DIAGNOSTIC BACTF RIOLOGIQUE DE NEISSERIA MENINGITIDIS

Magaly Ducos-Galand a, Annie Guiyoule a, Ren~ Pires a, Jean-Michel Alonso a, Muhamed-Kheir Taha a,*

R ( ~ s u m d

Neisseria meningitidis appartient au genre Neisseria de la famille des Neisseriaceae. Deux esp~ces sont pathog~nes pour I'homme : Neisseria gonorrhoeae et N. meningitidis. Ces bact~ries ont la morphologie typique de diplocoques & coloration de Gram n6ga- tive. Ce sont des bact~ries a6robies, immobiles, oxydase et cata- lase positives, acidifiant un nombre limite de glucides. L'identification des souches de N. meningitidis isolees des cas d'infection invasive reste ais6e. Cependant, les souches isol~es du tractus respiratoire peuvent presenter des profils atypiques. Outre I'identification bacteriologique et I'antibiogramme, les souches de N. meningitidis font I'objet de typages antig~niques (serogroupe, s~rotype, s~ro-sous-type). Le s~rogroupe refl~te I'identit~ de la capsule et permet de d6finir les prophylaxies vaccinales et la sur- veillance de cet agent potentiel d'epidemies.

Neisser ia meningi t id is - ident i f icat ion - t y p a g e - s(~rogroupe

- ant ib io t iques .

B a c t e r i o l o g i c a l d i a g n o s i s o f N e i s s e r i a m e n i n g i t i d i s

Neisseria meningitidis belong to the genus Neisseria of the family Neisseriaceae. Two species are pathogenic for humans : Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis. These bacteria have the typical shape of Gram-negative diplococcL They are strict aerobes, non motile, oxydase and catalase positive, acidifying a limited number of sugars. Meningococcal strains that are isolated from invasive infections are usually easily identified. However, strains that are isolated from respiratory pathway may show atypical profiles. Beside their bacteriological determination and antibiotic susceptibility testing, N. meningitidis strains are phenotyped serologically (serogroup, serotype, serosubtype). Serogroup is based on the antigenic nature of the meningococcal capsule. It is cru- cial to determine serogroup to select the appropriate vaccines to prevent secondary cases as weft as for epidemiological sur- veillance of this potentially epidemic bacterium.

Neisser ia meningi t id is - ident i f icat ion - typ ing - s e r o g r o u p -

ant ibiot ics,

a Unite des Neisseria et Centre national de reference des m6ningocoques Institut Pasteur 28, rue du Docteur-Roux ?5?24 Paris cedex 15

* Correspondance mktaha@pasteur.fr

article re~u et accept~ le ! 2 f6vrier 2004.

© Elsevier SAS.

1. Introduction

N eisseria meningitidis appartient au genre Neisseria de la famille des Neisseriaceae. Les bacteries de genre Neisseria sont des

diplocoques a coloration de Gram n~gative dont les faces adjacentes sont souvent aplaties, & I'exception de N. elongata qui se pr6sente sous forme de courts bacilles. Une infection meningococcique invasive est rev616e par la pr6sence des bact6ries dans un site anatomique nor- malement sterile.

2. Pr61~vements biologiques

Les m~ningocoques peuvent ~tre isoles d'h6mocultures et de prel~- vements de liquide cephalo-rachidien (la bact6ri6mie pr6c~de et accompagne la m6ningite). Cependant, la ponction lombaire peut ~tre contre-indiquee en cas d'hypertension intracr&nienne ou de choc sep- tique, mais I'h6moculture permettra alors d'isoler I'agent afin de ne pas retarder I'antibiotherapie. La recherche du m~ningocoque peut ~ga- lement ~tre r6alis6e par ponction articulaire en cas d'arthrite septique, par ponction p~ricardique en cas de p~ricardite & m6ningocoque ou par biopsie cutanee de I~sions de purpura ecchymotique.

Le m6ningocoque est un hSte du tractus respiratoire sup6rieur et peut ~tre retrouv6 dans des prelevements rhino-pharynges, mais cela ne permet pas de confirmer le diagnostic d'une infection invasive & m6nin- gocoque. En effet, I'interaction entre le m~ningocoque et son hSte conduit le plus souvent & un portage rhinopharynge asymptomatique et rarement ~. une infection invasive. Le taux de portage dans la popu- lation g6n6rale est de I'ordre de 1 0 %.

Les pneumonies & m~ningocoque existent. L'h6moculture positive est le meilteur critere de pneumonie invasive. Comme pour toute infection meningococcique invasive, I'isolement d'une IV. meningitidis a partir du tractus respiratoire risque d'entraTner une confusion entre une eventuelle souche de portage (notamment chez un patient souffrant de bronchite chronique) et une souche responsable de I'infection invasive.

3. Examen du liquide c(~phalorachidien (LCR)

Les manipulations ont lieu dans un poste de securite microbiologique & I'aide du materiel sterile adapte.

3.1. Examen macroscop ique

Le liquide est trouble (tous les degr~s existent) & cause de I'hyper- leucocytose. Cependant, I'observation d'un liquide clair ne peut pas 61iminer le diagnostic de meningococcie.

3.2. Examen rn icroscopique

La cytologie montre une hyperleucocytose de degre variable (le LCR normal contient moins de deux elements cellulaire par mm3). Une pre-

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Les infections ~ Neisseria meningitidis : ~pidemiologie, diagnostic, traitement et prevention

dominance des polynucleaires neutrophiles oriente vers une menin- gite & pyog~nes, mais peut egalement 6tre observ~e aux phases pr6- coces d'une meningite virale.

3.3. Co lo ra t ion de Gram

Elle permet parfois d'observer les meningocoques qui apparaissent comme des diplocoques & Gram negatif intra- ou extracellulaires.

3.4. Examen b ioch im ique

• Une hypo-glycorachie est observee graduellement (la normale etant de 0,5 g/L) et le rapport glycorachie/glycemie < 0,23, le glucose du LCR etant consomme par les bacteries.

• Une hyper-proteinorachie, souvent superieure & 1 g/L (la normale etant 0,3-0,5 g/L), reflete I'inflammation meningee avec extravasation des proteines plasmatiques.

3.5. Recherche des an t igenes so lub les

Cette recherche est realisee & I'aide des preparations d'anticorps diri- ges centre les antigenes polysaccharidiques meningococciques. Non seulement elle peut 6tre effectuee dans le LCR, mais egalement dans le serum et dans les urines. L'antibiotherapie n'emp6che pas cette detection.

En general, si le malade est traite depuis moins de 24 h, le LCR repre- sente 1'6chantillon de choix.

Chez les malades traites depuis plus de 24 h, les urines peuvent etre testees. Plusieurs techniques sont utilisees : I'agglutination, la coag- glutination, la contre-immunoelectrophorese.

La fiabilite de la recherche des antigenes solubles reste discutable en terme de specificite et de sensibilit& La sensibilit6 est de I'ordre de 37 % et a ete recemment am61ioree par un traitement ultrasonique pour atteindre 74 % [4]. Cette technique rationnelle et utile souffre de graves defauts dans la qualite et la standardisation des reactifs com- merciaux [6].

4. Mise en culture et diagnostic bact6riologique

Le meningocoque est un germe tr6s fragile, sensible & la chaleur et au froid. II ne faut pas refrigerer les prel~vements. IIs doivent 6tre main- tenus & 37 °C jusqu'& I'arrivee au laboratoire. Lorsque les prel6vements sont transportes & distance, il faut utiliser un milieu de transport qui fournit les conditions de conservation pendant le transport (24 & 48 h). La culture doit 6tre realisee dans les plus brefs delais sur milieux enrichis (gelose au sang-cuit ou gelose GCB supplementee). La cul- ture est realisee & 37 °C, en atmosphere humide enrichie avec 5 & 10 % de CO 2. Les colonies, visibles apr6s 18 h, sont gris~ttres, lisses, & bords reguliers et d'un diametre de 1 ~. 2 mm.

Pour les produits polymicrobiens, les milieux selectifs (par I'adjonction de certains antibiotiques) sont utilises apr6s la primoculture. Le melange inhibiteur VCF (vancomycine, colisitine et fungizone) est sou- vent utilise pour rendre le milieu selectif pour le meningocoque [5].

C a r a c t e r e s b i o c h i m i q u e s

IV. meningitidis est un diplocoque & coloration de Gram negative pos- sedant une cytochrome oxydase et une catalase. Le meningocoque est capable d'acidifier le glucose et le maltose et possede une gamma-glutamyl transferase. Cependant, il existe des souches de IV. meningitidis atypiques : des souches maltose-negatives ou encore (plus rarement) des souches negatives pour la gamma-glutamyl trans- ferase [8].

N. meningitidis est une bacterie aerobie, cependant, la croissance sous conditions d~ana~robie est possible en presence d~un accepteur final d'electron (comme les nitrites). Une galerie simplifiee permet I'iden- tification fiable de IV. meningitidis.

Cette galerie doit comporter :

- un milieu Heart Infusion Agar, pour I'etude des conditions de crois- sance en milieu nutfitif ordinaire ;

- 5 tubes de milieu CTA contenant & une concentration finale de 1 0/o du glucose, du maltose, du levulose, du saccharose et du lactose res- pectivement ;

- un milieu de Mueller-Hinton (MH), pour permettre la determination du serogroupe (sero-agglutination) d'un eventuel meningocoque. La sero-agglutination des bacteries cultivees sur gelose au sang cuit donne parfois des resultats aberrants ou d'interpretation difficile ;

- un milieu hypersaccharose (SA), pour I'etude de la synthese de poly- saccharides qui permet d'etablir le diagnostic de IV. polysacchareae ;

- le substrat necessaire & la recherche de I'activite gamma-glutamyl- transferase (GGT).

5. Ddtermination du sdrogroupe de N. meningitidis aux antibiotiques

La determination du serogroupe de meningocoque isole d'un patient atteint de meningococcie invasive est le complement indispensable de I'identification pour pouvoir instaurer la prophylaxie vaccinale des sujets contacts. Les vaccins actuels protegent contre quatre des serogroupes les plus frequemment incrimines, A, C, Y et W135. II n'existe pas encore de vaccin contre le serogroupe B. La recherche des serogroupes est realisee par agglutination sur lame de verre & partir d'une culture de 18-24 h sur milieu Mueller-Hinton. Le test est generalement realise sur une lame de verre porte-objet par agglutination des corps bacte- riens avec les immunserums sp6cifiques, testes comparativement & une solution d'eau physiologique (NaCI 0,15M).

Quatre cas peuvent se presenter :

- agglutination dans un seul reactif, ce qui permet de determiner le sere- groupe de la souche ;

- agglutination dans plusieurs serums, mais pas d'agglutination en eau physiologique : la souche est polyagglutinable ;

- agglutination dans plusieurs serums et en eau physiologique : la souche est autoagglutinable ;

- aucune agglutination n'est detectee : la souche est non agglutinable.

Les deux derniers resultats sont rarement observes pour les souches invasives, mais frequents pour les souches de portage rhino-pharyng&

6. Etude de la sensibilite de N. meningitidis aux antibiotiques

Le milieu consensus pour cette etude est le milieu de Mueller-Hinton additionne de sang de mouton & 5 % et coule en boftes carrees 12 x 12 cm a. raison de 80 mL par bofte. En effet, I'utilisation de ce milieu a permis une bonne correlation dans une etude comparative recemment realisee entre diff6rents laboratoires europeens [10].

Les boftes sont ensemencees par un inoculum bacterien ajuste & 108 unites-formant-colonie/mL, equivalent & 1 unite MacFarland, et aus- sit6t etale par inondation sur la gelose. Les disques d'antibiotiques et les bandelettes E-test sont deposes sur la bofte & I'aide du distribu- teur adapte ou & I'aide d'une pince metallique sterile. Les boftes sont incubees en position invers6e pendant 24 h & 37 °C sous 5 % de CO 2 avant la lecture des resultats.

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Les antibiotiques testes sont : p6nicilline G, oxacilline, ampicilline, amoxicilline, amoxicilline + ac. clavulanique, cefotaxime, cef- triaxone, streptomycine, spectinomycine, chloramphenicol, tetra- cycline, erythromycine, spiramycine, rifampicine, pefloxacine ou ofloxacine, sulfamides. La recherche d'une eventuelle ~-Iactamase est effectuee & I'aide du reactif Cefinase (Biorad).

Les donnees de I'antibiogramme du CNRM (Centre national de reference des meningocoques et Neisseria apparentees, Institut Pasteur, Paris) entre 1999 et 2002 montrent que toutes les souches invasives (2 167 souches) etaient sensibles au c6fotaxime et & la ceftriaxone, & la spiramycine, au chloramphenicol, & la cipro- floxacine, et & la rifampicine (excepte une souche) [2]. Elles etaient toutes r6sistantes & la streptomycine, et 69 % etaient resistantes aux sulfamides. Les determinations des concentrations minimales inhibitrices (CMI) de la penicilline G ont montre que la CMI de 0,125 mg/L, retenue comme valeur-seuil de sensibilite diminuee, etait atteinte par 31% des souches d'infections invasives. La sen- sibilite diminuee des meningocoques & la penicilline G est direc- tement correlee & des alterations de sequences du gene penA codant la proteine de liaison A la penicilline (PBP2). La diminu- tion de sensibilite & la penicilline G est transferable par transfor- mation d'une souche sensible & partir de I'ADN d'une souche de sensibilite diminuee [2, 3]. Aucune souche de N. meningitidis ~-Iactamase (cefinase) positive n'a 6te caracterisee en France.

7. Envoi des souches au Centre national de r f rence (CNRM)

En tout etat de cause, les souches doivent etre envoyees au CNRM pour complement de typages permettant d'etablir des liens et des evo- lutions epidemiques. Le milieu le plus adapte au transport de ces bac- teries est le milieu << VDK ,, decrit par Vandekerkove et coll. [9] qui doit etre richement ensemence & partir d'une culture pure et incube 18 h & 37 °C avant I'envoi. En effet, ce milieu n'est pas un milieu de culture mais de conservation & temperature ambiante (ne pas placer au froid).

Les souches doivent 6tre accompagnees d'une fiche de renseigne- ments cliniques.

Le CNRM assure I'etude des serogroupes (meme les rares) ainsi que la determination des serotypes et des serosous-types qui definissent le phe- notype selon la formule antigenique (s6rogroupe, serotype, sero-sous-type).

8. Typage ph notypique des souches

La determination du serotype et du sero-sous-type identifie les antigenes des proteines de membrane externe du meningocoque (PorB et PorA respectivement). Ces typages sont realises & I'aide d'une batterie d'an- ticorps monoclonaux par Elisa [1].

Cependant, les techniques immunologiques presentent certaines limites quant & leur utilisation comme outil de caracterisation epidemiologique. En effet, les techniques immunologiques caracterisent des structures Ioca- lisees & la surface de la bacterie, qui sont soumises & des variations anti- geniques importantes, selectionnees par la reponse immunitaire de I'h6te. En effet, le meningocoque est naturellement competent pour la trans- formation, ce qui facilite les echanges horizontaux d'ADN entre souches. Beaucoup de genes codant les proteines utilisees dans le typage ont une structure en mosaTque, ce qui temoigne de leur variabilit& Ces structures refletent donc plus I'interaction qui existe entre la bacterie et I'h6te infecte, que la diversite genetique intrinseque des bacteries etudiees.

De plus, le pool d'anticorps monoclonaux disponibles pour le typage des souches ne couvre pas la totalite des souches existantes, une variation minime au niveau des epitopes pouvant eliminer la reconnaissance par ces anticorps monoclonaux. Par consequent, une proportion non negli- geable de souches reste non caract6risable par la technique Elisa de base utilisee actuellement pour le typage des souches. Elles sont donc non typables (NT) et non sous-typables (NST) par cette methode ; elles sont dites ,, NT:NST ,>.

Le typage phenotypique peut ensuite etre complete par des typages moleculaires, en particulier pour les souches isolees des cas groupes et pour les souches suspectees d'appartenir & certains clones epide- miques [7].

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