MC BénéGrenoble 19 Janvier 2010

GC FaureGrenoble 12/12/2011

Où l’on cherche à identifier les leucocytes…. Identifier : techniques morphologiques

Étalement Séparation (gradients de densité) Cytocentrifugats Colorations Cytochimie

Compter Hémocytomètres Appareils de numération

Les limites de la technique Identification des « blastes » Sous populations

lymphocytaires « Rosettes mouton » … et

leurs dérivés Premiers anticorps …

polyclonaux : anti-immunoglobulines (von Behring) , TdT (90’s)

ANTICORPS POLYCLONAUX

Anticorps polyclonaux : « Gros » animaux

Vaccination avec rappels

Saignées répétées

Mélange d ’anticorps sériques- contre plusieurs épitopes-certains sans réactivité pour l ’antigèneTitre de chaque anticorps différent d’un animal à l’autre

TdT+,TdT+,cALL cALL

(CD10)+(CD10)+lymphoid lymphoid

blast crisisblast crisisof Ph’+ of Ph’+ chronic chronic myeloid myeloid

leukaemialeukaemia

(Lancet ii: 1058, (Lancet ii: 1058, 1976)1976)

La révolution de César Milstein et Georges Köhler Petite histoire…. 1976, Milstein travaille sur la diversité des

immunoglobulines et va faire une conférence à Bâle Générer une lignée cellulaire productrice d’anticorps

dirigés … contre des hématies de mouton pour travailler sur les mutations somatiques des gènes d’immunoglobuline

A l’époque la question de la spécificité des anticorps était encore débattue et on se battait avec la purification des anticorps polyclonaux

Dream No.1Dream No.1 Flow cytometry can be used for clinical leukaemia Flow cytometry can be used for clinical leukaemia diagnosis on the ‘immunophenotyping’ platformdiagnosis on the ‘immunophenotyping’ platform

anti-ALL (24 absorptions!)anti-ALL (24 absorptions!) fetal development: fetal development: BM is a lymphoid organBM is a lymphoid organ

Melvyn Greaves, Melvyn Greaves, Geoff Brown and Geoff Brown and George JanossyGeorge Janossy

Dream No.2 from G.JanossyDream No.2 from G.Janossy Monoclonal antibodies can be used for visualizing cells in Monoclonal antibodies can be used for visualizing cells in tissues, normal and pathological (‘monoclonal immunohistology’ tissues, normal and pathological (‘monoclonal immunohistology’ platform)platform)

CD1 (NA1/34) on CD1 (NA1/34) on human thymus:human thymus:The first ever tissue The first ever tissue section stained bysection stained bythe first anti-human the first anti-human monoclonal antibodymonoclonal antibody

CD1 (NA1-34) and CD1 (NA1-34) and CD45 (2D1) for T-ALL CD45 (2D1) for T-ALL diagnosis and thymicdiagnosis and thymicoriginorigin

Ken Bradstock, Gianni Pizzolo

Bradstock KF, Janossy G, Bollum FJ, Milstein C. Anomalous phenotype Bradstock KF, Janossy G, Bollum FJ, Milstein C. Anomalous phenotype in thymic acute lymphoblastic leukaemia. in thymic acute lymphoblastic leukaemia. NatureNature 1980; 284(5755): 1980; 284(5755): 455-7.455-7.

Lignée de myélome murinDéficiente en HGPRTImmunisation

Rate

Pas de fusion

--+

Sélection des clones

réactifs

Clones

Fusionen milieu

HAT

HYPOXANTHINEAMINOPTERINETHYMIDINE

Anticorps monoclonaux

Une explosion internationale Production d’anticorps monoclonaux dans tous les

laboratoires : liquides d’ascite Identification sur les cellules disponibles/connues

dans le laboratoire producteur Redondances+++ Organisation indispensable

Héritage du HLA Culture de la workshop (atelier) Premier atelier Human Leukocyte Differentiation Antigens, 1981/82, 55 équipes de 14 pays, 12 « fournisseurs »

Qu’est-ce qu’une workshop HLDA? Séries d’anticorps « proposés » pour une spécificité

donnée Aliquotage, anonymisation et dispatching dans labos

volontaires (pipette elbow) Tests sur des cellules données

En immunofluorescence En Western Blot Plus tard avec des techniques moléculaires ou cellulaires plus

sophistiquées Enregistrement de la réactivité observée Génération d’une immense base de données… … confiée aux statisticiens!

La technique de ClusteringL

Hierarchical C lus tering with C V' filtered genes ( MILE S ) Notion de distance

Et donc, les CLUSTERS de différenciation … ou CD!

Notion de CD Clusters de différenciation

Groupes de monoclonaux reconnaissant la même molécule

Par extension, cette molécule CD+ numéro + lettre : ex CD1a Épitopes intracytoplasmiques cCD ou

cyCD Antigènes sialylés CDns (ex CD15s)

Première workshop HLDA Réactivité testée sur

T-PBL Thymus PHA Non T-PBL Tonsils Spleen Monocytes Polymorphs Bone marrow

Anticorps classés en 3 groupes Groupe I : T cells, 70 anticorps (79*) Groupe II : B cells and CALLA, 24 anticorps (36*) Group III : monocytes and myeloid, 45 anticorps (56*)

*avec duplicates et contrôles

Evolution des Workshops HLDA 1982 Paris, 11CD + 4 provisoires 1984 Boston, 11 CD 1987 Oxford, 19 CD 1989 Vienne, 33 CD 1993 Boston, 31 CD 1996 Kobe, 55 CD 2000 Harrogate, 81 CD 2004 Adelaide, 93 CD 2010 Barcelone CD307, 351-363

Adelaide 2004 8th HLDA : 339/350 CDBarcelone 2008 363

Critères HLDA Nouveaux CD

Initialement, au moins deux anticorps issus de deux laboratoires différents

Evolution vers une préidentification par le laboratoire proposant l’anticorps, sur la base d’études moléculaires préalables

Sélection d’anticorps de bonne qualité pour les distributions Blind panel

Anticorps soumis aux workshops sans spécificité identifiée 101 à Harrogate: 31 « décryptés » Souvent des spécificités déjà connues Bon outil de vérification des corrélations intercentres Beaucoup testés sur des lignées

Jusqu’où? Peut être 4 à 5000 molécules?

Sur la base des spots des gels 2D Sur la base des analyses de mRNA Sur la base des analyses en SAGE

(serial analysis of gene expression) Quelle est la part des antigènes intracellulaires dans ces

estimations? Est-ce un réel problème? On estime que 20% des gènes codent pour des protéines

membranaires Des HLDA à l’HCDM :

Human Cell Differentiation MoleculesD’après Heddy Zola, Cell Research 2005

Les CD-anticorps Le plus souvent d’origine murine-souris

Reconnaissance universelle par des anticorps polyclonaux fluorescents anti-souris (lapin, chèvre, âne, cochon…)

Isotypes et sous-classes des immunoglobulines de souris IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b….

Production actuelle en réacteurs Il existe des monoclonaux de rat, notamment pour les

CD murins-souris Il existe des monoclonaux de lapin On peut faire des monoclonaux humains

Les CD-antigènes Surtout des protéines/peptides Les épitopes reconnus peuvent être conformationnels

Les carbohydrates sont les plus souvent reconnus par des monoclonaux IgM

Essentiellement des molécules de surface

BA

B

Les CD-antigènes : découverte des familles moléculaires Immunoglobulines et superfamille des Ig Récepteurs aux cytokines

TNF/TNFR Récepteurs aux cytokines Récepteurs aux chemokines

Molécules d'adhésion Sélectines Intégrines Tétraspanines

Immunité innée: TLRs CD45 Molécules costimulation SigLec

La superfamille des immunoglobulines Une structure de base, le « domaine » Une centaine d’acides aminés et deux cystéines Un disque de feuillets béta plissés antiparallèles Des boucles de jonction

Quel CD avec 1 seul domaine?

ORGANISATION DES FEUILLETS BETA-PLISSESLes feuillets clairs sont sur le dessus (cercle clair),les feuillets foncés en-dessous (cercle foncé)Ils sont reliés entre eux par des bouclesdont certaines peuvent porter des CDR

PONT DISULFURE

Représentation schématique de face

Représentation schématique de profil

Superfamilles du TNF et des récepteurs au TNF (TNFSF et TNFRSF)

Un grande famille de trimères transmembranaires généralement homotrimériques

Clivage de la portion extracellulaire par les métalloprotéinases pour générer des formes solubles

Implication dans l’apoptose, l’activation cellulaire, la prolifération, l’organogénèse…

TNFSF Identification initiale du

TNF Homologie de structure

avec une trentaine d’autres molécules

Duplication génique probable

Forme membranaire ou soluble

TNFRSF Protéines transmembranaires de type II Portion extracellulaire constituée de domaines riches

en cystéine Portion intracytoplasmique associant des domaines

de mort et des segments TRAF (TNF receptor associated factors)

Structure spécifique de la famille, sandwich de feuillets beta-plissés

CD95L CD178

CD27L CD70

CD30L CD153

CD40L CD154

TRAILCD253

OX40L CD252

RANKLCD254

APRIL CD256

BAFF CD257

TNFR1 CD12a

TNFR2 CD12b

Récepteurs aux cytokines Deux classes

Classe 1: hematopoietin receptor family Classe 2 : interférons et IL-10

Classe 1 : associations multimériques générant des récepteurs de spécificité variable Premier identifié, CD25, IL-2R alpha S’associe en fait à deux autres molécules pour former trois

récepteurs différents Chaîne commune CD130 commune à IL-6, IL-11, OSM, LIF, CNTF Chaîne commune CD131 partagée par les récepteurs des IL-3, IL-5,et

GM-CSF Chaîne gamma CD132 commune aux récepteurs des IL-2, IL-4, IL-7,

IL-9, IL-15, IL-21 Classe 2

Homodimères

Récepteurs aux cytokines à CD132

Récepteurs aux cytokines à CD130 et CD131

Récepteurs aux cytokines de classe 2

Nomenclature CD réservés à partir de

CD120 CD 120 a et b: TNF-R 1 et 2 CD121: IL-1R CD122: IL-2R beta CD123: IL-3R CD124: IL-4R alphaCD125:

IL-5R alpha CD126: IL-6R CD127: IL-7R CD128: IL-8R CD129: IL-9R

CD130: partagée par IL-6R et IL-11R

CD réservés à nouveau à partir de CD210 CD210: IL-10R CD213a &b / IL-13R1 &R2 CD217: IL-17R

Récepteurs aux cytokines La portion extracellulaire d’une des chaînes donne la

spécificité cytokinique La portion intracytoplasmique transduit les signaux

de réponse à cette cytokine Le clivage membranaire génère des récepteurs

solubles toujours capables de fixer la cytokine Anomalies impliquées dans des déficits immunitaires

Superfamille des récepteurs aux chemokines Molécules transmembranaires intégrales avec 7

passages transmembranaires, serpentines Liaison sous membranaire aux protéines G

CD183 CXCR3CD184 CXCR4CD194 CCR4CD195 CCR5CD197 CCR7 v

Molécules d’adhésion

© Pr MC Béné

CD34

Sialomucines

CD31

Superfamille des Ig

CD62E

Sélectines

CD49a

Intégrines

CD29

Tetraspanines

CD9

Superfamille des sélectines Structure complexe mais similaire

Succession de SCR = short consensus repeats Un domaine EGF = epidermal growth factor Domaine C-lectine terminal = reconnaissance de

carbohydrates Impliquées dans l’adhésion cellulaire et la diapédèse Exprimées sur

Les cellules endothéliales : CD62E Les plaquettes : CD62P Les leucocytes : CD62L

Molécules flip-flop des granules alpha et des corps de Weibel-Pallade = CD62E et P sur les deux types cellulaires

Superfamille des intégrines Chaînes alpha et chaînes beta « hand » domains et i domains « Appareil locomoteur » des cellules

Portion extracellulaire capable de se fixer à la matrice extracellulaire : collagène, fibrinogène, laminine, vitronectine…

Portion intracellulaire liée aux molécules du cytosquelette : actine, actinine, taline, vinculine…

Dépendance ++ aux ions Ca, Mn, Mg Déficit immunitaire lié à l’absence de CD18 : LAD

Beta 1 = CD29Alpha 1 à 6 = VLA 1 à 7 = CD49 a à gBeta 2 = CD18Alpha L = CD11aAlpha M = CD11bAlpha X = CD11cAlpha E = CD103…

RGD receptors =Tripeptide Arg-Gly-Asp

Superfamille des tetraspanines Molécules à quatre passages transmembranaires Très conservées dans la phylogénie Hélices alpha et ponts disulfure dans les boucles extracellulaires Sites de palmitoylation sur les cystéines intracelllulaires Signature dans la boucle intracytoplasmique (exclut CD20!!) Relations avec les radeaux lipidiques (rafts) Formation de microdomaiones enrichis en tetraspanines (TEM) Réorganisation des interactions moléculaires de surface : notion

de tetraspan-web Rôle dans l’adhésion, la mobilité et les métastases

Toll-like receptors TLRs Récepteurs de l’immunité innée Très conservés dans l’évolution Initialement identifiés chez la drosophile (merci Jules) Une dizaine identifiés chez l’homme CD286 TLR6 CD288 TLR8 CD290 TLR10

Isoformes de CD45 Leukocyte common antigen (LCA) Forme CD45 exprimée sur tous les leucocytes Isoformes par splicing alternatif

9th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens

• Barcelona, Spain, 11-13 March 2010– P Engel

• From HLDA to HCDM• B-cell oriented

The old B-CDs

• CD 19, 20, 21, 22• CD 79a, 79b• CD179a, 179b• http://www99.mh-hannover.de/aktuelles/projekte/hlda7/hldabase/select.htm

– Database of antibodies assigned from HLDA1 to 6

• VIIth – CD267, 269, 307e

The new CDs 307’s…. 363• CD307a,b,c,d,e,f = FCRL1-6• CD351 FCA/MR• CD352 NTBA = SLAMF6• CD353 BLAME = SLAMF8• CD354 TREM-1• CD355 CRTAM (Nectin family)

• No CD number for molecules under the surface (iCD) where there is life FoxP1… bcl6….PRDM1/Blung1?

New CDs

• TNF superfamily– CD356 HVEM TNFRSF14– CD357 GITR TNFRSF18– CD358 ?

• Cytokine receptors– CD359 IL-15RA– CD360 IL-21R– CD(w)210 IL10RA

• CD361 EVI2b• CD362 Syndecan 2• CD363S1PR1, EDG-1

Marqueurs associés à la lignée B

CD19

ITAMITAM

CD22

or

ITIMITIMITIMITIM

ITIMITIMITIMITIM

ITAMITAM

CD20

P

CD24

CD21

BCR

NH2

COOH

CD23

CD1

CD2

TCR

ζζ/ζηγ δ ε εCD3

ITAMITAM

ITAMITAM

ITAMITAM

ITAMITAM

ITAMITAM

ITAMITAM

ITAMITAMITAMITAMITAMITAM ITAMITAM

CD4

CD5

CD8

CD7

Marqueurs associés aux cellules myéloïdes

CD13

EE

NH2

COOH

EE

CD14

LL

L

L

L

LL

L

L

L

P

CD33

CD11b

Mg

Mg

Mg

MPO

KK

CD117

CD15CD65

3-fucosyl-N-acetyl-lactosamine

céramide dodecasaccharide

CD36

CD35

CD16

Integrated collaborationIntegrated collaborationRequires strong Requires strong leadership and a leadership and a long time-scalelong time-scale

(10-15 yrs)(10-15 yrs)

Before a new drugBefore a new drug

But so many But so many underwayunderway

http://1degreebio.org/

De la NLM S Shaw PROW … 339http://www.sciencegateway.org/resources/prow/index.htmlà Via l’ASSIM … 363http://www.thefcn.com/cd_list_hlda_9_barcelona_2010.html

References HLDA 1: Leucocyte Typing - Bernard, A., et al. Eds., Springer-Verlag

(1984)HLDA 2: Leucocyte Typing II - Reinherz, E.L., et al. Eds., Springer-Verlag (1986)HLDA 3: Leucocyte Typing III - McMichael, A.J., et al. Eds., Oxford University Press (1987)HLDA 4: Leucocyte Typing IV - KnappW., et al. Eds., Oxford University Press (1989)HLDA 5: Leucocyte Typing V - Schlossman, S.F., et al. Eds., Oxford University Press (1995)HLDA 6: Leucocyte Typing VI - Kishimoto, T., et al. Eds., Garland Publishing, Inc. (1997)HLDA 7: Leucocyte Typing VII - Mason, D., et al. Eds., Oxford University Press (2002)Leukocyte and Stromal Cell Molecules The CD Markers - H. Zola, B. Swart, I. Nicholson, E. Voss. Wiley (2007)

+ Immunology Letters