Diagnostic prénatal non invasif : Du Génotypage Rhésus Fœtal au Diagnostic de la Trisomie 21

Dr. A. Levy-MozziconacciUnite Fonctionnelle de Biologie Materno-Fœtale et Centre de Médecine Fœtale, APHM, AMU, Marseillea.levy@ap-hm.fr

Diagnostic Prénatal Invasif : Ex : Amniocentèse, Placentocentèse , sang de cordon

Diagnostic prénatal non invasif

Isolement de l’ADN fœtal dans le sang maternel

LE DIAGNOSTIC PRENATAL

Depuis 1975Risque de perte fœtale : > 1% des grossesses

Depuis 2000Risque de perte fœtale : 0

13

L’enjeu est majeur !!!

GRAAL pour certain…

COUPE DU MONDE… pour d’autres

L’enjeu est majeur !!!

Mais la difficulté d’y arriver… aussi

Quelles doivent être les caractéristiques de ce diagnostic ?

• FIABILITE : 100%• FIABILITE : 100%

• APPLICABLE A TOUTES LES FEMMES

• UTILISABLE EN ROUTINE

• COUT RAISONNABLE

Isolement de l’ADN fœtal dans le sang maternel

Centrifugation

Cellules Foetales

Culot cellulaire

Quels sont les sources non

invasives de matériel fœtal ?

LES CELLULES FŒTALES ?

Prélèvement ENDOCERVICAL

SANG MATERNEL

Paterlini-Brechot et al., Lancet 2003

Sifakis et al., Early Human Development, 2010

ETUDE NIFTY (2002)Taux d’echec : 17%Taux de détection : 74,4%

Quels sont les sources non invasives

de matériel fœtal ?

ADN/ARN FŒTAL EXTRACELLULAIRE DANS LE SANG MATERNEL

Isolement de l’ADN fœtal dans le sang maternel

Centrifugation

Cellules Foetales ADN Fœtal « libre »

Plasma ou SérumCulot cellulaire

Lo et al., 1998

Acides nucléiques libres circulants

• 1948 : présence d’ADN et D’ARN libre plasmatique (Mandel et al.,)

• 1970-80 : augmentation ADN sérique chez des patients

• 1970-80 : augmentation ADN sérique chez des patients porteurs de tumeur solide

• 1994 : découverte de mutation oncogène à partir de l’ADN sérique

• 1998: Mise en évidence de l’ADN Fœtal circulant dans le sang maternel (Lo et al., 1998)

FoetusFoetusFoetusFoetus

Analyse quantitative de l’ADN Fœtal dans le Sang Maternel

TermeADN Fœtal/Plasma maternel

ADN Fœtal/Culot cellulaire

11-28 SA

37-43 SA

3,4 %

6,2 %

0,001%

0,01 %

X 3400

X 620

Lo et al., 1998

PCR quantitative en temps réel : RQPCR

Lo et al., 1999

ANEC :

Origine placentaire

500 nm

Microparticules

Hahn S et al. Placenta. 2005 Aug. Review.

500 nm

100 nm

Exosomes

Bonello N.et al 2010

Isolement de l’ADN fœtal dans le sang maternel

Centrifugation

ADN Maternel : 94 à 97%

Cellules Foetales ADN Fœtal « libre »

Plasma ou Sérum

Culot cellulaire

Lo et al., 1998

ADN Maternel : 94 à 97%

ADN Fœtal : 3 à 6 %

Acides nucléiques circulants extracellulaires (ANEC)

PCR quantitative Tps réel ( 2000)

2 Approches

Séquenceur très haut débit (2014)

• Rhésus gènes Rhésus– Alloimmunisation foeto-maternelle

Tps réel ( 2000)

• Sexe gène SRY- Maladie liée à l’X: Hyperplasie des surrénales,

Identification d’un GENE fœtal

non présent chez la mère ♣ Trisomie 21 et autres Aneuploïdies

Quantification de l’ADN fœtal

•

RhD- FREQUENCE EN FRANCE

• Population caucasienne : 15% • Population Afrique subsaharienne : 7%• Population asiatique : 0,3%

• En France : 150 000 RHD- femmes enceintes/an• En France : 150 000 RHD- femmes enceintes/an

• 90 000 femmes RHD- enceintes d’un fetus RHD + :Risque d’immunisation

RhD Pos

RhD Négatif et génotypeRhD Négatif et génotype

Fréquence du Phénotype RhD-Caucasiens : 15% ( délétion RHD >96%)

RHD Neg

Prévention de l’alloPrévention de l’allo--immunisation immunisation RhDRhD foetofoeto--maternellematernelle

�� «« LorsqueLorsque lele génotypagegénotypage fœtalfœtal RhDRhD sursur sangsangmaternelmaternel peutpeut êtreêtre réalisé,réalisé, ilil estest recommandérecommandé dedematernelmaternel peutpeut êtreêtre réalisé,réalisé, ilil estest recommandérecommandé dedel’appliquerl’appliquer afinafin dede limiterlimiter lala prophylaxieprophylaxie RhRh auxauxseulesseules femmesfemmes enceintesenceintes d’enfantd’enfant RhDRhD positifpositif »»(Grade(Grade C)C)

Patiente RhD négatif non immunisée< 12 SA

12-26 SA

Injection d’IgG anti-D cibléeEn casd’évènementscliniquessensibilisants

Injection d’IgG anti-D cibléeEn casd’évènements

GénotypageRhD fœtal

Fœtus RhD négatif

Fœtus RhD positif

ou indéterminé

40%60%

26-28 SA

d’évènementscliniquessensibilisants

Accouchement

Pas deprophylaxie

Ni cibléeNi systématique

Bilan Immuno-Hématologique Mère et Enfant

ou indéterminé

RAI 26-28 SA

Injection systématiqueIgG anti-D : 300 µµµµg IM

Représentation de l’organisation génomique des haplotypes RH D + et RH D -

RHD psy

RhD Pos

Caucasiens : 15% ( délétion RHD >96%)Africains : 3-5% ( 67% sont RHD psy, 18% délétion RHD)

RHD psy

RHD Neg

RhD variant

Quelles doivent être les caractéristiques de ce diagnostic ?

• FIABILITE : 100%• FIABILITE : 100%

• APPLICABLE A TOUTES LES FEMMES

• UTILISABLE EN ROUTINE

• COUT RAISONNABLE

RHD SMP1 RHCE

Structure du gène et de la protéine RH D

Corrélation génotype/phénotype

Classification Phénotype Protéine Gène

RhD neg Rh D neg Absence Deletion

Anomalie quantitative

Subst. a.aminéTmemb ou Intra Cell

Mutation gène présentRh - ou douteux avec

D faibleTmemb ou Intra Cell

( Anti-D : 0)gène présentRh - ou douteux avec

Du+

D partiel

Anomalie qualitative

Subst. a.aminéSurface GR

( Anti-D possible ) Mutationgène présent

Rh - ou douteux ou Rh D +

avec Du douteux

Recherche D partiel ( EFS)

D ψψψψ Rh D Neg

Absence

(Anti-D +)

Insertion 36pb(intron4-exon5)gène présent *

Risque Risque d’immunisationd’immunisation

HaplotypeHaplotypeDensité en Densité en ag/ celluleag/ cellule

Nucléotide Nucléotide changéchangé

AllèleAllèleTypeType

Pas d’alloPas d’allo--antianti--D D documentédocumenté

CDeCDe533 533 -- 1.1971.197 T GT G en en 809809RHD(V270G)RHD(V270G)11

Peut causer une Peut causer une immunisation immunisation antianti--DD

cDEcDE446 446 -- 950950C G en C G en 5252

G A en G A en 809809RHD (L18V, RHD (L18V, V270G)V270G)

22

Des alloDes allo--anti D anti D peuvent être observépeuvent être observé

cDecDe1.872 1.872 -- 1.9191.919

C G en 602C G en 602

T G en 667T G en 667

G A en 819G A en 819

RHD (T201R, RHD (T201R, F223V)F223V)

44

G A en 819G A en 819

??cDEcDE218 218 -- 386386C A en 446C A en 446RHD (A149D)RHD (A149D)55

AlloAllo--antianti--D à titre D à titre élévé documenté élévé documenté avec l’haplotype avec l’haplotype cDecDe

cDe ou cDe ou CDeCDe

183183G T en 885G T en 885

RHD (M295)RHD (M295)1111

Pas d’alloPas d’allo--antianti--D D documentédocumenté

CDeCDe66 66 C T en 340C T en 340RHD RHD (R114W)(R114W)

1717

Rhesusbase www.uni-ulm.de

Partenariat avec la Tunisie

sensibilitésensibilité 99,65%99,65%

spécificitéspécificité 96,04%96,04%

VPPVPP 98,42%98,42%

VPVP 19941994

FPFP 3232

VNVN 777777VPNVPN 99,11%99,11%

exactitudeexactitude 98,61%98,61%

VNVN 777777

FNFN 77

2% de cas où le génotypage Rhesus foetal sur sangmaterneln’a pas pu être conclu

(n= 2810)

CREATION D’UNE PLATEFORME PACA DE DPNI

2009-2014 : Diffusion des analyses de DPNI dans toute la région PACA ( financement ARS) :

Création d’un réseau de soin PACA autour d’un seul laboratoire REFERENT (APHM)

20

-750 prescripteurs PACA-Toutes les maternités publiques et privées- Les PMI- 350 Laboratoires privés

Acides nucléiques circulants extracellulaires (ANEC)

PCR quantitative Tps réel ( 2000)

2 approches

Séquenceur très haut débit (2014)

• Rhésus gènes Rhésus– Alloimmunisation foeto-maternelle

Tps réel ( 2000)

• Sexe gène SRY- Maladie liée à l’X: Hyperplasie des surrénales,

Identification d’un GENE fœtal

non présent chez la mère ♣ Trisomie 21 et autres Aneuploïdies

Quantification de l’ADN fœtal

•

Prénatal diagnosis, 2012,32:1-2

Séquençage à très haut débit (Technologie Illumina)

Norwitz, Rev Obstet Gynecol. 2013;6(2):48-62

Publications 2012Populations à haut risque

Etude N N aneuploidies

Sens. Spéc.

Sparks 167 T21 : 36T18 : 8

T21 : 100%T18 : 100%

T21 : 100%T18 : 100%

Aschoor 397 T21: 50T18 : 50

T21 : 100%T18 : 98%

T21 : 100%T18 : 100%

Bianchi 532 T21 : 89T18 : 36T13 : 14XO : 16

T21 : 100 %T18 : 97,2 %T13 : 78,6%XO : 93,8%

T21 : 100%T18 : 100%T13 :100 %XO :99,8 %

Norton 3228 T21 : 81T18 : 38

T21 : 100%T18 : 97,4%

T21 : 99,97%T18 : 99,93%

Conclusions sur l’évolution du dépistage de la trisomie 21

Période Type de dépistage Sensibilité Faux +

Années 70 Age maternel 30% 5%Années 70 Age maternel 30% 5%

Années 80 Age + MS 2è T 70% 5%

Années 90 Age + CN 80% 5%

Années 2000 Age + CN + MS 1er T 85-90% 3-5%

Années 2010 DPNI > 99% <1%

Trisomie 21: avis favorable du comitéd'éthique sur le nouveau test de diagnosticLEXPRESS.fr, publié le 25/04/2013

Le Comité d'éthique a indiqué que le nouveau test dedépistage de la trisomie 21 "correspond à unedépistage de la trisomie 21 "correspond à uneamélioration technique du dépistage" actuel, par sa"plus grande facilité" et avec "moins d'effet

secondaires".

MST1

ACTUEL AVENIR

MST1

>1/250>1/250

Prélèvement invasifFISH, Caryotype foetal

5% des grossesses

>1/250

Recherche T21 sur ADN fœtal/ Sg maternel

Si positif

1% des grossesses

Insertion dans le dépistage actuel ?

Test combiné

Option 1 Option 2

DPNI

Option 3

DPNI à 10 SA

DPNI

Confirmation par Test invasif

Confirmation par Test invasif

Echo 12 SATest combiné si échec DPNI

Test invasif pour confirmation ousigne d’appel écho

Et demain …

Remerciements