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Différenciation des cellules intestinales Cellules absorbantes Cellules sécrétrices stem cell -Math1 cellules de Paneth cellules en gobelet cellules endocrines ? ? ngn3 -Math1 +Math1 Matrice extracellulaire p27

Différenciation des cellules intestinales Cellules absorbantes Cellules sécrétrices stem cell -Math1 cellules de Paneth cellules en gobelet cellules endocrines

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Différenciation des cellules intestinales

Cellules absorbantes

Cellules sécrétrices

stem cell

-Math1

cellules de Paneth

cellules en gobelet

cellules endocrines

? ? ngn3

-Math1 +Math1

Matrice extracellulairep27

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La voie Notch dans la différenciation intestinale

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Signalisation Notch

• Notch: molécule transmembranaire

• 4 récepteurs (notch 1, …) et 5 ligands (delta 1-3 -4 ou jagged 1-2)

• Lorsque notch interagit avec son ligand):Clivage de la partie intracellulaire de notch (Notch IntraCellular Domain), translocation dans le noyau

• Activation de la transcription de gènes

• « interrupteur »

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Notch et différenciation

• Notch est impliqué dans le devenir des cellules lors du développement

Chez l’adulte, permet le maintien de l’homeostasie

• Cibles de la signalisation Notch: Math-1, Hes-1, ngn3 qui sont impliqués dans la différenciation

• Surexpression de NICD (partie intracelllulaire de Notch) dans des souris transgéniques entraîne blocage de la différenciation des cellules sécrétrices.

• La signalisation notch est essentielle dans les cryptes pour maintenir l’état indifférencié et prolifératif des cellules progénitrices.

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Notch signals control the fate of immature progenitor cells in the intestine

Fre et al.

Nature (2005) 435; 964-968

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introduction

• Les signaux via Notch sont impliqués dans le développement de nombreux types cellulaires (cellules nerveuses, hématopoïétiques,…).

• La modulation de ces signaux peuvent donc affecter la différenciation, la prolifération, l’apoptose des cellules. Notch est un inhibiteur de la différenciation de nombreux types cellulaires

• math-1, ngn3 modulent la différenciation. Ces facteurs sont contrôlés par Notch

• Rôle du signal Notch dans la différenciation et la prolifération des cellules précurseur dans l’intestin

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stratégie

• Création de souris transgéniques

• Expression d’une forme constitutivement active de Notch

• Utilisation du promoteur de la villine: la forme constitutivement active de la villine est présente dans toutes les cellules intestinales y compris dans les cellules souches.

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Effet sur la différenciation(cellules en gobelet)

• Coloration au bleu cyan

• Cellules en gobelet

WT Notch actif

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Effet sur la différenciation(cellules endocrine)

• Marquage de la chromogranine A(Marqueur général des cellules endocrines)

WT Notch actif

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conclusion

• L’expression de Notch entraîne la déplétion de cellules en gobelet et des cellules enteroendocrines

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Notch et cryptdine

wtNotch

L’expression constitutive de Notch inhibe l’expression de cryptdine et donc la différenciation des cellules de Paneth

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Donc…

• L’expression de notch constitutivement active provoque la déplétion des cellules sécrétrices

• À rapprocher du résultat suivant:

la surexpression de NICD (partie intracelllulaire de Notch) dans des souris transgéniques entraîne blocage de la différenciation des cellules sécrétrices.

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Notch et facteurs de transcription

wtNotch

L’expression constitutive de Notch entraîne: la surexpression de Hes-1, la sous-expression de Math-1 et de Ngn3

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Notch et Hes-1localisation de Hes-1

• Notch augmente la concentration nucléaire de hes-1

wt

notch

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Cellules sécrétrices

stem cell

cellules de Paneth

cellules en gobelet

? ? ngn3

+Math1-hes1

Notch

•La surexpression de notch entraîne la déplétion des cellules sécrétrices en modulant l’expression des facteurs de transcription.

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Statut d’autres facteurs de transcription regulés par notch

• Hes5, Hey-1…

• Pas d’effet de notch sur ces facteurs

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Effet de notch sur la prolifération

• Selon le contexte cellulaire, la signalisation Notch peut influencer la prolifération cellulaire.

• Qu’en est il dans l’intestin?

Ki67

wt Notch

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Effet de notch sur la prolifération

Brdu (marquage 30’ sacrifice 24 heures après)

wt Notch

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Conclusion

Notch augmente le nombre de cellules qui prolifèrent

(Expansion du compartiment de prolifération)

Pourquoi en Wt y a t’il des cellules Brdu + dans la villosité)?

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Notch et morphologie

wt

Notch

Notch diminue le nombre de microvillosités au niveau du domaine apical

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WT

Notch

Microvillosités moins uniformes et moins rigidesRessemble a des cellules immatures, faiblement différenciées

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conclusions

• La signalisation Notch semble importante dans l’intestin et particulièrement dans les cryptes.

• Notch empêche la différenciation en modulant l’expression de Hes-1, ngn3,…

• Elle maintient l’état indifférencié et prolifératif des cellules des cryptes

• Interrelations avec d’autres voies ( voie wnt) voir TD2

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Différenciation des cellules de Paneth

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Cellules de Paneth

• Cellules sécrétrices (lysosyme, cryptdines, defensines)

• Cellules localisées dans les cryptes

• Elles achèvent leur différenciation lors de leur migration dans la base des cryptes.

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De la cellule souche à la cellule de Paneth

Auto-renouvellementCellule souche

Spécification(secretion)

Tris(rester dans les cryptes)

Différenciation

MORT (autophagie)

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Différenciation des cellules sécrétrices

Cellules absorbantes Cellules sécrétrices

stem cell

-Math1Hes1

+Math1Hes1

cellules de Paneth

cellules en gobelet

cellules endocrines

? ? ngn3

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Hes-1-deficient mice show precocious differentiation of paneth cells in the small

intestine

Suzuki et al., 2005

Biochem Biophys Res Commun328 (2005) 348-352

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introduction

• Hes-1, facteur de transcription (régulé par Notch)

• souris déficientes en Hes-1: différenciation excessive des cellules endocrines (pancréas)

Utilisation de souris KO pour Hes-1: étude du role de Hes-1 sur la différenciation des cellules de Paneth.

Utilisation des souris juste après la naissance. A ce stade, il n’existe pas de cellules de Paneth dans les intestins de souris normales

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Expression du lysosyme et des cryptdines dans les intestins murins

• RT-PCR semi quantitative

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conclusion

• Lysosyme: augmentation des ARNm dans l’intestin des souris KO Hes1

• Idem pour les cryptidines -1, -4, -5

• Hes1 module négativement l’expression des marqueurs de cellules de Paneth

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Expression de marqueurs in situHes1

• Hes-1: pas de Hes-1 dans les cellules Ko pour cette molécule.

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Expression de marqueurs in situlysosyme

• Lysosyme positive cells

Villus intervillous

WT 0 0,03

Ko 0,8 0,49

WT Ko Hes1

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Expression de marqueurs in situcryptdine-4

• cryptidine positive cells

Villus intervillous

WT 0 0,21

Ko 2,7 0,82

WT Ko Hes1

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conclusions

• Cellules difficilement détectables dans les souris normales

• Augmentation de l’expression dans les souris hes1 KO

• Développement précoce de cellules de paneth dans les souris KO

• Hes1 a un effet inhibiteur sur la différenciation des cellules de Paneth

• Présence des cellules de Paneth dans les villosités: Hes1 jouerait un rôle dans la distribution des cellules (tri)

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Microscopie electronique

WT

KO

• Souris KO Hes1: présence de cellules contenant de nombreux granules (cellules de Paneth)

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Expression de Ki67

• Ki67: présence dans les cellules progénitrices capables de proliférer.

WT KO

Hes1KO: présence de cellules progénitrices dans la villosité.

Hes1 module la localisation des cellules progénitrices

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• Les souris déficientes en Hes-1 possédent une différenciation précoce par rapport aux souris normales.

• Hes1 joue un role inhibiteur dans la différenciation des cellules de Paneth

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Différenciation des cellules de PanethAutres voies impliquées…

EphB/ephrinB

• ephB(récepteurs)/ephrinB(ligands)• ephB: récepteurs à tyrosine kinase• Leur interactions implique des interactions cellule-cellule:

répulsion des cellules.• Variation d’expression des ephrines dans l’axe’ crypte/villosité

• Mutation d’une ephrinB

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Marquage du lysosyme

WT EphB mutée

•EphB/ephrinB contrôle la localisation des cellules de Paneth.

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Différenciation des cellules dePaneth

• Autres voies de signalisations impliquées…

Wnt

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La voie Wnt

• En absence de voie wnt, la caténine est associée a un complexe: ubiquitinilation et dégradation

l’activation de la voie wnt inhibe le complexe, la caténine est stabilisée, transloquée dans le noyau. Interaction avec les facteurs de transcription TCF: transcription de gènes spécifiques.

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Implication de la voie wnt dans l’intestin

• Dans les cellules qui prolifèrent, il y a accumulation de catenine nucléaire et de Tcf4: forte signalisation wnt

• L’activation de la voie wnt entraîne la formation d’adénomes

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Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts

• Van Es et al. Nature cell biology (2005) 7. 381-386

• Utilisation d’embryon de souris TCF-

• Analyse de l’expression des marqueurs de cellules de Paneth

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Localisation de TCF4 et de caténinedans l’intestin normal

Tcf 4 catenin

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conclusion

• Les noyaux des cellules de Paneth contiennent une accumulation de -catenine et de Tcf-4: la voie wnt est sans doute impliquée.

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Hybridation in situ

• WT: si les cellules de Paneth ne sont pas morphologiquement observables dans les embryons, certaines cellules expriment des cryptdines

• Ko TCF: pas d’expression de cryptdines

WT WT

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conclusion

• Souris normales: expression de cryptdines

• Souris Tcf4-: perte d’expression des cryptdines

• Tcf4 participe à la différenciation des cellules de Paneth

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La voie Wnt

• Différents récepteurs Frizzled:

• Frizzled 5 et frizzled 6 sont fortement exprimés dans l’intestin normal.

• fz6: dans toutes les cellules épithéliales sauf les cellules de Paneth

• Et fz5?

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Localisation de frizzled 5

embryon adulte

• Frizzled 5 est localisée uniquement dans les cellules de Paneth

• Activation de la voie wnt via activation de Fz5?

• Souris mutantes pour Fz5…

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Localisation du lysosyme

Les cellules de Paneth sont distribuées de façon aléatoire le long de l’axe crypte-villosité si Fz5 mutée.

Fz5 participe à la localisation des cellules de Paneth.

WT Ko FZ5

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Et l’EphB/ephrineB?Souris FZ5-

• Les cellules de Paneth mal positionnées n’expriment pas ephB…Qui est un gène cible de Tcf4

• Fz5 activerait la voie wnt , qui activerait l’expression de eph B qui permet le positionnement des cellules de Paneth dans les cryptes.

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-catenine

Souris Fz5-

• La -catenine nucléaire est absente des cellules de Paneth mal positionnées

• Fz5 activerait la voie wnt , la beta catenine transloque dans le noyau et interagit avec Tcf4. Cela activerait l’expression de eph B qui permet le positionnement des cellules de Paneth dans les cryptes.

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Frizzled 5

Expression de Eph BPositionnement Des cellules dePaneth dans les cryptes