En vue de l'obtention du

DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ DE TOULOUSEDélivré par :

Institut National Polytechnique de Toulouse (INP Toulouse)Discipline ou spécialité :

Pathologie, Toxicologie, Génétique et Nutrition

Présentée et soutenue par :M. NASRALLAH ZBIB

le lundi 15 décembre 2014

Titre :

Unité de recherche :

Ecole doctorale :

TOXICITE DE LA FETUQUE ELEVEE ET DU RAY-GRASS ANGLAISENDOPHYTES SUR OVINS

Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB)

UR Mycotoxicologie - ENVTDirecteur(s) de Thèse :

M. DIDIER TARDIEU

Rapporteurs :Mme CECILE GINANE, INRA CLERMONT FERRAND

M. SERGE MOUKHA, UNIVERSITE BORDEAUX 2

Membre(s) du jury :1 Mme ISABELLE OSWALD, INRA TOULOUSE, Président2 M. DIDIER TARDIEU, ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE, Membre2 M. ETIENNE BENOIT, VETAGRO SUP LYON, Membre2 M. PHILIPPE GUERRE, ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE, Membre

« Tout ce qui doit arriver arrivera, quels que soient vos efforts

pour l'éviter.

Tout ce qui ne doit pas arriver n'arrivera pas, quels que soient vos

efforts pour l'obtenir. »

Râmana Mahârshi

2

Remerciements

Je tenais très sincèrement à remercier toute l’équipe de Mycotoxicologie

de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse.

Un grand merci à mon directeur de thèse Didier Tardieu, pour son aide

dans l’élaboration de mon rapport, ainsi que pour ses conseils, sa bonne

humeur, sa patience et sa disponibilité.

Je remercie également le Professeur Philippe GUERRE de m’avoir

accueilli dans son laboratoire, pour son savoir et sa gentillesse. Je souhaiterais

également lui dire à quel point j’ai apprécié sa grande disponibilité et son

respect sans faille des délais serrés de relecture des documents que je lui ai

adressés. J’ai été extrêmement sensible à ses qualités humaines d'écoute et de

compréhension tout au long de ce travail doctoral. Merci de m’avoir donné

l’opportunité d’effectuer mes premiers pas dans la recherche. Enfin, Merci

pour les petits conseils et astuces originaux de bricolage !!

Un grand merci à Lydie pour ses cours de biochimie, sa bonne humeur et

surtout sa « présence » au retour de nos sorties à Saint-Affrique !

Il est impossible pour moi de ne pas remercier mes deux compères de

thèse : Céline et Emad !!!! Merci !

Merci à toute l’équipe du lycée agricole de La Cazotte à St Affrique et

du domaine du Merle à Salon de Provence pour sa grande implication dans les

différents protocoles expérimentaux et pour l’entretien de « mes » brebis !!

Comment ne pas remercier toutes les stagiaires qui ont contribué à ce

travail : Justine, Hélène, Alizée et Aurore, vous avez été formidables !!!

3

Ce serait une honte d’oublier toutes les personnes avec lesquelles j’ai

passé d’excellents moments à l’ENVT. Donc un grand merci à : Nathalie,

Arlette, Marie-Rose, Alain, Sylviane, Jean-Denis et Claudine !

Je veux aussi exprimer toute ma reconnaissance aux membres du jury

qui ont accepté d’évaluer cette thèse : Isabelle Oswald, Cécile Ginane, Serge

Moukha et Etienne Benoit.

Merci aux membres de mon comité de thèse pour leurs regards

pertinents portés sur mon travail : Isabelle Oswald, Florence Forget, Florence

Mathieu et Olivier Puel.

Merci à tous les proches qui m’ont soutenue durant ce parcours. Merci

à mes amis de longue date pour leur soutien. Merci aux familles Scudier,

lasvignes et Lacoste pour leur encouragements et leurs soutien. Merci à mon

frère Bachar et à sa femme pour leur joie de vivre, leur énergie et leur

soutien sans faille. Merci à mes parents pour leurs encouragements, pour leur

soutien sans faille et pour tous les bons moments passés ensemble au

téléphone. Cette thèse est aussi le fruit de ce que vous m’avez transmis : vos

valeurs, le goût d’apprendre sans cesse, la volonté de comprendre et d’aller

plus loin. Même à distance vous étiez toujours présents!!

Enfin, un très grand et tout spécial Merci à ma femme Rayenne pour

tout ce qu’on partage, qui me rend heureux et me donne confiance. Merci

pour tes encouragements et ton soutien infaillible. Tu es toujours là quand il

faut et comme il faut. Merci aussi pour tous les bons moments partagés,

pour nos longues discussions sur tous les sujets imaginables et inimaginables. Il

y a encore tellement de choses qu’on doit construire ensemble ...

4

Table des matières

Remerciements .......................................................................................... 2

Table des matières ..................................................................................... 4

Table des encadrés ..................................................................................... 5

Liste des abréviations ................................................................................ 6

Introduction ........................................................................................... 7

Chapitre 1 : présentation de l’article 1 ..................................................... 10

Article 1 .......................................................................................... 15a

Chapitre 2 : présentation de l’article 2 .................................................... 36

Article 2 ........................................................................................ 42a

Chapitre 3 : présentation de l’article 3 .................................................... 72

Article 3 ........................................................................................ 76a

Chapitre 4 : présentation de l’article 4 .................................................. 108

Article 4 ........................................................................................... 77

Conclusion ............................................................................................. 128

Références bibliographiques ......................................................... 132

5

Table des encadrés

Encadré 1 : Présentation des phases expérimentales réalisées sur brebis

au cours de la thèse .................................................................................... 8

Encadré 2 : Démarche mise en œuvre au cours de la thèse .................... 9

Encadré 3 : Effets de l’ergovaline dans la fétuque. ............................... 42

Encadré 4 : Effets de l’ergovaline dans le ray-grass. ............................ 76

Encadré 5 : Relations structures / activités entre l’ergovaline et le

lolitrème B. ............................................................................................. 131

6

Liste des abréviations

°C : degrés Celsius

µg : microgramme

5-HT2 : récepteurs 5-hydroxytryptamine 2

CAT : catalase

CYP450 : cytochrome P450

EV : ergovaline

FE - : fétuque non endophyté

FE + : fétuque endophytée

FE : fétuque élevée

g : gramme

GPx : glutathion peroxydase

GR : glutathion reductase

GSH : glutathion reduit

H2O2 : peroxyde d’hydrogène

HPLC : chromatographie en phase liquide à haute performance

IV : intraveineuse

J : jours

Kg : kilogramme

l : litre

LB : lolitrème B

LD : limite de détection

MDA : malondialdéhyde

ml : millilitre

MS : matière sèche

ng : nanogramme

O2.- : anion superoxyde

PRL : prolactine/ prolactinémie

RG - : ray-grass non endophyté

RG + : ray-grass endophyté

RG : ray-grass anglais

SOD : superoxyde dismutase

TCI : indice de thermocirculation

UDP : uridine diphosphate

INTRODUCTION GÉNÉRALE

Les parcelles ( EPL La Cazotte, Aveyron)

7

Introduction

Le développement de champignons endophytes du genre Epichloë (anciennement

Neotyphodium) dans les graminées conduit à la production de divers alcaloïdes dont certains

sont toxiques pour le bétail. Cette problématique est particulièrement connue en Australie,

Nouvelle-Zélande, Amérique du Nord, où la fétuque élevée (FE) et/ou le ray-grass anglais

(RG) endophytés sont utilisés en monoculture sur de très grandes étendues. Elle conduit à

différentes maladies dont l’importance et l’étiologie ont progressivement été explicitées au

cours des années 1950-80. En Europe, bien que le taux d’infestation de graminées sauvages

par Epichloë soit élevé, le nombre de cas de toxicité est rare. Différentes hypothèses, outre

une plus faible exposition, peuvent expliquer ce constat : 1) faible production de mycotoxine

dans les plantes endophytées, 2) facteurs agronomiques et d’élevage conduisant à une

moindre exposition, 3) facteurs liés à l’animal et à l’effet des toxines. Le travail de thèse que

j’ai réalisé porte principalement sur les volets 2 et 3, une autre thèse, réalisée en parallèle,

ayant principalement porté sur les volets 1 et 2.

Dans l’objectif de comprendre notre problématique, il nous a paru intéressant de faire

dans un premier temps un rappel bibliographique (article 1) de la toxicité des principales

mycotoxines produites, l’ergovaline (EV) et le lolitrème B (LB). Les objectifs de cet article

de revue bibliographique sont : (i) De présenter un historique des intoxications animales liées

à la consommation de la fétuque élevée ou du ray-grass anglais endophytés en essayant de

mettre en lumière les hypothèses éthiologiques avancées ainsi que les facteurs pouvant

expliquer des différences éventuelles de sensibilité (ii) De comparer la survenue d’affections

spontanées aux études cherchant à les reproduire expérimentalement (iii) De faire une

synthèse des modes d’actions proposés des principales toxines produites au cours de cette

symbiose impliquées dans ces affections, et (iv) De présenter leur devenir dans l’organisme

animal afin de pouvoir aborder la problématique des résidus dans les productions animales et

d’origine animale (encadré 2, page 9).

Cette analyse révèle que le nombre de données disponibles sur les effets de l’EV et du

LB sur la brebis en lactation est relativement limité, en dépit d’une forte exposition potentielle

et d’un risque de transfert de mycotoxine par le lait. Par ailleurs, il apparait que les effets

toxiques de l’EV et du LB liés à leur interaction avec différents neuromédiateurs sont assez

bien connus, alors que d’autres effets en lien avec le stress oxydatif et l’activité des systèmes

8

enzymatiques de biotransformation ont été principalement explorés sur rongeurs, la réalité de

leur implication sur les animaux directement exposés aux toxines étant très peu voire pas

documentée. Ce double constat nous a conduit à explorer les effets de la distribution de

différents fourrages de RG et FE endophytés toxinogènes produits dans des conditions

agricoles françaises, sur la santé et la production animale et les mécanismes d’action de l’EV

et du LB au travers de plusieurs protocoles expérimentaux (encadré 1, page 8). Les

paramètres suivis ont principalement porté sur : i) le suivi clinique et la production, ii)

l’analyse de marqueurs spécifiques d’effets (indice de thermocirculation, prolactinémie

(PRL), iii) l’exploration d’effets sur des marqueurs de stress oxydatif et les enzymes de

biotransformation...), iv) la présence résiduelle des mycotoxines dans les tissus et le lait. Ces

travaux ont conduit à la réalisation de deux publications.

Parmi les différents effets obtenus sur ces deux dernières études, nous nous sommes

intéressés à la prolactine, ce qui a fait l’objet d’un 4ème article scientifique visant sur son

utilisation comme marqueur d’exposition à l’EV. Ce paramètre a été mesuré chez des brebis à

des stades physiologiques différentes (croissances vs laitières), dans des conditions

expérimentales différentes (bergerie et pâturage) dans le but de mesurer les effets de FE et de

RG endophytés (encadré 1, page 8).

Encadré 1 : Présentation des phases expérimentales réalisées sur brebis

au cours de la thèse

Phases animales

HERBE : FE-K31 / RG-Samson

croissance2011, 23j, champ

Crau

lactation2010, 70j, bergerie

Aveyron

Suivi sur Pl-Prolactine

(Article 4)

Fétuque

Ray-grass

Fétuque

Ray-grass

lactation2011 / 2012, 28j, bergerie

Aveyron

Fétuque

Ray-grass

FOIN : FE-K31 / RG-Samson

ZootechnieBiochimie plasmatique NécropsieRésidus

Stress oxydatifEnzymes de biotransformation

(Articles 2 et 3)

9

Encadré 2 : Démarche mise en œuvre au cours de la thèse

Endophyte

Ergovaline

Fétuque Élevéeendophytée

*EpichloëCoenophiala

Ray-Grassendophyté

Lolitrème B « RyegrassStaggers »

« F

esc

uefo

ot d

ise

ase

»«

Sum

me

rSyn

dro

me

»

Résidus ?Résidus ?

EV + LB=

Modulation toxicité???Bio-marqueur ??

↗ ↗ Stress Oxydatif↗ ↗ Enzymes de biotransformation

Facteurs génétiques

*Epichloëfestucaevar. lolii

En présence de T°C ↗ ↗

↗↗ excitabilitécellulaire

↘ ↘ ↘ ↘

prolactine

Vasoconstrictionhyperthermie

Facteurs agronomiques

GABA

Fixation Effets Symptômes Production

D2

5-HT2

Variabilitéselon les pays

D2: récepteur dopaminergique, 5-HT2 : récepteur 5-hydroxytryptamine 2, GABA : acide gamma amino-butyrique, *champignon endophyte.

CHAPITRES

Domaine du Merle

─ La partie de la thèse qui suit est organisée en quatre chapitres correspondant à quatre

articles portant chacun sur un thème différent.

─ Chaque article est précédé d’une introduction rédigée en français expliquant le

contexte scientifique de l’étude et le résumé de l’article.

─ L’article qui est rédigé en francais ou en anglais constitue le corps du chapitre. Il est à

noter que les titres et les numéros de figures à l’intérieur des articles leur sont propres et ne

sont pas dans la continuité du manuscrit.

─ La bibliographie de chaque article a été incluse dans la bibliographie générale du

manuscrit.

Brebis Lacaunes Brebis Mérinos d’Arles

10

Chapitre 1 : présentation de l’article 1

La consommation par les ruminants de fourrages endophytés est responsable de

différentes affections qui varient selon la plante en cause mais aussi la saison. Ces différentes

maladies sont caractérisées d’un point de vue clinique depuis environ un siècle, mais ce n’est

que depuis le milieu du 20ème siècle que l’association de fourrage et moisissure endophyte a

été réalisée. L’identification progressive des espèces en cause a permis de révéler que ces

affections étaient liées à la présence de champignons du genre Epichloë (anciennement

Neotyphodium, Leuchtmann et al., 2014). Epichloë Coenophiala (Neotyphodium

coenophialum) se développant dans la fétuque élevée (Lolium arundinaceum) et E. festucae

var. lolii (Neotyphodium lolii) dans le ray-grass anglais (Lolium perenne).

La fétuque endophytée est responsable de deux principaux syndromes dont

l’expression et la gravité sont fortement variables.

La « fescue foot », que l’on peut traduire par « maladie du pied » se caractérise

par des nécroses des extrémités dont l’intensité est particulièrement marquée lors

d’hivers rigoureux.

Le « summer syndrome », que l’on peut traduire par « syndrome estival »,

d’expression plus polymorphe, conduit principalement à des pertes de production

observées en été. En plus de ces deux formes, une affection rare qualifiée de

« lipomatose » a été décrite. Son diagnostic est le plus souvent nécropsique, associé à

la prolifération d’amas graisseux (Article 1, page 18).

Le ray-grass anglais endophyté, est responsable d’une maladie connue sous le nom

anglo-saxon de « ryegrass staggers disease » que l’on pourrait traduire par « titubement du

ray-grass ». Elle est caractérisée par des troubles neurologiques tels que incoordination,

tremblements, mouvements saccadés de la tête, tous exacerbés par l'exercice (Article 1,

tableau 1, page 20).

Au cours de leur développement symbiotique, les Epichloë peuvent synthétiser

différentes mycotoxines de la classe des alcaloïdes en fonction de la plante hôte. Quatre

groupes sont identifiés dans les plantes endophytées : les ergotiques, les indole-diterpènes, les

lolines et les pyrrolopyrazines.

11

L’ergovaline (EV) (Article 1, figure 1, page 26), est une ergopeptine du groupe des

alcaloïdes ergotiques, synthétisée lors du développement d’E. coenophiala dans la fétuque

élevée. Cette molécule a des effets biologiques multiples dont les mécanismes d’action sont

complexes. Elle est le principal alcaloïde présent dans la fétuque endophytée, et pratiquement

le seul dont la toxicité est renseignée.

La présence d’E. festucae var. lolii dans le ray-grass anglais conduit à la production

de lolitrème B (LB) (Article 1, figure 2, page 27) mais aussi d’EV. Le LB est un indole-

diterpène trémorgénique, considéré comme le principal responsable de la toxicité du ray-grass

endophyté.

Les alcaloïdes appartenant aux groupes des lolines et des pyrrolopyrazines peuvent

être synthétisé par les champignons endophytes du genre Epichloë / Neotyphodium en

association avec des graminées. Ces mycotoxines possèdent des propriétés toxiques et

répulsives contre de nombreux ravageurs de culture.

La reproduction expérimentale des intoxications par la fétuque endophytée (FE+) a

été réalisée dans différentes espèces. Les troubles observés sont généralement moins violents

que ceux décrits dans les formes spontanées.

Chez les ovins (Article 1, tableau 2, page 20), lors d’exposition à des doses

supérieures à 1000 µg/kg, on observe une diminution de l’ingestion d’aliment, une baisse de

la fécondité, des signes de boiteries et des difficultés des animaux à réguler leur température.

Ces troubles sont associés à de rares altérations biochimiques alors qu’une chute de la

prolactinémie a été rapportée dans la quasi-totalité des études où cet effet a été recherché.

Chez les bovins (Article 1, tableau 3, page 22), on observe des troubles de même nature ainsi

qu’une chute de la prolactinémie dans la quasi-totalité des études. De plus, de fortes doses

d’EV (1500 µg/kg d’aliment), distribuées sous de fortes températures (39°C) conduiraient à

une diminution des activités des glutathions réductases et peroxydases et une consommation

accrue du glutathion réduit dans les cellules mononuclées. Cet effet n’est pas observé en

l’absence de stress thermique (Burke et al., 2007). L’espèce bovine semble plus sensible que

l’espèce ovine.

Parmi les autres facteurs favorisant la survenue des affections, on peut noter que l’âge

ou le stade physiologique des animaux ne semblent pas avoir de rôle déterminant. En

revanche, la température joue un rôle déterminant. En effet, des températures inférieures à

10°C seraient nécessaires à la survenue des boiteries alors que des températures supérieures à

12

30°C provoquent une chute des performances. La prolactinémie se révèle la principale

altération biochimique observée. Elle est diminuée à partir d’une dose de 300 µg d’EV dans

l’aliment. L’augmentation de la durée d’exposition semble aggraver ce phénomène.

Un seuil de toxicité en ergovaline a été fixé entre 400-700 et 500-800 µg/kg pour les

bovins et les ovins respectivement. Les doses responsables d’une chute de la prolactinémie

sont inférieures.

La toxicité du ray-grass endophyté (RG+) a été reproduite expérimentalement dans

différentes espèces (Article 1, tableau 5, page 24).

Malgré la présence d’ergovaline dans le ray-grass à des doses parfois supérieures à

celles reconnues comme toxiques lorsque cet alcaloïde est présent dans la fétuque, seuls les

effets du LB sont observés. Les symptômes observés sont ainsi limités à des tremblements.

Les ovins apparaissent à nouveau plus tolérants à la toxine que les bovins.

Un seuil toxique en LB de 2000 µg/kg d’aliment à été fixé pour ces espèces

indépendamment de la température externe et de l’âge des animaux.

Malgré la gravité et l’importance économique de ces maladies, assez peu de données

sont disponibles quant aux mécanismes d’action toxiques de l’EV et du LB.

L’ ergovaline présente, comme tous les alcaloïdes ergotiques, une analogie structurale

avec les amines biogènes : dopamine, noradrénaline et sérotonine (Article 1, figure 1, page

26). Cette analogie structurale conduit à différents effets biologiques, selon le récepteur sur

lequel la toxine se fixe. En se fixant aux récepteurs D2 des cellules lactotropes de la partie

antérieure de l'hypophyse, l’ergovaline entraine une chute de la prolactinémie (Article 1,

figure 1 et 2, pages 26 et 27).

Sa fixation aux récepteurs adrénergiques et/ou sérotoninergiques (Article 1, figure 1,

page 26) conduit à une diminution du flux sanguin périphérique respectivement modérée ou

plus efficace. Par exemple, sa fixation aux récepteurs sérotoninérgiques de type 5-HT2 situés

au niveau des muscles lisses des vaisseaux sanguins va entrainer une diminution du diamètre

de ces derniers (Oliver et al., 1989). Dans les cas les plus extrêmes, cet effet, exacerbé par le

froid lors d’hivers rigoureux, conduit à une vasoconstriction telle qu’elle peut entrainer anoxie

et nécrose des tissus des extrémités. C’est le « fescue foot » syndrome.

13

Lors de températures élevées, la vasoconstriction induite par l’EV entraine une baisse

de capacité de régulation thermique corporelle conduisant à une baisse de l’activité. Cette

dernière devient essentiellement une activité de lutte contre la chaleur (hyperventilation,

recherche d’eau et d’ombre) qui va entrainer une altération des performances de production

(diminution du gain de poids et de la production laitière) essentiellement dues à une baisse de

consommation. C’est le « summer syndrome ». Un indice de thermocirculation (fonction de la

température cutanée, interne et ambiante) a été défini pour quantifier cet effet de l’EV

(Gadberry el al., 2003 ; Articles 2 et 3). Certains auteurs ont émis l’hypothèse selon laquelle

l'hyperthermie peut prédisposer l’animal à un stress oxydatif en particulier chez les

bouvillons, ils démontrent une diminution du glutathion total et une augmentation du

glutathion oxydé dans le sang (Lakritz et al., 2002). Ce stress oxydatif pourrait être expliqué

par la production de radicaux libres et par la peroxydation des produits lipidiques associés à la

respiration cellulaire (Skibba et al., 1991). L’hyperthermie implique la nécessité de la perte de

chaleur via les voies respiratoires, ce qui favorise une diminution des antioxydants dans le

système respiratoire par la déshydratation et l’hyperventilation (Freed et al., 1994). Enfin, le

stress thermique qui réduit l'appétit serait associé à une réduction cellulaire des concentrations

en glutathion (Oliver, 1997). Le stress oxydatif que l’on peu définir dans les systèmes

biologiques, est la conséquence d’un déséquilibre entre la production des radicaux libres et

leur destruction par des systèmes de défenses anti-oxydantes. Les radicaux libres ou espèces

réactives de l’oxygène sont nécessaires à la vie, mais peuvent également engendrer des

dommages importants sur la structure et le métabolisme cellulaire en dégradant de

nombreuses cibles : protéines, lipides et acides nucléiques. Le stress oxydatif est le résultat

d’une augmentation de la production des radicaux libres (O2.-, H2O2...) ou de la diminution

des défenses anti-oxydantes (SOD, CAT, GR, GPx, GSH), conduisant à des lésions pouvant

constituer des marqueurs du stress oxydatif (MDA qui est un marqueur de la peroxydation

lipidique ...).

Ces effets, qu’ils s’agissent de la chute de la prolactinémie ou de l’action vasomotrice,

sont rapidement observés après l’exposition à la toxine (30 minutes après injection

intraveineuse) et sont communs à la plupart des alcaloïdes ergotiques. Ainsi, d’autres toxines

que l’ergovaline, ou ses intermédiaires de synthèse, pourraient contribuer a la sévérité des

effets cliniques observés.

En parallèle à ces effets, une modification de l’expression de différents systèmes

enzymatiques de biotransformation de phase I et II impliqués dans le métabolisme des

xénobiotiques est signalée (Hohenboken et al., 1997 ; Bhusari et al., 2006 ; Settivari et al.,

14

2006, 2008). La principale fonction de ces enzymes est de convertir ces composés en produits

polaires afin de faciliter leur excrétion. Ce processus se divise généralement en deux étapes

qui sont la phase I (oxydations, réductions et hydrolyses) et la phase II (conjugaison) visant à

rendre la molécule exogène plus hydrophile afin d’être éliminée. Une augmentation de

l’expression des gènes des enzymes de biotransformation de phase I (CYP450) ainsi qu’une

élévation des activités des enzymes de biotransformation de phase II (glutathion-S-

transférases et UDP-glucuronyltransférases) sont observées. D’autres études conduites sur les

alcaloïdes ergotiques révèlent par ailleurs une action directe des toxines sur certaines enzymes

de biotransformations de phase I, principalement les cytochromes P450 3A. L’inhibition de

ces cytochromes conduirait à une aggravation de la toxicité (Liaudet, 1999).

Les différents effets des alcaloïdes sur les systèmes enzymatiques de

biotransformation et leurs conséquences possibles en terme de toxicité pour l’animal

constituent une part importante de mes travaux de thèse. Ils seront abordés plus en

détail au cours des articles 2 et 3.

Le LB est un alcaloïde trémorgène dont les effets biologiques sont plus simples que

ceux de l’ergovaline, même si des incertitudes persistent encore quant à son mécanisme

d’action pharmacologique. Ce composé inhiberait les canaux potassiques activés par le

calcium présents au niveau des neurones et des muscles, conduisant à une augmentation de

l’excitabilité cellulaire. D’autres effets tels qu’une inhibition des récepteurs à l’acide gamma-

aminobutyrique de type A et/ou les neurotransmetteurs des acides aminés (acide aspartique et

glutamique), pourraient contribuer aux troubles de « ryegrass staggers » (Article 1, figure 3,

page 28).

Enfin, quelques données existent en ce qui concerne la toxico-cinétique de ces

mycotoxines et leur risque de persistance à l’état résiduel dans les productions animales.

Ces études permettent de caractériser les différentes phases de devenir des molécules

exogènes dans l’organisme. On distingue généralement l’absorption, la distribution, le

métabolisme et l’élimination. L’absorption orale de l’EV et du LB varie entre 0,05 et 3% avec

une durée d’élimination inférieure à 1 heure ce qui traduit la proportion de toxine qui va

passer dans le sang. Les toxines vont ensuite être distribuées dans l’organisme. L’ergovaline

n’a jamais été retrouvée dans les tissus. Plus lipophile, le LB est plus persistant dans les

graisses. Des teneurs résiduelles de 120-200 µg/kg sont observées dans ces matrices chez les

bovins lors d’exposition dans les conditions naturelles en l’absence de signes cliniques à des

doses comprises entres 1200 et 2000 µg LB/kg MS (Miyazaki et al., 2004). Après une phase

15

de métabolisme, les toxines peuvent êtres éliminées par différentes voies (urines, lait...). Le

LB est également retrouvé dans le lait. Le faible nombre de données disponibles

concernant ces toxines et leur transfert dans les productions justifie que mon travail de

thèse soit en partie axé sur leur détection dans les matrices animales, y compris le lait

(Articles 2 et 3).

En conclusion, bien que de nombreuses études expérimentales sur la toxicité de la

fétuque et du ray-grass anglais endophytés aient été réalisées, de nombreuses incertitudes

persistent quant à la nature des toxines en causes et leurs effets. Ces incertitudes portent

principalement sur l’ergovaline, dont la toxicité semble plus importante lorsqu’elle est

présente dans la fétuque que dans le ray-grass. L’origine de ces différences reste inconnue, la

principale hypothèse émise pour expliquer ces différences étant la présence d’autres

alcaloïdes ergotiques produits dans la fétuque mais pas le ray-grass. La différence de

sensibilité entre ovins et bovins est également méconnue, de même que les effets de

l’ergovaline sur les mécanismes de lutte contre le stress oxydatif et les systèmes de

biotransformations dans les espèces exposées au risque. Enfin, bien que la prolactine

apparaisse comme un marqueur précoce et sensible d’exposition, peu de données sont

disponibles quant à son utilisation en tant que bio-marqueur d’exposition ou de toxicité. Ces

différents points pourraient contribuer à expliciter l’origine des différences de fréquence des

pathologies rapportées selon les continents.

Article 1

Toxicité des mycotoxines produites par des champignons endophytes

du genre Neotyphodium

N. ZBIB, C. REPUSSARD, D. TARDIEU, P. GUERRE

Laboratoire Mycotoxicologie, ENVT, F-31076 Toulouse, France

Mots-clés

Neotyphodium, endophytes, alcaloïdes ergotiques, lolitrem B, ergovaline, fescue foot,

ryegrass staggers

Article publié dans la Revue de Médecine Vétérinaire

Revue Méd. Vét., 2014,165, 3-4, 116-13

Revue Méd. Vét., 2014, 165, 3-4, 116-135

ZBIB (N.) AND COLLABORATORS116

Introduction

Les champignons endophytes du genre Neotyphodium peuvent coloniser plus d’une vingtaine de plantes di!érentes [94]. Les espèces N. coenophialum et N. lolii, sont les plus connues et les plus étudiées. Elles sont respectivement rencontrées dans la fétuque élevée, Lolium arundinaceum (anciennement Festuca arundinacea) et le ray-grass anglais, Lolium perenne. L’association plante-champignon est stable tout au long de la vie de la plante. Le champignon confère à la plante un certain nombre d’avantages, tels résistance aux stress et aux ravageurs, alors que la plante fournit protection et nutriments nécessaires à la croissance mycélienne. Certaines de ces associations peuvent conduire à la synthèse de mycotoxines, toxiques pour les insectes et nématodes ravageurs mais aussi pour les herbivores. Les béné&ces réciproques de cette symbiose ainsi que la nature et les conditions de production des mycotoxines ont fait l’objet d’une précédente revue [94]. L’objectif de cette analyse est de présenter les intoxications animales observées lors de la consommation de fétuque ou de ray-grass anglais endophytés par des espèces du genre Neotyphodium suivies d’une étude des mécanismes d’actions toxiques et de la toxicocinétique des principales mycotoxines impliquées dans ces a!ections.

Historique

Les intoxications animales spontanées faisant suite à la consommation de fétuque ou de ray-grass anglais endophytés sont anciennes, rares et mal caractérisées. Un diagnostic de certitude n’est quasiment jamais établi, de nombreuses hypothèses étiologiques étant souvent avancées. Ce n’est qu’après la caractérisation des mycotoxines produites au cours de la symbiose et qu’après reproduction expérimentales de ces intoxications qu’un certain consensus bibliographique s’est fait autour des premiers cas rapportés dans la littérature. Toutefois, depuis que des méthodes de dosage spéci&ques et sensibles sont disponibles, le nombre de cas spontanés rapportés est très limité. L’hypothèse communément avancée pour expliquer la rareté des intoxications spontanées est la commercialisation en Australie, Nouvelle-Zélande et États-Unis de variétés fourragères endophytées dépourvues de capacité de synthèse de mycotoxines toxiques pour le bétail, mais conservant des capacités de production de toxines insecticides et nématocides. Cette hypothèse n’explique toutefois pas la rareté des intoxications spontanées dans les autres pays (consommation de fourrages de prairies naturelles) alors que le niveau d’endophytisme et les niveaux de productions de mycotoxines peuvent être élevés, comme c’est par exemple le cas en Europe [94].

RÉSUMÉ

Les associations symbiotiques entre di!érentes espèces de champignon du genre Neotyphodium et des plantes fourragères sont à l’origine de la production de mycotoxines responsables, dans certains pays, de toxicoses du bétail et de pertes économiques. Le développement de N. coenophialum dans la fétuque, qui est associé à la production d’ergovaline, est responsable de « fescue foot disease » alors que la présence de N. lolii dans le ray-grass anglais, qui est accompagnée d’une production de lolitrem B, est responsable du « ryegrass staggers ». L’objectif de cette revue bibliographique est de faire un rappel des conditions historiques des survenues de ces a!ections, et une analyse des études cherchant à les reproduire expérimentalement. Les mécanismes d’action toxiques supposés de l’ergovaline et du lolitrem B, ainsi que leurs toxicocinétiques et risques de persistance à l’état résiduel dans les productions animales et d’origine animale sont ensuite présentés.

Mots-clés : Neotyphodium, endophytes, alcaloïdes

ergotiques, lolitrem B, ergovaline, fescue foot, ryegrass

staggers

SUMMARY

Toxicity of mycotoxins produced by endophytic fungi of the genus Neotyphodium

/e symbiotic associations between di!erent varieties of fungi of the Neotyphodium kind and forages are responsible for the production of mycotoxins which are responsible of toxicoses in livestock and economic losses in some countries. /e development of N. coenophialum in tall fescue, which is associated with the production of ergovaline, is responsible for « fescue foot disease » while the presence of N. lolii in ryegrass, which is accompanied by the production of lolitrem B, is responsible for the « ryegrass staggers »./e aim of this literature review is to recall the historical conditions on which these diseases occurred, followed by an analysis of studies seeking to experimentally reproduce the diseases. /e supposed mechanisms of the toxic actions for ergovaline and lolitrem B, their toxicokinetics and the risk of persistence in the residual state in animal productions and animal origin are later presented.

Keywords : Neotyphodium, endophyte, ergot alkaloids,

lolitrem B, ergovaline, fescue foot, ryegrass staggers

Toxicité des mycotoxines produites par des

champignons endophytes du genre Neotyphodium

N. ZBIB, C. REPUSSARD, D. TARDIEU, P. GUERRE*

Laboratoire Mycotoxicologie, Université de Toulouse, INPT, ENVT, F-31076 Toulouse, France

* Auteur chargé de la correspondance : p.guerre@envt.fr

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TOXICITÉ DES MYCOTOXINES PRODUITES PAR NEOTYPHODIUM 117

L’objectif de ce chapitre est de présenter les premiers cas rapportés dans la littérature et de préciser les hypothèses étiologiques avancées par leurs auteurs à cette époque.

INTOXICATIONS LIÉES À LA CONSOMMATION DE FÉTUQUE

Dans les années 1940 à 50, di!érents cas de boiteries ont été observés sur des bovins suite à la consommation de fétuque endophytée et nommés «  fescue foot disease » [23, 47, 135]. Ce n’est que dans les années 1970 que la relation entre la présence d’un champignon endophyte dans la plante, pourtant identi&é dès 1941 [82], et les e!ets sur les performances et les symptômes a été suspectée [135]. Ce n’est que dans les années 1990 que l’ergovaline (EV) a été considérée comme responsable des troubles observés [45, 91]. En parallèle de la «  fescue foot disease  » deux autres syndromes, le «  summer syndrome  » et le «  fat necrosis syndrome » et divers e!ets sur la lactation et la reproduction ont été attribués à la consommation de fétuque endophytée, sans qu’aucune étiologie toxique ne soit identi&ée.

Fescue foot disease

La « fescue foot disease » a été décrite pour la première fois en Nouvelle Zélande en 1948 par Cunningham, sur des bovins pâturant de la fétuque élevée [23]. La boiterie est décrite comme débutant habituellement par les postérieurs, le plus souvent le pied gauche. La maladie semble rétrocéder spontanément si un autre aliment est distribué. Dans les cas graves, une nécrose du pied est observée. L’ergotisme est exclu des hypothèses étiologiques sur la base de la saisonnalité de l’a!ection, observée principalement en hiver (l’ergotisme survient surtout en l’été). L’a!ection aurait été reproduite expérimentalement sur un animal. Les chevaux ne seraient pas sensibles à cette pathologie. Il est recommandé de ne pas faire de foin pour les bovins sur des prairies de fétuques et de ne pas laisser les animaux plus de dix jours sur ces prairies. Une photo de vache dont le postérieur droit est coupé au niveau du jarret accompagne la publication. Des cas de boiteries similaires (avec nécrose) accompagnés de chutes des oreilles et de la queue sont également rapportés au Colorado par Goodman en 1952 sur des bovins pâturant de la fétuque élevée [47]. Un épisode violent aurait été observé l’hiver 1951-52 après de fortes chutes de neige et une pénurie de foin. Suite à la publication de Cunningham, la maladie, initialement attribuée à de l’ergotisme, est considérée comme due à une cause toxique non encore identi&ée présente dans la fétuque élevée. Suite à l’article de Goodman, des symptômes similaires sont rapportés par Stearns en 1953, sur des bovins pâturant de la fétuque 31 au Kentucky alors que le dactyle et le trè<e seraient morts du fait de la sécheresse [119].

Ces accidents, et di!érents rapports personnels, conduisent Jensen à tenter une reproduction expérimentale de l’a!ection sur 14 bovins. Un groupe de 7 animaux est mis sur pâture de fétuque élevée contenant de faible quantité d’autres graminées et de trè<e d’août 1954 à décembre 1954, un groupe de 2 animaux reçoit du fourrage de fétuque élevée

de novembre à décembre, un groupe de 5 animaux est divisé en deux, deux recevant du foin de fétuque élevée de décembre à février, trois recevant du fourrage mixte de décembre à avril. Cinq animaux sur les 7 au pâturage vont développer des signes de boiteries et des lésions de la queue. Tous les animaux recevant du foin de fétuque élevée vont présenter des signes de boiterie voire de nécrose  ; ceux recevant un foin di!érent n’ont aucun signe. Le nombre de jours nécessaires à l’apparition des boiteries varie de 18 à 50 lors de distribution de fourrage et de 50 à 70 au pré. De nombreuses photos montrant des signes de nécrose accompagnent la publication. L’implication de la fétuque élevée semble dé&nitivement établie, la discussion porte sur la saisonnalité de l’a!ection (automne et hiver) et le mécanisme d’action du toxique (vasoconstriction qui prédispose à la thrombose et la nécrose).

En 1962, Yates réalise une analyse bibliographique des cas de «  fescue foot disease  » [134]. Un descriptif clinique détaillé de l’a!ection est réalisé après analyse d’une trentaine de publications. L’auteur souligne la grande variabilité de son incidence (globalement rare) et de sa prévalence (1 animal a!ecté ou 78% de l’e!ectif) et l’absence d’étiologie certaine. Di!érentes étiologies sont présentées comme devant être prises en compte dans le diagnostic di!érentiel : intoxication par l’ergot, intoxication par le sélénium, piétin, nécrose due au froid, lésions mécaniques… La spéci&cité de l’atteinte bovine est soulignée, de même que l’adaptabilité de certains animaux au toxique, et la faculté de développer une « résistance » relative. En&n, sur une même pâture, l’a!ection semble apparaitre de façon aléatoire, des cas de nécrose des extrémités étant observés certaines années (1956-57) alors que des performances excellentes sont observées d’autres années (1965-66) [60].

Les études visant à caractériser l’agent étiologique fournissent des résultats contradictoires. Certains travaux font état de l’absence de propriété vasoconstrictrice des extraits de fétuques élevées, alors que ces propriétés sont présentes avec les extraits d’ergot ou même d’autres extraits végétaux, notamment de ray-grass [126]. Dans un article joint à celui de Jensen en 1956, Maag établit la présence d’alcaloïdes (extraction alcaline et réaction colorimétrique) dans les extraits de fétuque élevée responsables des cas de boiterie et ce en l’absence de sclérote visible [70]. En 1963, Jacobson explore les propriétés vasoconstrictrices et la survenue de gangrène sur bovins recevant di!érents extraits de fourrages de fétuques responsables de « fescue foot disease » [61]. La toxicité est présente dans les extraits alcooliques mais pas les extraits chloroformiques obtenus après alcalinisation du milieu, ce qui suggère que les principes actifs ne sont pas des alcaloïdes. En 1969, Yates suggère que les extraits toxiques de fétuques élevées capables de reproduire l’a!ection pourraient être produits par des agents fongiques de la famille des Fusarium [135].

A partir des années 1970, di!érents syndromes vont être associés à la consommation de fétuque, sans que des

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symptômes aussi violents que ceux décrits dans les années 40 à 50 ne soient aussi fréquemment rapportés dans la littérature. La découverte de moisissures endophytes dans la fétuque, la caractérisation de leurs toxines, et di!érentes études expérimentales réalisées par la suite ont permis de conclure que, même si une relation de cause à e!et semble avoir été observée entre la consommation de fétuques endophytées et la survenue de « fescue foot disease », les preuves irréfutables de la seule implication de l’endophyte dans l’ensemble des cas rapportés font défaut [4, 106].

Syndrome estival

Di!érentes appellations ont été utilisées pour caractériser des a!ections observées sur des prairies de fétuque apparaissant l’été, dont les manifestations sont di!érentes de celles de la « fescue foot disease ». Parmi elles, le syndrome estival, sous son appellation anglo-saxone « summer slump » ou «  summer syndrome  », est le plus connu. D’autres appellations telles la « fescue toxicity » ou « fescue toxicosis », ont également été utilisées. Ce syndrome se caractérise par une diminution du gain de poids, une intolérance à la chaleur, une salivation excessive, une croissance anormale des poils, une élévation de la température, de la nervosité, une diminution de la production laitière et des problèmes de fécondité [6, 20, 122].

Décrit pour la première fois chez les bovins en 1963 [61], ce syndrome peut également apparaitre chez les ovins [88]. Chez la jument, la consommation de fétuque endophytée, notamment au cours du dernier trimestre de la gestation, provoquerait un épaississement du placenta conduisant à la mort du poulain peu avant la naissance, et quelque fois la mort de la mère, ou une agalaxie [32, 55].

Si les di!érents symptômes caractérisant le syndrome estival varient selon l’espèce et/ou le stade physiologique, tous semblent exacerbés par une augmentation de la température externe. L’importance de la température dans la symptomatologie a été révélée dès les premières suspicions cliniques. L’observation d’un comportement particulier des bovins, à la recherche d’eau et d’ombre, sur des pâtures de fétuques élevées remonte aux années 50 [77]. La première reproduction de la maladie sur génisse révèle une élévation de la température corporelle et du rythme respiratoire [61]. L’e!et de la température extérieure sur la sévérité du syndrome estival chez les veaux est démontré dans les années 80 [51].

Les symptomatologies du « summer syndrome » et de la « fescue foot », proches de celles observées lors d’intoxication par des toxines de l’ergot, ont rapidement orienté les recherches vers l’hypothèse d’un toxique dont les propriétés vasoconstrictrices pourraient expliquer les nécroses des extrémités et les diRcultés à lutter contre la chaleur. De nombreuses études expérimentales ont dès lors été réalisées a&n de mieux comprendre la maladie et son origine. Ces études seront traitées dans la seconde partie de cet article.

Nécrose lipidique / Lipomatose

La nécrose lipidique, parfois quali&ée de lipomatose bien que d’origine non tumorale, est une a!ection rare, observée dans un grand nombre d’espèces animales, dont le diagnostic est le plus souvent nécropsique et dont l’étiologie est complexe. Il est en général admis que le mécanisme physiopathologique à l’origine d’une nécrose lipidique est une modi&cation de la composition en acides gras des masses graisseuses abdominales conduisant la formation d’un tissus de consistance augmentée, jaunâtre, globuleux, au sein duquel la vascularisation serait dé&ciente ce qui conduirait à sa nécrose [100, 132]. Di!érents facteurs sont suspectés être à l’origine de cette lésion  : obésité, modi&cation de la composition en acide gras de la ration, carence en vitamine E, pancréatite, modi&cation de la circulation sanguine, facteurs génétiques… L’analyse histologique permet en général d’exclure l’origine pancréatique, le diagnostic étiologique précis des autres causes étant diRcile.

Plusieurs rapports cliniques font état de nécrose lipidique chez des ruminants (vache, chèvre, cerf…) consommant de la fétuque élevée [100, 114, 132, 133]. La présence d’acides gras saturés en quantité supérieure aux zones non nécrosées a été retrouvée dans les lésions [100]. Un fort taux d’azote favoriserait l’apparition de nécrose lipidique, tout en diminuant la teneur en cholestérol [123]. Il convient toutefois de noter que, dans cette étude, le diagnostic de nécrose lipidique est e!ectué par palpation transrectale, et que la cholestérolémie varie fortement selon le moment de prélèvement. La composition en acides gras des graisses musculaires et du gras sous-cutané de bovins consommant de la fétuque endophytée sauvage (E+) a été comparée à celle de bovins consommant de la fétuque endophytée par une moisissure non toxinogène (AR542) [93]. Les animaux consommant les fétuques E+ ont un taux supérieur d’acides gras saturés (SFA) et un taux inférieur d’acides gras mono-insaturés (MUFA), sans qu’il y ait de di!érence sur les teneurs en acides gras poly-insaturés (PUFA) ni le rapport PUFA/SFA. Ces résultats sont toutefois à considérer avec prudence, le taux de SFA et PUFA variant selon le lieu de prélèvement [93]. Aucun agent étiologique spéci&que à la fétuque élevée responsable de nécrose lipidique n’a à ce jour été mis en évidence.

Ainsi, même si l’analyse des cas spontanés d’intoxication par de la fétuque endophytée se révèle complexe et contradictoire, di!érents éléments peuvent être dégagés. Alors que la prévalence des champignons endophytes est mondiale, les intoxications animales sont principalement décrites aux États-Unis et en Australie. Cette première constatation suggère l’importance de facteurs externes, mode d’élevage, météo, dans la survenue des a!ections. Bien que toutes les espèces herbivores soient exposées, les bovins semblent les plus sensibles. Di!érentes hypothèses peuvent être émises pour expliquer ces di!érences  : particularité du mode d’élevage, choix alimentaires, di!érences de biodisponibilité

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des toxines et/ou de métabolisme et élimination… Par ailleurs, c’est dans l’espèce bovine que la symptomatologie est la plus variable, deux syndromes principaux pouvant être di!érenciés selon les conditions climatiques : la « fescue foot », caractérisée par des nécroses des extrémités, principalement observée lors d’hivers rigoureux, le «  summer syndrome », dont l’expression clinique est polymorphe, conduisant à des pertes de production, principalement observé au cours du printemps et l’été. C’est ce dernier syndrome qui serait principalement décrit chez les ovins, alors que les équins seraient plus sensibles aux troubles de la reproduction.

Des incertitudes existent en ce qui concerne l’agent étiologique. Les syndromes de gangrènes observés chez les bovins peuvent être confondus avec di!érentes pathologies, dont l’intoxication par les alcaloïdes de l’ergot. L’analyse de di!érents extraits de fétuques responsables de troubles donne des résultats contradictoires. Pour certains, le principe toxique répondrait aux caractéristiques physiques et chimiques d’un alcaloïde (composé extractible par les solvants organiques en milieu alcalin) alors que pour d’autres il ne présenterait pas ces caractéristiques. Di!érentes hypothèses alimentaires et minérales ont également été avancées pour expliquer certains cas. En dé&nitive, le seul point commun à toutes ces a!ections semble leur survenue sur des prairies riches en certaines espèces de fétuques élevées. Par la suite, la découverte des moisissures endophytes et la caractérisation des toxines produites, principalement l’ergovaline (EV), conduira à une évolution du regard porté sur ces a!ections, dont les étiologies précises et les circonstances de survenue n’auront pas toutes été élucidées.

INTOXICATIONS LIÉES À LA CONSOMMATION DE RAY-

GRASS

En Nouvelle Zélande, des symptômes de type

tremblements provoqués par l’ingestion de ray-grass chez les herbivores est connue depuis plus d’un siècle. Le terme de « staggers » a été largement utilisé pour décrire ces a!ections dont l’étiologie s’est peu à peu précisée au cours du temps. La littérature scienti&que attribue à Gilruth la première description des troubles observés chez les ruminants en 1906. Cette publication, qui n’est plus aujourd’hui disponible, décrirait des incoordinations musculaires ou des spasmes tétaniques [54]. Jusque dans les années 1970, di!érentes publications décriront des troubles nerveux de type tremblements, observés sur ovins, bovins et équins, lors de la consommation d’ergot, de ray-grass ergoté voire de ray-grass non ergoté [24, 54]. En 1973, Keogh tente une première reproduction expérimentale de la maladie de février à avril sur béliers. Deux groupes de 12 animaux sont mis sur pâture à dominante de ray-grass, le premier consommant la partie haute de l’herbe (supérieure à 2,5 cm), le second la partie basse. L’apparition de symptômes sévères de «  ryegrass staggers » sur le seul groupe consommant la partie basse des plantes va marquer un tournant dans la connaissance de la maladie. Une classi&cation des symptômes, sous la forme de score clinique, sera réalisée (tableau 1), l’hypothèse de

l’implication d’un agent fongique/mycotoxique autre que l’ergot (qui se développe dans les in<orescences) sera retenue [64].

Dès lors, di!érents travaux seront réalisés pour préciser les conditions de survenue de l’a!ection. En 1981, une étude visant à mesurer l’in<uence de l’âge des pâtures sur le développement de la maladie révèle un taux très élevé d’endophytisme (81-100%) sur les prairies à risque. Les prés semés depuis plus de deux ans seraient plus dangereux que ceux de l’année [40]. L’analyse des conditions climatiques durant l’étude révèle que les symptômes les plus graves ont été observés pendant une période de sécheresse, avec une faible croissance de l’herbe, et une consommation importante de feuilles mortes et hampes <orales par les animaux [39]. Di!érentes altérations biochimiques ont également été observées et attribuées à la consommation de ray-grass telles : une diminution de la prolactine chez les ovins [38], une réduction de la testostérone sérique chez les bovins [89] ainsi que des altérations hépatiques [90]. Di!érentes publications vont par ailleurs établir une relation de cause à e!et lorsque des troubles de type « staggers » sont observés sur pâture de ray-grass chez des cervidés ou des camélidés en l’absence d’autre hypothèse étiologique [18, 53, 71, 72, 102, 103].

C’est également en 1981 que sera réalisée la caractérisation du lolitrem B (LB), considéré dès lors comme responsable de tremblements observés chez les animaux exposés au ray-grass endophyté par N. lolii [44]. Di!érentes études expérimentales précisant les niveaux d’exposition seront par la suite réalisées, ces travaux sont présentés dans la suite de l’article.

Toxicité expérimentale

Sont présentés ici les e!ets sur la santé et modi&cations biochimiques associées lorsque des niveaux d’exposition en alcaloïdes sont disponibles. Les mécanismes d’actions des mycotoxines sont abordés dans le chapitre suivant.

TOXICOSE DE LA FÉTUQUE

Di!érentes études de toxicité ont été réalisées à partir de fourrages de fétuques endophytées plus ou moins supplémentés de graines a&n d’augmenter l’apport en alcaloïdes. Sont analysés ici les résultats pour lesquels des doses d’exposition en ergovaline (EV) ou alcaloïdes totaux sont disponibles. Ces études ont principalement été e!ectuées sur ovins et bovins, qui sont des espèces naturellement exposées au risque, mais aussi sur rongeurs, en tant que modèles expérimentaux.

Animaux naturellement exposés au risque

OVINS

Les e!ets chez les ovins d’une alimentation à base de fourrages de fétuques endophytées plus ou moins complémentés de graines de la même espèce sont rapportés

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Score Symptômes

0 Comportement normal.

1 Pas de tremblement au repos. Quelques crises isolées de tremblements sur tout le corps, de courte durée et de faible intensité, provoquées par l’exercice ou la manipulation.

2 Pas de tremblement au repos. Plusieurs crises isolées de tremblements sur tout le corps d’intensité modérée, observées après un exercice intense.

3 Crises spontanées et répétées de tremblements au repos. Crises répétées d’intensité modérée à forte avec hochements de tête, provoquées par l’exercice ou la manipulation. Troubles de la vision.

4 Crises spontanées intenses et prolongées de tremblements de faible intensité au repos. Toute stimulation extérieure peut entraîner des épisodes de convulsions.

5 Tremblements spontanés de très forte intensité habituellement accompagnés d’épisodes convulsifs pouvant entraîner la mort.

Tableau I : Score clinique permettant d’évaluer la sévérité des symptômes de « ryegrass staggers » [64].

Animaux

Circonstances d’intoxications

Symptômes / paramètres RéférenceEV (µg/kg / source)

Durée (jours)

T (°C)

Agneaux 1500 / graines 21 34 digestibilité [50]

960 / foin 95 14* PRL (104 à 27 ng/ml) [31]

910 † / foin 17 21 digestibilitéPRL (24 à 16 ng/ml)

[36]

812 / herbe 28 10* boiteries, gon<ements et gangrène des postérieurs, pelage décoloré

[124, 125]

640 / graines 14 33 ingestion alimentaire, TCI PRL (145 à 9 ng/ml)

[42]

610 / (foin+graines) 28 16 PRL (23 à 6 ng/ml) [69]

Brebis 1200 / graines 150 12 albuminémie, GGT [124, 125]

750 / graines 7 23 ingestion alimentaire PRL (28 à 7 ng/ml)

[68]

520 / herbe 42 8 boiteries, T°C rectale PRL (60 à 4,2 ng/ml)

[124, 125]

460 / herbe 42 14 PRL (60 à 4.6 ng/ml)

Béliers 1600 / graines 42 22 testostéronémie, mobilité des spermatozoïdes, T° rectale, FR

PRL (15 à 4 ng/ml)

[21]

1180 / graines 15 32 dérégulation de la température, vascularisation, ingestion

alimentaire

[95]

† : alcaloïdes totaux.

*  : température estimée [138] diminution augmentation

EV = ergovaline, PRL = prolactine, TCI = indice de thermocirculation, FR = fréquence respiratoire, GGT = gamma glutamyl transférases, T° = température.

Tableau II : E!ets de la consommation de fétuque endophytée chez les ovins.

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dans le tableau 2 en fonction de l’âge des animaux. Chez les agneaux, des signes de type boiteries, et un cas de gangrène, sont décrits après quelques semaines d’exposition au pré à des teneurs voisines de 800 µg d’EV/kg d’aliment, lorsque la température extérieure moyenne est assez basse (10°C) [124, 125]. Des teneurs en EV supérieures (960 µg/kg), distribuées sur une durée plus importante (plusieurs mois), ne semblent pas entraîner de signes cliniques à des températures pourtant voisines (14°C) [31]. Des e!ets sur la production, principalement associés à une diminution de l’ingestion alimentaire, sont observés après quelques jours d’exposition à 640 µg d’EV/kg d’aliment lorsque la température externe est de 33°C et à 910 µg/kg lorsque la température est de 21°C [36, 42]. Ces études semblent con&rmer la dualité d’e!ets de la température précédemment décrits  : le froid entrainant la survenue de boiteries, le chaud une diminution de performances. Une forte chute de la prolactinémie (baisse supérieure à 50%) est par ailleurs rapportée dans la quasi-totalité des études où cet e!et a été recherché, et ce dès une exposition à des teneurs de 610 µg d’EV/kg d’aliment [69]. Cet e!et semble précoce, et assez peu dépendant de la dose : baisse de 74% après 28j d’exposition à 610 µg d’EV/kg d’aliment et baisse de 33% après 17j à 910 µg d’EV/kg d’aliment [36, 69]. Le mode de dosage de la prolactine (radio-immunologique) rend par ailleurs diRcile la &xation de valeurs usuelles pour ce paramètre.

Chez les adultes, des e!ets similaires à ceux décrits chez les agneaux sont observés : troubles de type boiteries à basse température (décrits sur brebis), baisse de l’ingestion alimentaire (sur les deux sexes) pour des températures plus élevées [68, 95, 124, 125]. Il faut toutefois noter de fortes variations individuelles dans l’expression des troubles, notamment des boiteries (1 animal sur tout un troupeau !) [124, 125]. Des modi&cations des paramètres biochimiques sont rarement rapportées. Une diminution de l’albuminémie et une augmentation des activités gamma glutamyl transférases sans e!et sur les paramètres hématologiques sont observées chez 50% des animaux à 1200 µg d’EV/kg d’aliment [124, 125]. Les e!ets reprotoxiques de fortes doses d’EV (1600 µg/kg d’aliment) ont par ailleurs été évalués chez les béliers. Une diminution de mobilité des spermatozoïdes, pouvant conduire à une baisse de fécondité, a été décrite, probablement en raison d’une modi&cation de la thermorégulation. Comme chez l’agneau, la prolactinémie est chez l’adulte un marqueur sensible d’exposition, diminué dans toutes les études où il a été évalué, et ce dès une exposition à 460 µg d’EV/kg d’aliment chez la brebis [124, 125].

BOVINS 

Les conséquences de la distribution à des bovins d’un aliment à base de fourrage de fétuques endophytées, plus ou moins complémenté de graines de la même espèce, sont présentées dans le tableau 3 en fonction de l’âge. Chez les bouvillons, l’exposition à des teneurs en EV supérieure à 500µg/kg d’aliment semble s’accompagner de signes

vasculaires et d’une modi&cation de la température rectale [1, 21, 84, 95, 116, 124, 125]. Les signes de boiteries sont rarement rapportés [124, 125] et bien qu’une température extérieure basse soit à l’origine d’une vasoconstriction précoce (dès 4h) des extrémités [1], aucun cas de nécrose ne semble avoir été expérimentalement reproduit. L’exposition à de fortes doses (> 1000 µg d’EV/kg d’aliment) sous des températures de 19 à 36°C, conduit à une diminution de l’ingestion alimentaire [95, 116]. A l’inverse de ce qui est observé chez les ovins, certaines études font également état d’une altération de paramètres biochimiques indicateurs d’une sou!rance hépatique et/ou musculaire à des doses d’exposition de 300 à 500 µg d’EV/kg d’aliment [19, 84]. Ces e!ets ne semblent pas systématiquement observés. De fortes doses d’EV (1500 µg/kg d’aliment), distribuées sous de fortes températures (39°C), conduiraient également à une augmentation des activités des glutathions réductases et peroxydases, et une consommation accrue du glutathion réduit dans les cellules mononuclées, cet e!et n’étant pas observé en l’absence de stress thermique [21]. Comme chez les ovins, une chute de la prolactinémie est quasi-systématiquement rapportée lors d’exposition à des doses supérieures à 300 µg d’EV/kg d’aliment. Une exposition prolongée à la toxine semble entraîner une baisse très prononcée dès les faibles doses (baisse de 90% après 85 j d’exposition à 322 µg d’EV/kg d’aliment) alors qu’une exposition plus courte, mais à de fortes doses, semble avoir un e!et moins marqué (baisse de 75% après 14 j d’exposition à 2000 µg d’EV/kg d’aliment) [19, 116]. Sept jours d’exposition à 317 µg d’EV/kg d’aliment seraient suRsants pour entrainer une baisse signi&cative (56%) de la prolactinémie [118].

Chez les vaches en lactation, de fortes doses d’EV (>1000 µg/kg d’aliment) conduisent, comme chez les animaux en croissance, à une diminution de l’ingéré alimentaire et di!érentes altérations suggérant la survenue d’un stress oxydatif (diminution du glutathion réduit et augmentation du glutathion oxydé dans le sang) [67]. Dans le lait, une diminution des taux butyreux et protidiques, sans modi&cation du niveau de production, a été rapportée lors d’exposition pendant 28 jours à un aliment contenant 782 µg d’EV/kg sous une température de 7°C [65].

EQUINS 

Peu de travaux sont disponibles en ce qui concerne les e!ets de la fétuque endophytée chez les équins (tableau 4). Des études sur juments exposées plusieurs semaines à des aliments contenant de 300 à 860 µg d’EV/kg, révèlent que la baisse de prolactinémie, également décrite chez les ruminants, semble s’accompagner d’une baisse de la progestéronémie, sans que cette diminution n’ait de conséquence sur la fonction de reproduction [2, 16, 75]. Chez les hongres, la distribution d’un aliment supplémenté en graines de fétuques endophytées contenant 500 µg d’EV/kg de matière sèche (MS) pendant 21 jours n’a aucun e!et sur la digestion, le poids, la température rectale, les paramètres biochimiques plasmatiques et la prolactinémie [107].

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ZBIB (N.) AND COLLABORATORS122

AnimauxCirconstances d’intoxications

Symptômes / paramètres RéférenceEV (µg/kg / source)

Durée (jours)

T (°C)

Bouvillons Génisses

2000 / graines 14 36 ingestion alimentaire, T° rectale PRL (45 à 12 ng/ml)

[116]

1500 † / herbe 90 ≥ 39 T°C, gain de poids, GSH cellulaire, GR, GPx

[21]

1180 / graines 15 32 T° cutanée, vascularisation [95]

1000 / graines 6 19 ingestion alimentaire [116]

850 / graines 11 5,4 vasoconstriction, FC PRL (112 à 20 ng/ml)

[1]

825 / graines 42 16 T° rectale, signes de ‘fescue foot’ [124, 125]

560 / herbe 120 20* gain de poids, T°C rectale, FR, ALP, LDH, créatinine, Triglycérides, cholestérol PRL (155 à 17 ng/ml)

[84]

448 † / herbe 180 26* gain de poids PRL (165 à 55 ng/ml)

[131]

325 / graines 42 16 Aucun e!et [124, 125]

322 / herbe 85 21 gain de poids, ALP, ALT, AST, LDH, CK, Triglycérides, Ca, KPRL (36 à 3,6 ng/ml)

[19]

317 / foin 7 9 PRL (15,4 à 6,7 ng/ml) [118]

? / herbe 28 9* rapport albumine/globuline, ALT, cholestérol, protéinémie, Cu, globules rouges, VGM, CCMH, éosinophiliePRL (214 à 13 ng/ml)

[87]

? / herbe 180 18 réponse immunitaire [101]

Vaches laitières

1400 / graines 14 33 l’ingestion alimentaire, GSH, GSSG [67]

1300 / graines 75 28* PRL (25 à 9 ng/ml) [80]

782 / foin 28 7 TB, TP [65]

? : non mesurée.† : alcaloïdes totaux.*  : température estimée [138] diminution augmentationEV = ergovaline, T° = température, PRL = prolactine, FC = fréquence cardiaque, FR = fréquence respiratoire, ALP = alkaline phosphatases, ALT = alanine

aminotransférase, AST = aspartate aminotransférase, LDH = lactate déshydrogénase, CK = créatinine kinase , Ca = calcium, K = potassium, Cu = cuivre, VGM = volume globulaire moyen, CCMH = concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine, GSH = glutathion réduit, GSSG = glutathion oxydé, GR = glutathion réductase, GPx = glutathion peroxydase, SOD = superoxyde dismutase, TB = taux butyreux, TP = taux protéique.

Tableau III : E!ets liés à la consommation de fétuque endophytée chez les bovins.

AnimauxCirconstances d’intoxications

Symptômes / paramètres RéférenceEV (µg/kg / source)

Durée (jours)

Juments 860 / herbe 120 progestéronémie [16]

308 / graines 28 PRL (6 à 3,5 ng/ml) [2]

? / herbe 21 progestéronémiePRL (7 à 3 ng/ml)

[75]

Hongres 500 / graines 21 Aucun e!et [107]

? : non mesurée.*  : température estimée [138] diminutionEV = ergovaline, PRL = prolactine.

Tableau IV : E!ets liés à la consommation de fétuque endophytée chez les équins.

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TOXICITÉ DES MYCOTOXINES PRODUITES PAR NEOTYPHODIUM 123

Il ressort de ces études que la reproduction expérimentale des syndromes attribués à la consommation de fétuque endophytée est diRcile sur les animaux naturellement exposés au risque. Elle nécessite souvent l’ajout de graines à la ration, ce qui ne correspond pas aux conditions habituelles d’exposition, et suggère que d’autres facteurs/toxines sont peut être impliqués dans la survenue des a!ections.

Les bovins seraient plus sensibles que les ovins, l’âge et le stade physiologique ne semblant pas avoir un rôle déterminant. Parmi les facteurs favorisants suspectés lors d’intoxications spontanées, la température semble bien jouer un rôle aggravant. Des basses températures, qui favorisent les vasoconstrictions périphériques des extrémités, seraient nécessaires à la survenue de boiteries. Les animaux exposés à de la fétuque endophytée seraient moins tolérants aux hautes températures que les témoins consommant des fourrages non endophytés, ce qui se traduit par une diminution de l’ingestion alimentaire et des performances.

La prolactinémie se révèle le principal biomarqueur d’exposition. Il est diminué dès les teneurs de 300 et 500 µg d’EV dans l’aliment, respectivement chez les bovins et ovins. Au-delà de ces seuils, l’augmentation du niveau d’exposition semble avoir un e!et modéré, la durée d’exposition semble en revanche aggraver le phénomène. L’analyse des relations dose-e!et sur la prolactinémie est toutefois diRcile en raison de son mode de sécrétion et détermination (cf. infra). Un seuil toxique en EV voisin de 400 à 700 µg/kg pour les bovins et 500 à 800 µg/kg pour les ovins a été &xé dans la fétuque élevée, quels que soient la température externe et l’âge des animaux [26, 124, 125].

Animaux de laboratoire

Les e!ets de la fétuque endophytée ont été étudiés chez les lapins, rats et souris par réalisation d’aliments complémentés en graines (tableau 5). Les niveaux d’exposition sont souvent très élevés, ils visent à caractériser des manifestations toxiques qu’il aurait été diRcile d’explorer chez les espèces naturellement exposées au risque. Chez des lapins, la distribution pendant trois semaines d’un aliment supplémenté en graines de fétuques endophytées contenant 340 µg d’alcaloïdes totaux/kg entraine un retard de croissance accompagné d’une diminution de la prise alimentaire [33].

Chez le rat, di!érentes études ont été réalisées en vue de déterminer l’in<uence de la température externe. A 21 °C, la distribution pendant 8 jours d’un aliment supplémenté par des graines endophytées contenant 2060 µg d’EV/kg d’aliment, entraine dès 3 jours d’exposition une diminution de l’ingéré alimentaire, du gain de poids et une diminution de la température interne (mesurée au niveau intra péritonéal). Le même aliment distribué en présence d’un stress thermique (22 jours à 31°C) entraine une diminution plus importante de l’ingéré alimentaire et du gain de poids, alors qu’une élévation de la température interne est cette fois observée [115].

A la température de 21°C, la distribution pendant 5 jours d’un aliment supplémenté contenant 4100 µg d’EV/kg d’aliment entraine une chute de la température corporelle, de la prise alimentaire, du poids et de la prolactinémie (50%) [108, 110]. Ces e!ets s’accompagnent d’une régulation négative de divers gènes impliqués dans le métabolisme énergétique, la croissance et la lutte contre le stress oxydatif (glutathion peroxydase, superoxyde dismutase et catalase) [109]. En revanche, une régulation positive des gènes associés à la néoglucogenèse et les biotransformations de phase 1 (CYP450) est constatée [108]. Le même aliment, distribué à la température de 31°C, provoque des chutes plus importantes de la température corporelle, de la prise alimentaire et du poids, ainsi qu’une élévation de la prolactinémie. Des e!ets plus ou moins marqués sont également notés sur les gènes impliqués dans la lutte contre le stress oxydatif (diminution des glutathion peroxydase et superoxyde dismutase mais pas d’e!et sur la catalase) alors que les gènes associés à la phosphorylation oxydative, le métabolisme des xénobiotiques (CYP450 et mono-oxygénases à <avine), les mécanismes antioxydants et la fonction immunitaire ont tous été fortement réprimés [110]. Notons que chez la souris maintenue à 34°C, la distribution pendant 15 jours d’un aliment contenant 4100 µg d’EV/kg entraine en revanche une augmentation de l’expression d’un certain nombre de gènes impliqués dans le métabolisme énergétique et les enzymes de biotransformation de phase 1 alors que d’autres gènes impliqués dans la régulation des dommages de l’ADN sont réprimés [9].

Les e!ets de l’EV sur la régulation thermique ont été con&rmés chez le rat par injection intrapéritonéale (15 µg d’EV/kg de poids vif) en présence et en absence de stress thermique [117]. Pour une température externe de 9°C, on observe, 15 min après l’injection, une diminution de la température interne et externe de l’animal de 1°C. En revanche, lorsque les animaux sont maintenus à 30°C, on constate une augmentation de la température interne tandis que la température périphérique décroit de 0,7°C [117].

Di!érentes études concernant la reprotoxicité de l’EV ont été réalisées chez la souris. Dans cette espèce, la distribution pendant une semaine d’un aliment contenant 50% de graines de fétuque endophytées (taux d’infection de 80%) entraine une diminution de la taille des portées et de la viabilité des nouveaux nés [46]. Dans une autre étude, conduite sur 50 jours, la distribution d’un aliment de même nature entraîne une diminution du poids des testicules, de l’épididyme, et de la motilité des spermatozoïdes chez les mâles accompagnée, chez les femelles, d’une diminution du taux de gestation et du nombre de petits par portée [136, 137]. Ces travaux ont été complétés sur des souches de souris sélectionnées sur leur degré de sensibilité ou de résistance à la toxicité de fétuque (cf. infra). Chez les souches sensibles, un aliment contenant 2600 µg d’EV/kg distribué pendant 8 semaines diminue d’une manière signi&cative le poids des testicules, aucun e!et n’étant observé sur la lignée résistante. En revanche, une diminution de la viabilité des spermatozoïdes (17%) et une

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ZBIB (N.) AND COLLABORATORS124

augmentation du taux des cellules anormales (26%) chez les mâles des deux lignées ont été observées [96].

Comme signalé précédemment, des souches de souris résistantes et sensibles à la toxicose de la fétuque endophytée ont été sélectionnées sur 8 générations en fonction de leur croissance lors d’exposition à un régime alimentaire à base de graines de fétuque endophytées [52]. A l’issue de cette sélection, la toxicité d’un aliment contenant 2275 µg EV/kg a été évaluée pendant 42 jours à 24°C. La lignée sensible révèle une diminution de croissance plus importante que la lignée résistante. Cet e!et est accompagné d’une élévation des activités glutathion-S-transférases et les UDP-glucuronyltransférases chez les souris résistantes alors qu’une diminution de ces activités est observée chez les souris sensibles. En revanche, les activités des cytochromes P450 et b5 ne sont pas a!ectées [52]. Une forte corrélation entre les activités glutathions-S-

transférases et les paramètres de reproduction (nombre et poids des portées, nombre de nouveaux nés survivants) a été démontrée sur la lignée résistante lors de distribution d’un aliment contenant 50% de graines endophytées. Les activités des UDP-glucuronyltransférases sont restées inchangées [129].

Ainsi, l’administration de graines de fétuques endophytées à des rongeurs conduit à des manifestations toxiques qui présentent un certain nombre de similitudes avec les e!ets décrits sur les espèces naturellement exposées au risque, avec notamment des e!ets vasculaires et l’ampli&cation des troubles par les hautes températures. On peut toutefois remarquer que seuls des niveaux très élevés d’exposition conduisent à ces troubles, sans que les mécanismes pouvant expliquer les di!érences de susceptibilités entre espèces ne soient identi&ées. L’existence de lignées de souris résistantes

AnimauxCirconstances d’intoxications

Symptômes / paramètre RéférenceEV (µg/kg / source)

Durée (jours)

T (°C)

Lapins 340 † / 20% graines 21 - croissance poids consommation

[33]

Rats 4100 / 50% graines 5 21 T° interne consommation poids, expression CYP450

[108]

GPx SOD CATPRL (12 à 6 ng/ml)

[109]

3 31 expression gènes de l’apoptose consommation expression GPx et SODPRL (11 à 19 ng/ml)

[110]

2060 / 40% graines 8 21 T° interne poids consommation

[115]

31 T° interne

IP * ** 9 T° interne et cutanée [117]

30 T° interne, T° cutanée

Souris 4100 / 50% graines 15 34 expression CYP450 expression gènes de l’apoptoseexpression gènes des enzymes anti-

oxydantes (GR, SOD et MTs)

[9]

2600 / 50% graines 56 - qualité du sperme [96]

2275 †† / 50% graines 42 24 croissance, GSt, UDPGT

[52]

? / 50% graines 7 22 taille des portées viabilité des nouveaux nés

[46]

50 - capacités de reproduction [137]

nombre des petits par portée poids des testicules mobilité des spermatozoïdes

[136]

252 - reproduction, GST [129]

? : non mesurée.† : alcaloïdes totaux ; †† : EV + ergovalinine.*  : injection intrapéritonéale (15µg EV/kg poids vif)**: 2 heures.

diminution augmentationEV = ergovaline, T° = température, GSt = glutathions-S-transférases, UDPGT = UDP-glucuronosyltransférases, PRL = prolactine, CYP450 = gènes des

cytochromes P450, GPx = glutathion peroxydase, SOD = superoxyde dismutase, CAT = catalase, GR = glutathion reductase, MTs = métallothionéines

Tableau V : E!ets liés à la consommation de fétuque endophytée chez les rongeurs.

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TOXICITÉ DES MYCOTOXINES PRODUITES PAR NEOTYPHODIUM 125

et di!érentes analyses génomiques sur rat et souris, suggèrent qu’un stress oxydatif secondaire à une dérégulation thermique pourrait participer aux e!ets toxiques de l’EV. L’équipement en enzyme de biotransformation de phase 2, principalement en glutathion-S-transférases, pourrait également jouer un rôle dans les di!érences de susceptibilités entre espèces.

TOXICOSE DU RAY-GRASS

La toxicité expérimentale du ray-grass endophyté a été évaluée chez di!érentes espèces (tableau 6). Comme pour la fétuque, sont présentés ici les e!ets sur la santé et modi&cations biochimiques observées lorsque des niveaux d’exposition en lolitrem B (LB) sont connus.

Animaux naturellement exposés au risque

OVINS

Chez l’agneau, 7 jours de consommation de ray-grass endophyté contenant 2000 à 2500 µg de LB/kg de matière sèche (MS) en été et automne entrainent l’apparition de tremblements [26]. Dans une autre étude, une réduction de gain de poids de l’ordre de 24% est observée chez des agneaux

consommant du ray-grass endophyté pendant cinq mois (juin-octobre) avec un pic de concentration en LB de 1700 µg/kg MS en août [85]. En revanche, aucun autre trouble n’a été signalé, et aucun e!et sur la santé, les paramètres biochimiques et nécrosiques n’a été observé en &n d’étude [85].

Chez la brebis pâturant du ray-grass endophyté contenant 2135 µg de LB/kg MS durant octobre/novembre (température moyenne de 21°C), on observe une rigidité des membres antérieurs accompagnée de diRcultés de locomotion dès onze jours d’exposition sur 42 animaux sur les 237 exposés [124, 125]. Si les animaux sont forcés à se déplacer, des signes de nervosité accompagnés de crises de tétanies apparaissent. Les troubles disparaissent quatre jours après l’arrêt de l’exposition [124, 125]. Au cours d’un deuxième essai, réalisé sur 20 jours en décembre (température moyenne de 4°C), avec une teneur en LB de 1465 µg/kg MS, aucun animal sur les 179 du troupeau, n’a présenté de trouble [124, 125].

BOVINS

Des taureaux reproducteurs ayant consommé de la paille de ray-grass anglais porte-graines contenant 3850 µg

Espèce

Circonstances d’intoxications

Symptômes / paramètres Référence Toxines (µg/kg)

Sources Durée (jours)

T (°C)

LB EV

Agneaux 2500 ? herbe 7 14* score clinique 2 à 2.5 † [26]

Brebis 2135 ? herbe 11 21 diRcultés de marche, tétanies au niveau des muscles, comportement nerveux

[124, 125]

1700 ? 180 18* réduction de poids [85]

Bouvillons 2000 ? paille 14 ? tremblements des membres postérieurs, contraction des muscles, perte de poids

[78]

1550 160 25 9 aucun e!et [37]

Taureaux 3000 500 10 >30* crises de tremblement,voussure du dos

[7]

Vaches laitières

1700 100 herbe 14 ? aucun effet [3]

Chevaux 2000 360 foingraines

14 11*des membres,lésions du talon, écoulement nasal

[63]

Rhinocéros 1000 ? foin ? 23* tremblements au niveau de la tête et des jambes, instabilité en position debout

[10]

?  : non mesurée.† : voir tableau 1* : température estimée [138]PRL = prolactine, LB = lolitrème B, EV = ergovaline.

Tableau VI : E!ets liées à la consommation de ray-grass endophyté

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ZBIB (N.) AND COLLABORATORS126

de LB/kg MS et 500 µg d’EV/kg MS en période de canicule, ont présentés des symptômes de « ryegrass staggers » dès 10 jours d’exposition. Ces derniers se sont manifestés par des crises de tremblements de 10 à 15 secondes, renforcés lors de stimulation, avec voussure du dos [7]. Une augmentation des activités aspartate aminotrasférase et créatinine kinase a été observée au niveau plasmatique. Après le retrait de la paille, le retour à la normale s’est e!ectué en une dizaine de jours [7].

Chez les bouvillons des signes de «  ryegrass staggers  » apparaissent après 14 jours de consommation d’une paille de ray-grass anglais contenant 2000 µg de LB/kg MS. Les animaux ont montré des tremblements des membres postérieurs avec une démarche titubante [78]. Une perte de poids a également été observée sans qu’aucun e!et sur la digestion ou la composition chimique du contenu ruminal ne soit constaté. Les paramètres biochimiques plasmatiques minéraux et enzymatiques n’ont révélé aucune anomalie. L’examen nécropsique n’a pas montré de lésion [78]. Toujours chez les bouvillons, l’ingestion pendant 25 jours de paille de ray-grass endophyté contenant 1550 µg de LB/kg MS et 160 µg d’EV/kg MS n’a entrainé aucun e!et sur la digestion, les capacités de fermentation du rumen, la fréquence cardiaque et respiratoire, la température rectale et la prolactinémie [37].

Chez des vaches laitières, la distribution durant deux semaines de ray-grass endophyté contenant 1730 et 1200 µg de LB/kg MS (premier essai et deuxième essai) et 100 µg d’EV/kg MS (sur les deux essais) n’entraine aucun e!et sur la prolactinémie et les paramètres quantitatifs et qualitatifs du lait [3].

EQUINS ET AUTRES ESPECES

Les e!ets d’une alimentation à base de foin et graines de ray-grass endophyté contenant 2000 µg de LB/kg MS et 360 µg d’EV/kg MS ont été évalués pendant 2 semaines sur des chevaux de race, âge et sexe di!érents [63]. Dès 4 jours d’exposition, des tremblements accompagnés d’ataxie se développent chez tous les animaux. Des gon<ements des membres avec lésions du talon et un écoulement nasal séreux ont été observés chez les animaux les plus gravement atteints. La fréquence cardiaque augmente, sans toutefois dépasser les valeurs normales ; aucun e!et n’est observé sur la température rectale, la fréquence respiratoire, les paramètres biochimiques plasmatiques et hématologiques [63].

Des rhinocéros blancs du zoo d’Auckland, Nouvelle Zélande, ont été involontairement exposés à du foin porte graines de ray-grass endophyté contenant 1000 µg de LB/kg MS dans les feuilles et tiges et 5600 µg dans les graines/kg MS [10]. Une femelle de 17 ans et un mâle de 24 ans ont présenté des tremblements d’apparition soudaine au niveau de la tête et des membres pendant 2 à 5 jours. Aucun autre animal du zoo n’a montré de trouble [10].

En conclusion, l’analyse de ces études révèle que les symptômes d’intoxication par du ray-grass endophyté observés lors de reproduction expérimentale de l’a!ection chez ovins ou bovins, sont essentiellement limités à des tremblements parfois accompagnés d’une perte de poids. Les ovins seraient un peu plus tolérants à la toxine que les bovins. Le seuil toxique en LB dans le ray-grass a été &xé à 2000 µg/kg pour les ovins et bovins, quels que soient la température externe et l’âge des animaux [26, 124, 125].

Animaux de laboratoire

Chez la souris, la distribution d’un aliment à base de graines de ray-grass endophyté contenant 4890 µg de LB/kg d’aliment sur une durée de 8 semaines, entraine une réduction du poids et du nombre d’individus par portée [127, 128]. Des signes d’excitation et de nervosité sont également signalés.

Chez des souris femelles âgées de 6-8 semaines, plusieurs injections intra péritonéale de LB allant de 500 à 8000 µg/kg de poids corporel entrainent des tremblements dès 30 min après l’injection. Après 2-3h, le score clinique est de 4, après 6h il reste compris entre 3 et 4 (tableau I). Au-delà de 30h les animaux se sont rétablis [43].

Mécanismes d�action

ERGOVALINE

L’ergovaline, présente des analogies structurales avec la dopamine, noradrénaline et sérotonine [8, 81] qui suggèrent que des interactions avec les récepteurs des amines biogènes pourraient expliquer les symptômes observés (&gure 1).

Figure 1 : Structures de l’ergovaline et des amines biogènes : nature des e!ets.

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TOXICITÉ DES MYCOTOXINES PRODUITES PAR NEOTYPHODIUM 127

Activité dopaminergique

La dopamine est un précurseur de la noradrénaline qui joue un rôle modulateur de di!érentes fonctions motrices et psychiques (fonctions cardiovasculaires, motricité digestive, contractions musculaires, appétit et régulation de température) [97]. La dopamine est également une neurhormone produite par l’hypothalamus. Sa principale fonction endocrine est d’inhiber la libération de prolactine par le lobe antérieur de l’hypophyse par &xation aux récepteurs D

2 des cellules lactotropes (&gure 2) [83].

L’activité pharmacologique de l’EV sur les récepteurs D1

et D2 est di!érente [112]. On observe un e!et antagoniste

vis-à-vis des récepteurs D1, ceux qui sont responsables de la

vasodilatation et de la libération de l’hormone parathyroïde, alors qu’un e!et agoniste est constaté sur les récepteurs D

2.

Les récepteurs D2 inhibent la libération de norépinephrine,

dépriment l’activité chimio-sensorielle et répriment la prolactine et l’hormone stimulant les mélanocytes alpha (α) [22]. Chez les bovins, la consommation de fétuque endophytée diminue les concentrations pituitaires en prolactine [92, 105]. L’e!et de l’EV sur la libération de la prolactine a été con&rmé in vitro sur cellules pituitaires de rats. L’alcaloïde exerce un e!et inhibiteur sur la libération de la prolactine d’au moins 40% à toutes les concentrations testées (jusqu’à 10-8M) et inhiberait également sa synthèse [121].

Activité adrénergique

L’adrénaline est majoritairement sécrétée par les glandes surrénales en réponse à un stress ou en vue d’une activité physique [5]. L’ergovaline a une faible activité agoniste vis-à-vis des récepteurs adrénergiques alpha 1 (α

1) et alpha 2

(α2) [29]. Toutefois, une forte activité vasoconstrictrice a été

démontrée sur la veine dorsale du pied de bovin [86]. Cet e!et semble également dû à la &xation de la toxine aux récepteurs sérotoninergiques de type 2 [29]. L’ergovaline a une forte

activité vasoconstrictrice comparée à d’autres alcaloïdes ergotiques, qui se manifeste plus au niveau des veines que des artères. Par ailleurs aucun e!et synergique entre di!érentes classes d’alcaloïdes n’est observé [86].

Activité sérotoninergique

La sérotonine, synthétisée et stockée au niveau de la muqueuse gastro-intestinale, joue un rôle dans la motilité intestinale [99]. Une partie de la sérotonine du tube digestif passe dans le sang où elle est stockée dans les plaquettes [74]. Lors de la première étape de la coagulation sanguine, les plaquettes libèrent la sérotonine qui se &xe aux récepteurs 5-HT

2 présents dans les muscles lisses vasculaires qui, en

se contractant, provoquent une vasoconstriction et une hypertension [29].

L’activité pharmacologique de l’EV sur les récepteurs sérotoninergiques a été moins étudiée que celle de l’ergotamine. Toutefois, certains e!ets observés in vivo, tels une modi&cation des <ux sanguins sur les artères utérines et ombilicales [95], sont corrélés à ceux obtenus in vitro et sur organes isolés [29]. Les vasoconstrictions sont longues à apparaitre mais également à disparaitre, ce qui tendrait à signi&er une grande aRnité pour les récepteurs tissulaires [29]. Les phénomènes de vasoconstriction pourraient entrainer l’anoxie des tissus périphériques, qui, lorsqu’ils sont exacerbés par le froid, pourraient conduire à des phénomènes de gangrène sèche similaires à ceux observés lors d’intoxication par l’ergot et expliquer la «  fescue foot » [17]. L’action sérotoninergique inhibant les contractions du reticulorumen pourrait également en partie expliquer les diminutions de gain moyen quotidien et la baisse de digestibilité parfois observées sur les ruminants [120].

LOLITREM B Le LB est un indole-diterpène qui exerce un e!et

inhibiteur sur les canaux potassiques activés par le calcium «  BK channels  » [25, 57–59, 66]. D’autres hypothèses suggèrent une action inhibitrice, sur les récepteurs à l’acide gama amino-butyrique de type A (GABA

A), et/ou les

neurotransmetteurs des acides aminés, ou une stimulation des récepteurs cholinergiques (&gure 3) [56].

Figure 2 : Action de l’ergovaline sur la sécrétion de prolactine.

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ZBIB (N.) AND COLLABORATORS128

Les « BK channels »

Les canaux potassiques activés par le calcium («  BK channels » ou canaux BK) existent au niveau des neurones et des muscles. Ils participent à la régulation de la sécrétion de neurotransmetteurs [49] et jouent un rôle dans le contrôle de l’excitabilité neuronale et musculaire [27, 49, 104]. Les canaux BK permettent la régulation du potentiel d’action de la membrane en réduisant l’excitabilité pour empêcher la surexcitation cellulaire [57]. Les canaux BK sont formés de 4 sous-unités alpha (α) conduisant à la formation d’un pore [59], et d’une sous-unité beta (β) dont la nature varie selon les tissus (sous unités β

1, β

2, β

3 et β

4 respectivement présentes

dans les muscles lisses, les ovaires les testicules et les tissus nerveux) [58]. Le LB bloquerait les canaux potassiques activé spar le calcium par &xation à la sous-unité β

4, conduisant aux

tremblements observés lors d’intoxication [25, 57–59, 66]. Les récepteurs cholinergiques

Les récepteurs cholinergiques sont principalement de type nicotinique ou muscarinique. Les récepteurs nicotiniques sont couplés à des canaux cationiques provoquant très rapidement une dépolarisation et une excitation cellulaire. Les récepteurs muscariniques, couplés aux protéines G, peuvent induire des réponses excitatrices ou inhibitrices. Chez les ovins, le LB possède une action excitatrice sur l’activité électromyographique des muscles squelettiques [113] et des e!ets excitateurs ou inhibiteurs sur l’activité électromyographique des muscle lisses gastro-

intestinaux [76, 113, 130]. Ces e!ets peuvent être liés à une stimulation directe des récepteurs muscariniques ou une augmentation de libération d’acétylcholine (ACh) au niveau des synapses neuromusculaires du reticulo-rumen [76, 98, 113, 130]. Le LB, en stimulant les récepteurs nitotiniques ou muscariniques, agirait comme agoniste de l’ACh, qui pourrait contribuer aux troubles observés lors de la consommation du fourrage endophyté [76].

Les récepteurs GABA

L’acide gamma-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur dans le cerveau chez les vertébrés [30]. Di!érents récepteurs au GABA ont été identi&és, les récepteurs de type A (GABA

A) étant

responsables de l’activation des canaux chlorures voltage dépendants impliqués dans l’hyperpolarisation membranaire et la diminution du potentiel d’action [30]. Di!érents sites de &xation des xénobiotiques aux récepteurs GABA

A ont

été identi&és. Le LB exercerait son action [30] en se &xant au site des benzodiazépines, ce qui conduirait au blocage du récepteur, empêchant l’entrée du chlore dans les cellules, conduisant à une augmentation de l’excitabilité cellulaire et la survenue de tremblements [30].

Les neurotransmetteurs d’acides aminés

L’hypothèse d’une action du LB sur les récepteurs aux acides aminés fait suite à la mise en évidence d’une libération accrue d’acide aspartique et glutamique dans des

Figure 3 : Structures du Lolitrem B et de di!érents neuromédiateurs : nature des e!ets.

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TOXICITÉ DES MYCOTOXINES PRODUITES PAR NEOTYPHODIUM 129

synaptosomes cérébro-corticaux préparés à partir d’ovins présentant des symptômes de ray-grass staggers [73]. Cet e!et pourrait contribuer aux troubles observés au niveau périphérique dus à la &xation aux récepteurs GABA

A.

Action sur la prolactine

Comme signalé précédemment, la diminution de la prolactinémie observée lors d’exposition à la fétuque endophytée a été associée à un e!et de l’EV sur sa libération. Bien que de l’EV soit présente en quantité élevée dans le ray-grass endophyté, la chute de la prolactinémie semble moindre quand l’ergovaline est produite dans le ray-grass que quand elle est présente dans la fétuque élevée. Chez des agneaux, la consommation pendant 14 jours à 33°C d’un aliment supplémenté en graines de ray-grass ou fétuques endophytés contenant respectivement 610 et 530 µg d’EV/kg entraine une réduction respective de la prolactinémie de 58 et 83% par rapport aux témoins [42]. Dans une autre étude, des brebis exposées à une température de 25°C, consommant du ray-grass endophyté sélectionné (AR6) contenant 800 ou 1200 µg d’EV/kg MS mais pas de LB, aucune di!érence au niveau de la prolactinémie n’a été observée par rapport aux témoins. En revanche, un stress thermique (30 à 42°C) provoque une augmentation de la prolactinémie chez les témoins et pas les traités [41]. Chez des vaches laitières, la consommation pendant 30 jours, de ray-grass endophyté contenant 400 µg d’EV/kg MS, à une température ambiante voisine de 28°C, ne diminue pas la prolactinémie [11], alors qu’une exposition de 5 mois (été-automne) à des teneurs moyennes en EV de 420 µg/kg MS, avec un pic de concentration en automne de 800 µg/kg MS, entraine un e!et faible et variable sur ce paramètre [11–14].

Ainsi, la di!érence d’e!et de l’EV sur la prolactinémie lorsqu’elle est présente dans le ray-grass ou la fétuque, suggère que des alcaloïdes autres que l’EV, présents dans la fétuque pourraient jouer un rôle important dans la chute de la prolactinémie, ou que des alcaloïdes produits dans le ray-grass pourraient avoir un e!et antagoniste à celui de l’EV sur ce paramètre [42].

Toxicocinétique, métabolisme et résidus

Les toxicocinétiques de l’EV et du LB ont été étudiées après administration intraveineuse (IV) chez di!érentes espèces. Les teneurs en toxines ou leurs métabolites ont également été recherchés dans di!érentes matrices après administration orale ou exposition à des fourrages contaminés.

ERGOVALINE

Chez la chèvre, au cours du 5ème mois de lactation, l’injection IV de 32 µg d’EV/kg montre une décroissance rapide de l’alcaloïde avec une demi-vie de 40 min et une clairance plasmatique de 25 ml/min/kg [28]. La molécule est retrouvée dans le lait pendant 8h après l’injection, avec

un taux d’excrétion de 0,05% [28]. Chez le mouton, après injection IV de 17 µg d’EV/kg, la demi-vie d’élimination est de 24 min, la clairance totale de 20 ml/min/kg [62]. Chez le cheval, après injection IV de 15 µg d’EV/kg, la demi-vie d’élimination est de 57 min, la clairance totale de 20 ml/min/kg [15].

Chez la chèvre en lactation, l’administration intra-ruminale de 38 µg d’EV/kg n’entraine pas d’apparition de traces détectables dans le plasma (LD = 1,2 ng/ml) ou le lait (LD = 0,2 ng/ml) [48]. De même, l’EV n’a pas été détectée dans les urines d’ovins recevant une alimentation à base de foin et graines de fétuques endophytées contenant 610 µg d’EV/kg d’aliment pendant 28 jours [69]. Une teneur de l’ordre de 480 µg d’EV/kg a été retrouvée dans les excréments. Chez le cheval consommant un régime à base de graines de fétuque endophytées contenant 500 µg d’EV/kg d’aliment sur une durée de 20 jours, l’alcaloïde a été retrouvé dans les selles mais pas dans les urines [107]. Le dosage en parallèle des teneurs en acide lysergique suggère une biotransformation de l’EV en cet alcaloïde in vivo [107].

LOLITREM B

Chez la chèvre en lactation, l’administration IV de 23 µg de LB/kg montre une décroissance rapide le l’alcaloïde, avec une demi-vie de 14 min et une clairance 25 ml/min/kg PV [48]. La molécule est retrouvée dans le lait pendant 32h après l’injection avec un taux d’excrétion de 3% [48]. Le LB a été retrouvé en quantités in&mes dans le muscle, aucune trace n’étant détectée dans le foie ou les urines après 50h [48].

Toujours chez la chèvre en lactation, l’administration intra-ruminale de 100 µg de LB/kg n’entraine aucune trace détectable dans le plasma (LD = 0,85 ng/ml). Dans le lait, la concentration maximale de LB était de 4,6 ng/ml après 24h ; la durée totale d’élimination de 75h avec un total d’excrétion lactée de 0,19% de la dose administrée [48]. Les résidus de LB dans la graisse ont été recherchés chez les ovins pâturant du ray-grass endophyté sur une période de 9 mois. Une concentration en LB de l’ordre 62 µg/kg a été retrouvée au pic de la concentration de LB dans la plante, soit 3400 µg/kg MS [34].

Les résidus de LB dans le lait ont été mesurés chez des vaches consommant du ray-grass endophyté contenant 1800 µg de LB/kg MS sur 12 jours. Le LB est détectable après 24 h, sa demi-vie est de 38 heures. Après arrêt de l’exposition, il faut 8 jours pour que la toxine soit totalement éliminée du lait. Au total, 0,23% de la dose ingérée est excrétée dans le lait [35]. Aucune trace de LB n’a été détectée dans le tissu cérébral, le foie, le muscle et les reins chez les vaches laitières consommant pendant 15 jours de la paille de ray-grass anglais endophyté contenant 1200 µg de LB/kg MS alors qu’une concentration de 200 µg/kg a été retrouvée dans la graisse [79]. Chez des bouvillons consommant de paille de ray-grass endophyté contenant 2000 µg de LB/kg MS pendant 3 à 12 semaines, des teneurs en LB de 120 et 150 µg/kg ont été

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détectés dans la graisse alors que des teneurs de 1 à 5 µg/kg étaient mesurées dans le foie, les reins et le muscle [78, 111] et que la toxine n’était pas détectable dans le plasma [111].

Le LB n’a pas été détecté dans les urines de chevaux recevant pendant 2 semaines une alimentation à base de foin et graines de ray-grass endophyté contenant 2000 µg LB/kg MS [63].

Au bilan, il apparait que l’absorption orale de l’EV et du

LB sont faibles et que leurs cinétiques d’élimination sont rapides. On peut noter que le LB est retrouvé dans le lait, lors d’exposition au pâturage dans les conditions naturelles. Le taux d’excrétion de cet alcaloïde dans cette matrice pourrait atteindre 3%. Celui de l’EV dans ce milieu est de l’ordre 0,2%. En ce qui concerne les matrices carnées, il apparait que la graisse est le milieu le plus contaminé en LB, alors que l’EV n’a jamais été retrouvée dans les tissus.

Conclusion

Des intoxications animales spontanées faisant suite à la consommation de fétuque ou de ray-grass anglais ont été décrites au début du XXème siècle chez les ruminants. Tout d’abord caractérisées par leurs appellations cliniques, « fescue foot » et « summer syndrome » pour les a!ections observées sur fétuques élevées et « ryegrass staggers » pour celles observées sur ray-grass anglais, ces pathologies ont progressivement été attribuées à des mycotoxines produites par des champignons du genre Neotyphodium au cours de leurs développements symbiotiques dans les graminées. Di!érents essais de reproduction expérimentale révèlent que le «  ryegrass staggers  » semble lié à la présence de lolitrem B dans la plante, alors que la «  fescue foot  » et le «  summer syndrome  » pourraient être attribués à la présence d’ergovaline. Des facteurs prédisposants (espèce) et des facteurs favorisants (température) contribueraient à la diversité des e!ets observés, d’autres alcaloïdes produits par le champignon pouvant également jouer un rôle dans la gravité de l’a!ection.

Le lolitrem B est aujourd’hui reconnu comme une mycotoxine trémorgène susceptible de se &xer sur di!érents récepteurs cellulaires à l’origine d’une modi&cation de l’excitabilité et des manifestations de type tremblements. L’ergovaline est un alcaloïde ergotique dont le mécanisme d’action est plus complexe. En interagissant avec les amines biogènes, ce composé modi&erait la vascularisation périphérique conduisant à une anoxie tissulaire dont les e!ets seraient ampli&és par le froid, et/ou d’autres facteurs. A terme, les conséquences seraient une nécrose tissulaire avec perte possible des extrémités, troubles qui ne sont quasiment plus jamais observés aujourd’hui. Lors d’exposition à de fortes températures, l’ergovaline entrainerait une diminution de la résistance à la chaleur qui conduirait à des pertes économiques. Des phénomènes de type stress oxydatif et/ou des altérations des systèmes enzymatiques de biotransformation de phase 2 pourraient contribuer aux e!ets de la toxine. La &xation de

l’ergovaline sur les récepteurs des amines biogènes conduirait également à des perturbations endocriniennes. Parmi elles, la diminution de la prolactinémie est reconnue depuis plusieurs années comme un marqueur sensible d’exposition. Bien qu’il apparaisse indéniable que l’ergovaline se &xe au niveau des récepteurs D

2 de l’hypophyse, conduisant à une diminution

de la libération de prolactine par les cellules lactotropes, rien ne permet d’expliquer pourquoi ces e!ets sont plus marqués quand la toxine est produite dans la fétuque plutôt que dans le ray-grass, ce qui con&rme que de nombreuses inconnues persistent quant à la toxicité des mycotoxines produites par les champignons endophytes.

Bien que peu de données soient disponibles en ce qui concerne la toxicocinétique de l’ergovaline et du lolitrem B, il apparait que leur absorption orale est faible et leur élimination rapide. Plus lipophile, le lolitrem B est également plus di!usible dans le lait et plus persistant dans les graisses, des teneurs résiduelles pouvant être observées dans ces matrices lors d’exposition dans les conditions naturelles en l’absence de signes cliniques chez les animaux.

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36

Chapitre 2 : présentation de l’article 2

La consommation de fétuque endophytée (FE+) est à l’origine de différentes affections

dont les manifestations cliniques, la prévalence, la saisonnalité et les espèces cibles varient

considérablement (Article 1, partie historique, pages 16). Parmi les troubles observés, un

certain nombre est associé à l’action de l’ergovaline (EV) sur les récepteurs des amines

biogènes. C’est notamment le cas de la baisse très prononcée de la prolactinémie (PRL),

associée à une inhibition des récepteurs D2 des cellules lactotropes de l’hypophyse antérieure

(Article 1, colonne 1, page 29). De même, une modification du flux sanguin périphérique,

associée à une action vasoconstrictrice de l’EV, a été très tôt caractérisée et considérée

comme responsable de la survenue des nécroses des extrémités. En parallèle de ces actions,

d’autres effets de l’EV peuvent contribuer à la diversité des troubles observés. Ainsi, une

diminution des mécanismes de défense contre le stress oxydatif (mesurée par une diminution

de la teneur en glutathion et une diminution des activités des enzymes impliquées dans le

métabolisme des dérivés oxydés), et parfois une augmentation des dommages oxydatifs

(mesurée par une augmentation des teneurs en malondialdéhyde et glutathion oxydé)

indiquent la survenue d’un stress oxydatif (Article 1, colonne 2, pages 21) (Lakritz et al.,

2002 ; Spiers et al., 2005). Par ailleurs, des études réalisées chez la souris ont montré des

différences de sensibilité à la toxicose de la FE+ entre race ou souche (Article 1, colonne 2,

page 24). Ces différences seraient en partie expliquées par des différences dans l'expression

et/ou l’activité des enzymes de biotransformation (Hohenboken et al., 1997, Wagner et al.,

2000). L’importance réelle de ce phénomène sur les animaux de production reste largement

méconnue.

En Europe malgré la présence d’EV à de fortes teneurs dans les variétés sauvages de

fétuque, les pathologies liées à la consommation de FE+ ne sont que très rarement décrites.

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de la consommation d’un fourrage de fétuque

endophytée, récolté dans une situation de « pire cas », sur la santé animale et la production

laitière chez des brebis en lactation. Les effets toxiques seront notamment mesurés sur la

température cutanée, le stress oxydatif, la prolactinémie et les activités enzymatiques de

biotransformation. Enfin, la présence résiduelle de l’EV a été déterminée dans différents

tissus et dans le lait.

37

En septembre 2009, deux parcelles de fétuque élevée de variété Kentucky 31,

endophytée (FE+) et non endophytée (FE-) ont été semées en Aveyron. Le foin a été récolté à

maturité au pic de concentration en ergovaline, juste avant la dissémination des graines. Seize

brebis laitières Lacaune (76 ± 10 Kg) ont été réparties en deux lots homogènes alimentés 28

jours ad libitium avec du foin de FE+ ou FE- complété par 700g de concentré riche en

protéines, 500g d'orge et 20g de complément multivitaminé. Les paramètres de productions

(poids, production laitière et consommation) ont été mesurés. Les températures internes,

cutanées et ambiantes ont été enregistrées en vue de calculer l’indice de thermocirculation.

Des prélèvements sanguins ont été effectués à la jugulaire pour mesure de l’hématocrite, de la

biochimie minérale et enzymatique, de la PRL et des marqueurs du stress oxydatif. Tous les

animaux ont été abattus et autopsiés après 28 jours d’exposition. Des tissus (foie, reins,

muscle, cerveau et graisse) et du lait ont été collectés et stockés à -80°C en vue de la mesure

des paramètres de stress oxydatif et enzymes de biotransformation et à -20°C en vue de la

détermination des teneurs en EV. Des fractions cytosoliques et microsomales hépatiques et

rénales ont été préparées par centrifugation différentielle et stockées à -80°C. Les méthodes

utilisées pour la détermination des paramètres de stress oxydatif et enzymes de

biotransformation sont présentées en pages 47-49 (Article 2).

Les concentrations en EV dans le foin, les tissus et le lait ont été déterminées par

HPLC avec un détecteur de fluorescence. Le pourcentage d’extraction de l’EV dans le foin est

de 83% avec une limite de détection (LD) de 5 µg/kg MS. Dans les matrices carnées et le lait,

le pourcentage d’extraction est de 91 et 99%, la limite de détection de 0,15 µg/kg ou µg/l.

Les principaux résultats obtenus dans cette étude révèlent que la distribution d’un

fourrage contenant 497 ± 52 µg EV/kg MS n’a entrainé aucun signe de toxicité chez les

brebis. Comme déjà souligné dans l’article 1, la température peut constituer un élément clef

dans l’apparition de la « fescue foot » chez l’animal. Dans cette étude, malgré une semaine

d’exposition à 5°C, le stress thermique au froid n’était pas suffisant pour développer des

signes de boiteries ou des nécroses des extrémités (Tor-Agbidye et al., 2001). Ce résultat est

en accord avec des données obtenues sur d’autres études et confirme la relative

résistance de l’espèce ovine à la toxicité de la fétuque endophytée.

En revanche, une diminution du poids corporel et de la consommation, sans impact sur

la production et la qualité du lait, a été observée chez les brebis alimentées avec du foin FE+

(Article 2, figure 1, p 69). La baisse de consommation n’a jamais été décrite à cette dose,

mais elle a été observée chez les animaux exposés à des teneurs en EV comprises entre 640 à

38

1400 µg/kg aliment final (Lakritz et al., 2002; Gadberry et al., 2003; Looper et al., 2006;

Spiers et al., 2012).

L’analyse des teneurs en EV dans le lait et les tissus est inférieure à la LD (0,15 µg/l et

0,15 µg/kg, respectivement). L’absence résiduelle d’EV dans le lait est en accord avec une

étude de toxicocinétique réalisée chez les caprins qui montre un taux d’excrétion négligeable

dans le lait (0,05%) après une injection IV de 32 µg d’EV/kg (Durix et al., 1999). Une autre

étude décrit l’absence d’EV dans le lait après une administration intra-ruminale de 38 µg

EV/kg chez la chèvre en lactation (Grancher, 2007). Cela confirme le très faible taux de

transfert de l’EV dans cette matrice.

Une baisse significative réversible de la température cutanée et de l’indice de

thermocirculation (TCI) est observée chez les animaux consommant du fourrage FE+ (Article

2, figure 2, page 70). Le TCI a été développé pour révéler l’effet vasomoteur de l’EV, ou

d’autres alcaloïdes ergotiques (Gadberry et al., 2003). Dans cette étude, la diminution du

TCI est liée à une diminution de la température cutanée, observée entre 3 et 7 jours

d’exposition. Elle démontre un effet précoce mais fugace de l’EV sur le flux sanguin

périphérique. Ce résultat est en accord avec une étude réalisée chez des agneaux recevant un

aliment contenant 640 µg EV/kg qui montre une diminution significative du TCI après 14

jours d’exposition confirmant ainsi l’effet vasomoteur de l’EV (Gadberry et al., 2003). Des

données obtenues chez le rat révèlent un effet de l’EV sur la régulation thermique 15 minutes

après injection intra-péritonéale de 15 µg d’EV/kg de poids vif (Spiers et al., 1995). Une autre

étude chez des bovins (administration IV de 3,5 µg EV/kg poids vif) montre une diminution

rapide (30 min) de la température cutanée mesurée au niveau de la queue (McCollough et al.,

1994).

L’évolution des concentrations en prolactine au cours du temps dans les deux groupes

a été comparée en utilisant un modèle linéaire pour évaluer l'effet du groupe, du temps, et de

l'interaction entre groupe et temps. Quand un effet significatif du temps a été observé, un test

complémentaire a été utilisé pour la comparaison individuelle des moyennes. Une baisse

significative de la PRL est observée de j0 à j28 dans les deux groupes (Article 2, figure 3,

page 71). Ce phénomène est accentué par la consommation du foin FE+ contenant 497 µg

EV/kg MS. On observe une chute significative de 63 et 70% respectivement après 3 et 28

jours d’exposition. Ce résultat est en accord avec toutes les études où ce paramètre a été

mesuré (Article 1, tableaux 2, 3 et 4, pages 20 et 22). Par exemple, chez des bouvillons, une

diminution significative de la PRL a été observée après 7 jours d'exposition à un fourrage

39

contenant 317 ug EV/kg MS (Stamm et al., 1994). Chez la brebis, une diminution marquée de

la PRL (> 90%) a été observée après 42 jours d'exposition (460 ug EV/kg MS). En revanche

une chute plus faible (75%) a été observée après 7 jours d'exposition (750 ug EV/kg MS). Ces

résultats confirment que la consommation de FE+ entraîne une chute précoce de la

prolactinémie dont l’effet s’accroit faiblement lorsque la durée d'exposition augmente.

Cette diminution n'a toutefois pas de conséquences significatives sur la production

lactée.

Les résultats du dosage de paramètres de mesure du stress oxydatif au niveau

plasmatique, hépatique et rénal, sont présentés dans les tableaux 1 et 2 (Article 2, pages 65 et

66). Dans le plasma, la teneur totale en glutathion diminue significativement avec le temps

dans les deux groupes FE- et FE+. L’activité catalase a également diminué avec le temps,

mais la baisse est plus prononcée dans le groupe FE+ (57%) que FE- (24%). Chez les brebis

exposées à FE+, une diminution significative des teneurs en malondialdéhyde et de la

concentration de glutathion total ont été observées dans les reins. Une diminution modérée

mais significative des activités des enzymes impliquées dans la lutte contre le stress oxydatif,

est également observée dans le groupe FE+ : baisse des activités glutathion réductase et

glutathion peroxydase rénales de 21 et 14%. Nos résultats sont en accord avec des études à

fortes doses sur rongeurs dans lesquels une exposition concomitante à de fortes température

était réalisée. Par exemple, des teneurs en EV supérieures à 4000 µg/kg d’aliment, en

présence d’un stress thermique chaud, provoquent des modifications de l’expression de gènes

d’enzymes impliquées dans la lutte contre le stress oxydatif, tel : glutathion peroxydase,

superoxyde dismutase et catalase (Settivari et al., 2008 ; Settivari et al., 2009). Chez les

bouvillons, l’exposition à de fortes doses (>1000 µg EV/kg d’aliment) en présence d’un stress

thermique (33°C) conduit à une diminution du glutathion réduit (25%) et augmentation du

glutathion oxydé (65%) dans le sang (Lakritz et al., 2002). Les résultats que nous avons

observés dans cette étude suggèrent qu'une baisse modérée des mécanismes de défense

contre les dommages oxydatifs est possible chez les brebis consommant FE+, sans

conséquence apparente sur la santé animale ou la production laitière.

Les activités enzymatiques de biotransformation de phase I et II hépatiques et rénales

sont présentées dans le tableau 3 (Article 2, page 67). Les biotransformations correspondent à

l’ensemble des réactions qu’un xénobiotique peut subir dans un organisme. La principale fonction

de ces enzymes est de convertir ces composés en produits polaires afin de faciliter leur excrétion.

Ce processus se divise généralement en deux étapes qui sont la phase I (activation par oxydation,

réduction et hydrolyse) et la phase II (conjugaison). Les activités enzymatiques des cytochromes

40

P450 représentent l’essentiel des réactions de la phase I. Ces cytochromes sont classés en familles

(CYP1, CYP2, CYP3 et CYP4,…) , sous-familles (CYP1A, CYP2D, ...) et isoenzymes (CYP3A4,

CYP2D6.) Les résultats observés dans cette étude révèlent une diminution significative des

activités de O-déalkylations de l’éthoxyrésorufine, la méthoxyrésorufine et la

pentoxyrésorufine dans le foie des animaux exposés à FE+. L’activité diméthylnitrosamine N-

déméthylase diminue aussi. En revanche une augmentation marquée de 302% de l’activité

érythromycine N-déméthylase est observée dans le lot FE+. Au niveau rénal, une inhibition de

92% de l’activité des glutathion transférases est observée.

Les activités O-déalkylases mesurées dans cette étude sont attribuées aux P450 1A et

2B (Machala et al., 2003 ; Szotáková et al., 2004), alors que l’activité diméthylnitrosamine N-

déméthylase est attribuée à des P450 de la famille 2 (Yamazaki et al., 1992 ; Stiborová et al.,

1996 ; Chowdhury et al., 2012).. L’activité érythromycine N-déméthylase est attribuée à des

P450 de la sous-famille 3A (Zhang et al., 1996). Les isoenzymes de cette sous-famille (3A)

sont impliqués dans le métabolisme des alcaloïdes ergotiques et notamment l’ergotamine,

alcaloïde proche de l’EV (Peyronneau et al., 1994 ; Repussard et al., 2014). Des observations

réalisées chez l’homme démontrent que l’inhibition de cette activité en présence d’ergotamine

utilisée à des fin médicales conduit à un dépassement des doses thérapeutiques et l’apparition

de toxicité (Liaudet, 1999). Son induction dans la présente étude suggère une

augmentation du métabolisme de l’EV, qui pourrait contribuer à expliquer les

différences de toxicité observées entre espèces lors d’exposition à la fétuque endophytée.

Enfin, différentes études réalisées sur rongeurs réalisées lors d’exposition à de fortes

doses d’EV (>4000 µg/kg d’aliment) en présence des fortes températures (>30°C) ont montré

une modulation de la transcription de gènes codant pour la synthèse de différentes enzymes de

biotransformation de phase I et II. Parmi eux, une régulation positive des gènes Cyp2a12,

2d26, 2c13 et 2e1 (gènes des cytochromes P450) et une régulation négative du gène Cyp3a25

ont été rapportés (Bhusari et al., 2006 ; Settivari et al., 2006). Une régulation négative des

gènes de la glutathion S-transférase a également été observée (Settivari et al., 2006). La

diminution d’expression de la GSH-transférase pourrait contribuer à expliquer la diminution

d’activité observée dans notre étude. En revanche, les effets observés sur l’activité des

enzymes de biotransformation de phase I semblent aller à l’encontre des résultats obtenus

dans notre étude. Ces différences pourraient s’expliquer par des différences entre espèces

mais aussi par l’existence de schémas physiopathologiques différents selon que les animaux

sont exposés à de faibles doses ou à de fortes doses, en présence de facteur aggravant

(encadré 3, page 42).

41

En conclusion, la distribution d’un fourrage de fétuque endophyté contenant 497 µg

d’ergovaline/kg MS à des brebis en lactation confirme les effets précédemment rapportés à de

plus fortes doses sur la circulation périphérique et sur la prolactinémie. A niveau d’exposition

de cette étude, aucune conséquence clinique et aucune altération de qualité des productions ne

sont observées. De même, un effet modéré sur les mécanismes de défense contre le stress

oxydatif est observé, sans apparente conséquence. Les modulations des activités

enzymatiques de biotransformation observées n’ont jamais été mises en évidence sur les

animaux de production. La correspondance avec les effets observés dans d’autres modalités

d’exposition chez les rongeurs ou l’homme suggèrent que des études complémentaires sont

nécessaires pour déterminer l’importance réelle de ces effets dans la toxicité de l’EV

(encadré 3 page 42).

42

Encadré 3 : Effets de l’ergovaline dans la fétuque.

+

+

Enzymes de biotransformation

RécepteursD2 5-HT2

Ergovaline

↘ ↘ PRL Effet vasomoteur↘ 70% ↘ TCI↘ 50% ↗ T°C interne

Effetspharmacologiques

↘ ↘ ↘ ↘ gènes(SOD, CAT, GR, GPx)

↘ activités(CAT, GR , GPx)

↘ EROD, MROD, PROD (P450 1A et 2B)

↘ diméthylnitrosamineN-déméthylase (P450 2)

↗ 300% érythromycine N-déméthylase (P450 3A)

↘ 92% GSt

↗ transcription CYP2A12, 2D26, 2C13, 2E1

↘ transcription CYP3A25

↘ transcription GSt

Résultats obtenus dans :- Revue bibliographique (Article 1)- Études rongeurs (4000 µg EV/kg + T°C élevées) / (Settivariet al., 2008, 2009 et 2010)- Étude FE+, 497 µg EV/kg (Article 2)

Capacités de lutte contre le stress oxydatif

Effetsbiochimiques

FE+ : fétuque endophytée, D2: récepteur dopaminergique, 5-HT2 : récepteur 5-hydroxytryptamine 2, PRL : prolactine, TCI : indice dethermocirculation, SOD : superoxyde dismutase, GPx : glutathion peroxydase, GR : glutathion réductase, CYP : cytochrome P450, EROD :éthoxyrésorufine, MROD : méthoxyrésorufine, PROD : pentoxyrésorufine, GSt : glutathionS-transférase.

Stress oxydatif

+

Mécanismesd’action supposés

Étude FE+

Étude FE+

Études rongeurs

Études rongeurs

Article 2

Ergovaline in tall fescue and its effect on health, milk quality,

biochemical parameters, oxidative status and drug metabolizing

enzymes of lactating ewes

N. Zbib*, C.Repussard*, D.Tardieu*, N.Priymenko†, C. Domange†and P. Guerre*2

*Université de Toulouse, INP, ENVT, UR Mycotoxicologie, F-31076 Toulouse, France

†Université de Toulouse, INP, ENVT, INRA UMR1331 Toxalim, F-31076 Toulouse France.

Running title: Effects of ergovaline on lactating ewes

Keywords:

drug metabolizing enzymes, endophyte-infected tall fescue, ergovaline, ewes, oxidative

status, prolactin

Article publié dans : Journal of Animal Science J Anim Sci. 2014 Nov;92(11):5112-23. doi: 10.2527/jas.2014-8106

43

INTRODUCTION

The development of N. coenophialum in tall fescue (Lolium arundinaceum) leads to

production of ergot alkaloids of which ergovaline (EV) is the most abundant (Tor-Agbidye et

al., 2001; Repussard et al., 2013). This symbiotic association is responsible for fescue foot,

summer slump syndrome, and economic loss of livestock (Schmidt and Osborn, 1993;

Strickland et al., 1993; Bacon, 1995). Animal species, external temperature, and farming

practicesplay a role in the occurrence and severity of the diseases (Spiers et al., 2005; Zbib et

al., 2014).

The interaction of EV with biogenic amines receptors alters peripheral blood flow

leading to hyperthermia during heat stress and to tissue necrosis when the temperatures are

low (Oliver and Abney, 1989; Oliver et al., 1993; Strickland et al., 1993). Oxidative status

has been reported to play a critical role in the severity of the diseases under heat stress

(Lakritz et al., 2002; Spiers et al., 2005). In addition, the binding of EV to the dopaminergic

receptors of the pituitary gland inhibits prolactin (PRL) secretion (Schillo et al., 1988;

Strickland et al., 1994). A decrease in PRL concentration has been observed during endophyte

infected tall fescue (FE+) exposure in all animal species investigated but its consequences are

difficult to estimate (Oliver, 1997; Zbib et al., 2014).Among the hypotheses proposed to

explain sensitivity to the toxin, some involve interactions with drug metabolizing enzymes.

Strains of mice with high glutathione S-transferase activity are resistant to FE+ toxic effects,

whereas inhibition of P4503A activity increases ergot alkaloid toxicity (Hohenboken and

Blodgett, 1997; Liaudet, 1999; Wagner et al., 2000).

The purpose of this study was to investigate the impact of the consumption of FE+

hay, produced under French agricultural conditions, on animal health and milk production in

lactating ewes. Additional effects on skin temperature, oxidative damage, PRL and drug

metabolizing enzymes activities were investigated to explain EV mechanisms of action in

ewes.

MATERIALS AND METHODS

Hay production, animal exposure and sampling

Studies were conducted at the agricultural school "La Cazotte" (12400 Saint-Affrique,

France). Two homogeneous 0.75 ha plots were sown in 2009 in the fall with Kentucky 31tall

fescue, one with endophyte-free (FE-) seeds, and other with endophyte-infected (FE+) seeds

44

(infection rate of 94% on seedling) obtained from RAGT (12000 Rodez, France). The hay

was harvested at maturity in June 2012 and stored in a hangar until the beginning of the assay

with ewes in November 2012. One kg of hay was taken from five different locations of the

bales after harvest and during the animal assay for chemical analysis. Dry matter (DM) was

around 90%. Crude protein was 82 and 44 g/kg DM, crude fiber was 391 and 429 g/kg DM,

net energy for lactation intake was 1.003 and 0.901 Mcal/kg DM for FE- and FE+,

respectively. Ergovaline was determined fluorimetrically after HPLC separation as described

below. Other ergot alkaloids (ergotamine, ergotaminine, ergocryptine, ergocryptinine,

ergocornine, ergocorninine, ergosine, ergosinine, ergometrine, ergometrinine, ergocristine,

ergocristinine) were determined by HPLC-MS (Qualtech SA laboratory, 54503 Vandoeuvre,

France) and were below the limit of detection (3 µg/kg).

The ewes used in this study were housed in a large barn characterized by low stocking density

and high ventilation. Italian ryegrass was used as forage before the beginning of assay with

tall fescue hay. Daily, a complementary feed was supplied individually (head locks): 700 g of

high protein concentrate (Evialis, 84270 Vedène, France), 500 g barley and 20 g multi-

vitamin supplement (Unicor, 12032 Rodez, France). Three days before the beginning of the

study, sixteen lactating ewes (Lacaune breed, body weight 76.0 ± 0.6 kg) were selected in a

herd of 48 animals to minimize individual variations. Animals were randomized by weight

and milk production and divided into two homogeneous groups of eight housed in two parks

of 15m² each. On day 1 that corresponded to day in milk 31 +/- 4,long stem FE- or FE+ hay

was provided ad libitum for 28 days. Daily, orts were removed, and then around 20 kg of new

hay were provided on racks self-service. Symptomatology was checked daily for sign of stress

(hyperventilation), disease (prostration, diarrhea) or any abnormal comportment. Body

weight, feed consumption, milk production were recorded on days 1 and 22. Two milk

samples (50 ml each) were collected on the same days. The first was analyzed for fat, protein

contents and number of cells according to the French Ministry of Agriculture for the payment

of the Milk Quality (LIAL laboratory, 15000 Aurillac, France). The second was frozen at -

20°C until ergovaline determination.

On days 0, 3, 7, 14, 21 and 28, temperatures were measured and blood samples were collected

one hour after milking. Core body temperature (Tco) was measured via a handheld digital

thermometer placed approximately 3 cm into the rectum. Skin temperature (Ts) was

determined in the medial area of the caudal side of the ear using a thermo-flash infrared

thermometer. Air temperature (Ta) was measured with the same apparatus. Blood samples

were taken by jugular vein puncture in lithium heparinized tubes (Terumo, Leuven, Belgium).

45

One tube was stored at room temperature for five hours before hematocrit determination.

Another was immediately centrifuged at 3,000 x g for 10 min to collect plasma. Five hundred

microliters were deproteinized with metaphosphoric acid (1.25 M, vol/vol) for future

determination of glutathione content. The rest of the plasma and deproteinized plasma

samples were stored at -80°C until analysis.

Ewes were euthanized at day 28 by exsanguination after stunning at the Saint-Affrique

slaughterhouse. Post mortem examination was conducted to reveal anomalies. The carcass,

liver, kidneys and adrenals were weighed. Fifty grams of tissues (brain, liver, kidneys, muscle

and abdominal fat) were collected, frozen in liquid nitrogen, and stored at -80°C until

analysis. The animal carcasses were dispatched for rendering.

All experimental procedures involving animals were in accordance with the French National

Guidelines for the care and use of animals for research purposes.

Thermocirculation index, hematocrit, biochemistry and prolactin determinations

The thermocirculation index (TCI) was calculated (Burton and Edholm, 1955) according to

the following equation: TCI = (Ts – Ta)/(Tco – Ts).

Hematocrit was determined on heparinized blood in a microcapillary tube at 11,000 x g for 15

min. Plasma analytes were assayed for sodium (Na), potassium (K), urea, creatinine, total

bilirubin, total protein, cholesterol and triglycerides. For enzymes, the following specific

activities were also assayed: lactate dehydrogenase (LDH) (EC 1.1.1.27), aspartate

aminotransferase (AST) (EC 2.6.1.1), alanine aminotransferase (ALT) (EC 2.6.1.2) and

creatine kinase (CK) (EC 2.7.3.2). All parameters were performed at the Salvetat medical

laboratory in Saint-Gilles (31880 La Salvetat Saint-Gilles, France) using a clinical chemistry

analyzer (Hitachi 717, Tokyo, Japan) following the manufacturer’s recommendations.

Plasma was assayed for prolactin (PRL) by RIA following the procedure of Kann(1971). The

analyses were conducted at the Neuroendocrinology Laboratory (INRA, Nouzilly, France).

The sensitivity of this method is 2.5 ng/ml with intra- and interassay CVs of 7-12% and 10-

14%, respectively.

Ergovaline determination in hay, tissues, and milk

46

Ergovaline standard was kindly provided by G.E. Rottinghaus (College of Veterinary

Medicine, University of Missouri). All reagents and chemicals, HPLC grade, were purchased

from Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA).

Extraction

One kilogram of hay was dried for 24 h at 60°C and ground to 0.5 mm with a grinding mill

(Cyclotech 1093, Foss, Hogande, Sweden). Five grams were extracted with alkaline

chloroform (100 ml chloroform + 5 ml NaOH 0.1 M) for 2 hours on an orbital shaker

(Rotatest 400, Fischer Scientific, Illkirch, France) and then filtered (Whatman PS1). Ten ml of

the filtered solution were then recuperated for ergovaline purification (Rottinghaus et al.,

1991).

Three grams of tissues were added to 6 ml of phosphate buffer (pH 7.6, 0.1M) and

homogenized with an Ultra Turrax (TP 18, IKA, Staufen, Germany). Three ml of the

suspension were collected and extracted twice with 6 ml of chloroform on an orbital shaker

for 1 h. The chloroform extracts were pooled and filtered as previously described. Fat and

brain were directly extracted with chloroform without homogenization. The whole amount of

filtered solution was used for ergovaline purification.

Five ml of milk were shaken with 15 ml of acetone for 10 minutes. Samples were then

centrifuged at 3,000 x g for 10 min to separate the protein. The supernatant was collected and

the acetone was evaporated. The aqueous residue was alkalinized in 20 µl of 30% (vol/vol)

ammonia solution and extracted twice with 10 ml of chloroform for1 h on an orbital shaker.

The chloroform extracts were pooled and filtered as previously described. The whole amount

of filtered solution was used for ergovaline purification (Durix et al., 1999).

Purification

Chloroform extracts were purified on homemade ergosil columns prepared as follows: one

centimeter (about 150 mg) of Ergosil silica gel (Analtech Inc., Newark, DE, USA) was placed

in a 5 ml empty SPE cartridge (Silicycle, Quebec, Canada), followed by a biological disk

(Silicycle, Quebec, Canada) and one centimeter of sodium sulfate (about 1,000 mg) was

added. The columns were first preconditioned with 3 ml of chloroform, and then the extracted

samples were passed through the column. Columns were washed with 5 ml of acetone-

chloroform (75:25, vol/vol) and dried for a few minutes. Ergovaline was eluted with 3 ml of

47

methanol. The eluate was collected and evaporated to dryness with a sample concentrator at

45°C under a stream of nitrogen (Rottinghaus et al., 1991; Durix et al., 1999).

Dosage

The dry residue was dissolved in methanol (100 to 500 µl) and 20-40 µl were injected into the

HPLC system comprising a pump (M 2200, Bischoff, Leonberg, Germany) connected to a

C18 column (Prontosil, 250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Germany). The mobile phase was

composed of acetonitrile-water (35:65, vol/vol) with 200 mg ammonium carbonate added per

liter. The flow rate was 1.5 ml/min. Fluorescence was detected (250 nm excitation and 420

nm emission) by a RF-10AXL fluorometer (Shimadzu, Japan). The resulting chromatograms

were monitored by PIC 3 software (ICS, Toulouse, France). Ergovaline retention time was 9.5

minutes. The limits of detection were 5, 0.15 and 0.15 ng/g and ng/ml with mean recovery

ratesof 83, 91 and 99% in hay, tissues and milk, respectively.

Preparation of the tissue fractions and protein assay

Chemicals and compounds were purchased from Sigma (St. Louis, USA). Microsomal and

cytosolic fractions were prepared at 4°C. Four grams of tissue were homogenized in 11 ml 0.1

M phosphate buffer (0.1 M Tris acetate; 0.1 M KCL; 1 mM EDTA; 0.02 M butylated

hydroxytoluene) at pH 7.4. The samples were then centrifuged at 9,000x g for30 min. The

supernatant fraction was collected and centrifuged at 105,000x gfor 60 min. The upper phase

(cytosolic fraction) was collected. Five hundred microliters were deproteinized with

metaphosphoric acid (1.25 M, vol/vol) for future determination of glutathione content. The

rest of the cytosolic fraction and the deproteinized fraction were stored at -80°C until analysis.

The pellet (microsomal fraction) was homogenized with 3 ml 0.1 M sodium pyrophosphate

buffer (pH 7.5) and centrifuged at 105,000x gfor 30 min. The supernatant was eliminated and

the pellet (microsomal fraction) was suspended in 3 ml phosphate buffer (pH 7.4; 0.1 mM

EDTA; 20% glycerol) and stored at -80°C until analysis.

Protein contents in the tissue homogenate were determined using the Bio-Rad protein assay

(Bio-Rad Laboratories, 80939 München, Germany) using bovine serum albumin as standard

according to the manufacturer’s recommendations.

Oxidative damage and antioxidant enzyme activities

Malondialdehyde (MDA) contents in plasma or in the tissues fraction (1 mg protein/ml) were

measured fluorometrically (excitation: 515 nm emission: 548 nm) after formation of a pink

48

complex with thiobarbituric acid (Buege and Aust, 1978) followed by butanol extraction

(Ohkawa et al., 1979; Yagi, 1987).

Measurement of superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) activity was based on the

inhibition of the formation of blue formazan by xanthine-xanthine oxidase (EC 1.17.3.2, 1

mU) in the presence of nitroblue tetrazolium (Sun et al., 1988). The activity was measured in

plasma (5 mg protein/ml) and in the cytosolic fraction of tissues (25 µg protein/ml). After 10

min incubation at ambient temperature, the reaction was monitored spectrophotometrically at

540 nm. SOD activity was calculated by linear regression from a standard curve obtained with

bovine erythrocyte SOD (0.075 to 3 U/ml).

Catalase (CAT, EC 1.11.1.6) oxidizes methanol in the presence of H2O2 (1.5 µg/ml) to

produce formaldehyde, which reacts with Purpald reagent to form a complex that is

spectrophotometrically dosed at 540 nm (Johansson and Håkan Borg, 1988). Activity was

measured at room temperature in plasma (0.5 mg protein/ml, 25 min incubation) or in the

cytosolic fraction of tissues (10 µg protein/ml, 2.5 min incubation). Results were calculated

by linear regression from a standard curve obtained at various formaldehyde concentrations.

Glutathione reductase (GR, EC 1.6.4.2) reduces oxidized glutathione (GS-SG) into

glutathione (GSH) in the presence of NADPH (1.8 mM). The activity of the enzyme was

measured in plasma (5 mg protein/ml, 12 min of kinetics) and in the cytosolic fraction of

tissues (1.5 mg protein/ml, 2 min of kinetics) by monitoring the decrease in NADPH

absorbance at 340 nm (Carlberg and Mannervik, 1984).

Glutathione peroxidase (GPx, EC 1.11.1.9) activity was determined based on a coupled

reaction with GR. In the presence of GSH (40 mM), GPx reduces cumene hydroperoxide

(0.18 mM) to produce GSSG, which is recycled into GSH by GR in the presence of NADPH

(4.5 mM). The activity of the enzyme was measured in plasma (5 mg protein/ml, 12 min of

kinetics) and in the cytosolic fraction of tissues (0.5 mg protein/ml, 2 min of kinetics) by

monitoring the decrease in NADPH absorbance at 340 nm (Paglia and Valentine, 1967).

Total glutathione was measured using an optimized enzymatic recycling method for the

quantification of GSH (Baker et al., 1990). The sulfhydryl group of GSH reacts with Ellman’s

reagent 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) to produce 5-thio-2-nitrobenzoic acid (TNB) and

GS-TNB. Both GSSG and GS-TNB are reduced by GR to recycle the GSH, which produces

more TNB. The rate of TNB was spectrophotometrically measured at 405 nm (50 µl of

deproteinized samples in a total reaction volume of 200 µl). Dilution of the deproteinized

49

cytosolic fraction (1/100 and 1/5, for liver and kidneys, respectively) with 0.2 M MES buffer

(pH 6.0;2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid; 0.05 M K2HPO4; 1 mM EDTA) is required

before determination. GSSG, exclusive of GSH, is obtained by a first derivatization of GSH

with 1 M 2-vinylpyridine before measurement of total glutathione (Griffith, 1980).

Drug metabolizing enzyme activities

N-demethylation activities were measured in the microsomal fraction of tissues (1 mg

protein/ml, 20 min incubation at 37°C) with aminopyrine, benzphetamine, ethylmorphine or

erythromycin (20 mM each) and N-dimethylnitrosamine (100 mM) as substrates. The

activities were estimated through the formation of formaldehyde detected by the method of

NASH modified by Cochin and Axelrod (1959). Formaldehyde formation was determined

spectrophotometrically at 405 nm.

Dealkylation of 7-methoxyresorufin, 7-ethoxyresorufin and 7-penthoxyresorufin (2.55 mM

each) were measured in the microsomal fraction of tissues (0.5 mg protein/ml, 10 min

incubation at 37°C) by fluorescence (Ex 535 nm Em 582 nm) after butanolic extraction of

resorufin using the method of Lake (1987).

UDP-glucuronyltransferase activity in the microsomal fraction of tissues (1 mg protein/ml)

with p-nitrophenol (PNP) as substrate (0.7 mM) was spectrophotometrically measured (405

nm) by monitoring (12 and 3 min of kinetics for liver and kidneys, respectively) the formation

of PNP-glucuronide (Frei, 1970).

Glutathione S-transferase activity (Habig et al., 1974), using 1-chloro-2-4-dinitrobenzene

(CDNB) as substrate (8 mM), was determined in the cytosolic fraction of the liver and

kidneys (5 and 50 µg protein/ml, respectively) by monitoring the formation of CDNB-

conjugate (spectrophotometrically dosed at 340 nm, 2 min of kinetics). The same protocol

was used with 1,2-dichloro-4-nitrobenzene as substrate (1 and 2 mg protein/ml, for the liver

and kidneys respectively).

Statistical analyses

Statistical analyses were performed using R software (2.11.1, R Foundation for Statistical

Computing, Vienna, Austria). Body weight, milk production, temperatures, TCI, prolactin

concentration, biochemistry and oxidative stress in plasma were compared using a linear

model to assess the effect of group, time, and the interaction between group and time. When a

significant effect was obtained (P<0.05), a complementary range test (Wilcoxon) was used for

50

the individual comparison of means. Oxidative stress parameters and biotransformation

enzyme activities in tissues were compared using Student’s test after verification of normality

(Shapiro) and equality of variance (Fisher). Significantly different groups (P<0.05) are

identified by a superscript. Data are reported as means ± SD or SE.

RESULTS

Hay, and effects on health, feed intake, body weight, milk production and residues

Ergovaline concentrations in FE+, measured on days 0, 14, and 21, were 437, 533 and 521

µg/kg dry matter, respectively (mean of three determinations). All the analyzed samples were

below the limit of detection (20 µg/kg DM) in FE-bales.

No animal died during the study, and no sign of toxicity was observed. Effects of

consumption of FE- or FE+ hay on body weight, milk production and feed consumption are

shown in Figure 1. A significant decrease in body weight was observed from day 1 to day 22

in both groups. Because slight differences in BW were observed between the groups on day 1,

individual decreases in BW were calculated (data not shown). The mean +/- SD decrease in

BW between day 1 and day 22 was 8 +/- 4 and 12 +/- 3 kg in FE- and FE+, respectively. This

difference was significant (P= 0.02), demonstrating an additive effect of the consumption of

the FE+ hay on the BW decrease that occurs during lactation. By contrast, although a

significant decrease in milk production was observed with time in the two groups (P = 0.002),

there was no difference between FE- and FE+. The average hay consumption was lessin the

FE+ group than in FE- group on days 1 and 22. Over the 28 days of the study, mean hay

consumption was around 40 kg DM/ewe in the FE- group and 27 kg DM/ewe in the FE+.

Average hay moisture (10.1%), mean FE+ consumption (30 kg/ewe), mean body weight (70

kg/ewe) and mean EV concentration (497 µg/kg DM) enabled to calculate a mean intake of

6.8 µg EV/kg BW in ewes fed FE+ hay.

Analyses of milk quality were performed on days 1 and 22. No difference in fat and protein

contents was observed between groups, or in the number of cells (data not shown). Ergovaline

residues were also measured in milk. All samples were below the limit of detection (0.15

ng/ml).

At the end of the study, post mortem examination failed to reveal any pathological alteration.

No difference in the weight of the carcass, liver, kidneys and adrenals was observed between

51

FE- and ewes fed FE+ hay. Ergovaline residues, measured in the brain, liver, kidneys, muscle

and abdominal fat, were below the limit of detection (0.15 ng/g) in all the animals studied.

Temperatures and thermocirculation index

Core body temperature, skin temperature, and air temperature are listed in Figure 2A. These

data enabled the determination of a thermocirculation index (TCI), which is shown in Figure

2B. Core body temperature remained constant throughout the study in both groups. By

contrast, air temperature varied (from 19 to 5°C) leading to variations in the skin temperature

and TCI in both groups. Comparison of data obtained from the FE- and FE+ groups revealed

significantly lower skin temperature in FE+ ewes on day 3, and significantly lower TCI on

days 3 and 7. From day 14 to day 28, skin temperature and TCI did not differ in the two

groups.

Plasma prolactin concentration

Plasma prolactin (PRL) concentrations are shown in Figure 3. Prolactin values decreased (P<

0.001) from day 0 to day 28 in both groups. A linear model was used to assess intergroup

variations in PRL concentrations with time. The model revealed significant differences

between groups, with an effect of time (P<0.05), which led us to use a complementary range

test (Wilcoxon) for individual comparisons of means. In the FE- group, the decrease in the

concentration of PRL from day 0 was significant on days 14 and 28 (P<0.05, superscript “†”

in Figure 3).By contrast, in the FE+ group, there was a decrease (P = 0.001) from day 3 until

day 28. When intergroup comparison was performed on each measurement day

(superscript“*”in Figure 3), the concentrations of PRL were lower in the ewes which received

the FE+ hay than in the FE-, on days 3, 7, 14 and 28.

Biochemistry

Hematocrit, plasma analytes and enzymes are listed in Table 1. The effect of time and the

effect of feeding were investigated together. A decrease in sodium concentration with time

was observed in both FE- and FE+ groups whereas urea increased during the same period. In

ewes fed with FE- hay, a significant increase in cholesterol and a significant decrease in

triglycerides was observed between day 0 and day 28, whereas these parameters remained

constant in the FE+ group throughout the study period. When intergroup comparison was

performed, cholesterol and triglycerides were significantly different in FE- and FE+ groups at

day 28.

52

Oxidative damage and antioxidant enzyme activities

Oxidative damage and antioxidant enzyme activities were measured in plasma (Table 1) and

in the liver and kidneys (Table 2). In plasma, total glutathione content (TGSH) decreased with

time in both groups (P< 0.01), with no significant difference between groups on day 28.

Catalase activity also decreased with time, but the decrease was more pronounced in the ewes

fed with FE+ than in control ewes fed with FE- hay. A significant decrease in MDA

(cytosolic fractions), and total glutathione concentrations were observed in the kidneys of the

ewes fed the FE+ in comparison to the ewes fed FE- (P = 0.014 and 0.001, respectively).

These decreases were accompanied by a decrease in glutathione reductase and in glutathione

peroxidase activities in kidneys in the FE+ group. Concerning the liver, no difference between

groups was observed, whatever the parameter investigated.

Drug metabolizing enzyme activities

The effects of 28 days of consuming endophyte-free (FE-) or endophyte-infected (FE+) tall

fescue on hepatic and renal drug metabolizing enzymes are listed in Table 3. A significant

decrease in ethoxyresorufin, methoxyresorufin and pentoxyresorufin O-dealkylases activities

was observed in the liver of ewes fed with FE+ hay. By contrast, in kidneys, no difference

between groups was observedin O-dealkylases activities. Concerning N-demethylase activity

in the liver, a decrease was observed in the FE+ group when dimethylnitrosamine was used as

substrate, whereas an increase was observed when erythromycin was used as substrate. No

activity of N-demethylation was detected in kidneys, whatever the substrate used.

Glutathione S-transferase activity was measured in the liver and kidneys using CDNB and

DCNB as substrates (Table 3). No difference in activity between groups was observed in the

liver. By contrast, in the kidneys, a marked decrease in glutathione S-transferase activity with

DCNB as substrate was observed in the FE+ group whereas no difference was observed when

CDNB was used. The UDPGT activity, using PNP as substrate, was not affected by

consuming FE+ hay, either in the liver or the kidneys.

DISCUSSION

Animal monitoring and production

No sign of toxicity and no pathological alteration was observed during the postmortem

examination in this study. For ewes fed FE+ hay for 28 days in the stable, this result is

consistent with data obtained in the same species at the same physiological stage in the

53

pasture in September. Sheep grazing tall fescue containing 458 µg EV/kg DM did not develop

any signs of toxicity (Tor-Agbidye et al., 2001).This result confirms the higher resistance of

sheep, compared to cattle (Tor-Agbidye et al., 2001). A decrease in body weight was

observed in steers at a lower dose of 322 µg EV/kg DM after 21 days of exposure (Brown et

al., 2008). Although room temperature in the stable was around 5°C for 7 days (day 16 to day

23 of the study), this period of cold was too short to allow time for lameness to appear.

Indeed, 21 days at 8°C are reported to be necessary for sheep to develop signs of toxicity at an

EV concentration of 520 µg/kg DM in grass (Tor-Agbidye et al., 2001).

The consumption of hay was lower in the FE+ group that contained 497 µg EV/kg DM than

in FE-.Decrease of hay consumption has been reported in cattle fed FE+ forage (Schmidt et

al., 1982)and decrease in palatability in lambs and heifers were mentioned (Emile et al.,

2000). Also, a decrease in the consumption of feed is common when seeds are added to feed.

Such decreases have been reported in lambs, non-lactating ewes, calves, and dairy cows at a

relatively high final EV level in the feed (640, 750,1,000 and 1,400 µg/kg feed, respectively)

(Lakritz et al., 2002; Gadberry et al., 2003; Looper et al., 2006; Spiers et al., 2012). Both BW

and milk production decreased with time in lactating ewes, which is a physiological response

(Convey, 1974), but a larger decrease in BW was observed in the FE+ ewes than in FE-.This

additional effect could be due to the decrease in the consumption of FE+ hay. This effect has

never been reported at this dose in sheep, whereas a decrease in BW gain is common in calves

(Hoveland et al., 1983; Nihsen et al., 2004; Watson et al., 2004; Burke et al., 2007; Brown et

al., 2008; Spiers et al., 2012). No change in milk quality or additional decrease in milk

production linked to FE+ consumption was observed in this study. Although no data is

available on the effects of EV on milk production and quality in sheep, hay containing 782 µg

EV/kg was reported to decrease fat and protein contents in dairy cows (Kim et al., 2007). No

EV residue was detected in milk after 28 days of exposure to 6.8 µg EV/kg BW/d. These

results strengthens data obtained in lactating goats, demonstrating that EV excretion in milk is

very low after an IV route, only 0.05% of the administered dose (Durix et al., 1999). It also

corroborates the lack of EV detection in milk after intra-ruminal administration of a single

dose of EV (38 µg EV/kg BW) to lactating goats (Grancher, 2007).

Temperatures and thermocirculation index

In this study, core body temperature remained constant, suggesting that a balance between

heat production and heat loss was maintained. The thermocirculation index (TCI)was

developed to identify vasomotor effect of EV, and other ergot alkaloids, which are considered

54

to be responsible for the signs of lameness and necrosis that appear during fescue toxicosis

(Burton and Edholm, 1955; Oliver et al., 1993). The TCI has been reported to decrease in

lambs after 14 days of feeding a diet containing 640 µg EV/kg (Gadberry et al., 2003). In this

study, a decrease in TCI was obtained on days 3 and 7. This effect was linked to a decrease in

skin temperature, measured on the ear. It demonstrated the rapid effect of EV on peripheral

blood flow, in agreement with data obtained in rat where a decrease in external temperature

was observed 15 minutes after intra-peritoneal injection (Spiers et al., 1995). A rapid

reduction in tail skin temperature (30 min) was also obtained in cattle after IV dosing

(McCollough et al., 1994).Interestingly, after 14 days of exposure, no difference was

observed between FE- and FE+ fed ewes, even with an external temperature of 5°C,

suggesting that the effects of EV on peripheral blood flow in lactating ewes are brief. The

disruption of basic homeostatic processes plays a key role in potentially vulnerability to the

effects of endophyte-infected fescues. Animal age and species are known to be determining

factors in thermoregulatory response to FE+ toxins, especially under heat stress (Spiers et al.,

1995, 2005, 2012). However, although several studies have been conducted in cattle and rat,

few data are available in sheep (Spiers et al., 2005). This result is nevertheless of interest with

respect to the proposed mechanism of action of EV. Reduced blood flow has been

demonstrated in all species in which it has been studied, and a prolonged effect has been

considered necessary to induce anoxia of extremities leading to lameness followed by

necrosis (Strickland et al., 1993; Oliver, 1997; Spiers et al., 2005). In this study, ewes fed the

FE+ hay only showed lower skin temperature values than those fed the FE- hay at the

beginning of the exposure. This agrees with all the available data on sheep, which appears to

be more resistant to necrosis of the extremities than cattle (Tor-Agbidye et al., 2001).

Plasma prolactin concentration

In this study, PRL concentrations decreased with time, which is common during lactation

(Convey, 1974). The decrease in PRL was more pronounced in ewes fed the FE+ hay than in

the FE- hay, in agreement with several studies on the subject. A decrease in PRL

concentration was observed during FE+ exposure in all the animal species investigated (Zbib

et al., 2014). This effect has been linked to the direct action of EV on dopaminergic receptors

of the pituitary cells (Schillo et al., 1988; Strickland et al., 1994). EV blocks the liberation of

PRL through fixation on the dopaminergic receptors in the cells (Siegel et al., 1989). The

decrease in PRL occurs rapidly, as observed in cattle 30 min after an IV dose of EV

(McCollough et al., 1994). Because the concentration of PRL varies with the species, age, and

physiological stage, the inter studies comparison is difficult. In steers, a significant decrease

55

in PRL was observed seven days after exposure to forage containing 317 µg EV/kg DM

(Stamm et al., 1994). In lambs, a decrease in PRL was observed 14 days after exposure to

feed containing 640 µg EV/kg DM, or 28 days after 610 µg/kg (Gadberry et al., 2003; De

Lorme et al., 2007). In ewes, a marked decrease in PRL (> 90%) was observed after 42 days

of exposure to a grass containing 460 µg EV/kg DM, and a smaller decrease (75%) was

observed after seven days of exposure to a feed containing 750 µg EV/kg DM, suggesting that

the length of exposure determines the severity of the effect (Tor-Agbidye, 1993; Tor-Agbidye

et al., 2001; Looper et al., 2006). In the present study, a decrease of 60% and 73% in PRL

was observed on day 3 and day 28, respectively, in ewes fed with FE+, confirming the effect

of time on this parameter. This result also shows that although PRL is a very sensitive

biomarker of exposure to FE+ during lactation, the decrease in PRL concentration has no

significant effect on milk production.

Biochemistry

Only a few biochemical effects were observed in this study, most of which were linked to

lactation and not to the consequence of FE+ feeding. This result is in agreement with all

available data on sheep, demonstrating the lack of effect of feed containing endophyte fescue

(seeds or grass) on plasma analytes or enzyme biochemistry (Zbib et al., 2014). On day 28,

the only differences between groups observed concerned cholesterol and triglycerides, with a

decrease in cholesterol and an increase in triglycerides. A decrease in cholesterol was also

reported in steers and heifers fed FE+ grass, but the decrease was accompanied by a decrease

in triglycerides (Oliver et al., 2000; Nihsen et al., 2004; Brown et al., 2008), which was not

the case in the present study. The effects on cholesterol and triglycerides are thus difficult to

interpret, they appeared to be linked to time in the FE- fed ewes (significant difference

between day 0 and day 28), but not in the FE+ fed ewes (no significant difference between

day 0 and day 28).

Oxidative damage and antioxidant enzyme activities

Oxidative damage is recognized as an important mechanism that may occur during exposure

to FE+ under heat stress in cattle and rodents(Lakritz et al., 2002; Spiers et al., 2005; Bhusari

et al., 2006; Burke et al., 2007; Settivari et al., 2009). Most of the results obtained

demonstrated a decrease in antioxidant defense mechanisms (measured by a decrease in GSH

content and in antioxidant enzyme activities) and sometimes an increase in oxidative damage

(measured by increased MDA and GSSG contents) (Lakritz et al., 2002). In this study, only

56

weak effects of FE+ on oxidative damage and antioxidant enzyme activities were observed. A

decrease in catalase activity in plasma was observed in ewes fed FE+ forage, in agreement

with data obtained in rat (Settivari et al., 2008). A slight decrease in SOD, CAT, GPx and

TGSH were also observed in the liver of FE+ fed ewes, but these effects were not significant,

in contrast to data obtained in rodent sunder high EV exposure (Bhusari et al., 2006; Settivari

et al., 2008, 2009). GR and GPx activities decreased in the kidney of FE+ ewes, whereas a

decrease in TGSH and MDA contents was also observed. Taken together, these results

suggest that a moderate decrease in the mechanism of defense against oxidative damage is

possible in ewes fed FE+ forage, with no significant consequences for health, as measured by

biochemistry, and milk production.

Drug metabolizing enzyme activities

Drug metabolizing enzymes are involved in the metabolism of drugs and toxic compounds.

These activities can be decreased or increased by several mechanisms, with possible

consequences for toxicity and for the excretion rate of chemical compounds. Previous studies

conducted to explain differences between breeds/strains to fescue toxicosis hypothesized that

some of the observed differences are linked to differences in expression and /or activities of

drug metabolizing enzymes. In mice, resistant lines displayed significantly higher Glutathione

S-transferase activity than sensitive lines, whereas total cytochrome P450 and UDPGT

activities were not affected (Hohenboken and Blodgett, 1997; Wagner et al., 2000). Genomic

analysis of the impact of fescue toxicosis on the expression of drug metabolizing enzymes

during heat stress in mice also showed that some P450 genes (Cyp2d26 and Cyp2a12) were

up-regulated while others were down-regulated (Cyp3A25) (Bhusari et al., 2006).Studies in

rat revealed up regulation of Cyp (2c13 and 2e1) and down regulation of glutathione S-

transferase genes (Settivari et al., 2006).Both direct effects on gene expression and indirect

mechanisms linked to the effects of ergot alkaloids on the mechanism of defense against

oxidative damages in liver have also been cited to explain the pathogenesis of fescue toxicosis

(Settivari et al., 2008, 2009). In the present study, drug metabolizing enzyme activities of

P450 enzymes in the liver generally decreased, with the exception of erythromycin N-

demethylase activity, which increased. Erythromycin is a substrate of subfamily P450 3A,

which is involved in the metabolism of ergot alkaloids, its inhibition leading to toxicity

(Liaudet, 1999). Species and gender differences have been reported in in vitro metabolism of

ergotamine, an alkaloid similar to EV, and it has been suggested that these differences could

explain variations in sensitivity to fescue toxicosis (Duringer et al., 2005; Moubarak et al.,

2006). Breed differences have also been cited to explain the differences in the prevalence of

57

fescue toxicosis around the world. Indeed, the prevalence of the disease is low in Europe and

high in the USA, Australia and New-Zealand, even though wild endophytes that produce high

levels of EV are present in Europe(Repussard et al., 2013).Interestingly, breed differences in

erythromycin N-demethylase activities have been demonstrated in cattle (Dacasto et al.,

2005). Finally, because erythromycin is a substrate of P450 3A, which is involved in the

metabolism of ergot alkaloids, we hypothesize that the threefold increase in erythromycin N-

demethylase activity observed in this study in FE+ fed ewes contributes to a protective effect

against EV toxicity.

By contrast, dimethylnitrosamine N-demethylase activity, which is linked to family P450

2(Yamazaki et al., 1992; Stiborová et al., 1996; Chowdhury et al., 2012),and ethoxyresorufin,

methoxyresorufin and pentoxyresorufin, N-dealkylase activities, which are linked to

subfamilies P450 1A and 2B(Machala et al., 2003; Szotáková et al., 2004)decreased. Whereas

P450 1A, 2B and 2 were not reported to be involved in the metabolism of ergot alkaloids.

Glutathione S-transferase activity with DCNB as substrate decreased in the kidney but not in

the liver. No data is available concerning the effect of ergot alkaloids on drug metabolizing

enzymes in kidney, however, a decrease in the expression of this enzyme has been reported in

mice liver (Settivari et al., 2006). UDPGT activities were not affected in the liver and kidney

in the present study, in agreement with previous data in rodents (Hohenboken and Blodgett,

1997; Wagner et al., 2000).

In conclusion, feeding FE+ hay containing 497 µg EV/kg DM to lactating ewes for a period

of 28 days in the stable led to a decrease in consumption and a decrease in BW, but no effect

on milk production or quality, and no residues of EV were detected. A decrease in ear

temperature was detected the first week of the study, then disappeared, suggesting an adaptive

response. By contrast, a decrease in PRL was observed from day 3 to day 28, confirming it is

a sensitive biomarker of FE+ exposure. The measurement of oxidative damage and

antioxidant enzyme activities suggested a moderate decrease in the defense mechanism

against oxidative damage in FE+ fed ewes, with no consequences for health in the breeding

conditions used in the present study. Analysis of drug metabolizing enzyme activities

revealed a general decrease in activity in ewes fed FE+ forage, with the exception of a marked

increase in demethylation of erythromycin that was attributed toP450 3A activity, which is

involved in the metabolism of EV.

58

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65

TABLE 1. Biochemical and oxidative stress parametersin plasma of ewesfedendophyte free

(FE-) or endophyte-infected (FE+) tall fescue.

FE- FE+

Day 0 Day 28 Day 0 Day 28

Hematocrit, % 31.0 ± 5.1 31.3 ± 4.0 33.7 ± 4.3 35.6 ± 3.7 Sodium, mE/L 150 ± 3 144 ± 6† 153 ± 5 146 ± 2† Potassium, mE/L 4.9 ± 0.6 4.9 ± 0.9 4.7 ± 0.3 4.8 ± 0.5 Protein, g/L 78.6 ± 7.1 76.0 ± 9.9 75.8 ± 4.4 76.3 ± 3.2 Urea, mmol/L 6.4 ± 1.2 11.9 ± 2.5† 8.1 ± 0.9 10.7 ± 1.6† Creatinine, µmol/L 51.7 ± 8.1 51.3 ± 9.2 47.6 ± 19.8 54.9 ± 15.6 Cholesterol, mmol/L 0.17 ± 0.05 0.23 ± 0.04† 0.15 ± 0.02 0.17 ± 0.02* Triglycerides, mmol/L 2.23 ± 0.49 1.72 ± 0.27† 1.94 ± 0.32 2.13 ± 0.45* Total bilirubin, µmol/L 2.0 ± 0.0 2.0 ± 0.0 2.0 ± 0.0 2.0 ± 0.0 AST1, UI/L 138 ± 77 93.5 ± 20.6 105 ± 24 91.8 ± 17.0 ALT2, UI/L 12.1 ± 5.9 15.0 ± 4.2 11.4 ± 3.8 13.9 ± 2.9 CPK3, UI/L 200 ± 111 152 ± 140 160 ± 42 161 ± 86 LDH4, UI/L 611 ± 91 459 ± 83 521 ± 107 467 ± 77 MDA5, nmol/mg13 9.5 ± 2.5 10.5 ± 2.3 9.86 ± 2.33 11.1 ± 1.4 SOD6, mU/min/mg13 2.28 ± 0.32 2.32 ± 0.28 2.22 ± 0.52 2.63 ± 0.45 CAT7, ng CH2O

11/min/mg13 88.2 ± 14.9 67.2 ± 19.0† 80.5 ± 20.7 34.5 ± 13.3†* GR8, µmol NADPH12/min/mg13 0.33 ± 0.08 0.28 ± 0.11 0.28 ± 0.05 0.32 ± 0.06 GPx9, µmol NADPH12/min/mg13 0.82 ± 0.04 0.80 ± 0.19 0.74 ± 0.28 0.62 ± 0.27 TGSH10, pmol/mg 14.3 ± 7.6 8.35 ± 3.36† 14.3 ± 6.2 8.47 ± 2.71† 1AST = aspartate aminotransferase. 2ALT= alanine aminotransferase. 3CPK = creatine phosphokinase. 4LDH = lactate dehydrogenase. 5MDA =malondialdehyde. 6SOD = superoxide dismutase. 7CAT = catalase. 8GR = glutathione reductase. 9GPx =glutathione peroxidase. 10TGSH = total glutathione. 11CH2O = formaldehyde. 12NADPH = nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. 13mg of plasma proteins. †Significant difference from day 0, *Significant difference between groups at the same day (Wilcoxon, P<0.05). Values are expressed as mean ± SD, n = 8.

66

TABLE 2. Effects of 28 days of feeding ewesendophyte-free (FE-) or endophyte-infected

(FE+) tall fescue on oxidative stress parameters

Day 28

FE- FE+

Liver, g 995 ± 183 894 ± 148 MDA1, nmol/mg of cytosolic proteins 64.3 ± 14.3 76.8 ± 17.2 MDA1, mmol/mg of microsomal proteins 6.35 ± 4.31 5.34 ± 0.68 SOD2, U/min/mg of cytosolic proteins 27.0 ± 8.9 22.8 ± 6.1 CAT3, µg CH2O

8/min/mg of cytosolic proteins 376 ± 119 327 ± 72 GR4, µmol NADPH9/min/mg of cytosolic proteins 30.6 ± 7.4 30.4 ± 6.8 GPx5, µmol NADPH9/min/mg of cytosolic proteins 120 ± 23 102 ± 15 TGSH6, µmol/mg of cytosolic proteins 36.8 ± 16.9 21.2 ± 12.8 GSSG7, µmol/mg of cytosolic proteins 6.15 ± 2.93 3.09 ± 1.50

Kidneys, g 193 ± 40 171 ± 31 MDA1, nmol/mg of cytosolic proteins 69.7 ± 11.5 53.6 ± 7.7* MDA1, mmol/mg of microsomal proteins 22.0 ± 4.9 25.0 ± 2.5 SOD2, U/min/mg of cytosolic proteins 8.59 ± 0.93 9.98 ± 2.68 CAT3, µg CH2O

8/min/mg of cytosolic proteins 57.1 ± 14.4 54.9 ± 15.9 GR4, µmol NADPH9/min/mg of cytosolic proteins 48.2 ± 6.4 38.0 ± 4.2* GPx5, µmol NADPH9/min/mg of cytosolic proteins 83.3 ± 10.6 71.6 ± 8.7* TGSH6, µmol/mg of cytosolic proteins 2.60 ± 0.47 1.75 ± 0.43* GSSG7, µmol/mg of cytosolic proteins 0.09 ± 0.06 0.07 ± 0.04

1MDA =malondialdehyde. 2SOD = superoxide dismutase. 3CAT = catalase. 4GR = glutathione reductase. 5GPx =glutathione peroxidase. 6TGSH = total glutathione. 7GSSG = oxidized glutathione. 8CH2O = formaldehyde. 9NADPH = nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. *Significant difference between groups (Wilcoxon, P<0.05). Values are expressed as mean ± SD, n = 8.

67

TABLE 3. Effects of 28 days of feeding ewesendophyte-free (FE-) or endophyte-infected

(FE+) tall fescue on hepatic and renal drug metabolizing enzymes.

Day 28

FE- FE+

Liver, g 995 ± 183 894 ± 148 O-dealkylation1

Ethoxyresorufin 7.97 ± 1.42 3.66 ± 0.74* Methoxyresorufin 1.67 ± 0.25 1.32 ± 0.17* Pentoxyresorufin 0.58 ± 0.09 0.42 ± 0.04*

N-demethylation2

Aminopyrine 156 ± 22 139 ± 36 Benzphetamine 162 ± 27 146 ± 34 Dimethylnitrosamine 85.3 ± 15.2 55.7 ± 21.3* Erythromycin 19.4 ± 11.3 58.6 ± 23.9* Ethylmorphine 53.1 ± 17.5 47.2 ± 28.0

Glutathione S-transferase

CDNB3 1.28 ± 0.62 1.19 ± 0.25 DCNB4 1.18 ± 0.34 1.06 ± 0.30

UDPGT5

PNP6 0.81 ± 0.21 0.90 ± 0.20 Kidneys, g 193 ± 40 171 ± 31

O-dealkylation1

Ethoxyresorufin 1.75 ± 0.67 1.39 ± 0.53 Methoxyresorufin 2.63 ± 0.78 2.52 ± 0.40 Pentoxyresorufin 0.52 ± 0.11 0.53 ± 0.14

Glutathione S-transferase

CDNB3 0.22 ± 0.04 0.21 ± 0.03 DCNB4 0.12 ± 0.05 < 0.01*

UDPGT5

PNP6 0.12 ± 0.04 0.11 ± 0.04 1In pmol resorufin formed/min/mg of microsomal proteins. 2In ng formaldehyde formed/min/mg of microsomal proteins. 3CDNB = in mmoles of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene conjugated/min/mg of cytosolic proteins. 4DCNB = in µmoles of 1,2-dichloro-4-nitrobenzene conjugated/min/mg of cytosolic proteins. 5UDPGT = Uridine diphosphate-glucuronosyltransferase. 6PNP = in µmoles of paranitrophenol conjugated/min/mg of microsomal proteins. *Significant difference between groups (Wilcoxon, P<0.05). Values are expressed as mean ± SD, n = 8.

68

Figure Captions

Figure 1. Body weight (A), milk production (B) and hay consumption (C) in ewesfed

endophyte-free (FE-) or endophyte-infected (FE+) tall fescue after 22 days.†Significant

difference from day 1 (Wilcoxon, P < 0.05).Values are expressed as mean ± SE, n = 8.

Figure 2. Effect of consumption of endophyte-free (FE-) or endophyte-infected (FE+)

tall fescue on temperatures (A) and thermocirculation index (B) in ewes. Rectal (■), ear (●)

and air temperatures (▲). *Significant difference between groups on the same day

(Wilcoxon, P<0.05). Values are expressed as mean ± SE, n = 8.

Figure 3: Plasma prolactin concentration in ewesfed endophyte-free (FE-) or

endophyte-infected (FE+) tall fescue. †Significant difference from day 0, *Significant

difference between groups on the same day (Wilcoxon, P<0.05). Values are expressed as

mean ± SE, n = 8.

69

Figure 1

50

55

60

65

70

75

80

1 22

We

ight

, kg

Time, days

FE- FE+ A

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

1 22

Milk

pro

duc

tion,

L

Time, days

FE- FE+ B

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

1 22

Ha

y co

nsum

ptio

n, k

g D

M/e

we

/d

Time, days

FE- FE+ C

† †

† †

70

Figure 2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 7 14 21 28

Te

mp

era

ture

, °C

Time, days

A- - - FE FE+

*

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 7 14 21 28

TC

I

Time, days

FE- FE+

**

B

71

Figure 3

0

50

100

150

200

0 7 14 21 28

Pro

lact

in, n

g/m

L

Time, days

FE- FE+

†* †* †*

†*

† †

72

Chapitre 3 : présentation de l’article 3

La consommation de ray-grass anglais endophyté (RG+) est à l’origine d’une affection

connue sous le nom de « ryegrass staggers » dont les manifestations sont attribuées au

lolitrème B (LB) (Gallagher et al., 1981). En dehors de tremblements, très peu de données

sont disponibles sur les effets de l’ingestion RG+. De même, malgré la présence d’ergovaline

(EV) à des niveaux relativement élevés, seuls les effets du LB sont observés chez les animaux

(Article 1, tableau 6, page 25). Cette étude a pour objectif d’évaluer l'impact de la

consommation d’un fourrage RG+ produit dans des conditions agronomiques françaises, sur

des brebis en lactation. Étant donnés les niveaux respectifs en EV et LB mesurés dans le

fourrage distribué (cf. infra), l’intérêt spécifique de ce travail est de comparer les résultats

observés à ceux précédemment décrits lors d’exposition à un fourrage de fétuque endophytée.

Le protocole d’exposition animale et les paramètres mesurés étant similaires à ceux décrits

dans l’étude précédente, ces éléments ne seront pas représentés ici (présentation de l’article 2,

page 36).

Les concentrations en LB et EV dans le foin, les tissus et le lait ont été déterminées par

HPLC avec un détecteur de fluorescence. Le pourcentage d’extraction de LB dans le foin est

de 86% avec une limite de détection de 10 µg/kg MS. Dans les matrices carnées et le lait, le

pourcentage d’extraction est de 81 et 97%, la limite de détection de 0,15 µg/kg ou µg/l

respectivement. Pour l’EV, la méthode de dosage et ses données de validation sont décrites

dans la présentation de l’article 2 (page 37).

Aucun signe de toxicité, aucun effet sur la température, aucune altération biochimique

non spécifique et aucune lésion à l’autopsie n'ont été observés chez les brebis affouragées en

RG+ contenant respectivement 851 et 884 µg/kg MS d’EV et LB, pendant 28 jours (Article 3,

tableau 1 et figure 1, pages 96 et 102). L’absence des tremblements n'est pas surprenante étant

donné le seuil de toxicité de 2000 µg LB/kg de MS rapporté pour cet effet (Tor-Agbidye et

al., 2001). Paradoxalement, bien que le niveau d’exposition en EV ait été supérieur à celui de

l’étude sur fétuque, aucun effet n’a été observé sur la consommation, le poids des

animaux, la température de la peau et l'indice de thermocirculation.

Les concentrations en prolactine (PRL) chez les animaux non exposés diminuent avec

le temps (Article 3, figure 2A, page 103), ce qui est en accord avec l’étude réalisée sur

73

fétuque. Cependant, la baisse est plus prononcée chez les brebis affouragées en RG+ qu’en

RG-. Une diminution de la PRL de 56% et 51% a été observée après 7 et 28 jours (encadré 4,

page 76). Dans l’étude sur fétuque, une teneur en EV dans le fourrage de 497 µg EV/kg

entraînait aux mêmes échéances une baisse de la PRL de 66% et 73%. Ce résultat confirme

que la PRL est un bio-marqueur sensible à l’EV mais que son effet est moins important

suite à la consommation du foin RG+ que du foin FE+ (Fletcher et al., 1997 ; Bluett et al.,

2003 ; Gadberry et al., 2003).

Les résultats du dosage de différents paramètres de stress oxydatif plasmatique,

hépatique et rénal, sont présentés dans le tableau 3 (Article 3, page 98). Contrairement à la

fétuque endophytée, aucune donnée n'est disponible concernant l'effet de l’ingestion du RG+

sur les dommages oxydatifs. Les résultats obtenus dans cette étude montrent une

augmentation significative de l’activité superoxyde dismutase plasmatique et rénale (123 et

125%, respectivement) et de la catalase rénale de 127%. Ce résultat va donc à l’encontre de ce

qui avait été noté lors de distribution de FE+, où une diminution des enzymes impliquées dans

les mécanismes de défense contre les dommages oxydatifs avait été observée (Article 2,

tableaux 1 et 2, pages 65 et 66). Ce résultat suggère que les effets des fourrages SE+ et

FE+ sur les paramètres de lutte contre le stress oxydatif sont différents (encadré 4, page

76).

Les activités enzymatiques de biotransformation de phase I et II hépatiques et rénales

sont présentées dans le tableau 4 (Article 3, page 99). Les résultats révèlent une augmentation

de l’activité activité méthoxyrésorufine O-déalkylase (137%) hépatique. Au niveau rénal, une

augmentation (151%) de l’activité UDP-glucuronosyltransférase et une diminution (40%) de

l’activité glutathion S-transférase ont été observées. Contrairement à l’étude précédente,

aucune augmentation de l'activité érythromycine N-déméthylase n’a été observée chez les

brebis. Aucune donnée n'est disponible concernant les effets de LB sur ces activités

enzymatiques. Des études réalisées avec d'autres alcaloïdes du groupe des indoles (auquel

appartient le LB) suggèrent que ces composés interagissent également avec les enzymes de

biotransformation. Parmi eux, la rutaecarpine et la limonin, réduisent l'activité érythromycine

N-déméthylase (Iwata et al., 2005) et augmentent l'activité méthoxyresorufine O-déalkylase

(Jeon et al., 2006) et l’expression des UDP-glucuronyltransférases chez la souris (Zhu et al.,

2013). Nos résultats, qui sont en accord avec ces données bibliographiques, suggèrent que le

LB pourrait avoir les mêmes effets. En ce qui concerne l’activité glutathion-S-transférase, une

diminution significative (40%) au niveau rénal a été observée chez les brebis affouragées en

SE+, alors que la distribution de FE+ entraînait également une diminution, mais plus

74

prononcée (92%). Ainsi, la distribution d’un fourrage RG+ contenant de l’EV et du LB a

des conséquences sur les activités de différentes enzymes de biotransformation. De façon

étonnante, bien que les teneurs en EV soient deux fois supérieures à celles présentes

dans le fourrage FE+ utilisé, ces effets ne vont pas dans le même sens. La présence de LB

(indole-diterpène), pourrait être à l’origine de ces différences (encadré 4, page 76).

Enfin, les teneurs en EV et LB ont été mesurées dans le lait et les tissus (Article 3,

tableau 5, page 100). Pour la première fois la présence d’EV a été détectée dans le lait, la

graisse, les reins et le foie chez les animaux affouragés en SE+. L’excrétion lactée de l’EV

dans le lait est faible, en accord avec une étude réalisée chez la chèvre en lactation après

administration intraveineuse qui montre un taux d’excrétion de 0,05% (Durix et al., 1999).

Dans la précédente étude, l’exposition des brebis à 497 µg EV/kg MS n'a pas montré la

présence d'EV dans ces matrices. Ces différences peuvent s'expliquer par la forte teneur

en EV dans le foin RG+ utilisé dans cette étude. Du LB a été retrouvé dans les tissus et le

lait avec des teneurs plus importantes dans la graisse. La présence de LB dans le lait à des

teneurs supérieures à celles observées pour l’EV est en accord avec un taux d’excrétion lactée

plus élevé, des valeurs de 0,19 et 3% ayant été rapportées chez la chèvre en lactation après

une administration IV (23 µg de LB/kg) ou intra-ruminale (100 µg de LB/kg) (Grancher,

2007). Un taux d’excrétion de 0,23% a été également décrit chez vaches consommant du RG+

contenant 1800 µg LB/kg MS (Finch et al., 2013). La graisse, est par ailleurs le tissu le plus

contaminé lors d’analyse de résidus dans les études conduites chez les vaches laitières et

bouvillons exposés à des fortes teneurs en LB (>1200 µg/kg MS) dans le RG+ (Miyazaki et

al., 2004, 2007 ; Shimada et al., 2013). Ces résultats démontrent la présence d’EV et de

LB dans les tissus et le lait en l’absence de signe clinique chez la brebis.

En conclusion, la distribution à des brebis en lactation d’un foin de RG+ contenant

respectivement 851 et 884 µg/kg d’EV et de LB, pendant 28 jours n'a pas de conséquence sur

la santé animale ou la production lactée. Cependant, une diminution de la PRL a été observée

à partir du jour 7 jusqu’au jour 28. Ce résultat confirme que ce paramètre est altéré de manière

sensible et précoce lors de la distribution de fourrage RG+ contenant des fortes teneurs en EV.

La mesure de l'activité des enzymes de biotransformation suggère des effets complexes des

toxines qui pourraient être dus à des différences d’effets entre les alcaloïdes ergotiques et les

alcaloïdes indoliques. L'analyse du lait et des tissus ont révélé la présence d'EV et LB à des

niveaux faibles mais mesurables. Bien que d'autres études soient nécessaires pour comprendre

les conséquences des changements dans les activités enzymatiques de biotransformation

observés chez les brebis exposées au foin RG+, ces modifications peuvent contribuer à

75

expliquer la différence de toxicité observée pour l’EV en présence ou en absence d'autres

alcaloïdes.

76

Encadré 4 : Effets de l’ergovaline dans le ray-grass.

↗MROD, UDPGT

↗CAT, SOD, GPx

Effet biochimique??

Enzymes de biotransformation

Résultats obtenus dans : - Revue bibliographique (Article 1)- Étude RG+, 851 µg EV/kg et 884 µg LB/kg (Article 3)- Étude FE+, 497 µg EV/kg (Article 2)- Études rutaecarpine et limonin (Iwatael al., 2005; Jeonet al., 2006; Yan et al., 2013, Zhu et al., 2013)

Capacités de lutte contre le stress

oxydatif

Effet biochimique??

Ergovaline

Effetspharmacologiques

RécepteursD2 5-HT2

Effet PRL variable Aucun effet vasomoteur↘ 51% PRL Aucun effet TCI↘ 70% PRL ↘ TCI

Lolitrème B

Effets pharmacologiques

Récepteurs GABA / BK channels

Tremblements

↘MROD↗ érythromycine N-déméthylase

↗MROD↘ érythromycine N-déméthylase

↗UDPGT

↗ CAT, GPx

↘CAT, SOD

FE+ : fétuque endophytée, RG+ : ray-grass endophyté, D2: récepteur dopaminergique, 5-HT2 : récepteur 5-hydroxytryptamine 2, PRL :prolactine, TCI : indice de thermocirculation, SOD : superoxyde dismutase, GPx : glutathion peroxydase, GPx : glutathion péroxydase,MROD : méthoxyrésorufine, GABA : acide gamma amino-butyrique, BK channels : canaux potassiques activés par le calcium, UDPGT :UDP-glucuronosyltransférase.

Étude FE+

Étude FE+

Études rutaecarpine

Études rutaecarpine

Article 3

High ergovaline level in endophyte-infected ryegrass and its effect on

health, milk quality, biochemical parameters, oxidative status and

drug metabolizing enzymes of lactating ewes

N. Zbib*, C.Repussard*, D.Tardieu*, N.Priymenko†, C. Domange†and P. Guerre*2

*Université de Toulouse, INP, ENVT, UR Mycotoxicologie, F-31076 Toulouse, France

†Université de Toulouse, INP, ENVT, INRA UMR1331 Toxalim, F-31076 Toulouse France.

Running title: Endophyted ryegrass and lactating ewes

Keywords:

drug metabolizing enzymes, endophyte-infected perennial ryegrass, ergovaline, ewes, lolitrem

B, prolactin

Article soumis dans : Journal of Animal Science

77

INTRODUCTION

The development of Epichloë festucae var. lolii (formerly named Neotyphodium lolii,

Leuchtmann et al., 2014) in perennial ryegrass (Lolium perenne) leads to the production of

several alkaloids belonging to the indole-diterpene and ergopeptine groups (Repussard et al.,

2013). Endophyte-infected ryegrass is responsible for staggers in livestock, which is often

reported in New Zealand and Australia (Cunningham and Hartley, 1959; Rattray, 2003).

Despite the high level of endophyte-infected ryegrass in Europe, the disease is rarely

encountered (Bony et al., 1998, 2001; Benkhelil et al., 2004). The reason for the lack of

toxicity is unknown.

Lolitrem B (LB) is an alkaloid of the indole-diterpene group known to produce

tremorgenic symptoms in several animal species and has a toxic threshold of 1,800-2,000

µg/kg DM. Ergovaline (EV), is an ergopeptine alkaloid, also produced by endophyte-infected

ryegrass, known for its vasomotor properties. This compound is responsible for fescue foot,

summer syndrome, and economic loss in livestock after consumption of endophyte-infected

tall fescue (FE+) with a toxic threshold of 300-500 µg/kg DM (Bacon, 1995; Tor-Agbidye et

al., 2001; Zbib et al., 2014a).

Despite the high level of EV that may be present in infected ryegrass, only a few

studies have been conducted on its toxicity in the presence of non-toxic concentrations of LB.

Interestingly, some studies have suggested that EV toxicity was lower when LB is present in

endophyte-infected ryegrass than in endophyte-infected tall fescue (Gadberry et al., 2003).

The purpose of this study was to investigate the impact on lactating ewes of consuming hay

made of endophyte-infected ryegrass produced under French agricultural conditions and

containing high EV and low LB levels. This study focuses on animal health, milk production,

oxidative damage, drug metabolizing enzyme activities and the risk of persistence of EV and

LB in food destined for human consumption.

MATERIALS AND METHODS

Hay production and animal exposure

Two homogeneous 0.75 ha plots were sown in the fall in 2009 with Samson perennial

ryegrass at the agricultural school "La Cazotte" (12400 Saint-Affrique, France), one with

endophyte-free seeds, and other with endophyte-infected seeds with an infection rate of 70%.

The seeds used were obtained from RAGT (12000 Rodez, France). In June 2011, at the fully

78

ripe stage, hay was harvested then stored in a hangar until November 2011 when the study on

ewes began. Each week of the assay, one kg of hay was taken from five different locations of

the bales after harvest and during the animal assay for chemical analysis. Ergovaline and

lolitrem B were determined fluorimetrically after HPLC separation as described below. Other

ergot alkaloids, ergotamine, ergotaminine, ergocryptine, ergocryptinine, ergocornine,

ergocorninine, ergosine, ergosinine, ergometrine, ergometrinine, ergocristine, ergocristinine,

were determined by HPLC-MS (Qualtech SA laboratory, 54503 Vandoeuvre, France) and

were below the limit of detection (3 µg/kg).

Sixteen lactating ewes (Lacaune breed, body weight 80 ± 10 kg) were housed in a large barn

characterized by low stocking density and high ventilation. Italian ryegrass was used as forage

before the beginning of assay with perennial ryegrass hay. Three days before the beginning of

the study, ewes were selected on a herd of 47 animals on weight and milk production to

minimize individual variations. Animals were divided into two homogenous groups of eight

and housed in two park of 15 m2 each. On day 1 of experiment that correspond to day in milk

35 ± 4, animals were fed with long stem endophyte-free (SE-) or endophyte-infected (SE+)

hay ad libitum for 28 days. Daily, orts was removed then around 20 kg of new hay was

provided on racks self-service. Analysis of the quality of the hay offered revealed a dry matter

(DM) around 90%. Crude protein was 82 and 104 g/kg DM, crude fiber was 281 and 303 g/kg

DM, net energy for lactation intake was 1.32 and 1.19 Mcal/kg DM for SE- and SE+,

respectively. Complementary feed was supplied daily using head locks: 700 g of high protein

concentrate (Evialis, 84270 Vedène, France), 500 g barley and 20 g multi-vitamin supplement

(Unicor, 12032 Rodez, France). All experimental procedures involving animals were in

accordance with the French National Guidelines for the care and use of animals for research

purposes.

Animal monitoring and sampling

Clinical signs were checked daily for any mark of stress (hyperventilation), disease

(prostration, diarrhea) or any abnormal comportment. Core body temperatures (Tco), skin

temperatures (Ts) and air temperatures (Ta) were measured as described in Zbib et al. (2014b)

on days 0, 3, 7, 14, 21 and 28. The thermocirculation index (TCI) was calculated (Burton and

Edholm, 1955) according to the following equation: TCI = (Ts – Ta)/(Tco – Ts).

Body weight, feed consumption and milk production were recorded on days 1, 8 and 22. Fat

and protein contents and the number of cells in the milk were analyzed according to the

79

French Ministry of Agriculture for the payment of the Milk Quality (LIAL laboratory, 15000

Aurillac, France). One sample (50 ml) was stored at -20°C for ergovaline and lolitrem B

analysis. Blood samples were collected by jugular vein puncture in lithium heparinized tubes

(Terumo, Leuven, Belgium) one hour after milking on days 0, 7, 14, 21 and 28.

At day 28, ewes were euthanized by exsanguination after stunning at the slaughterhouse

(12400 Saint-Affrique, France). Post mortem examination was conducted to reveal anomalies.

The carcass, liver, kidneys and adrenals were weighed. Fifty grams of tissues (brain, liver,

kidneys, muscle and abdominal fat) were collected, frozen in liquid nitrogen, and stored at -

80°C until analysis. The animal carcasses were dispatched for rendering.

Blood analysis

Five hours after blood collection, hematocrit was determined in a microcapillary tube at

11,000 x g for 15 min whereas the rest of blood were centrifuged at 3,000 g for 10 min at 4°C

and the plasma was collected. A 500 µl aliquot was deproteinized with metaphosphoric acid

(1.25 M, vol/vol) for glutathione determination and stored with the rest of plasma samples at -

80°C until analysis.

Biochemical parameters were assayed in a medical laboratory (31880 La Salvetat Saint-

Gilles, France) using a clinical chemistry analyzer (Hitachi 717, Tokyo, Japan) following the

manufacturer’s recommendations. The concentration of prolactin (PRL) was measured at the

Neuroendocrinology Laboratory (INRA, Nouzilly, France) by RIA as previously described

(Zbib et al., 2014b). Plasma cortisol concentrations were measured with the Cayman cortisol

EIA Kit (Ann Arbor MI, USA) according to the manufacturer’s recommendations.

Ergovaline and lolitrem B determination

Ergovaline standard was kindly provided by G.E. Rottinghaus (College of Veterinary

Medicine, University of Missouri). Lolitrem B standard was purchased from AgResearch

Limited Ruakura Research Centre (Hamilton, New Zealand). All reagents and chemicals,

HPLC grade, were purchased from Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA).

Ergovaline concentrations in hay, milk and tissues were determined by HPLC after

purification on homemade ergosil columns according to the method of Rottinghaus et al.

(1991), with slight modifications (Zbib et al., 2014b).

80

Lolitrem B in the hay was determined after extraction with dichloromethane as previously

described (Repussard et al., 2014). Concentrations in the purified extracts were measured

after purification on homemade ergosil columns according to the method of Gallagher et al.

(1985), with slight modifications (Repussard et al., 2014). Lolitrem B in milk and tissues was

determined by HPLC according to Gallagher et al. (1985) after hexane extraction and SPE

purification according to Miyazaki et al. (2004) with slight modifications. Three grams of

tissues were added to 3 ml of phosphate buffer (pH 7.4, 0.1 M) and homogenized with an

Ultra Turrax (TP 18, IKA, Staufen, Germany). Two ml of the suspension were collected and

extracted with 12 ml of hexane on an orbital shaker for 1 h. Milk samples (3 ml) were diluted

with 3 ml of phosphate buffer (pH 7.4, 0.1 M) then extracted using the same protocol as that

described for tissues. Phase separation was conducted by freezing for 5 min at -80°C. The

supernatant was collected and the pellet extracted twice with 4 ml of hexane using the same

procedure. The hexane extracts were pooled before purification on SPE columns prepared as

follows: one centimeter (about 150 mg) of Ergosil silica gel (Analtech Inc., Newark, DE,

USA) was placed in an empty 5 ml SPE cartridge (Silicycle, Quebec, Canada), followed by a

biological disk (Silicycle, Quebec, Canada) and one centimeter of sodium sulfate (about 1,000

mg). The columns were preconditioned with 2 ml of hexane before the hexane extracts were

passed. Columns were washed with 5 ml of hexane. Lolitrem B was eluted with 6 ml of

dichloromethane/acetonitrile (80:20, vol/vol). Elute was collected and evaporated to dryness

with a sample concentrator at 45°C under a stream of nitrogen. The dry residue was dissolved

in 100 µl dichloromethane/acetonitrile (80:20, vol/vol). Lolitrem B was separated and

detected as previously described for hay (Repussard et al., 2014).

Tissue fractions and assays

Chemicals and compounds were purchased from Sigma (St. Louis, USA). All the tissue

fraction procedures were performed as previously described (Zbib et al., 2014b). Briefly,

tissues (the liver and kidneys) were homogenized in phosphate buffer, then centrifuged to

obtain microsomal and cytosolic fractions that were stored at -80°C until analysis. Protein

contents in the homogenates were determined using the Bio-Rad protein assay (Bio-Rad

Laboratories, 80939 München, Germany) according to the manufacturer’s recommendations

using bovine serum albumin as standard.

Oxidative stress parameters were measured in plasma and tissues. Malondialdehyde (MDA)

was determined fluorometrically after formation of a pink complex with thiobarbituric acid

(Buege and Aust, 1978). Both oxidized glutathione (GSSG) and total glutathione (TGSH)

81

were determined using an optimized enzymatic recycling method before quantification of

GSH with Ellman’s reagent (Baker et al., 1990) in the presence or absence of 2-vinylpyridine

used to derivatize GSH (Griffith, 1980). Superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) activity

was based on the inhibition of the formation of blue formazan by xanthine-xanthine oxidase

(EC 1.17.3.2) in the presence of nitroblue tetrazolium (Sun et al., 1988). SOD activity was

calculated using bovine erythrocyte SOD as standard. Catalase (CAT, EC 1.11.1.6) activity

was estimated by formation of formaldehyde in the presence of H2O2 (Johansson and Håkan

Borg, 1988). Glutathione reductase (GR, EC 1.6.4.2) reduces oxidized glutathione (GSSG)

into glutathione (GSH) in the presence of NADPH (Carlberg and Mannervik, 1984).

Glutathione peroxidase (GPx, EC 1.11.1.9) reduces cumene hydroperoxide in the presence of

GSH to produce GSSG, which is recycled into GSH by GR in the presence of NADPH

(Paglia and Valentine, 1967). Both activities were measured separately by monitoring the

decrease in NADPH.

Drug metabolizing enzyme activities were measured in microsomal or cytosolic tissue

fractions of the liver and kidneys. N-demethylation activities were measured in the

microsomal fraction of tissues with aminopyrine, benzphetamine, ethylmorphine,

erythromycin and N-dimethylnitrosamine as substrates by the formation of formaldehyde

which was detected by the method of NASH (Cochin and Axelrod, 1959). Dealkylation of 7-

methoxyresorufin, 7-ethoxyresorufin and 7-penthoxyresorufin was estimated through

resorufin formation in the microsomal fraction of tissues (Lake, 1987). UDP-

glucuronyltransferase activity with p-nitrophenol was measured in the microsomal fraction of

tissues by monitoring the formation of PNP-glucuronide (Frei, 1970). Using 1-chloro-2-4-

dinitrobenzene and 1,2-dichloro-4-nitrobenzene as substrates, glutathione S-transferase

activities were determined in the cytosolic fraction of tissues by monitoring the formation of

the respective conjugates (Habig et al., 1974).

Statistical analyses

Statistical analyses were performed using R software (2.11.1, R Foundation for Statistical

Computing, Vienna, Austria). Body weight, milk production, temperatures, TCI,

biochemistry, prolactin and cortisol concentrations were compared using a linear model to

assess the effect of group, time, and the interaction between group and time. When a

significant effect was obtained (P < 0.05), a complementary range test (Mann-Whitney) was

used for the individual comparison of means. Oxidative stress parameters and

biotransformation enzyme activities were compared using Student’s t test after testing for

82

normality (Shapiro) and equality of variance (Fisher). Significantly different groups (P <

0.05) are identified by a superscript. Data are reported as means ± SD or SE.

RESULTS

Exposure to alkaloids and effects on health

Table 1 lists the EV and LB concentrations in the ryegrass hay used in this study, measured

on days 1, 8, and 22. Mean EV and LB in SE+ were 851 and 884 µg/kg DM, respectively,

whereas these alkaloids were below the limit of detection in the SE- hay. Over the course of

the study, the mean hay consumption was 39 kg DM/ewe in both groups, whereas the mean

body weight of ewes was 80 and 79 kg in SE- and SE+ groups, respectively. The average hay

moisture was 10.2%, which enabled calculation of mean intake of EV and LB of 14.9 and

15.5 µg/kg BW, respectively in ewes fed the SE+ hay.

No animals died during the study, and no symptoms of toxicity were observed. No difference

in hay consumption was observed between the two groups, and the ewes’ body weight

remained constant throughout the study period in both groups. Milk production decreased

with time (P = 0.0002), whereas protein contents remained constant and fat contents increased

(P = 0.01). However, no difference in milk production or in the fat and protein contents in the

milk was observed between the groups (Table1).

A post mortem examination at the end of the study did not reveal any pathological alteration,

and no difference between groups was observed in the weight of the carcass, liver, kidneys

and adrenals (data not shown).

Temperatures and thermocirculation index

Figure 1 shows core body temperature, skin temperature, air temperature and the

thermocirculation index (TCI) in the ewes fed SE- and SE+. The core body temperature

remained constant throughout the study in both groups even though air temperature varied

from 15 to 5°C and skin temperature varied from 32 to 17°C in the two groups (Figure 1A).

The variations in skin temperature generally tracked variations in air temperature with no

difference between the groups. These changes led to variations in the TCI (Figure 1B). But

although TCI varied with time (P = 0.001), no difference between the groups was observed.

Plasma prolactin and cortisol concentrations and biochemistry

83

Plasma prolactin (PRL) and cortisol concentrations are shown in Figure 2. Because both

parameters appeared to vary with time in both groups, a linear model was used to assess

intergroup variations. Concerning the concentration of PRL, the model revealed differences

between groups, with an effect of time (P < 0.00001 and 0.002, respectively), which led us to

use a complementary range test (Wilcoxon) for individual comparison of means. In the SE-

group, the PRL concentration was less on day 28 than on day 0 (P = 0.04), whereas in the

group with the SE+ fed ewes, the concentration of PRL was less on days 7, 14, 21 and 28 (P <

0.01). Moreover a significant difference between groups was observed on days 7, 14, 21 and

28 (P < 0.03). A linear model was also used to assess intergroup variations of cortisol

concentrations. The model revealed differences between the groups (P = 0.001) but there was

no effect of time. Individual comparison of means (Wilcoxon test) revealed differences

between groups only on day 28 (P = 0.0012).

Table 2 lists hematocrit and biochemical parameters in ewes fed SE- or SE+ hay. A

significant increase in the concentration of urea and a significant decrease in cholesterol and

triglycerides were observed with time in both SE- and SE+ groups (P < 0.000001, 0.05 and

0.00001, respectively). However, no difference between groups was observed, whatever the

parameter analyzed.

Oxidative damage and antioxidant enzyme activities

Oxidative damage and antioxidant enzyme activities were measured in the plasma, liver and

kidneys (Table 3). Total and oxidized glutathione and MDA were not affected by exposure to

SE+ whatever the tissue analyzed. Concerning enzyme activities, an increase in SOD activity

was observed in the plasma (P = 0.006) and kidney (P = 0.04) but not in the liver of SE+ fed

ewes. Catalase activity in the kidney also increased in the SE+ group (P = 0.01), whereas it

remained unchanged in the plasma and liver. Glutathione reductase and glutathione

peroxidase activities were not affected by the diet of SE+ hay, whatever the tissue analyzed.

Drug metabolizing enzyme activities

The effects of 28 days of feeding SE+ hay on hepatic and renal drug metabolizing enzymes

activities in ewes are listed in Table 4. An increase (P = 0.002) in methoxyresorufin O-

dealkylase activity was observed in the liver of ewes fed with SE+ hay (+37%) whereas the

activity decreased (P = 0.009) in the kidney (-40%). No other drug metabolizing enzyme

activity changed in the liver as the result of consuming SE+ hay, and no activity of N-

demethylation was detected in kidneys whatever the substrate used. In the kidneys,

84

glutathione S-transferase activity measured with DCNB as substrate decreased (P = 0.002) in

the SE+ fed ewes whereas it was not affected when CDNB was used. By contrast, when PNP

was used as substrate, a two fold increase (P = 0.001) in UDPGT activity was observed in the

kidneys of SE+ fed ewes.

Residues in milk and tissues

Residues of EV and LB were measured in the milk, liver, kidneys, muscle, fat and brain of the

ewes fed SE- or SE+ hay. More than 80% extraction of both EV and LB was observed in milk

and tissues (Table 5). Concentrations of EV and LB were always below the LD (0.15 µg/kg)

in the SE- fed ewes whatever the sample analyzed. Also, EV was below the LD in muscle and

brain of SE+ fed ewes, whereas respectively two and four samples of fat and milk out of the

eight samples analyzed contained higher concentrations than the LD. The mean EV level in

the liver and kidneys was 0.55 and 0.44, respectively, and the concentrations in all the

samples were higher than the LD. LB was below the LD in the brain of SE+ fed ewes,

whereas two samples of the milk and kidneys out of the eight analyzed contained higher

concentrations than the LD. The mean level of LB in the liver and muscles was 0.43 and 0.50,

respectively, and only four samples out of eight were positive in the liver, whereas all the

samples were positive in the muscle. The highest concentration of LB was observed in fat,

with a mean of 2.39 µg/kg, all the samples showing higher concentrations than the LD.

DISCUSSION

Animal monitoring and production

Consumption of perennial ryegrass infected by E. festucae var. lolii is known to cause

tremorgenic symptoms in several animal species. LB is an alkaloid of the indole-diterpene

group that is present at relative high concentrations in SE+. Because LB is known to produce

tremors, and because staggers is a common symptom of toxicity in SE+, most studies have

focused on this compound (Repussard et al., 2013; Zbib et al., 2014a). In perennial ryegrass,

a toxic threshold of 2,000 µg LB/kg DM was reported in cattle and sheep (Dimenna et al.,

1992; Oldenburg et al., 1998; Tor-Agbidye et al., 2001). Ergovaline is an ergot alkaloid that

can also be produced by E. festucae var. lolii in infected ryegrass. This compound has

vasomotor effects which are considered to be responsible for the signs of lameness and

reduced growth after consumption of endophyte-infected tall fescue (Lolium arundinaceum)

during fescue toxicosis (Oliver et al., 1993; Bacon, 1995; Repussard et al., 2013; Zbib et al.,

2014a). In endophyte-infected tall fescue (FE+), an EV threshold of 300 and 500 µg/kg were

85

reported in cattle and sheep, respectively (Tor-Agbidye et al., 2001). However, although EV

has been identified in SE+, signs of toxicity linked to this toxin are rarely reported (Easton et

al., 1996). The reason of these differences is the low amount of EV in this plant compared

with levels observed in FE+. Indeed, the EV concentrations observed in SE+ hay or seeds

often represent around 10 to 15% of total LB concentrations (Auldist and Thom, 2000;

Hovermale and Craig, 2001; Benkhelil et al., 2004; Johnstone et al., 2012). So, toxic levels of

LB are generally reached before toxic levels of EV.

In the present study, no sign of toxicity, no effect on temperature, and no pathological

alteration was observed after ewes were fed with SE+ hay containing 851 and 884 µg/kg DM

of EV and LB, respectively for 28 days in the stable. The lack of tremors is not surprising

regarding the toxic threshold of LB (Dimenna et al., 1992; Tor-Agbidye et al., 2001). The EV

level in the SE+ hay was high compared with levels usually reported (Auldist and Thom,

2000; Benkhelil et al., 2004; Johnstone et al., 2012) although high levels of EV have already

been described in SE+ hay (Cagaš et al., 1999; Bony et al., 2001). This level was higher than

the level recognized toxic in FE+ (Hovermale and Craig, 2001; Tor-Agbidye et al., 2001;

Duringer et al., 2005). In a previous study on lactating ewes fed with FE+ hay containing 497

µg EV/kg DM for 28 days in the stable, a decrease in BW, skin temperature and

thermocirculation index were observed (Zbib et al. 2014b), all symptoms were lacking in this

study.

Plasma prolactin concentration

In this study, PRL concentrations decreased with time in the two groups, which is common

during lactation (Convey, 1974). However, a stronger decrease in PRL was observed in ewes

fed SE+ hay from day 7 to day 28. This decrease is often reported in animals fed with FE+,

but less common when SE+ was used in feed (Zbib et al., 2014a). The decrease in the

concentration of PRL has been linked to the block of the dopaminergic receptors of the

pituitary cells by EV (Schillo et al., 1988; Siegel et al., 1989; Strickland et al., 1994). In

lambs, 500 µg EV/kg feed reduced PRL (Gadberry et al., 2003). This decrease was of 83%

when EV was present in diets containing FE+ seeds and 59% in diets containing SE+ seeds

(Gadberry et al., 2003). In lactating ewes, the fed of FE+ hay containing 497 µg EV/kg led to

a 66% and 73% decrease in PRL on day 7 and day 28, respectively (Zbib et al, 2014b). In the

present study, a 56% and 51% decrease in PRL was observed on day 7 and day 28,

respectively, suggesting that the effect of EV on PRL was less when the toxin was present in

SE+ than in FE+ hays.

86

Cortisol, biochemistry and oxidative stress parameters

A significant difference in the concentration of cortisol was observed between SE- and SE+

fed ewes on day 28, but this result is difficult to explain. No effect of time was observed

whatever the group analyzed, and the concentrations measured were within the expected

range in ewes (Negrão and Marnet, 2003). Moreover, previous study failed to reveal an effect

of SE+ feeding on this parameter (Watson, 2000; Looper et al., 2006).

No effect of SE+ hay was observed on biochemistry in this study; which is in agreement with

results of previous studies even when staggers occurred (Miyazaki et al., 2007). Activities of

enzymes that are markers of cell damage are only increased when severe staggers occured

(Benkhelil et al., 2004).

No data is available concerning the effect of SE+ on oxidative damage, whereas a decrease in

antioxidant defense mechanisms is observed in FE+ fed animals, specially under heat stress

(Lakritz et al., 2002; Spiers et al., 2005; Bhusari et al., 2006; Burke et al., 2007; Settivari et

al., 2009). The results of the present study suggest a slight increase in the activity of some

enzymes involved in defense mechanisms against oxidative damage in ewes fed SE+ hay. By

contrast, a moderate decrease in the mechanism of defense against oxidative damage was

observed in lactating ewes fed FE+ hay containing 497 µg EV/kg (Zbib et al, 2014b).

Drug metabolizing enzymes

Taken together, the effects on health, prolactin, biochemistry and oxidative stress parameters

suggested that the toxic effects of EV were less when the toxin was in SE+ hay than in FE+.

That observation led to the hypothesis that other ergot alkaloids present in FE+ but not in SE+

increase toxicity. However, analysis of ergotamine, ergotaminine, ergocryptine,

ergocryptinine, ergocornine, ergocorninine, ergosine, ergosinine, ergometrine, ergometrinine,

ergocristine, ergocristinine revealed that these compounds were below 3 µg/kg DM in SE+

and FE+ hay (Zbib et al, 2014b). On the other hand, differences in sensitivity to endophyte-

infected plants between breeds/strains have been reported for several years (Morris et al.,

1995; Aymes et al., 2002; Morris et al., 2004; Bishop and Morris, 2007). Among the

hypotheses proposed to explain these differences, some involve a difference in the animal’s

ability to metabolize and eliminate the toxin. Studies conducted in mice demonstrated that

lines resistant to EV displayed significantly higher glutathione S-transferase activity than

sensitive lines (Hohenboken and Blodgett, 1997; Wagner et al., 2000). Genomic analysis also

revealed up or down regulation of P450 genes during fescue toxicosis (Bhusari et al., 2006;

87

Settivari et al., 2006, 2008, 2009). Interestingly, our previous study in lactating ewes fed with

FE+ hay revealed a marked increase in erythromycin N-demethylase activity (Zbib et al,

2014b), a substrate of P450 3A subfamily that is involved in the metabolism of ergot alkaloids

(Liaudet, 1999). This result and others conducted in vitro on the metabolism of ergotamine,

suggest that differences in alkaloid metabolism may explain variations in sensitivity to fescue

toxicosis (Duringer et al., 2005; Moubarak et al., 2006). In the present study, no increase in

erythromycin N-demethylase activity was observed in ewes despite high EV in the SE+ hay.

By contrast, methoxyresorufin O-dealkylase activity was increased. No data is available

concerning the effects of LB on drug metabolizing enzyme activities. However, some studies

conducted with other indole alkaloids suggest that these compounds interact with drug

metabolizing enzymes. Among them, rutaecarpine and limonin, which are indole alkaloids of

Evodia rutaecarpa, are the most studied. These compounds have been shown to decrease

erythromycin N-demethylase activity (Iwata et al., 2005) and increase methoxyresorufin O-

dealkylase activity (Jeon et al., 2006). Interestingly, rutaecarpine was also reported to increase

UDPGT expression in mice (Zhu et al., 2013) and a two fold increase in UDPGT activity was

observed in the kidneys of SE+ fed ewes in this study. Concerning glutathione S-transferase, a

decrease in this activity was observed in the kidneys of SE+ fed ewes, in agreement with what

was observed with FE + hay (Zbib et al., 2014b) whereas rutaecarpine and other indole

alkaloids have no effect on these activities in this tissue (Ueng et al., 2002). Taken together,

these results suggested that feeding SE+ hay containing 851 and 884 µg/kg of EV and LB,

respectively, led to different effects on drug metabolizing enzyme activities, in agreement

with previous data on ergot and indole alkaloids. These changes that differ from those

observed when FE+ was fed could lead to differences in toxin metabolism and/or toxicity.

Residues in milk and tissues

The HPLC method used for determination of EV in milk and tissues was based on the one

previously described in plants, with slight modifications. This method enabled good recovery

rates of EV in milk and tissues, which did not markedly differ from rates observed in plants

(Rottinghaus et al., 1991). The purification of extracts on homemade ergosil columns avoided

interference in the retention time of EV. Using this method, we report for the first time the

presence of residues of EV in milk, fat, kidneys and liver in ewes fed with SE+ hay

containing 851 µg EV/kg DM. The levels of EV in the ewes’ milk were very low, in

agreement with kinetics studies of EV in lactating goats that demonstrated an excretion rate of

0.05% of EV in milk (Durix et al., 1999). Our previous study on lactating ewes fed for 28

days with a FE+ hay containing 497 µg EV/kg DM failed to demonstrate the presence of EV

88

in milk and tissues. These differences can be explained by the higher EV level in the hay used

in the present study.

LB concentrations in milk and tissue were measured after extraction and purification of

samples using a method already described for tissues, whereas dosage and quantification were

done using a method described for LB analysis in plants (Gallagher et al., 1985; Miyazaki et

al., 2004). The chromatograms of the milk and tissues of ewes fed SE- hay failed to reveal

any interference in the retention time of LB. Fat was the tissue that contained the highest level

of LB, in agreement with results of a study conducted in dairy cows and steers (Miyazaki et

al., 2004, 2007; Finch et al., 2012; Shimada et al., 2013). Milk also contained LB, as reported

in dairy cows (Finch et al., 2013).

In conclusion, feeding SE+ hay containing 851 and 884 µg/kg of EV and LB,

respectively, to lactating ewes for a period of 28 days in the stable had no consequences for

animal health or milk production. However, a decrease in PRL was observed from day 7 to

day 28, confirming that this parameter is a biomarker of SE+ exposure in the presence of high

levels of EV. The measurement of drug metabolizing enzyme activities suggests complex

effects of the toxins that agree with previous data obtained with ergot and indole alkaloids.

Analysis of milk and tissues revealed the presence of EV and LB at low but quantifiable

levels. Although further studies are necessary to understand the consequences of the changes

in the activities of drug metabolizing enzymes observed during SE+ exposure in ewes, these

alterations may contribute to the difference in toxicity observed for ergovaline in the presence

or absence of other alkaloids.

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Zbib, N., C. Repussard, D. Tardieu, N. Priymenko, N. Domange, and P. Guerre. 2014.

Ergovaline in tall fescue and its effect on health, milk quality, biochemical parameters,

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herb–drug interactions. J. Ethnopharmacol. 147:215–219.

96

TABLE1. Ergovaline and lolitrem B concentrations in ryegrass hay, and effect on body

weight and milk production in ewes.

SE - SE +

Day 1 Day 8 Day 22 Day 1 Day 8 Day 22

Ergovaline, µg/kg < 5 < 5 < 5 1006 ± 397 674 ± 33 872 ± 351 Lolitrem B, µg/kg < 10 < 10 < 10 1027 ± 139 824 ± 28 800 ± 301 Feed intake, kg/ewe/d 1.35 1.23 1.52 1.53 1.12 1.46 Body weight, kg 81 ± 10 79 ± 10 80 ± 10 80 ± 9 77 ± 8 79 ± 9 Milk Production, L/d 2.6 ± 0.6 2.3 ± 0.6 1.8 ± 0.6† 2.6 ± 0.5 2.2 ± 0.4 1.8 ± 0.6† Fat content, g/L 49 ± 10 63 ± 6† 61 ± 10† 50 ± 7 66 ± 5† 63 ± 6† Protein content, g/L 51 ± 4 47 ± 5 51 ± 4 52 ± 4 49 ± 6 51 ± 6

†Significant difference from day 1 (Mann-Whitney, P < 0.05). SE- = endophyte-free ; SE+ = endophyte-infected ryegrass. Values are expressed as mean ± SD, n = 8.

97

TABLE 2. Biochemical parameters in the plasma of ewes fed endophyte-free (SE-) or

endophyte-infected (SE+) ryegrass.

SE - SE +

Day 0 Day 28 Day 0 Day 28

Hematocrit, % 33.5 ± 3.2 33.5 ± 4.4 34.5 ± 1.5 34.8 ± 1.8 Sodium, mE/L 145 ± 3 146 ± 7 144 ± 3 146 ± 9 Potassium, mE/L 4.61 ± 0.47 4.56 ± 0.62 4.70 ± 0.45 4.43 ± 0.63 Protein, g/L 74.3 ± 3.4 75.0 ± 7.2 73.7 ± 7.7 77.7 ± 4.5 Urea, mmol/L 7.23 ± 0.79 11.3 ± 1.5† 7.21 ± 1.42 9.75 ± 1.61† Creatinine, µmol/L 68.9 ± 3.8 71.3 ± 10.4 64.2 ± 7.62 68.7 ± 8.8 Cholesterol, mmol/L 2.10 ± 0.37 1.78 ± 0.54† 2.20 ± 0.34 1.93 ± 0.32† Triglycerides, mmol/L 0.25 ± 0 .05 0.15 ± 0.02† 0.23 ± 0.03 0.18 ± 0.05† Total bilirubin, µmol/L 2.00 ± 0.00 2.00 ± 0.00 2.00 ± 0.00 2.00 ± 0.00 AST1, UI/L 155 ± 48 134 ± 23 162 ± 27 174 ± 50 ALT2, UI/L 20.2 ± 8.3 21.2 ± 6.3 22.7 ± 3.6 25.6 ± 7.7 CPK3, UI/L 150 ± 20 135 ± 39 177 ± 49 170 ± 43 LDH4, UI/L 1093 ± 284 1006 ± 144 1154 ± 211 1140 ± 102

1AST = aspartate aminotransferase. 2ALT= alanine aminotransferase. 3CPK = creatine phosphokinase. 4LDH = lactate dehydrogenase. †Significant difference from day 0 (Mann-Whitney, P < 0.05). Values are expressed as mean ± SD, n = 8.

98

TABLE 3. Effects of 28 days of feeding ewes endophyte-free (SE-) or endophyte-infected

(SE+) ryegrass on oxidative stress parameters.

Day 28

SE- SE+

Plasma

MDA1, nmol/mg of plasma proteins 7.92 ± 1.03 8.81 ± 1.21 SOD2, mU/min/mg of plasma proteins 6.00 ± 0.74 7.37 ± 0.97* CAT3, ng CH2O

8/min/mg of plasma proteins 152 ± 96 130 ± 18 GR4, µmol NADPH9/min/mg of plasma proteins 0.45 ± 0.10 0.46 ± 0.09 GPx5, µmol NADPH9/min/mg of plasma proteins 0.79 ± 0.22 0.76 ± 0.27 TGSH6, pmol/mg of plasma proteins 3.44 ± 0.88 3.42 ± 0.86

Liver

MDA1, nmol/mg of cytosolic proteins 62.6 ± 23.6 52.4 ± 7.6 MDA1, mmol/mg of microsomal proteins 6.34 ± 1.42 6.80 ± 0.42 SOD2, U/min/mg of cytosolic proteins 14.4 ± 3.4 12.3 ± 2.2 CAT3, µg CH2O

8/min/mg of cytosolic proteins 506 ± 30 472 ± 32 GR4, µmol NADPH9/min/mg of cytosolic proteins 19.5 ± 4.1 21.4 ± 2.6 GPx5, µmol NADPH9/min/mg of cytosolic proteins 101 ± 8 108 ± 9 TGSH6, µmol/mg of cytosolic proteins 20.2 ± 11.2 17.5 ± 6.7 GSSG7, µmol/mg of cytosolic proteins 1.29 ± 0.71 1.40 ± 1.14

Kidneys

MDA1, nmol/mg of cytosolic proteins 76.8 ± 32.4 77.4 ± 29.8 MDA1, mmol/mg of microsomal proteins 13.4 ± 4.22 8.52 ± 1.78 SOD2, U/min/mg of cytosolic proteins 11.74 ± 2.56 14.36 ± 2.30* CAT3, µg CH2O

8/min/mg of cytosolic proteins 67.3 ± 7.4 85.3 ± 15.0* GR4, µmol NADPH9/min/mg of cytosolic proteins 75.5 ± 13.1 84.6 ± 22.9 GPx5, µmol NADPH9/min/mg of cytosolic proteins 250 ± 36 270 ± 42 TGSH6, µmol/mg of cytosolic proteins 0.66 ± 0.14 0.78 ± 0.12 GSSG7, µmol/mg of cytosolic proteins 0.03 ± 0.02 0.04 ± 0.03

1MDA = malondialdehyde. 2SOD = superoxide dismutase. 3CAT = catalase. 4GR = glutathione reductase. 5GPx =glutathione peroxidase. 6TGSH = total glutathione. 7GSSG = oxidized glutathione. 8CH2O = formaldehyde. 9NADPH = nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. *Significant difference between groups (Student, P < 0.05). Values are expressed as mean ± SD, n = 8.

99

TABLE 4. Effects of 28 days of feeding ewes endophyte-free (SE-) or endophyte-infected

(SE+) ryegrass on hepatic and renal drug metabolizing enzymes.

Day 28

SE- SE+

Liver, g 1246 ± 349 1015 ± 388 O-dealkylation1

Ethoxyresorufin 4.28 ± 1.92 4.24 ± 1.54 Methoxyresorufin 1.82 ± 0.28 2.50 ± 0.44* Pentoxyresorufin 1.54 ± 0.42 1.52 ± 0.18

N-demethylation2

Aminopyrine 112 ± 27 97 ± 25 Benzphetamine 101 ± 28 111 ± 18 Dimethylnitrosamine 25.2 ± 4.1 23.9 ± 5.7 Erythromycin 21.4 ± 8.2 18.3 ± 6.7 Ethylmorphine 54.9 ± 11.0 48.4 ± 7.6

Glutathione S-transferase

CDNB3 1.02 ± 0.22 0.86 ± 0.14 DCNB4 1.30 ± 0.28 1.16 ± 0.26

UDPGT5

PNP6 1.22 ± 0.20 1.16 ± 0.20 Kidneys, g 199 ± 41 204 ± 25

O-dealkylation1

Ethoxyresorufin 1.70 ± 0.24 1.34 ± 0.46 Methoxyresorufin 2.90 ± 0.86 1.74 ± 0.30* Pentoxyresorufin 0.40 ± 0.28 0.50 ± 0.20

Glutathione S-transferase

CDNB3 0.24 ± 0.02 0.26 ± 0.04 DCNB4 0.30 ± 0.12 0.12 ± 0.04*

UDPGT5

PNP6 0.20 ± 0.08 0.41 ± 0.06*

1In pmol resorufin formed/min/mg of microsomal proteins. 2In ng formaldehyde formed/min/mg of microsomal proteins. 3CDNB = in mmoles of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene conjugated/min/mg of cytosolic proteins. 4DCNB = in µmoles of 1,2-dichloro-4-nitrobenzene conjugated/min/mg of cytosolic proteins. 5UDPGT = Uridine diphosphate-glucuronosyltransferase. 6PNP = in µmoles of paranitrophenol conjugated/min/mg of microsomal proteins. *Significant difference between groups (Student, P < 0.05). Values are expressed as mean ± SD, n = 8.

100

TABLE 5. Lolitrem B and ergovaline concentrations in tissues and milk in ewes fed with

endophyte-infected ryegrass after 28 days of exposure.

Ergovaline

Lolitrem B Extraction1, % 99 - 91

97 - 81

Limit of detection2 0.15

0.15

Mean ± SD2 positive/total

Mean ± SD2 positive/total

Milk 0.16 ± 0.02 4/8

0.30 ± 0.12 2/8 Liver 0.55 ± 0.22 8/8

0.43 ± 0.33 4/8

Kidneys 0.44 ± 0.08 8/8

0.28 ± 0.27 2/8 Muscle < LD 0/8

0.50 ± 0.24 8/8

Fat 0.34 ± 0.39 2/8

2.39 ± 1.67 8/8 Brain < LD 0/8

< LD 0/8

1For milk and tissues, respectively. 2In µg/L or µg/kg for milk and tissues, respectively.

101

Figure Captions

Figure 1. Effect of consuming endophyte-free (SE-) or endophyte-infected (SE+)

ryegrass on temperatures (A) and thermocirculation index (B) in ewes. Rectal (■), ear (●) and

air temperatures (▲).†Significant difference from day 0 (Mann-Whitney, P < 0.05). Values

are expressed as mean ± SE, n = 8.

Figure 2. Plasma prolactin (A) and cortisol (B) concentrations in ewes fed endophyte-

free (SE-) or endophyte-infected (SE+) ryegrass. †Significant difference from day 0,

*Significant difference between groups on the same day (Mann-Whitney, P < 0.05). Values

are expressed as mean ± SE, n = 8.

102

Figure 1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 7 14 21 28

Te

mp

era

ture

, °C

Time, days

- - - SE- SE+ A

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 7 14 21 28

TC

I

Time, days

B- - - SE- SE+

†

†

† †

†

†

† † †

†

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

103

Figure 2

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 7 14 21 28

Pro

lact

ine

, ng/

mL

Time, days

SE- SE+ A

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 7 14 21 28

Co

rtis

ol,

ng/m

L

Time, days

SE- SE+

*

B

†

†*

†* †* †*

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

104

Chapitre 4 : présentation de l’article 4

Parmi les alcaloïdes produits par les Epichloë au cours de leur développement

symbiotique dans les fourrages, l’ergovaline (EV) est sans doute la plus toxique (Tor-Agbidye

et al., 2001). Parmi les effets observés avant l’apparition de troubles cliniques graves

(nécroses) ou de pertes économiques importantes, une baisse de la prolactinémie (PRL)

semble la plus souvent rapportée. Cette diminution est quasi-systématique lors de la

consommation de la fétuque endophytée (FE+) (Article 1, tableaux 2, 3 et 4, pages 20 et 22),

mais plus variable lors de la consommation de ray-grass endophyté (RG+) (Article 3, figure

2, page 103). Toutefois, étant donné que la PRL varie avec l’espèce, l’âge, le sexe et le stade

physiologique, son utilisation comme bio-marqueur est difficile. Cette étude porte sur

l’utilisation de la PRL comme marqueur d’exposition à l’EV. Ce paramètre a été mesuré chez

des brebis à des stades physiologiques différents (croissance vs laitières), dans des conditions

expérimentales différentes (bergerie et pâturage) dans le but de mesurer les effets de FE+ et

de RG+.

La première expérimentation, a été réalisée sur « le domaine du merle » à Salon de

Provence. Cinquante-quatre brebis Mérinos d’Arles nullipares en croissance ont été réparties

sur des pâtures semées en automne 2011 de FE et RG productrices (+) ou non (-) d’EV

pendant 23 jours. Le détail des pâtures et la répartition des animaux sont présentés dans la

pages 109 et 110 (Article 4). La seconde expérimentation a été réalisée sur le domaine du

lycée agricole de Saint-Affrique en Aveyron. En septembre 2009, quatre parcelles de FE et

RG productrices (+) ou non (-) d’EV ont été semées en Aveyron. Vingt brebis laitières

multipares de race Lacaune ont été réparties en quatre lots homogènes, affouragées en vert ad

libitium pendant 70 jours en bergerie. Dans les deux expériences, des prélèvements sanguins

ont été effectués à la jugulaire pour mesure de la PRL, ainsi que des prélèvements d’herbe en

vue de mesurer des teneurs en toxines.

Les concentrations en EV et LB dans l’herbe ont été déterminées par HPLC avec un

détecteur de fluorescence. Pour l’EV, ses données de validation sont décrites dans la

présentation de l’article 2 (page 37) et pour le LB dans la présentation de l’article 3 (page

72). La PRL a été déterminée par dosage radio-immunologique. La sensibilité de cette

méthode était de 2,5 ng/ml avec un coefficient de variation inter- et intra-dosage de 7-12% et

10-14%, respectivement.

105

Dans la première étude (brebis en croissance), la teneur en alcaloïdes est restée quasi-

constante dans les deux fourrages. Dans la FE+, la teneur en EV était de 48 µg/kg MS. Dans

le RG+, les concentrations en EV et LB étaient respectivement 95 et 1038 µg/kg MS. Dans la

seconde étude (brebis en lactation), les teneurs en alcaloïdes ont augmenté avec le temps, puis

diminués du fait de la distribution des repousses. Le pic de concentration a été observé à 56

jours d’exposition. Dans la FE+, la teneur en EV a varié de 47 à 286 µg/kg MS. Dans le RG+,

les concentrations en EV et LB ont respectivement varié de 17 à 442 et de 124 à 1381µg/kg.

Aucun signe de toxicité n'a été observé chez les brebis affouragées en FE+ et RG+

pendant les 23 ou 70 jours d’exposition. La répartition de la prolactinémie chez les brebis en

croissance ou en lactation est présentée par classes de concentrations dans la figure 1 et 2

respectivement (Article 4, pages 125 et 126). Chez les brebis en croissance, la PRL varie de

22 à 370 ng/ml avec une moyenne arithmétique et une médiane de 96 et 80 respectivement.

Deux classes de populations ont été identifiées. La première représente 91% de la population

avec des valeurs < 200 ng/ml et la deuxième représente 9% avec des valeurs en PRL > 200

ng/ml. Chez les brebis en lactation, la PRL varie de 56 à 479 ng/ml avec une moyenne

arithmétique et une médiane de 167 et 141 respectivement. Deux populations différentes ont

été également identifiées. La première représente 90% de la population avec des valeurs en

PRL < 280 ng/ml et l’autre 10% avec des valeurs > 280 ng/ml. Ces résultats montrent que

la distribution de la PRL chez les brebis de différents âges et stades physiologiques ne

suit pas une répartition normale. Dans les deux cas, 10% des échantillons dépassent les

valeurs de la population totale. Ces résultats sont en accord avec des données

bibliographiques réalisées chez l’enfant et la femme adulte (Wiedemann et al., 2009 ;

Batrinos, 2009). De plus, les valeurs en PRL obtenues chez les brebis en lactation sont plus

élevées que celles observées sur les brebis en croissance (respectivement 174 et 176% des

valeurs de la médiane et de la moyenne). Ces résultats sont en accord avec ce qui est connu

sur la sécrétion de prolactine qui augmente pendant la lactation (Convey, 1974).

Les conséquences de la consommation d’un fourrage endophyté sur la PRL chez les

brebis en croissance ou en lactation sont respectivement présentées dans les tableaux 1 et 2

(Article 4, pages 122 et 123). La comparaison individuelle des moyennes entre groupe a été

réalisée à chaque échéance et avec la population contrôle à j0. Chez les brebis en croissance,

les principaux résultats révèlent que la consommation de FE+ entraîne une diminution

significative de 39 et 57% de la PRL après 7 et 14 jours d’exposition. En revanche, chez les

brebis consommant du RG+ aucune diminution n’a été observée bien que les teneurs en EV

soient deux fois plus élevées. Chez les brebis en lactation consommant FE+, la comparaison

106

entre groupes révèle une diminution significative de 64 et 49% à j56 et j70. Chez les brebis

consommant du RG+, aucune diminution n’a été observée, alors que là encore les teneurs en

EV étaient supérieures. Ces résultats montrent que les jeunes animaux sont plus sensibles

à la diminution de la PRL que les brebis en lactation, et que les niveaux d’EV

nécessaires pour diminuer ce paramètre lorsque la toxine est présente dans le SE+ sont

supérieurs à ceux nécessaires avec la FE+.

Des diminutions de 75-94% de la PRL ont été rapportées chez des brebis en croissance

consommant FE+ contenant des teneurs en EV de 610 à 960 µg/kg (Emile et al., 2000 ;

Gadberry et al., 2003 ; De Lorme et al., 2007). Nos résultats montrent qu’une

concentration d'EV de 50 µk/kg MS dans la FE+ est suffisante pour diminuer la PRL

chez les brebis en croissance. Chez les brebis en lactation, la diminution de la PRL a déjà été

observée pour des doses de 460 à 750 µg EV/kg d’aliment (Article 2 ; Looper et al.,

2006 ; Tor-Agbidye et al., 2001). Nos résultats montrent qu’une dose d’exposition en EV

de 286 µg/kg MS entraine une chute de la PRL. En revanche une dose de 103 µg EV/kg

MS n’a aucun effet.

Concernant le RG, les effets sur la prolactinémie sont moins décrits et parfois sont

contradictoires (Bluett et al., 2003 ; Fletcher et al., 1997). Cependant, il a été observé que

l’EV a moins d'effet sur la PRL quand elle est présente dans le RG+ que FE+ (Article 2 et 3 ;

Gadberry et al., 2003). Nos résultats, confirment ces observations et suggèrent que la dose

seuil d’EV capable de diminuer la PRL n’a pas été atteinte dans cette étude.

La différence d’effets entre FE+ et RG+ sur la prolactinémie soulève plusieurs

hypothèses. La première, fait intervenir un effet additif d’autres alcaloïdes ergotiques

(ercocornine, ergocristine, ergocryptine, ergonovine et ergotamine) qui seraient présents dans

la FE+ et pas le RG+ (Flückiger, 1978 ; Shin, 1979 ; Mann et al., 1980 ; Browning, 2000 ;

Janssen et al., 2000). Dans cette étude, la mesure de l'ergotamine, ergocryptine, ergocornine,

ergosine, ergométrine, ergocristine, et de leurs formes « imine », n'a pas révélé la présence de

ces composés ni dans la FE+ ni dans le RG+. Une autre hypothèse pourrait faire intervenir

l’effet d’intermédiaires de synthèse de l’EV sur la PRL (Fleetwood et al., 2007 ; Schardl et

al., 2012). Une dernière hypothèse, en lien avec les résultats présentés dans les articles 2 et 3,

implique une intervention de métabolites sous l’action des enzymes de biotransformation. La

quantité de métabolites produits, voire leur nature, pourrait différer chez les animaux exposés

au FE+ et RG+. En effet, nous avons montré des effets différents de ces aliments sur les

107

activités enzymatiques de biotransformation, et il est établi que certains de ces enzymes

participent au métabolisme des ergopeptines.

Pour conclure, la détermination de la PRL chez les brebis de différents âges et stades

physiologiques ne suit pas une répartition normale. Les effets de l’EV sur la PRL varient en

fonction de l'âge et/ou du stade physiologique de l’animal, les brebis en croissance étant plus

sensibles que les brebis en lactation. Enfin, la comparaison des effets observés lors de la

distribution de FE+ et de RG+ révèle que la teneur en EV nécessaire pour entrainer une chute

de la PRL est plus élevée dans le RG+ que le FE+, mais reste inférieure au seuil toxique.

L’origine des différences entre FE+ et RG+ reste à déterminer.

Article 4

Prolactin in growing and lactating ewes: use as biomarker to

endophyte infected tall fescue and perennial ryegrass

N. Zbib*, C. Repussard*, D. Tardieu*, V. Thénard† and P. Guerre*

*Université de Toulouse, INP, ENVT, UR Mycotoxicologie, F-31076 Toulouse, France

† Centre de recherche INRA, UMR 1248 AGIR, F-31326 Castanet-Tolosan, France

Running title: Prolactin as biomarker to endophyte in sheep

Keywords:

biomarker, endophye, ewes, ryegrass, physiological stage, prolactin, tall fescue

Article en cours de soumission dans : Journal of Toxins

109

INTRODUCTION

The symbiotic association between different varieties of fungi of the genus Epichloë

(formerly known as Neotyphodium, [1]) and forage species leads to the production of

alkaloids that are responsible for toxicosis and cause economic losses in livestock [2,3]. E.

coenophiala in tall fescue (Lolium arundinaceum) produces ergopeptine alkaloids of which

ergovaline (EV) is the most abundant, whereas E. festucae var. lolii in perennial ryegrass

(Lolium perenne) produces EV and indole-diterpene alkaloids of which Lolitrem B (LB) is

the most abundant [4]. Consumption of endophyte-infected tall fescue (FE+) is recognized as

responsible for fescue foot, summer syndrome, and economic loss in livestock, with a toxic

threshold of 300-500 µg EV/kg DM [5,6]. Consumption of endophyte-infected perennial

ryegrass (RG+) is recognized as responsible for staggers and economic loss in livestock, with

a toxic threshold of 1,800-2,000 µg LB/kg DM [5,6]. Effects of EV in RG+ are less well

documented, but economic losses have been reported [3,7]. Among the effects observed

before signs of toxicity, a decrease in PRL is common during FE+ exposure in all animal

species investigated so far [8]. This decrease was less pronounced when SE+ was used in

feed, even when high levels of EV were present [9]. Unfortunately, because PRL varies with

species, age, sex and physiological stage it is difficult to use it as biomarker [10,11].

The purpose of this study was to define common values of prolactin in ewes at two different

physiological stages, and to measure the effects of endophyte infected tall fescue and

perennial ryegrass on this variable at levels of alkaloids that are not toxic.

MATERIALS AND METHODS

All experimental procedures involving animals were in accordance with the French National

Guidelines for the care and use of animals for research purposes.

Experiment in nulliparous growing ewes

Studies were conducted at the domain of “Le Merle” (13300 Salon de Provence, France) for

23 days from May to June 2011, using culled growing nulliparous Merinos d’Arles ewes.

Fifty-four ewes were randomly assigned to four experimental groups, two of which grazed

endophyte-infected tall fescue producing EV (here after referred to as FE+) or endophyte

infected perennial ryegrass producing EV (here after referred to as SE+) compared to two

groups of controls grazing the two types of grass that did not contain EV. All the pastures

were sown in autumn 2010 with seeds obtained from RAGT (12000 Rodez, France). The FE+

110

group contained 15 animals grazing on three 0.3 ha mini plots, sown with seeds of the

Kentucky 31 high endophyte (94%) variety. The SE+ group contained 15 animals, grazing on

three 0.3 ha mini plots, sown with seeds of the Samson high endophyte (70%) variety. The

fescue control group comprised 12 ewes grazing in four 0.1 ha mini paddocks with 3 ewes in

each plot sown with either seeds of Aprilia (n=2 plots) or of Callina (n=2 plots) varieties. The

ryegrass control group comprised 12 ewes grazing on four 0.1 ha mini paddocks with 3 ewes

in each plot sown with either seeds of Graal (n=2 plots) or of S773 (n=2 plots) varieties. Each

paddock in the field was enclosed with non-electric fencing. The animals were brought from

the fields to the stable for individual sampling. Blood samples were collected on days 0, 14

and 23 from each ewe by jugular vein puncture into lithium heparinized tubes (Terumo,

Leuven, Belgium) for PRL analysis. The blood samples were chilled immediately then

centrifuged at 3,000 x g for 10 min to collect plasma, and stored at -80 °C until subsequent

PRL analysis. Grass samples were collected on the same days for alkaloid determination. On

each sampling day, whole plants were cut just above the ground in five different areas

representative of the plot.

Experiment using multiparous lactating ewes

Studies were conducted at the agricultural school "La Cazotte" (12400 Saint-Affrique,

France) on multiparous lactating Lacaune ewes for a period of 70 days, from late April until

early July 2010. Twenty ewes were randomly assigned into four homogeneous experimental

groups. All four groups were fed ad libitum in the stable. One group was fed with endophyte-

infected tall fescue producing EV (FE+). The second group was fed with endophyte-infected

perennial ryegrass producing EV (SE+). One control group was fed with endophyte free tall

fescue, and the second with perennial ryegrass neither of which contained EV (FE- and SE-

respectively). All the pastures were sown in autumn 2009 with seeds obtained from RAGT

(12000 Rodez, France). Fresh grass was cut daily in the field, transported to the stable and

placed in self-service racks to feed the animals. The amount of grass ingested was calculated

by subtracting the quantity refused from the quantity distributed. Weekly, one kilogram of

green samples harvested in the morning were chopped for alkaloid determination. Blood

samples were collected on the same days by jugular vein puncture into lithium heparinized

tubes (Terumo, Leuven, Belgium). Sampling was done in the stable individually in the

morning after milking with the ewes immobilized in head locks. The blood samples were

immediately chilled then centrifuged at 3,000 x g for 10 min to collect plasma, and stored at -

80 °C until PRL analysis.

111

Prolactin concentration in blood plasma

Plasma was assayed for PRL by RIA at the Neuroendocrinology Laboratory (INRA, Nouzilly,

France) following the procedure of Kann [12]. Prolactin concentrations were calculated based

on references samples (3-5) obtained from 97 samples and expressed as ng/ml. Prolactin

values > 300 ng/ml were diluted and measured again. The sensitivity of this method is 2.5

ng/ml with intra- and interassay CVs of 7-12% and 10-14%, respectively.

Alkaloid determination

Ergovaline standard was kindly provided by G.E. Rottinghaus (College of Veterinary

Medicine, University of Missouri). Lolitrem B standard was purchased from AgResearch

Limited Ruakura Research Centre (Hamilton, New Zealand). All reagents and chemicals were

purchased from Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA) and were of HPLC grade. Grass

samples were dried for 24 h at 60 °C and ground to 0.5 mm in a mill (Cyclotech 1093, Foss,

Hogande, Sweden). The concentration of ergovaline was determined by HPLC after

purification on homemade ergosil columns according to the method of Rottinghaus et al.,

[13]. Lolitrem B was determined by HPLC after extraction with dichloromethane and

purification on homemade ergosil columns according to the method of Gallagher et al. [14]

with minor modifications [15]. Other ergot alkaloids, ergotamine, ergotaminine, ergocryptine,

ergocryptinine, ergocornine, ergocorninine, ergosine, ergosinine, ergometrine, ergometrinine,

ergocristine, ergocristinine, were determined by HPLC-MS (Qualtech SA laboratory, 54503

Vandoeuvre, France) and were below the limit of detection (3 µg/kg).

Data analysis

Data in tables are reported as means ± SD. Statistical analyses were performed using R

software (2.11.1, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). PRL data in table

1 and 2 were compared using the Mann-Whitney test after verification of normality (Shapiro)

and equality of variance (Fisher). Significantly differences (P < 5%) between groups at the

same time are identified in table by a superscript “*”. Significantly differences (P < 5%)

between PRL data in the experimental groups fed EV and PRL data obtained on day 0 are

identified by a superscript “†”.

RESULTS

Prolactin values in growing nulliparous ewes

112

The concentration of plasma prolactin in 54 nulliparous ewes categorized by class is shown in

figure 1. PRL concentrations ranged from 22 to 370 ng/ml; the arithmetic mean and median

were 96 and 80 ng/ml, respectively. Analysis of the distribution of PRL in growing ewes

revealed that it failed the normality test (Shapiro, P < 0.0001). Two categories of populations

were identified according to the range of classes. The first category, in which the PRL was

lower than 200 ng/ml, represented 91% of the entire population. The distribution of PRL in

this population passed the normality test and was modeled by a curve (Figure 1). The second

category comprised 9% of samples with PRL values higher than 200 ng/ml. The reference

interval 95% of PRL in the entire population was 35-235 ng/ml whereas the reference interval

95% in the population in which PRL values higher than 200 were excluded was 34-141 ng/ml.

The arithmetic mean and SD differed considerably, whereas less variation was observed in the

geometric means and the medians measured in the entire population, and in the population

with no PRL values higher than 200 ng/ml were nearly the same.

Effects of grazing endophyte-infected grasses in growing nulliparous ewes

Fifty four growing nulliparous growing ewes were randomly distributed into different

experimental groups which grazed tall fescue or perennial ryegrass as described in methods.

No mortality and no sign of toxicity were observed during this study. The mean EV level was

48 µg/kg DM in the FE+ grass, and it remained nearly constant over the study period. Mean

EV and LB levels also remained nearly constant in the SE+ grass over the study period, and

were 95 and 1,038 µg/kg DM, respectively.

The consequences of grazing endophyte-infected grasses on PRL are shown in table 1.

Intergroup comparison was performed on each measurement day (P < 0.05, superscript “*”)

and with the control population at day 0 (P < 0.05, superscript “†”). PRL decreased in

growing ewes grazing FE+ containing 48 µg EV/kg over a period of two or three weeks,

whereas it remained constant in the control group. By contrast, no significant difference

between groups was observed in growing ewes grazing SE+ containing 95 µg EV/kg

whatever the day of analysis.

Over the study period, the PRL in 10% of the samples (5 out of 48) taken from ewes not

exposed to EV was below the lowest value of the reference interval (95% of PRL) calculated

when PRL values > 200 were excluded (34 ng/ml). By contrast, in ewes fed FE+ containing

48 µg EV/kg DM and ewes fed SE+ containing 95 µg EV/kg DM, respectively 34% and 17%

of samples were below this value. Regarding the number of samples above the top value of

113

the reference interval 95% (141 ng/ml) calculated when PRL values higher than 200 were

excluded, 21% of samples taken from ewes not exposed to EV were higher, whereas only 3%

and 8% were higher in ewes fed FE+ and SE+ grasses, respectively.

Prolactin values in multiparous lactating ewes

Plasma prolactin concentrations categorized by class in lactating ewes in the second month of

lactation (n=20) are shown in figure 2. At this physiological stage, PRL ranged from 56 to

479 ng/ml. The arithmetic mean and the median value were 167 and 141 ng/ml, respectively.

The variable failed the normality test (Shapiro, P = 10-5). In 10% of the population, PRL was

higher than 280 ng/ml. PRL values ranging from 56-280 ng/ml accounted for 90% of the

entire population; these values passed the normality test and were modeled by a curve. The

reference interval (95%) in the entire population was 65-427 ng/ml, whereas in the population

in which PRL values higher than 280 were excluded, it was 64-226 ng/ml. The geometric

means measured in the entire population and the population with no PRL values higher than

200 were 146 and 130 ng/ml, respectively. Geometric means were near the median measured

in the entire population and in the population with no PRL values higher than 280, whereas

arithmetic means were farthest from the median.

Effects of grazing endophyte-infected grasses on multiparous lactating ewes

Twenty ewes randomly assigned into four experimental groups were fed in the stable with

fresh grass collected daily in the fields of tall fescue and of perennial ryegrass as described in

methods. No mortality and no sign of toxicity were observed during the study period. From

day 14 to day 56 of the experiment, the mean EV level ranged from 47-286 µg/kg DM in the

group fed FE+ grass. On day 70, the EV level was 27 µg/kg DM. In the group fed SE+ grass,

from day 14 to day 56, the mean EV ranged from 38 to 442 µg/kg DM, whereas the mean LB

level ranged from 116 to 1,381 µg/kg DM respectively. On day 70, the EV and LB levels

were 17 and 124 µg/kg DM, respectively.

The effect of grazing endophyte infected grasses on PRL are shown in table 2. In ewes fed

FE+ grass, a decrease in PRL was observed on days 56 and 70. This decrease was significant

when intergroup comparison was performed or when the PRL values were compared to the

data measured in lactating ewes in their second month of lactation, before exposure to the

toxin. By contrast, no significant difference was observed in ewes fed SE+ grass. No

significant difference was observed between PRL measured in lactating ewes fed with grasses

that did not contain EV and values measured in the second month of lactation.

114

Over the study period, the PRL in 6% of samples (3 out of 50) taken from ewes not exposed

to EV was below the lowest value of the reference interval 95% of PRL calculated when PRL

values higher than 280 were excluded (64 ng/ml). By contrast, in ewes fed FE+, 32% of the

samples were below this value (100% of samples on day 56), whereas in ewes fed SE+, no

sample was below 64 ng PRL/ml. Regarding the number of samples above the highest value

of the reference interval 95% (226 ng/ml), 10% of samples taken from ewes not exposed to

EV were higher, whereas in ewes fed FE+ and SE+ grasses, respectively 4% and 20% were

higher.

DISCUSSION

Because ergovaline is toxic and because its level in grass varies considerably over time

[6,16,17], the availability of preclinical markers for its exposure is of great importance. These

markers are of particular interest in (young) animals, which are highly sensitivity to the toxin,

but also in animals that are largely exposed to the toxin due to high feed intake (lactating

ewes). It has been demonstrated that EV reduces prolactin through direct action on the

dopaminergic receptors of the pituitary cells due to the structural analogy between them [18–

20]. The decrease in PRL occurs rapidly, as observed in cattle 30 min after an IV dose of EV

[21]. Surprisingly, although EV was present in both FE+ and SE+, a decrease in PRL is

common in animals fed with FE+, whereas conflicting results have been observed in SE+

[6,22]. These differences can be explained by different effects of the toxins and/or the

difficulty involved in establishing a significant effect on PRL. Indeed PRL, varies with many

factors including species, age, sex and physiological stage [10,11], rendering its use as a

biomarker difficult. These difficulties have been underlined in different studies conducted in

steers or dairy cows fed with FE+ or SE+ forage [23,24]. They justify the precise

determination of control values and reference interval of PRL in animals as a function of their

physiological stage.

In this study, PRL measured in ewes of different ages and at different physiological stages

revealed that PRL distribution does not follow a normal pattern. In both cases, around 10% of

samples showed a very high PRL level. This result is in agreement with data in the literature

concerning children and adult women [25,26]. In human, high PRL values are observed in the

presence of different kind of tumors, but also in 5%-10% of patients with no known disease

[26]. The reason for high PRL values in the absence of specific disease is not known. It has

been demonstrated that stress increases PRL, but results were inconsistent [27]. Nevertheless,

because samples with high PRL values deviated by more than two SDs from the group mean,

115

they can be excluded from the normal panel [28]. PRL values in lactating ewes were generally

high compared to growing ewes with 174% and 176% more on median and average values

respectively. These results are consistent with what is known about an increase in PRL

secretion during lactation [29].

Exposing ewes to EV decreased PRL, as already reported in several studies. The interest of

the result presented here is the comparison of effect depending on age and physiological

stage, and the comparison of the level of EV that was required to decrease PRL when the

toxin was present in FE+ or SE+ grass. The decrease in PRL was more pronounced in

growing ewes than in lactating ewes and more pronounced in animals fed with FE+ than in

animals fed with SE+. A more than 50% decrease in PRL has been reported in many animal

species consuming endophyte-infected tall fescue [6]. Decreases of 75-94% in PRL have been

reported in growing ewes fed FE+ containing 610-960 µg EV/kg [22,30,31]. The present

study showed that an EV concentration of nearly 50 µg/kg DM in the grass was sufficient to

cause a decrease in PRL in growing ewes. The effect was observed by conventional statistical

comparison of PRL values in the two experimental groups. Analysis of the number of animals

that had PRL below the lowest value of the reference interval 95 calculated in ewes not

exposed to the toxin also revealed exposure. In lactating ewes, a decrease in PRL was

observed when EV reached 286 µg/kg DM. By contrast, no effect was observed when EV was

103 µg/kg DM or below. A marked decrease in PRL has already been reported in lactating

ewes fed FE+ containing 460-750 µg EV/kg [5,8,32]. The present study is the first to show an

effect at an EV level below 300 µg EV/kg. Interestingly, this effect appears to persist over

time, as it was observed two weeks after maximum exposure, when EV had decreased to 27

µg/kg in regrowth grass. The use of the reference interval 95 also allowed identification of the

decrease in PRL, 100% of the ewes fed with grass containing 286 µg/kg DM showed a PRL

of less than 64 µg/l.

The effects on PRL of feeding SE+ are less well documented, even if high levels of EV have

been measured, the reported data were inconsistent [23,33]. Several hypotheses were cited to

explain these differences. The marked variation in EV content in endophyte infected plants

and the lack of comparative studies in the same conditions may explain some of these

differences [17,34,35]. It has also been observed that EV reduced PRL less when it was

supplied in SE+ hay than when it was supplied in FE+ [8,9,22]. The results obtained in this

study agree with this observation. No decrease in PRL was observed in growing ewes or in

lactating ewes fed with SE+ grass that contained around 2-fold higher levels of EV than the

level that reduced PRL when the toxin was present in FE+. This suggests that the EV

116

threshold dose able to reduce PRL was not reached in this study. A previous study in lactating

ewes fed SE+ showed a decrease of 56% in PRL after seven days of being fed with hay

containing 851 µg EV/kg DM [9]. In growing ewes, the comparison of the number of samples

below and above the lower and the upper limit of the reference interval (95%) calculated in

ewes not exposed to the toxin suggested a small effect of the toxin. Indeed, the number of

samples with PRL below the lower limit was higher in the SE+ group than in the control

group, whereas the number of samples above the upper limit was lower.

The simultaneous determination of PRL in ewes fed SE+ and FE+ grass containing EV

clearly demonstrated that higher EV levels are required to reduce PRL when the toxin is

present in SE+ than in FE+. Other ergopeptine alkaloids than EV, such as ercocornine,

ergocristine, ergocryptine, ergonovine and ergotamine (alphabetic order), are reported to

reduce PRL [36–40]. However conflicting results are reported concerning ergonovine [41]

and EV appears to reduce PRL more efficiently than ergotamine [21]. In the present study, the

measure of ergotamine, ergocryptine, ergocornine, ergosine, ergometrine, ergocristine, and

their imine forms, failed to reveal the presence of this compound either in FE+ or in SE+

grass. However it cannot be excluded that synthesis intermediates of EV that may differ

between FE+ and SE+ or that can accumulate at a different level in FE+ and SE+ contribute

to the decrease in PRL [42,43]. Another hypothesis used to explain differences PRL between

FE+ and SE+ in the effect of EV on PRL involves drug metabolizing enzymes of the liver.

Studies on ergotamine revealed that it is a substrate of P450 belonging to the 3A subfamily

[44–46]. Data obtained in lactating ewes demonstrated that N-demethylation of erythromycin,

which is a substrate of P450, increased in ewes fed FE+ but decreased in ewes fed SE+.

Although complementary studies are required to clarify the mechanism involved, this result

suggests that EV metabolism may differ in FE+ and SE+ exposure, and that these differences

can alter toxicity.

In conclusion, PRL determination in growing and lactating ewes revealed that this variable

does not follow a normal distribution. Reference intervals (95%) that excluded PRL values

which deviated by more than two SDs from the group mean were calculated. Feeding FE+

grass showed that the reference intervals (95%) help reveal exposure and that growing ewes

are more sensitive than lactating ewes to a decrease in PRL. SE+ grass provided in the same

conditions revealed that the EV level required to decrease PRL was around 2-fold higher than

the level required in FE+.

117

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122

Table 1: Effect of endophyte-infected tall fescue or endophyte infected perennial ryegrass on

the concentration of plasma prolactin of growing nulliparous ewes

Day 14 Day 23 Tall Fescue EV (µg/kg) < 5 PRL (µg/l) Mean ± SD 83 ± 39 114 ± 77 PRL n<341 (%) 2/12 (16%) 1/12 (8%) PRL n>1412(%) 1/12 (8%) 4/12 (33%) EV (µg/kg) 48 PRL (µg/l) Mean ± SD 51 ± 22 †* 49 ± 50 †* PRL n<341 (%) 3/15 (20%) 7/15 (47%) PRL n>1412(%) 0/15 (0%) 1/15 (7%) Ryegrass EV (µg/kg) < 5 LB (µg/kg) < 10 PRL (µg/l) Mean ± SD 65 ± 32 137 ± 116 PRL n<341 (%) 2/12 (17%) 0/12 (0%) PRL n>1412(%) 0/12 (0%) 5/12 (42%) EV (µg/kg) 95 LB (µg/kg) 1,005 PRL (µg/l) Mean ± SD 56 ± 25 † 130 ± 107 PRL n<341 (%) 4/15 (27%) 0/9 (0%) PRL n>1412(%) 0/15 (0%) 2/9 (22%)

Values are expressed as mean ± SD. EV = ergovaline; LB = lolitrem B. *Significant difference between groups on the same day (Mann-Whitney, P < 0.05). †Significant difference from the reference population as defined in figure 1. 1Lower limit of reference interval 95%. 2Upper limit of reference interval 95%

123

Table 2: Effect of endophyte-infected tall fescue or endophyte infected perennial ryegrass on

plasma prolactin in lactating ewes.

Day 14 Day 28 Day 42 Day 56 Day 70 Tall Fescue EV (µg/kg) < 5 PRL (µg/l)

Mean ± SD 105 ± 79 89 ± 48 153 ± 73 98 ± 13 134 ± 39 PRL n<641 (%) 1/5(20%) 2/5(40%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) PRL n>2262 (%) 0/5(0%) 1/5(20%) 2/5(40%) 0/5(0%) 0/5(0%) EV (µg/kg) 47 58 103 286 27 PRL (µg/l)

Mean ± SD 187 ± 140 89 ± 29 103 ± 39 35 ± 9 †* 68 ± 16 †* PRL n<641 (%) 0/5(0%) 1/5(20%) 1/5(20%) 5/5(100%) 1/5(20%) PRL n>2262 (%) 1/5(20%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) Ryegrass EV (µg/kg) < 5 LB (µg/kg) < 10 PRL (µg/l)

Mean ± SD 82 ± 26 111 ± 43 137 ± 22 118 ± 44 174 ± 95 PRL n<641 (%) 1/5(20%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) PRL n>2262 (%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) 2/5(40%) EV (µg/kg) 38 52 149 442 17 LB (µg/kg) 116 246 535 1381 124 PRL (µg/l)

Mean ± SD 92 ± 24 208 ± 94 205 ± 87 131 ± 34 159 ± 77 PRL n<641 (%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) 0/5(0%) PRL n>2262 (%) 0/5(0%) 2/5(40%) 2/5(40%) 0/5(0%) 1/5(20%)

Values are expressed as mean ± SD. EV = ergovaline; LB = lolitrem B. *Significant difference between groups on the same day (Mann-Whitney, P < 0.05). †Significant difference from the reference population defined in figure 1. 1Lower limit of reference interval 95%. 2Upper limit of reference interval 95%

124

Figure legends

Figure 1. Concentration of plasma prolactin in 54 growing nulliparous ewes

categorized by class and modeled by a curve. The descriptive parameters calculated for the

entire population and for ewes with a PRL values below 200 ng/ml are listed under the graph.

Figure 2. Concentration of plasma prolactin in 20 multiparous lactating ewes

categorized by class and modeled by a curve. The descriptive parameters calculated for the

entire population and for ewes with a PRL values below 280 ng/ml are listed under the graph.

125

Figure 1

PRL Samples Arithmetic

Mean SD

Geometric Mean

Median Reference Interval

95% All data n = 54 96 60 83 80 [35-235]

Values < 200 n = 49 80 30 74 78 [34-141]

Frequencies (%)

Prolactin (ng/ml)

126

Figure 2

PRL Samples Arithmetic

Mean SD

Geometric Mean

Median Reference Interval

95% All data n = 20 167 102 146 141 [65-427]

Values < 280 n = 18 139 51 130 130 [64-226]

Frequencies (%)

Prolactin (ng/ml)

CONCLUSION GÉNÉRALE

128

Conclusion générale

Des intoxications animales faisant suite à la consommation de fétuque élevée ou de

ray-grass anglais endophytés sont décrites depuis de nombreuses années. La caractérisation

des principales toxines produites, principalement l’ergovaline (EV) et le lolitrème B (LB)

dans le lait et les tissus, a révélé leur présence en l’absence de signe majeur de toxicité chez

les brebis. Bien que les niveaux de contamination soient faibles, ce résultat doit être pris en

considération dans l’évaluation du risque associé à l’exposition aux alcaloïdes chez

l’homme, notamment les alcaloïdes ergotiques.

L’ergovaline, principal alcaloïde présent dans la fétuque endophytée, est le plus

toxique. Ce composé, en se fixant aux récepteurs des amines biogènes (dopamine, sérotonine,

adrénaline), modifie le flux sanguin périphérique (conduisant à une anoxie tissulaire) et

diminue la prolactine (PRL). Le lolitrème B, molécule trémorgène, se fixe sur différents

récepteurs cellulaires et est à l’origine d’une modification de l’excitabilité et provoque des

manifestations cliniques de type tremblements (encadré 5, page 131).

Les travaux réalisés sur brebis en lactation confirment le seuil de toxicité d’EV dans

la fétuque élevée endophytée (500 µg/kg MS) à travers les effets observés sur la

consommation, la circulation périphérique et la prolactinémie, sans conséquence apparente

sur la santé animale. De manière surprenante, ils démontrent aussi clairement que ce seuil de

toxicité est différent lors de consommation de ray-grass anglais endophyté par l’absence

d’effet sur la consommation et la circulation périphérique et à travers un effet modéré sur la

prolactinémie, et ce malgré une teneur plus élevée en EV.

La détermination d’un seuil de toxicité de l’EV dans le ray-grass endophyté

pourrait être une perspective des travaux à venir, mais nous nous sommes surtout

interrogés sur l’origine des effets moins prononcés lors de consommation du ray-grass

endophyté.

Les effets de la consommation de fétuque ou ray-grass endophytés sur les activités

enzymatiques de biotransformation et les paramètres de stress oxydatif mesurés sont

différents selon que l’animal est exposé à la fétuque ou au ray-grass Si ces résultats sont

originaux, puisque c’est la première fois qu’ils sont explorés de manière si approfondie chez

129

des animaux de production, ils ne semblent pas contribuer à la toxicité de l’EV. Peu de

données sont disponibles pour essayer d’expliquer les mécanismes à l’origine de ces

différences. Les études effectuées sur rongeurs ont démontré, lors d’exposition à de fortes

doses d’EV, une modulation de la transcription de gènes codant pour la synthèse de

différentes enzymes de biotransformation de phase 1 et 2. Les mécanismes invoqués pour

expliquer ces effets sont une toxicité cellulaire générale, en partie liée au stress oxydatif et/ou

à la présence de facteurs aggravant (température). Cette hypothèse semble peu vraisemblable

dans nos études puisque aucun dommage cellulaire n’a pu être démontré.

Les modifications des activités enzymatiques de biotransformation observées dans nos

études sur les animaux de production suggèrent des effets différents de l’EV et de

l’association EV+LB. Ce résultat n’a jamais été mis en évidence et soulève de nombreuses

questions, en particulier de savoir quel pourrait être l’impact des enzymes de

biotransformation sur le schéma métabolique d’EV chez l’animal ?

L’hypothèse retenue jusqu’à présent pour expliquer la plus forte toxicité de l’EV

lorsqu’elle est présente dans la fétuque endophytée invoque l’effet additif d’autres alcaloïdes

ergotiques qui potentialiseraient l’effet de l’EV et qui ne seraient pas présents dans le ray-

grass endophyté. Cette hypothèse semble être exclue dans nos études qui ont été réalisées

avec de l’herbe/foin dans lesquels l’absence des autres alcaloïdes ergotiques a été vérifiée.

Par contre, une autre hypothèse pourrait être que le LB serait capable de modifier

chez l’animal le métabolisme de l’EV et ainsi d’en modifier la toxicité. De plus, l’analyse

bibliographique concernant les effets d’autres alcaloïdes du groupe des indoles (rutaecarpine

et limonine) révèle que ces composés ont des effets directs spécifiques sur l’expression et

l’activité de certains enzymes de biotransformation qui vont dans le même sens que ceux que

nous avons observé sur les animaux recevant du RG endophytés. Cette dernière hypothèse est

donc privilégiée pour expliquer les résultats observés dans nos études. Elle est présentée sous

forme schématique dans l’encadré 5 (page 131). Ainsi, la partie non indolique de l’alcaloïde

serait responsable des effets « pharmacologiques » des molécules tandis que sa partie

indolique pourrait être à l’origine d’une modulation de l’expression de différents systèmes de

biotransformation et/ou enzymes impliquées dans la lutte contre le stress oxydatif.

Ceci ouvre la possibilité d’une nouvelle problématique de recherche qui pourrait

être abordée expérimentalement par des techniques de métabolisme in vitro, afin de

130

déterminer le schéma métabolique de l’ergovaline sur fraction cellulaires obtenues à partir

d’animaux exposés aux différents fourrages endophytés ou non.

En ce qui concerne la PRL, elle peut être utilisée comme un bio-marqueur sensible

d'exposition à l’EV même en présence d’un très faible niveau en toxine. Toutefois,

l’utilisation pratique au champ de ce paramètre en tant que bio-marqueur est toutefois délicate

étant donné les nombreux paramètres à l’origine d’une variation de sa concentration dans le

sang.

131

Encadré 5 : Relations structures / activités entre l’ergovaline et le

lolitrème B.

Ergovaline (A)(effet vasomoteur,

hypoprolactinémiant)(+ + +)

Dopamine Sérotonine

Rutaecarpine (B)

GABA Acétylcholine

Lolitrème B (C) Lolitrème E (trémorgène) (non trémorgène)

Enzymes de biotransformation

↘EROD, MROD, PROD↘ diméthylnitrosamineN-déméthylase↗ érythromycine N-déméthylase

↘GSt

↗MROD↗UDPGT↘GSt

↗MROD↘ érythromycine N-déméthylase

↗UDPGT

(A)

(B)

(C)

Stress oxydatif

↘CAT, GR , GPx

↗CAT, SOD, GPx

↗CAT, GPx

(A)

(B)

(C)

SOD : superoxyde dismutase, GPx : glutathion peroxydase, GR : glutathion réductase, CAT : catalase, EROD : éthoxyrésorufine, MROD :méthoxyrésorufine, PROD : pentoxyrésorufine, GSt : glutathionS-transférase, GABA : acide gamma amino-butyrique, UDPGT : UDP-glucuronosyltransférase.

Ergométrine(effet vasomoteur,

hypoprolactinémiant)(+)

132

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154

Auteur : ZBIB Nasrallah

Titre en anglais: Toxicity of endophyte-infected tall fescue and perennial ryegrass on sheep

Directeur de thèse : TARDIEU Didier

Lieu et date de soutenance :

Résumé en Anglais

The symbiotic associations between different varieties of fungi of the Epichloë kind and

forages are responsible for the production of mycotoxins which are responsible of toxicoses in

livestock and economic losses in some countries. The development of E. coenophiala in tall

fescue, which is associated with the production of ergovaline, is responsible for « fescue foot

disease » while the presence of E. festucae var. lolii in ryegrass, which is accompanied by the

production of lolitrem B, is responsible for the « ryegrass staggers ». and the production of

ergovaline, whose the toxic effects associated in the presence of lolitrem B are poorly

documented. My thesis was to explore the effects of the distribution of different toxic forages

of endophyte-infected tall fescue or ryegrass produced in French agricultural conditions on

health and animal production and the mechanisms of action of ergovaline and lolitrem B.

Key words : Epichloë festucae var. lolii , Epichloë coenophiala, Lolium arundinaceum,

Lolium perenne, ergovaline, lolitrème B, fescue foot disease, ryegrass staggers

Discipline administrative : Mycotoxicologie Intitulé et adresse du laboratoire : UR Mycotoxicologie, ENVT, INP Toulouse, 23 chemin

des Capelles, 31076 Toulouse, France

155

Auteur : ZBIB Nasrallah

Titre : Toxicité de la fétuque élevée et du ray-grass anglais endophytés sur ovins

Directeur de thèse : TARDIEU Didier

Lieu et date de soutenance :

Résumé en Français

Les associations symbiotiques entre différentes espèces de champignon du genre Epichloë et

des plantes fourragères sont à l’origine de la production de mycotoxines responsables, dans

certains pays, de toxicoses du bétail et de pertes économiques. Le développement de d’E.

coenophiala dans la fétuque, qui est associé à la production d’ergovaline, est responsable de «

fescue foot disease » alors que la présence d’E. festucae var. lolii dans le ray-grass anglais,

qui est accompagnée d’une production de lolitrem B, est responsable du « ryegrass staggers »

et de la production d’ergovaline, dont les effets toxiques associés à la présence de lolitrème B

sont mal documentés. Mon travail de thèse a consisté à explorer les effets de la distribution de

différents fourrages de fétuque et ray-grass endophytés toxinogènes produits dans des

conditions agricoles françaises, sur la santé et la production animale et les mécanismes

d’action de l’ergovaline et du lolitrème B.

Mots clés : Epichloë festucae var. lolii , Epichloë coenophiala, Lolium arundinaceum, Lolium

perenne, ergovaline, lolitrème B, fescue foot disease, ryegrass staggers

Discipline administrative : Mycotoxicologie Intitulé et adresse du laboratoire : UR Mycotoxicologie, ENVT, INP Toulouse, 23 chemin

des Capelles, 31076 Toulouse, France