 habitants et sur-tout révèlent des augmentations annuelles constantes et fortes de l’ordre de 6 à 12 % dans la plupart des pays. La répartition par tranche d’âge varie également selon les régions. En Europe de l’Ouest, les patients âgés de plus de 65 ans représentent la classe d’âge la plus importante (23 % des cas), alors qu’en Europe de l’Est, l’incidence est plus élevée chez les jeunes adultes de 25 à 44 ans (43 % des cas).

1.3. En FranceComme l’Amérique du Nord, l’Australie et la plu-part des pays de l’Europe de l’Ouest, la France est aujourd’hui un pays considéré comme à faible inci-dence de tuberculose. En France, le taux d’inci-dence de la tuberculose continue de diminuer pour un taux national de 8,1 cas pour 100 000 habitants. Alors que la vaste majorité des régions présentent des taux inférieurs à 10 nouveaux cas pour 100 000 habitants, l’Ile-de-France et la Guyane se singularisent avec des taux respectifs de 16,3 et 15,9 pour 100 000 habitants [2]. Certains groupes de population sont particulièrement touchés : les personnes sans domicile fixe avec un taux d’incidence de 155 cas pour 100 000 et les patients nés à l’étranger, notamment en Afrique. Les taux sont de 4,1 pour les personnes nées en France et 36,1 pour celles nées à l’étranger. Ce taux diminue avec l’ancienneté de l’entrée en France. Chez les personnes en France depuis moins de 2 ans, le taux est de 230 pour 100 000 (408 pour les personnes nées en Afrique). Il n’est plus que de 16,8 pour 100 000 après plus de 10 ans en France. Quant au taux supérieur à la moyenne nationale de 11,8 observé chez les personnes de 65 ans et plus, il s’explique pour une large part à des réactivations d’infections acquises à une période où l’incidence de tuberculose en France était plus fréquente qu’aujourd’hui (80 pour 100 000 en 1960).© 2013 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.

THÉMATIQUE À TAPER

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - FÉVRIER 2013 - 449 BIS // 39

55es JOURNÉES DE BIOLOGIE CLINIQUE NECKER – INSTITUT PASTEUR

Parce que l’infection latente par Mycobacterium tuber-culosis n’a pas de période d’incubation définie, des cas continueront d’émerger en France comme dans les autres pays industrialisés du fait de l’importance des mouve-ments de population et aussi longtemps que les dispari-tés de l’épidémiologie de la tuberculose subsisteront [3]. Ceci souligne l’importance d’un renforcement continu du système de surveillance, de la vigilance et de l’adaptation des interventions aux changements de la situation épidé-miologique et de leurs besoins. En particulier, les grandes villes et certains groupes de population les plus touchés nécessitent des mesures de lutte spécifiques, comme les personnes sans domicile fixe dont les difficultés d’accès aux soins rendent particulièrement complexes le diagnostic et le suivi de traitement.

2. Épidémiologie de la résistance

Les données de l’OMS montrent que le taux de succès des traitements des nouveaux cas de tuberculose pulmo-naire à frottis positif est élevé et atteint 87 % au niveau mondial. Mais l’émergence de bacilles multi-résistants, c’est-à-dire résistants aux deux antituberculeux majeurs que sont l’isoniazide et la rifampicine, est particulière-ment préoccupante. En effet si la tuberculose à bacilles sensibles peut être guérie sous traitement standard de 6 mois, la tuberculose à bacilles multi-résistants néces-site le recours à des traitements longs de 24 mois. De plus ces traitements doivent être ajustés en fonction des résistances et des caractéristiques cliniques des patients car ils requièrent des médicaments dits de seconde ligne beaucoup plus toxiques que ceux utilisés dans le traitement standard.Chez les bacilles de la tuberculose, les résistances aux antibiotiques sont dues à des mutations strictement chromosomique (il n’y a pas de plasmide de résistance). L’apparition de souches résistantes est uniquement due à la sélection de bacilles résistants au sein de la population bactérienne. Ce phénomène est lié à une mauvaise observance du traitement (interruption avant terme, sélection des antibiotiques par le patient, prise irrégulière) ou à des prescriptions inadaptées, mais aussi à des problèmes structurels (mauvaise organisation et dysfonctionnement des centres de dépistage et de soins, approvisionnement erratique en antituberculeux, etc.). Ainsi, le taux de résistance dans une région est un bon indicateur de la qualité des structures de soin et de prise en charge de la tuberculose. On distingue la résistance secondaire, acquise par les patients sous traitement, de la résistance primaire, diagnostiquée chez des patients n’ayant jamais été traités et ayant donc été contaminés par des bacilles déjà résistants. La résistance secondaire est une conséquence directe d’une mauvaise prise en charge. Les patients concernés rassemblent une population hétérogène de cas chro-niques, de rechutes et d’échecs au traitement. Pour prévenir l’acquisition de résistance, il faut connaître le spectre de résistance élargi pour décider de la bonne association médicamenteuse (ne jamais ajouter une seule molécule active). Le soutien d’une équipe entraînée à la prise en charge des cas à traitement difficile (en France :

CNRMyRMA, sanatorium Centre médical de Bligny) est particulièrement utile. Pour prévenir la résistance primaire, il faut interrompre la chaîne de transmission des bacilles résistants, avec la mise en isolement respiratoire des patients à bacilles multi-résistants jusqu’à négativation de la culture des prélèvements.

2.1. La résistance au niveau mondialLa résistance aux antituberculeux est retrouvée dans toutes les régions du monde. La prévalence de la résistance à un antituberculeux chez les nouveaux cas varie de 0 % dans certains pays d’Europe occidentale à plus de 56 % à Bakou en Azerbaïdjan. Chez les anciens cas, les pour-centages sont généralement deux fois plus élevés. Les données concernant la multi-résistance sont très alar-mantes. Les patients des pays de l’ex-Union soviétique et de plusieurs régions de Chine ont 10 fois plus de risque d’être infectés par une souche multi-résistante que dans le reste du monde et la multi-résistance touche plus de 5 % des nouveaux patients de ces pays (jusqu’à 14 % des nouveaux cas dans certaines régions). Au niveau mondial, le taux de prévalence médian est de 7 % chez les patients déjà traités [1].Le nombre de nouveaux cas de tuberculose à bacilles multi-résistants est estimé à 440 000 par an, parmi les-quels environ 50 000 cas seraient ultra-résistants selon la définition de l’OMS, c’est-à-dire des bacilles résistants à isoniazide et rifampicine (multi-résistants) et également aux fluoroquinolones et à un aminoside. En 2006, l’OMS a reconnu la tuberculose multi-résistante comme un défi majeur mondial alors que le diagnostic et le traitement de la tuberculose multi-résistante restent très problématiques dans la plupart des pays. En 2010, moins de 5 % des nouveaux patients et des patients déjà traités ont béné-ficié d’un dépistage de la tuberculose multi-résistante au niveau mondial. Le nombre de patients sous traitement adapté a augmenté en 2010 mais ne représente toujours que 16 % des cas de tuberculose multi-résistante.

2.1. La résistance en FranceEn France, les données de 2010 du CNR-MyRMA collec-tées par le réseau Azay-Mycobactéries (réseau national de laboratoires pratiquant des examens de mycobactériolo-gie) montrent que chez les nouveaux cas, la proportion de bacilles résistants à au moins un antibiotique est de 9,7 % (5,4 % pour l’isoniazide et 1,3 % pour la rifampicine) alors que chez les cas déjà traités la résistance à au moins un antibiotique s’élève à 20,9 % (17,6 % pour l’isoniazide et 8,8 % pour la rifampicine). Quant au nombre annuel de cas multi-résistants, il reste depuis 1992 compris entre 30 et 80, soit une proportion de 0,4 à 1,4 %. En 2009, parmi les 51 cas répertoriés, 8 % étaient des cas chroniques déjà identifiés les années précédentes et 59 % des cas vivaient en Ile-de-France. Parmi les cas identifiés pour la première fois, 9 % étaient séropositifs au VIH et 87 % étaient nés hors de France. Deux cas étaient secondaires à des trans-missions familiales. La proportion de cas multi-résistants parmi les nouveaux cas était de 1,1 %. Le faible taux de résistance en France souligne l’efficacité du système de lutte antituberculeuse [4].



permettent la détection des cultures liquides par fluori-métrie ou colorimétrie, avec un gain de 1 à 2 jours sur la méthode manuelle.Les méthodes biochimiques d’identification de M. tuber-culosis, lentes, fastidieuses, nécessitant la manipulation de grandes quantités de bacilles, ont été supplantées par des techniques de biologie moléculaire. Si les tout premiers tests phénotypiques différenciaient M. tuber-culosis, l’agent de la tuberculose humaine de M. bovis, l’agent de la tuberculose bovine, les méthodes molécu-laires ne permettent généralement que la reconnaissance du complexe des bacilles de la tuberculose. Plusieurs sondes spécifiques des bacilles de la tuberculose sont commercialisées.

3.2. Méthodes d’identification moléculaires

1. Sondes chimioluminescentes. De telles sondes sont disponibles pour les bacilles de la tuberculose et d’autres espèces mycobactériennes. Dans ce test, une sonde d’ADN complémentaire d’ARN ribosomal-16S marquée par un ester d’acridinium est mise en présence d’un lysat de culture (milieux solides ou milieux liquides). Après hybridation avec l’ARN ribosomal et élimination des fragments de sonde non hybridés, la sonde hybri-dée est détectée par chimioluminescence à l’aide d’un luminomètre.

2. Tests d’hybridation inverse sur bandelettes. Dans ce test, les séquences cibles sont amplifiées par PCR en utilisant des amorces biotinylées. Les produits amplifiés sont alors hybridés à des sondes fixées sur membrane de nitrocellulose, couvrant le fragment de séquence spéci-fique d’espèce. Les hybrides sont détectés par le système avidine-biotine permettant une détection colorimétrique. Les séquences cibles sont selon les fabricants soit la région intergénique d’ARN ribosomal 16S-23S, soit des séquences du gène 23S.

Ces tests peuvent être réalisés sur des cultures liquides ou solides, les résultats sont disponibles en 2-4 heures. Leur spécificité pour les bacilles de la tuberculose est de 100 %. Un test d’hybridation inverse sur bandelettes a été développé pour la différenciation des bacilles de la tuber-culose et la reconnaissance précise de M. tuberculosis, M. bovis et M. bovis BCG. Le test repose sur le polymor-phisme du gène gyrB et la détection de la séquence RD1, absente des souches de BCG. Il faut aussi mentionner une méthode rapide (30 minutes) d’identification des bacilles de la tuberculose par immunochromatographie utilisant un anticorps monoclonal anti-MBP64, commercialisée sous différentes versions selon les pays.

Pour pallier la lenteur relative des méthodes de cultures qui imposent d’importants délais, de nombreux coffrets utilisant des méthodes d’amplification et de détection diverses ont été commercialisés.La PCR (polymerase chain reaction) a été utilisée dès le début des années 1990 pour la détection des bacilles de la tuberculose. D’autres procédés ont été mis au point les années suivantes pour amplifier des séquences géno-miques. On peut citer l’amplification transcriptionnelle qui associe transcriptase inverse et ARN polymérase,

3. Diagnostic bactériologique

Seule l’identification bactériologique de M. tuberculosis ou des autres bacilles de la tuberculose plus rarement rencontrés, principalement M. bovis et M. africanum, permet de confirmer le diagnostic de tuberculose car les éléments cliques et radiologiques ne sont que présomptifs. Le genre Mycobacterium représente plus de 150 espèces largement présentes dans l’environnement dont plusieurs sont également pathogènes pour l’homme mais non trans-missibles de patient à patient. L’identification précise de l’espèce est donc essentielle.

3.1. Méthodes conventionnellesLe diagnostic bactériologique est un diagnostic direct, selon des méthodes conventionnelles par examen micros-copique direct, mise en culture du prélèvement et iden-tification de M. tuberculosis avec étude de la sensibilité aux antituberculeux. Ces méthodes conventionnelles sont réalisées en association ou non avec des tests molécu-laires d’amplification génique qui permettent de s’affran-chir de la lenteur de croissance des bacilles. En effet, M. tuberculosis se caractérise par un temps de génération d’environ 20 heures (20 minutes pour Escherichia coli). Les méthodes rapides sont évidemment à privilégier pour la prise en charge adéquate du patient.L’examen microscopique avec la coloration spécifique de Ziehl-Neelsen ou de ses variantes met en évidence l’acido-alcoolo-résistance des mycobactéries. C’est grâce à cet examen que sont diagnostiqués la vaste majorité des patients dans le monde. Bien que toutes les myco-bactéries et pas seulement M. tuberculosis présentent cette propriété, la spécificité du test est élevée dans les pays à forte endémie tuberculeuse. Les avantages de l’examen microscopique sont la rapidité d’exécution, le faible coût, l’accessibilité, et l’identification des patients les plus contagieux. Le test souffre d’un manque de sen-sibilité important car la détection n’est fiable qu’à partir de 10 000 bacilles par ml.La culture des bacilles est beaucoup plus sensible et per-met de détecter 10 bacilles par ml mais la lenteur de la technique est un réel handicap. Les prélèvements broncho-pulmonaires ou de toute autre source non stérile doivent être décontaminés pour éliminer la flore associée car il n’y a pas de milieu sélectif pour les mycobactéries. Bien au contraire, M. tuberculosis est un bacille exigeant qui doit être cultivé sur milieu complexe. Les traitements préalables à l’ensemencement sont critiques car trop drastiques, ils peuvent stériliser le prélèvement et conduire à des faux négatifs, trop légers ils peuvent entraîner une contami-nation massive de la culture qui masquerait les bacilles de la tuberculose éventuellement présents. Sur le milieu solide traditionnel de Löwenstein-Jensen, M. tuberculosis se développe en 3 semaines. La culture en milieu liquide permet de réduire le délai d’apparition de la positivité à 10-15 jours en moyenne, selon la richesse bacillaire du prélèvement. La recommandation actuelle est l’utilisation en parallèle d’un milieu solide pour assurer le meilleur taux de recouvrement, détecter d’éventuelles cultures mixtes et assurer une culture en cas de contamination du milieu liquide. Des automates avec incubateurs incorporés



l’amplification-ligation qui utilise la T4 ADN ligase, l’ampli-fication par déplacement de brin qui associe l’enzyme de Klenow, l’enzyme de restriction HincII, des désoxy-nucléotides dont l’un est modifié et deux jeux d’amorces complémentaires, et la Q-β amplification utilisant la Q-β réplicase.Les techniques de détection génomique après amplifi-cation doivent être réalisées sur des produits patholo-giques décontaminés, généralement avec de la soude et de la N-acétyl- L-cystéine. L’étape suivante, l’extraction d’ADN, est un préalable indispensable à la détection des mycobactéries dont la composition pariétale est un obs-tacle à un bon rendement de lyse. Des agents physiques (ultrasons, chauffage) et chimiques (SDS, triton X100) doivent être utilisés.

3.3. Méthodes de détection moléculairesDe nombreuses études comparatives évaluant la sensi-bilité, la spécificité, les valeurs prédictives positives et négatives des trousses commercialisées ont été publiées. L’analyse montre que :– la sensibilité des méthodes commercialisées d’amplifi-cation génomique est plutôt inférieure à celle de la culture (sensibilité autour de 100 bacilles/ml) ;– la sensibilité est excellente (supérieure à 90 %) pour des prélèvements dont l’examen direct est positif, mais demeure faible pour les échantillons paucibacillaires (environ 50 %) ;– la sensibilité des trousses évaluées est globalement comparable ;– la spécificité des méthodes est excellente.L’utilisation des techniques commerciales d’amplification destinées au diagnostic de la tuberculose pulmonaire dans les formes extrapulmonaires a montré une moindre sensibi-lité que celle obtenue pour les prélèvements pulmonaires. Ceci peut être expliqué par une difficulté accrue à obtenir un échantillon quantitativement important et homogène pour l’extraction, mais aussi du fait d’une faible charge microbienne dans ces échantillons.

4. Mesure de la sensibilité

aux antituberculeux

La réalisation d’un antibiogramme est justifiée pour tout isolement de M. tuberculosis. Les antibiotiques à tes-ter en première intention sont isoniazide, rifampicine et éthambutol. En cas de suspicion de résistance (malade déjà traité, cas contact de patient connu pour tubercu-lose à bacilles résistants), la souche doit être adressée à un laboratoire spécialisé pour la réalisation d’un anti-biogramme étendu. La méthode des proportions est la méthode de référence. Développée à l’origine sur milieu solide de Löwenstein-Jensen, la méthode a été adaptée à l’utilisation en milieu liquide ce qui permet de réduire considérablement les délais d’obtention des résultats. Sur milieu solide, il faut de 3 à 4 semaines pour une culture positive et de 4 à 6 semaines pour l’antibiogramme à partir de cette culture soit un délai de 7 à 10 semaines depuis l’obtention du prélèvement. En milieu liquide, ce délai se situe entre 2 à 4 semaines.

Des tests de détection rapide des résistances ont été développés par biologie moléculaire. Il s’agit de tests d’hybridation inverse sur bandelettes réalisables sur cultures ou sur prélèvements à microscopie positive ciblant le gène rpoB dont les mutations sont responsables de la résistance à la rifampicine. L’OMS recommande l’usage de ces tests pour le diagnostic rapide de la multi-résistance aux antituberculeux chez les nouveaux patients des régions où l’incidence de multi-résistance est élevée. En effet, comme le taux de mutation conduisant à la résistance à la rifampicine est beaucoup plus bas que celui de l‘isoniazide, la probabilité qu’une souche résistante à la rifampicine le soit aussi à l’isoniazide est très élevée. L’OMS recommande également un test récemment développé (en 2011) et qui consiste en une PCR en temps réel, semi-nichée, combinant dans une cartouche unique traitement de l’échantillon, détection des cibles (fragments du gène rpoB) et amplification enzymatique [5]. Ce test a une sensibilité supérieure à celle des bandelettes comparable à celui des autres tests d’amplification génique (environ 100 bacilles/ml). Ces deux tests diffèrent beaucoup dans leurs conditions d’ap-plication. Les tests d’hybridation inverse sur bandelettes nécessitent un savoir faire de biologie moléculaire et l’agencement approprié du laboratoire pour éviter les contaminations par les amplicons mais peu de matériel autre que le matériel standard pour biologie moléculaire. À l’inverse le test en cartouche nécessite l’investisse-ment coûteux d’un thermocycleur en temps réel mais peu de savoir-faire humain et un environnement sans pré-requis spécifiques.L’OMS souligne que ces tests ne peuvent remplacer les besoins en culture et antibiogramme conventionnel, seuls capables de suivre l’évolution bactériologique sous traitement et de détecter les résistances aux anti-biotiques autres que la rifampicine. En France, il est recommandé de recourir à ces tests pour les patients à risque de multi-résistance : échecs thérapeutiques, patients ayant reçu plusieurs traitements antitubercu-leux, personnes provenant de pays à forte endémie de tuberculose multi-résistante, contacts de patients à tuberculose multi-résistante. Les résultats des tests moléculaires montrant une résistance doivent être confir-més par un antibiogramme conventionnel, élargi aux antibiotiques de deuxième ligne pour déterminer avec fiabilité les antibiotiques encore actifs.

5. Typage moléculaire

L’épidémiologie moléculaire est une approche multidisci-plinaire qui intègre des données de biologie moléculaire, de médecine clinique, et d’épidémiologie, en associant les caractéristiques épidémiologiques des patients aux propriétés biologiques des souches isolées [6]. L’épi-démiologie moléculaire repose sur le postulat que les patients infectés avec des souches à profil génomique identique sont épidémiologiquement liés alors que ceux infectés avec des souches à profil distinct ne le sont pas. Pour valider cette hypothèse, les propriétés des mar-queurs génomiques doivent être assez polymorphes pour distinguer des souches différentes mais suffisamment


77 pb, dans les régions intercistroniques de différents opérons. Les unités MIRU sont dupliquées en nombre variable selon les souches et selon les loci. La technique consiste en l’amplification des régions flanquantes des MIRUs puis à la détermination de la taille des produits amplifiés, qui reflètent le nombre de copies de l’élément au locus étudié. Le profil génétique de chaque souche ne correspond pas à une image, mais se réduit à un nombre à 15 chiffres (comparable à un code-barres), chaque chiffre correspondant au nombre de répétition de MIRU dans chacun des 15 loci étudiés. Le format numérique des données est simple et reproductibleAppliqué à la tuberculose, le typage moléculaire permet d’étudier la dynamique de la transmission de la mala-die en identifiant les groupes de transmission récente, les facteurs de risque associés et l’identification des cas index ; de confirmer des épidémies communau-taires, familiales ou survenues dans des lieux spécifiques (prisons, hôpitaux, abris pour sans domicile fixe,…) ; de différencier réactivation endogène et réinfection exo-gène ; et d’assurer la surveillance de la tuberculose multi-résistante. La surveillance de la tuberculose multi-résistante au niveau national est devenue systématique dans plusieurs pays, en particulier en France. Ainsi le typage moléculaire des souches multi-résistantes isolées en 2009 a montré que 2 cas étaient secondaires à des transmissions familiales [4].Le typage moléculaire a permis d’identifier des familles génétiques particulières, certaines à dissémination res-treinte (comme la famille Cameroun par exemple) et d’autres en expansion au niveau mondial, comme la famille Beijing. Les souches du génotype Beijing apparaissent généti-quement très homogènes et dans de nombreuses zones géographiques, elles sont plus fréquemment isolées chez des patients jeunes que dans les classes d’âge élevées. Ces observations suggèrent que l’émergence et la dis-sémination de cette famille sont récentes. De plus les souches Beijing sont fréquemment associées à des pro-fils de résistance aux antituberculeux. La famille Beijing est épidémique en Extrême-Orient et dans plusieurs régions des États-Unis, et fréquemment retrouvée à Cuba, en ex-Union soviétique, en Afrique du Sud et dans des pays d’Europe de l’Ouest. Il est frappant de constater la prévalence de la famille Beijing dans des régions à taux élevé de multi-résistance. La question encore non éluci-dée est de savoir si le génotype Beijing a développé des mécanismes efficaces de résistance aux antibiotiques qui n’altèrent pas ou même augmentent sa capacité de transmission dans la communauté.

6. Conclusion

Le financement de la lutte contre la tuberculose s’élève à 4,4 milliards USD en 2012 (3,5 milliards USD en 2006). La plus grande partie de ce financement va au diagnostic et au traitement de la tuberculose non résistante. Les pays du groupe BRICS (Brésil, Fédération de Russie, Inde, Chine, Afrique du Sud) ont investi 2,1 milliards USD dans la lutte contre la tuberculose en 2010, à 95 % à l’aide de sources nationales. Si le financement de la tuberculose multi-résistante est en augmentation et

stables pour que les différents isolements d’une même souche soient reconnus comme identiques. La stabilité des marqueurs est évidemment essentielle en tubercu-lose où le délai entre infection et diagnostic peut s’étaler sur plusieurs mois.

5.1. Première méthode de référenceLa première méthode de référence dite « méthode RFLP IS6110 » repose sur la détermination du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) pré-sentant la séquence IS6110, une séquence d’insertion, soit un petit élément génétique mobile ne comportant que les gènes nécessaires à sa transposition et à sa régulation. L’élément est spécifique des bacilles de la tuberculose et absent des autres espèces mycobacté-riennes. Le nombre de copies de IS6110 est variable d’une souche à l’autre ainsi que leur localisation sur le chromosome. Ce polymorphisme de distribution de IS6110 est le résultat de transpositions ou de divers événements génétiques successifs survenus au cours de l’évolution des bacilles de la tuberculose. La stan-dardisation de la méthode RFLP IS6110 a contribué à sa généralisation et à la constitution de larges banques de données constituées des profils génomiques des milliers de souches étudiées. La réalisation technique (extraction de l’ADN, purification, digestion, électrophorèse, transfert sur membrane, hybridation, révélation) s’effectue sur une dizaine de jours. En plus d’être lente, la méthode est lourde car elle nécessite plusieurs milligrammes de culture mycobactérienne, l’ADN doit être très pur et de bonne qualité sans dommage physique. Cette méthode est aujourd’hui remplacée par des méthodes rapides amplifiant des régions spécifiques du génome.

5.2. La méthode « spoligotyping »Cette méthode repose sur la détection du polymorphisme de la région DR (direct repeat), une région unique du génome des bacilles de la tuberculose qui contient des répétitions directes parfaitement conservées de 36 pb (identiques pour toutes les souches de M. tubercu-losis) séparées par des séquences variables de 35 à 41 pb. Ces séquences varient d’une souche à l’autre par leur longueur, leur séquence et leur nombre. La méthode « spoligotyping » consiste à amplifier la région DR puis à hybrider les produits d’amplification à une membrane comportant les 43 séquences oligonucléoti-diques variables les plus fréquentes. Les résultats sont très reproductibles et la nature binaire de l’analyse (pré-sence ou absence de la séquence fixée à la membrane) permet une interprétation facile des données et leur échange inter-laboratoires. De plus la méthode permet de reconnaître facilement les familles génétiques de M. tuberculosis.

5.3. La nouvelle méthode de référence : le typage MIRUElle s’appuie sur le polymorphisme d’une classe d’élé-ments répétés, les MIRU (mycobacterial interspersed repetitive units). Le séquençage complet de M. tuber-culosis H37Rv a révélé 41 loci d’intégration de ces éléments, constitués de séquences répétées de 51 à



Références[1] WHO report Global tuberculosis control 2011[2] Antoine D, Che D. Les cas de tuberculose déclarés en France en 2010. BEH 2012 ;24-25:285-91.[3] Veziris N, Jarlier V, Robert J. La résistance aux antituberculeux en France en 2009-2010. BEH 2012 ;24-25:291-3.[4] Rieder H. Tuberculose en France : la vigilance reste nécessaire. BEH 2012 ;24-25:283.

[5] World Health Organization. Policy statement : Automated real-time

nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detec-

tion of tuberculosis and rifampicin resistance : Xpert MTB/RIF system.

WHO, Geneva WHO/HTM/TB/2011.4, 2011 available at http://whqlib [1]

doc.who.int/publications/2011/9789241501545_eng.pdf

[6] Vincent V, Gutierrez MC. Épidémiologie moléculaire de Mycobacterium

tuberculosis. In : Mycobacterium tuberculosis et mycobactéries atypiques,

F. Denis & C. Perronne (eds). 2004, Elsevier, Paris.

devrait atteindre 0,6 milliard USD en 2012, un effort important doit être apporté à l’extension du dépistage et du traitement de la tuberculose multi-résistante pour une couverture universelle.Au niveau mondial, les moyens des laboratoires restent notoirement insuffisants. Parmi les 22 pays qui totalisent 90 % des cas de tuberculose déclarés dans le monde, 8 ne disposent même pas d’un laboratoire de microscopie

pour 100 000 habitants. Sur l’ensemble des 36 pays où la multi-résistance est très élevée, 20 ne disposent pas d’un laboratoire capable d’effectuer des mises en culture de M. tuberculosis et des tests de sensibilité aux antituberculeux pour 5 millions d’habitants [1].

Déclaration d’intérêts : l’auteur déclare ne pas avoir de conflits

d’intérêts en relation avec cet article.

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Diagnostic bactériologique de la tuberculose