33
1 Relaxed cleavage specificity within the RelE toxin family 1 2 Nathalie Goeders 1 , PierreLuc Drèze 1 and Laurence Van Melderen 1 # 3 4 1 Laboratoire de Génétique et Physiologie Bactérienne, IBMM, Faculté des Sciences, 5 Université Libre de Bruxelles (ULB), 12 rue des Professeurs Jeener et Brachet, B: 6041 6 Gosselies, Belgium. 7 8 Running title: Heterogeneous cleavage patterns of RelE toxins 9 10 #Corresponding author: 11 Laurence Van Melderen 12 E‐mail: [email protected] 13 14 Keywords: toxin‐antitoxin system, mRNA interferase, RNA degradation 15 Copyright © 2013, American Society for Microbiology. All Rights Reserved. J. Bacteriol. doi:10.1128/JB.02266-12 JB Accepts, published online ahead of print on 29 March 2013 on May 9, 2019 by guest http://jb.asm.org/ Downloaded from

Downloaded from on April 23, 2019 by guest · {t Brucella abortus áHelicobacter pylori Proteus vulgaris ... usu

Embed Size (px)

Citation preview

  1

Relaxed cleavage specificity within the RelE toxin family 1 

 2 

Nathalie Goeders1, Pierre­Luc Drèze1 and Laurence Van Melderen1# 3 

 4 

1Laboratoire de Génétique et Physiologie Bactérienne, IBMM, Faculté des Sciences, 5 

Université Libre de Bruxelles (ULB), 12 rue des Professeurs Jeener et Brachet, B: 6041 6 

Gosselies, Belgium. 7 

 8 

Running title: Heterogeneous cleavage patterns of RelE toxins 9 

 10 

#Corresponding author: 11 

 Laurence Van Melderen 12 

E‐mail: [email protected] 13 

 14 

Keywords: toxin‐antitoxin system, mRNA interferase, RNA degradation 15 

Copyright © 2013, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.J. Bacteriol. doi:10.1128/JB.02266-12 JB Accepts, published online ahead of print on 29 March 2013

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  2

Abstract 16 

Bacterial  type  II  toxin‐antitoxin systems are widespread  in bacteria. Among  them,  the 17 

RelE  toxin  family  is  one  of  the  most  abundant.  The  RelEK‐12  toxin  of  E.  coli  K‐12 18 

represents the paradigm for this  family and has been extensively studied, both  in vivo 19 

and in vitro. RelEK‐12 is an endoribonuclease that cleaves mRNAs that are translated by 20 

the  ribosome machinery  as  these  transcripts  enter  the  A  site.    Earlier  in  vivo  reports 21 

showed that RelE cleaves preferentially in the 5’‐end coding region of the transcripts, in 22 

a codon‐independent manner.  To investigate whether the molecular activity as well as 23 

the  cleavage pattern are  conserved within  the members of  this  toxin  family, RelE‐like 24 

sequences  were  selected  in  Proteobacteria,  Cyanobacteria,  Actinobacteria  and 25 

Spirochaetes and tested in E. coli.   Our results show that these RelE‐like sequences are 26 

part of toxin‐antitoxin gene pairs and that they inhibit translation in E. coli by cleaving 27 

transcripts that are being translated. Primer extension analyses show that these toxins 28 

exhibit  specific  cleavage  patterns  in  vivo,  both  in  terms  of  frequency  and  location  of 29 

cleavage  sites.   We  did  not  observe  codon‐dependent  cleavage,  but  rather  a  trend  to 30 

cleave upstream purines, and between the second and third position of codons, except 31 

for  the  actinobacterial  toxin.    Our  results  suggest  that  RelE‐like  toxins  might  have 32 

evolved to rapidly and efficiently shut down translation in a large spectrum of bacterial 33 

species,  which  correlates  with  the  observation  that  TA  systems  are  spreading  by 34 

horizontal gene transfer.  35 

 36 

37 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  3

Introduction 38 

Bacteria  thrive  in  ever  changing  environments  and  therefore  have  evolved  regulatory 39 

mechanisms  allowing  rapid  modulation  of  gene  expression  and  thereby  adaptation. 40 

Among these mechanisms, ribonucleases (RNAses) play an important regulatory role by 41 

adjusting  RNA  levels  (for  review,  [1]). Escherichia  coli  encodes more  than  20  RNases 42 

involved in different processes such as RNA quality control, RNA maturation and stress 43 

response  modulation.  In  addition,  E.  coli  encodes  numerous  RNases  that  act  as 44 

bacteriocins  (for  review,  [2]) or belong  to CRISPR systems  (for  review,  [3]) and  toxin‐45 

antitoxin (TA) systems (for review, [4]).  46 

TA systems are classified in different types depending on the nature and mode of action 47 

of  the  antitoxin,  the  toxin  always  being  a  protein.  Type  II  systems  are  generally 48 

composed  of  two  genes  organized  in  an  operon,  the  first  gene  encoding  an  antitoxin 49 

protein and  the second a  toxin.   These systems are abundant  in bacterial genomes.  In 50 

some bacterial species such as Nitrosomonas europaea (Proteobacteria) and Chlorobium 51 

chlorochromatii  (Chlorobi), predicted type II TA systems represent around 2.5% of the 52 

total predicted ORFs of these genomes [5]. Type II systems are associated with mobile 53 

genetic elements  such as plasmids and phages as well as with chromosomes  in which 54 

they may be part of or constitute by themselves genomic islands/islets (for review, [4]) .  55 

It  has  been  proposed  that  they  move  between  genomes  through  horizontal  gene 56 

transfer.    The  question  of  their  biological  roles  remains  debated  although  several 57 

interesting  hypotheses  have  emerged  notably  their  implications  in  programmed  cell 58 

death,  stress  response,  persistence,  stabilization  of  large  genomic  regions  or  mobile 59 

genetic elements (for review, [4, 6]). 60 

Interestingly,  the  vast  majority  of  type  II  toxins  that  have  been  identified  and 61 

characterized  so  far  are  endoribonucleases  (also  denoted  as mRNA  interferases)  (see 62 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  4

notably, [7‐14]. One of the best characterized is the RelEK‐12 toxin of the relBEK­12 system 63 

of  E.  coli  K‐12  [7].  RelEK‐12  is  an  endoribonuclease  cleaving  mRNAs  in  a  translation‐64 

dependent manner. Free RelEK‐12 enters the ribosomal A site and binds to the ribosome 65 

30S  subunit  [15,  16].  Resolution  of  the  three‐dimensional  structure  of  the  RelEK‐12‐66 

ribosome complex showed that subsequent to complex  formation,  the target mRNA in 67 

the A site is re‐orientated so that RelEK‐12 catalyzes cleavage of the transcript [16]. Three 68 

RelEK‐12 residues are essential  for this activity: Y87 which re‐orients and stabilizes the 69 

mRNA to allow the nucleophilic attack, R61 which stabilizes the cleavage transition state 70 

and R81 which acts as a general acid [16]. RelEK‐12 cleaves preferentially in the 5’‐region 71 

of the target mRNA, usually between the second and the third nucleotide of codons or 72 

between  two  codons  [17].  The  RelBK‐12  antitoxin  wraps  around  the  toxin,  thereby 73 

inhibiting  its entry  in  the A site and  leading to structural rearrangements that disrupt 74 

the RelEK‐12 catalytic site [18, 19]. 75 

RelE‐like toxins belong to the widespread type II ParE/RelE super‐family [5, 20]. Type II 76 

toxin  super‐families  are based on  similarities  at  the  level  of  amino acid  sequence and 77 

three‐dimensional structure prediction/determination [5, 21]. Interestingly, this super‐78 

family is composed of two functionally distinct families (although not structurally) that 79 

are  either  endoribonucleases  as mentioned  above  (RelE  family)  or  proteins  inhibiting 80 

DNA‐gyrase  and  DNA  replication  (ParE  family)  [6,  22].  This  suggests  that  these  two 81 

families  share  a  common  ancestor  and  have  functionally  diverged  during  evolution. 82 

Several RelE‐like proteins (such as YoeB [14, 23], MqsR [24], YafQ [25] and YgjN [10]) of 83 

E. coli K‐12 have been characterized both at the activity and structural levels. While they 84 

all share a common fold with RelEK‐12 and most of them cleave mRNAs in a translation‐85 

dependent manner, differences are observed at the cleavage specificity  level. The YoeB 86 

toxin  cleaves  predominantly  between  the  start  and  the  second  codon  [23]  and minor 87 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  5

cleavage sites are observed downstream in the target mRNA, preferentially upstream of 88 

purines [26].  YafQ cleaves preferentially AAA codons [25] while YgjN does not show any 89 

specificity [10]. MqsR has been shown to act in a translation‐independent manner both 90 

in vivo and in vitro with a preference for GC(U/A) codons [10, 24]. Three RelE‐like toxins 91 

from different Proteobacteria (Brucella abortus, Helicobacter pylori and Proteus vulgaris) 92 

were characterized. Toxins from B. abortus and H. pylori were shown to cleave RNAs in a 93 

translation‐independent manner in vitro [27, 28]. For H. pylori RelE‐like, cleavage occurs 94 

preferentially upstream of purines. Finally, a RelE‐like from Proteus vulgaris was shown 95 

to cleave preferentially at AAA sequences in a translation‐dependent manner [29].  96 

To gain further insights into cleavage specificity within the RelE family, we investigated 97 

the mechanism of action of RelE homologues found in distantly related bacterial species. 98 

The  activity  of  6 RelE‐like  sequences  from different  phyla was  tested  in E.  coli.  These 99 

RelE‐like sequences are part of type II TA systems.  They cleave the E. coli lpp and ompA 100 

transcripts in a translation‐dependent manner without showing strong codon specificity 101 

although these toxins tend to cleave upstream of purines and between the second and 102 

third position of codons.   103 

104 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  6

Materials and methods 105 

Strains, Plasmids and Media  106 

See Table S1. 107 

Strains 108 

An E. coli strain deleted for the 10 type II TA systems identified at the time we started 109 

this work was  constructed  to  avoid  any  interference with  the  activity  of  the RelE‐like 110 

toxins  tested  [30,  31].  Note  that  the  toxins  of  these  10  systems  are  all  mRNA 111 

interferases.  MG1655Δ10  strain  was  constructed  starting  from  MG1655Δ5  (ΔmazEF, 112 

ΔrelBE, ΔchpB, ΔdinJ­yafQ, ΔyefM­yoeB) [32] by successive deletions of the yafNO, prlF­113 

yhaV, hicAB, ygjMN and mqsRA loci. Deletions were constructed using the mini‐ lambda 114 

RED system as described  in  [33]. Loci  replacement by antibiotic  resistance genes was 115 

checked  by  PCR  amplification  and  antibiotic  resistance  genes  were  subsequently 116 

removed using the pCP20 thermo‐sensitive plasmid as described in [34]. The ygjMN and 117 

mqsRA deletions were P1 transduced into MG1655Δ8 and MG1655Δ9, respectively as in 118 

MG1655Δ7  recombination did  occur  preferentially  at  the FRT  sites  rather  than  at  the 119 

loci of interest. 120 

The MG1655Δ10 strain was used for all the experiments described in this work except 121 

for the lpp mRNA northern blots. These experiments were performed in a MG1655Δ10 122 

Δlpp::kan  strain  (constructed  by  P1  transduction  of  lpp::kan  in  MG1655Δ10) 123 

transformed with the pSC710 or pSC711 plasmids [35]. 124 

Toxin and antitoxin­expressing plasmids 125 

Toxin and antitoxin genes were amplified by PCR on genomic DNA using the appropriate 126 

primers (see Table S2). Toxin PCR fragments, digested by the XbaI and PstI  restriction 127 

enzymes, were cloned  in  the pBAD33 vector digested by  the same enzymes. Antitoxin 128 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  7

PCR fragments, digested by the EcoRI and PstI restriction enzymes, were cloned into the 129 

pKK223‐3 vector digested by the same enzymes.  130 

Media 131 

Luria‐Bertani medium (LB) and M9 minimal medium (KH2PO4 (22 mM), Na2HPO4 (42 132 

mM), NH4Cl (19 mM), MgSO4 (1 mM), CaCl2 (0.1 mM), NaCl (9 mM), vitamin B1 (1mg ml‐133 

1)) supplemented with casamino acids (0.2%) and carbon sources (glucose 1%, glycerol 134 

1%, arabinose 1%) were used  to grow bacteria. Ampicillin and chloramphenicol were 135 

added at respective final concentration of 100 mg ml‐1 and 20 mg ml‐1. Isopropyl β‐D‐1‐136 

thiogalacto‐pyranoside (IPTG) was used at final concentrations of 0.01 mM or 1mM.   137 

Toxicity and anti­toxicity assays 138 

Colonies  of MG165510  containing  the  pBAD33  vector  or  its  derivatives  carrying  the 139 

toxin  genes  as  well  as  the  pKK223‐3  vector  or  its  derivatives  carrying  the  cognate 140 

antitoxin genes were diluted in 10‐2M MgSO4. Ten l of the serial dilutions were plated 141 

on  M9  minimum  solid  media  containing  the  appropriate  antibiotics  and  inducers. 142 

Colony forming units were observed after overnight incubation of the plates at 37°C. 143 

Northern blots 144 

Overnight  cultures  were  diluted  and  grown  to  an  OD600nm  ~  0.6  in  LB  media  and 145 

expression  of  the  toxins  was  induced  by  addition  of  1%  arabinose.  Total  RNAs  were 146 

extracted at times indicated in the figures with the RNeasy® MinElute® Cleanup Qiagen 147 

kit following manufacturer specifications or using the hot phenol method as described 148 

in [36]. Five g of total RNA extracts were separated on 1% agarose gels and transferred 149 

to a nylon membrane in 20 X SSC buffer. The membrane was hybridized overnight with 150 

the  labeled primers (Ambion® NorthernMax® Kit). Primers were  labeled with 3 l of 151 

[�‐32P]‐ATP (specific activity: 3,000 Ci/mmol). The Promega T4 polynucleotide kinase 152 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  8

was  used  for  primer  phosphorylation.  Labeled  primers  were  purified  by  PAGE  (12% 153 

acrylamide). The experiments were performed at least twice. 154 

Primer extensions 155 

Ten g of total RNA were hybridized with 0.2 pmol of labeled primers for 10 min. Primer 156 

sequences are described  in [17]. The mixture was cooled on  ice. Reverse transcription 157 

was  performed  with  the  Superscript®  III  Reverse  Transcriptase  (Invitrogen). 158 

Sequencing  reactions  were  preformed  using  the  USB  Thermo  Sequenase  Cycle 159 

Sequencing  Kit.  Cleavage  patterns  of  the  lpp,  ompA  and  the  rpsA mRNAs were  tested 160 

before  induction  and  30 min  after  toxin  expression.  The  lpp  transcript  (237  bp)  was 161 

analyzed using one primer  covering 195 nucleotides.  In order  to  cover  the  full‐length 162 

ompA mRNA (1,041 nucleotides), five primers were used, allowing the read of a total of 163 

957 nucleotides with 126 nucleotides  for ompA1, 180 for ompA2, 213 for ompA3 and 164 

ompA4 and 225  for ompA5  [17].   The  rpsA primer  covers  the 5’‐end 188 nucleotides 165 

over the 1,674 nucleotides of the full‐length rpsA.   The experiments were performed at 166 

least twice. 167 

Potential cleavage rate in the original host genomes 168 

For each  toxin,  the prevalence of  the  three codons cleaved most  frequently  in  the lpp 169 

and ompA transcripts were estimated in bacterial genomes based on the codon usage in 170 

each  species 171 

 http://exon.gatech.edu/GeneMark/metagenome/CodonUsageDatabase/.  Considering 172 

that  these  codons  are  cleaved  with  an  efficiency  of  100%,  the  inverse  of  the  sum  of 173 

frequencies estimates the toxin cleavage rate in the different genomes. 174 175 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  9

Results 176 

Detection of RelE­like toxins in bacterial genomes 177 

The ParE/RelE super‐family is one of the most abundant type II toxin super‐families in 178 

bacterial genomes  [5]. Previous studies revealed  that  these  toxins are quite divergent, 179 

although they share or are predicted to adopt a common RelE‐fold [21]. To test whether 180 

toxins  belonging  to  this  super‐family  share  common  molecular  mechanisms  and 181 

cleavage  specificity  despite  protein  sequence  divergence,  six  toxins  detected  on  the 182 

chromosomes  of  distantly  related  bacterial  species were  selected  for  further  analyses 183 

(RelEO157  from  Escherichia  coli  O157:H7  (�‐Proteobacteria),  RelERpa  from 184 

Rhodopseudomonas  palustris  BisB18  (α‐Proteobacteria),  RelESme  from  Sinorhizobium 185 

meliloti  (α‐Proteobacteria),  RelETde  from  Treponema  denticola  (Spirochaetes),  RelEMav 186 

from  Mycobacterium  avium  (Actinobacteria)  and  RelENsp  from  Nostoc  sp. 187 

(Cyanobacteria)) (Table S3).  These putative toxins appear to be part of genomic islands 188 

as indicated by their GC content and their different distribution among isolates from the 189 

same species (data not shown). 190 

Amino  acid  sequence  comparisons  confirmed  that  RelE‐like  sequences  are  quite 191 

divergent,  even  those  originating  from  the  same  or  closely  related  bacterial  species 192 

(Figure 1).  Table 1 shows that the RelE‐like sequences present 24% to 47% of similarity 193 

and 15% to 28% of identity with the canonical RelEK‐12.  Note that RelETde presents 52% 194 

identity  and  66%  similarity  with  the  YoeBK‐12  toxin.  Similarity  between  the  different 195 

RelE‐like sequences is even lower with only a few percent of similarity between RelESme 196 

and RelETde or RelEO157. Despite this very low conservation at the amino acid sequence 197 

level,  predicted  secondary  and  tertiary  structures  indicated  that  these  RelE‐like 198 

sequences share a similar fold with RelEK‐12 toxin (data not shown). 199 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  10

Functional  and  structural data  regarding RelEK‐12  indicate  that  the  active‐site  residues 200 

R61,  R81  and  Y87  are  essential  for  mRNAs  cleavage  as  single  mutations  lead  to  a 201 

decreased activity [16]. Amino acid sequence alignments show that  these residues are 202 

conserved  in  the  eight  RelE‐like  sequences,  although  to  different  extents  (Figure  1). 203 

While R61 is conserved in the 8 sequences, Y87 and R81 are less conserved (5 and 3 out 204 

of  8,  respectively).  The M.  avium  RelEMav  possesses  a  phenylalanine  at  the  position 205 

corresponding to Y87 like the H. pylori HP0894 RelE‐like toxin (F88) and the E. coli YafQ 206 

(F91) [28, 37]. In addition, RelEMav contains part of a HP0894 motif involved in substrate 207 

recognition (E107, L108 and F109) [28]. 208 

To  test  the  toxic  activity  of  the  RelE‐like  sequences,  the  corresponding  genes  were 209 

cloned in the pBAD33 vector under the control of the pBAD promoter.  These constructs 210 

as well as  the pBAD33‐relEK­12 plasmid were  transformed in E. coli MG1655 deleted of 211 

10  type  II  TA  systems  (MG165510,  see  materials  and  methods)  to  avoid  any 212 

interference with the 10 endogenous mRNA interferases encoded by these loci [30, 31].  213 

Transformation  of MG165510 with  the  pBAD33‐yoeBK­12  plasmid was  not  successful 214 

even  in  the  presence  of  glucose  to  repress  expression  from  the  pBAD  promoter most 215 

likely due to the absence of the chromosomal copy of the system ([38].  Figure 2A shows 216 

that ectopic overexpression of the 6 relE‐like genes inhibits E. coli growth. 217 

 218 

RelE toxins are associated with antitoxins belonging to different super­families 219 

The  6  RelE‐like  toxins  are  associated  with  predicted  antitoxins  belonging  to  three 220 

different  super‐families  i.e.  Phd,  HigA  and  RelB  (Fig.  S1,  Table  S3).  The  toxins  of  T. 221 

denticola  and  Nostoc  sp.  are  associated  with  predicted  relBTde  and  phdNsp  genes, 222 

respectively.  These  loci  exhibit  a  canonical  organization  in  which  the  antitoxin  genes 223 

precede  that  of  the  toxins.  In  contrast,  the  four  other  systems  present  a  reverse 224 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  11

organization in which the toxin gene is located upstream of the predicted antitoxin gene. 225 

Toxins  from R. palustris, S. meliloti, M. avium  and E.  coli  O157:H7  are  associated with 226 

predicted HigA antitoxins (Fig. S1, Table S3).  227 

The predicted antitoxin genes were cloned in the pKK223‐3 vector under the control of 228 

the  pTac  promoter.  These  antitoxin‐containing  plasmids  were  transformed  in  the 229 

MG1655Δ10 strain  containing  the  toxin‐expressing plasmids  (Fig. 2A). Except  for  the 230 

relENsp­phdNsp  gene pair, co‐expression of  the predicted antitoxins with  their respective 231 

toxins restores normal growth, showing  that  these gene pairs constitute  functional TA 232 

systems (Fig. 2B). Co‐expression of PhdNsp with RelENsp only partially restores E. coli cell 233 

growth  (data  not  shown).  To  visualize  the  expression  of  this  putative  antitoxin  by 234 

western blot, a N‐terminal FLAG tag was added to PhdNsp and surprisingly, this version 235 

of  the  antitoxin  completely  restored  cell  growth  upon  co‐expression with  relENsp  (Fig. 236 

2B)  while  addition  of  the  FLAG  tag  to  the  C‐terminal  did  not  restore  cell  growth.  237 

Altogether these data indicate that the PhdNsp is indeed an antitoxin and that blocking its 238 

N‐terminus might increase either its translation or its stability.   239 

Translation­dependent mRNA cleavage 240 

It was shown previously that over‐expression of RelESme, RelEMav and RelEO157 leads to a 241 

decrease of the global translation rate in E. coli [5]. As expected, ectopic over‐expression 242 

of  RelERpa,  RelENsp  and  RelETde  toxins  also  inhibits  translation  (Fig.  S2).  A  series  of 243 

northern  blot  experiments  was  then  carried  out  to  test  whether  these  toxins  affect 244 

mRNA stability in a translation‐dependent manner as observed for the canonical RelEK‐245 

12  toxin.  Ectopic  over‐expression  of  the  6  RelE‐like  toxins  leads  to  ompA  degradation 246 

(Fig.  3).  Translation‐dependence  was  tested  using  a  well‐established  mRNA  assay 247 

consisting of a version of the lpp mRNA that is not translated due to the mutation of the 248 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  12

start  codon  in  a  lysine  AAG  codon  [35].  Degradation  of  this mRNA was  tested  in  the 249 

MG1655Δ10 Δlpp::kan strain. While degradation was observed in the case of wild‐type 250 

lpp mRNA,  the mutant  transcript  remained  stable  in  all  cases  indicating  that  the RelE 251 

homologues cleave mRNAs in a translation‐dependent manner (Fig. S3). 252 

Cleavage pattern specificity 253 

Primer extension experiments on the lpp and ompA mRNAs were performed under over‐254 

expression of the different RelE toxins. Interestingly, expression of these toxins leads to 255 

different cleavage patterns, in terms of cleavage specificity as well as frequency (Fig. 4, 256 

5,  S4  and  Table  2).  No  cleavage  is  detected  in  the  5’‐UTR  region  of  the  test  mRNAs, 257 

confirming  that  the  6  RelE  homologues  cleave  mRNAs  in  a  translation‐dependent 258 

manner. The toxins did not show codon specificity although 5 of them preferentially cut 259 

between the second and third position and upstream of a purine.   260 

RelEK‐12 generates 33 cleavages in the lpp mRNA (28 major and 5 minor cleavages) and 261 

35  in  ompA  (18  major  and  17  minor  cleavages)  (Fig.  4,  5,  S4  and  Table  2).  RelEK‐12 262 

cleaves  the  lpp  mRNA  throughout  the  full‐length  sequence  while  the  ompA  mRNA  is 263 

preferentially  cleaved  in  the  5'  region.  Cleavages  occur  preferentially  between  the 264 

second  and  third  nucleotide  (61%)  and  mostly  upstream  of  a  purine  (70%).  Among 265 

these,  74%  occur  upstream  of  a  G.  The  3  codons  most  frequently  cleaved  (CAG, 266 

glutamine; CUG, leucine and GCG, alanine) represent 37% of the sites cleaved by RelEK‐12 267 

(Table 2).  268 

While the cleavage pattern of lpp by RelEO157 is similar to that of RelEK‐12 (i.e. throughout 269 

the mRNA), cleavage pattern of ompA is different (Fig. 4, 5, S4 and Table 2). Only minor 270 

cleavages were detected  in  the 5’‐end of ompA, most  of  them occurring after  the  first 271 

200 first bp (Fig. 4). Fewer cleavage sites were detected as compared to RelEK‐12 (46 vs 272 

68). Nineteen cleavages (15 major) were detected in the lpp mRNA and 27 (24 major) in 273 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  13

ompA.  As  for RelEK‐12,  RelEO157 most  frequently  cleaves  between  the  second  and  third 274 

nucleotide (90%) and mostly upstream of a G (70%). Among these, 70% occur between 275 

a U and a G. The 3 codons most  frequently cleaved (CUG,  leucine; CAG, glutamine and 276 

AUG codon) represent 65% of the total number of sites cleaved by RelEO157 (Table 2).  277 

The RelERpa toxin cleaves the lpp and ompA mRNAs throughout the full‐length sequence 278 

with  respectively  14  (11  major)  and  41  cuts  (30  major)  (Fig.  4,  5,  S4  and  Table  2).  279 

Cleavages  occur  preferentially  between  the  second  and  third  nucleotide  (69%)  and 280 

frequently  upstream  purines  (93%).  The  3  codons  most  frequently  cleaved  (CAG, 281 

glutamine; AAA lysine; CCG, proline) represent 58% of the sites cleaved by RelERpa. Note 282 

that  RelERpa  cleaves  100%  (15/15)  of  CAG  codons  covered  by  the  primer  extension 283 

experiments (Table 2).  284 

For RelESme, a smaller number of cleavage sites were detected both in  lpp (11 cuts and 285 

10 major) and ompA (11 minor cuts) (Fig. 4, 5, S4 and Table 2).  The cleavage pattern of 286 

lpp and ompA by RelESme  is quite different  than that observed with the other RelE‐like 287 

toxins as no cleavage is detected in the 5’‐end of the transcripts (first cleavage in lpp at 288 

position 77 and 68 in ompA) (Fig. 5). Cleavages occur preferentially between the second 289 

and  third  nucleotide  (82%)  and before purines  (82%).  The 3  codons most  frequently 290 

cleaved  (CAG,  glutamine;  AAA,  lysine  and  AUG  codon)  represent  63%  of  the  total 291 

number of cleavage sites (Table 2). 292 

The RelENsp  toxin generates 33 (21 major) and 8 major cleavage sites  in ompA and  lpp 293 

mRNAs, respectively (Fig. 4, 5, S4 and Table 2).  The cleavage patterns of lpp and ompA 294 

are quite similar, the mRNAs being cleaved throughout the full‐length sequences (Fig. 5). 295 

Cleavages occur preferentially between the second and third nucleotide (56%) and the 296 

first  and  second  nucleotide  (33%).  RelENsp  cleaves  preferentially  upstream  of  an  A 297 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  14

(71%).  The  3  codons  most  frequently  cleaved  (GAA,  glutamic  acid;  AAA  lysine;  GCA, 298 

alanine) represent 59% of the total number of sites cleaved by RelENsp (Table 2). 299 

The number of  cleavage  sites  for  the RelETde  toxin was  low as  compared  to  the other 300 

RelE‐like toxins (1 cleavage site  in the  lpp mRNA and 4  in ompA).  In both mRNAs,  the 301 

second AAA codon is cleaved by RelETde. To  investigate whether  the RelETde activity  is 302 

sequence‐ or position‐dependent, we used the rpsA mRNA which encodes an ACU codon 303 

in second position. In this experiment, the YoeBK‐12 toxin was included as it shows a high 304 

degree of similarity with RelETde (52% identity, 66% similarity) (Table 1).  In addition, 305 

YoeBK‐12  was  previously  reported  to  cleave  the  second  codon  of  mRNAs  [26].  Fig.  6 306 

shows that overall similar cleavage patterns and specificities are observed  in  the rpsA 307 

mRNA  for RelEK‐12, RelETde  and YoeBK‐12. As observed  for YoeBK‐12, RelETde  cleaves  the 308 

rpsA  mRNA  at  the  second  codon,  between  the  second  and  the  third  nucleotide 309 

(upstream of  a U). However,  in  contrast  to  the other  test mRNAs,  additional  cleavage 310 

sites were observed further in the rpsA transcript. Cleavages occurred mainly between 311 

the second and third nucleotide (82%) and preferentially upstream of purines (75 %). 312 

Sequence analysis revealed that the regions upstream (~ 12 nucleotides) the cleavage 313 

sites  have  in  common  a G‐A  rich  region presenting  similarities with  the GAAG  Shine‐314 

Dalgarno sequence (Fig. 7A). These regions might play a role in cleavage specificity, for 315 

instance by causing ribosome pausing and/or inducing secondary structures [39]. 316 

Cleavage  by  RelEMav  presents  some  specific  features  (Fig.  4,  5  and  S4). While  the  lpp 317 

mRNA  is  cleaved  regularly  (17  cleavages,  11 major), ompA  is  preferentially  cleaved  in 318 

the 3’‐end region (22 cleavages, 16 major). Only very minor cleavages were observed in 319 

the mRNA  regions  covered by ompA1  and ompA2  primers  (covering  the  5’‐end of  the 320 

ompA  mRNA).  In  addition,  although  preferentially  cleaving  upstream  of  a  G,  RelEMav 321 

cleaves  preferentially  between  codons  (90%)  (Fig.  7B). 322 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  15

Discussion 323 

This  work  highlights  the  general  conservation  of  molecular mechanisms  used  by  the 324 

members of the RelE family of type II toxin.  Although originating from distantly related 325 

bacterial species and sharing low amino sequence similarities, the toxins characterized 326 

in this work are mRNA interferases cleaving RNA in a translation‐dependent manner.  To 327 

determine  cleavage  specificity,  primer  extension  experiments  upon  RelE‐like  toxins 328 

overexpression were performed in a MG1655 strain deleted of the 10 well‐characterized 329 

type II systems. We thought to avoid secondary cleavage sites from endogeneous type II 330 

toxins,  although  we  cannot  rule  out  the  contribution  of  other  or  unknown 331 

endoribonucleases.  Our data show that RelE‐like toxins do not cleave at specific codons, 332 

but rather exhibit a  trend  to cleave upstream of purines, and between the second and 333 

third position of codons, which is similar to the activity of the canonical RelEK‐12 toxin. 334 

Using  the  highly  expressed  ompA  and  lpp  as  mRNA‐test,  we  found  that  these  toxins 335 

appear to preferentially cleave in vivo at codons that are abundant in bacterial genomes.  336 

Note  that  in  vitro  analyses  using  purified  toxins  and  translational  complexes  will  be 337 

needed  to  correlate  translation  rate  and  cleavage  specificity  using  artificial  mRNAs 338 

containing rare codons.  Nevertheless, our data show that RelEK‐12 preferentially cleaves 339 

the  glutamine CAG,  the  leucine CUG  and  the  alanine GCG  codons,  as  described before 340 

(Table 3) [17].   Considering these 3 preferential cleavage sites (representing only 37% 341 

of  the RelEK‐12 mediated cuts) and  their prevalence  in  the E. coli genome (117.3/1000 342 

codons,  Table  3),  and  assuming  that  these  codons  are  efficiently  cleaved,  the  initial 343 

cleavage rate for RelEK‐12 is one cleavage every 9 nucleotides.  This estimation is similar 344 

for  the  other  RelE‐like  toxins  (RelEO157  and  RelENsp  every  10  nucleotides  and  RelERpa 345 

every  14).    Regarding  RelEMav,  target  codons  are  also  well  represented  since  it 346 

preferentially  cleaves  before  codons  starting  with  G  (Fig.  7).    Thus,  the  relaxed 347 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  16

specificity of  these RelE‐like toxins allow them to be quite efficient and quite broad  in 348 

terms  of  substrates.    Interestingly,  we  observed  that  some  codons  are  cleaved  by 349 

different RelE‐like toxins (Table 3).  For instance, the CAG glutamine codon is cleaved by 350 

RelEK‐12, RelEO157, RelERpa and RelESme. The AAA lysine codon is also cleaved by RelERpa, 351 

RelENsp,  RelESme  and  RelETde  (Table  3).    This  codon  is  generally  found  at  the  second 352 

position of highly expressed mRNAs [40].   353 

Altogether,  our  in  vivo  data  suggest  that  these  RelE‐like  toxins  are  active  and  able  to 354 

exert  their  function  (s)  in  a  large  variety  of  bacterial  species.  Considering  that  TA 355 

systems  are  located  on  mobile  genetic  elements  and  that  they  invade  bacterial 356 

chromosomes through horizontal gene transfer and subsequent integration as genomic 357 

islands, it is likely that a relaxed specificity has been selected by evolution. 358 

359 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  17

Acknowledgements 360 

The  authors  are  grateful  to  Kenn  Gerdes  and  the  members  of  his  laboratory  for 361 

providing the pSC710 and pSC711 plasmids and for their help with the primer extension 362 

experiments. N.G.  is  supported by  the National Research Fund, Luxembourg (908853). 363 

This work was supported by the Fonds de la Recherche Scientifique (FRSM‐3.4530.04), 364 

the Fondation Van Buuren and  the Fonds Brachet. We  thank  the scientific  community 365 

for kindly providing us with genomic DNA and bacterial strains.   366 

 367 

   368 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  18

Figure legends 369 

FIGURE 1. Alignment of the RelE‐like sequences with RelEK‐12 and YoeBK‐12 370 

Amino acid sequences were aligned with MAFFT 371 

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/). Residues highlighted in dark green are 372 

conserved in 80% of the sequences, in medium green in 70% and 50% conservation is 373 

shown in light green. Arrows indicate residues important for the catalytic activity of 374 

RelK‐12. * indicates identical amino acids, : and . indicate similar residues. Boxes show 375 

conserved motifs.  The ELF motif in RelEMav is conserved in HP0894 [28]. 376 

 377 

FIGURE 2. The RelE‐like toxins inhibit E. coli growth and constitute TA systems 378 

(1A)  Serial  dilutions  of  the MG1655∆10  containing  the  pBAD33  control  vector  or  its 379 

derivatives with the relE‐like genes were plated on M9 minimal media containing either 380 

glucose (1%) or arabinose (1%) and the appropriate antibiotics.  (1B) Serial dilutions of 381 

the  MG1655∆10  containing  the  pBAD33  and  pKK223‐3  control  vectors  or  their 382 

derivatives with the relE‐like genes and their cognate antitoxin genes were plated on M9 383 

minimal media containing either glucose (1%) or arabinose (1%) and IPTG (1mM), and 384 

the  appropriate  antibiotics.  Note  that  the  pSC101‐lacIq  plasmid  was  co‐transformed 385 

with  the  pKK223‐3‐relBK­12  to  repress  relBK­12  expression  since  it  appears  to  be  toxic 386 

(data not shown).  IPTG was used at a final concentration of 0.01mM to induce antitoxin 387 

expression.  Plates were incubated overnight at 37°C and survival was estimated.   388 

 389 

FIGURE 3.  The RelE‐like toxins induce mRNA cleavage 390 

The MG1655∆10 containing the pBAD33 control vector or its derivatives with the relE‐391 

like genes were grown in LB to an OD600nm ~ 0.6. Toxin expression was then induced by 392 

addition of arabinose (1%). Total RNAs were extracted at 0, 15, 30, 45 and 60 min after 393 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  19

toxin  induction  and  were  used  for  northern  blot  analysis  of  the  ompA  mRNA  using 394 

specific probe as described in Materials and Methods.   395 

 396 

FIGURE 4. RelE‐like toxins expression leads to distinct cleavage patterns on the lpp and 397 

ompA transcripts 398 

Primer extension analysis of the lpp (A) and the ompA transcripts using ompA1 (B) and 399 

ompA5 (C) primers. The MG1655∆10 strain containing the pBAD33 control vector or its 400 

derivatives with the relE‐like genes were grown in LB with the appropriate antibiotic at 401 

37°C to an OD600nm ~ 0.6. Toxin expression was then  induced by addition of arabinose 402 

(1%)  for  30 min.  Total  RNAs  were  extracted  as  described  in  Materials  and Methods. 403 

Major and minor cleavage sites are indicated by filled and open circles, respectively. FL: 404 

full length. 405 

 406 

FIGURE 5. Location and frequency of RelE‐like toxins cleavage sites 407 

A schematic representation to scale of the  lpp (A) and ompA (B) transcripts, with each 408 

grey box representing 100 nucleotides. Small and large bars represent major and minor 409 

cleavage sites, respectively. 410 

 411 

FIGURE  6.  RelEK‐12,  YoeBK‐12  and  RelETde  toxins  expression  leads  to  similar  cleavage 412 

patterns on the rpsA transcripts 413 

Primer extension analysis of the rpsA transcript. The MG1655∆10 strain containing the 414 

pBAD33  control  vector  or  its  derivatives  expressing  the  RelEK‐12,  YoeBK‐12  and RelETde 415 

toxin were  grown  in  LB with  the  appropriate  antibiotic  at  37°C  to  an  OD600nm  ~  0.6. 416 

Toxin  expression  was  then  induced  by  addition  of  arabinose  (1%)  for  30  min.  Total 417 

RNAs were extracted as described in Materials and Methods. Major and minor cleavage 418 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  20

sites are indicated by filled and open circles, respectively.  419 

*: full length transcript from rpsA3 promoter [41]. 420 

 421 

FIGURE  7.  Consensus  sequences  around  the  cleavage  sites  of  the RelETde  and RelEMav 422 

toxins.  (A)  Conserved motif  upstream  the  RelETde  cleavage  site.  The  A/GXXGAAXC/A 423 

motif  is  conserved around 12 nucleotides upstream  the RelETde  cleavage  site  (arrow). 424 

Logo  sequence  were  constructed    using  (weblogo.berkeley.edu/logo.cgi).    (B)  The 425 

RelEMav toxin cleaves preferentially between codons ending and starting with guanines. 426 

The cleavage site is represented by an arrow.   The upstream codon (codon 1) and the 427 

downstream codon (codon 2), as well as the nucleotide position (1, 2, 3 in codon 1 and 428 

4, 5, 6 in codon 2) are indicated.  429 

430 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  21

References 431 

1.  Arraiano CM, Andrade JM, Domingues S, Guinote IB, Malecki M, Matos RG, 432 Moreira RN, Pobre V, Reis FP, Saramago M et al: The critical role of RNA 433 processing and degradation in the control of gene expression. FEMS 434 Microbiol Rev 2010, 34(5):883‐923. 435 

2.  Cascales E, Buchanan SK, Duche D, Kleanthous C, Lloubes R, Postle K, Riley M, 436 Slatin S, Cavard D: Colicin biology. Microbiol Mol Biol Rev 2007, 71(1):158‐229. 437 

3.  Horvath P, Barrangou R: CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and 438 archaea. Science 2010, 327(5962):167‐170. 439 

4.  Hayes F, Van Melderen L: Toxins­antitoxins: diversity, evolution and function. 440 Crit Rev Biochem Mol Biol 2011, 46(5):386‐408. 441 

5.  Leplae R, Geeraerts D, Hallez R, Guglielmini J, Dreze P, Van Melderen L: Diversity 442 of bacterial type II toxin­antitoxin systems: a comprehensive search and 443 functional analysis of novel families. Nucleic Acids Res 2011, 39(13):5513‐444 5525. 445 

6.  Hallez R, Geeraerts D, Sterckx Y, Mine N, Loris R, Van Melderen L: New toxins 446 homologous to ParE belonging to three­component toxin­antitoxin systems 447 in Escherichia coli O157:H7. Mol Microbiol 2010, 76(3):719‐732. 448 

7.  Christensen SK, Mikkelsen M, Pedersen K, Gerdes K: RelE, a global inhibitor of 449 translation, is activated during nutritional stress. Proc Natl Acad Sci U S A 450 2001, 98(25):14328‐14333. 451 

8.  Jorgensen MG, Pandey DP, Jaskolska M, Gerdes K: HicA of Escherichia coli 452 defines a novel family of translation­independent mRNA interferases in 453 bacteria and archaea. J Bacteriol 2009, 191(4):1191‐1199. 454 

9.  Christensen‐Dalsgaard M, Gerdes K: Two higBA loci in the Vibrio cholerae 455 superintegron encode mRNA cleaving enzymes and can stabilize plasmids. 456 Mol Microbiol 2006, 62(2):397‐411. 457 

10.  Christensen‐Dalsgaard M, Jorgensen MG, Gerdes K: Three new RelE­458 homologous mRNA interferases of Escherichia coli differentially induced by 459 environmental stresses. Mol Microbiol 2010, 75(2):333‐348. 460 

11.  Zhang Y, Yamaguchi Y, Inouye M: Characterization of YafO, an Escherichia coli 461 toxin. J Biol Chem 2009, 284(38):25522‐25531. 462 

12.  Zhang Y, Zhang J, Hara H, Kato I, Inouye M: Insights into the mRNA cleavage 463 mechanism by MazF, an mRNA interferase. J Biol Chem 2005, 280(5):3143‐464 3150. 465 

13.  Zhang Y, Zhang J, Hoeflich KP, Ikura M, Qing G, Inouye M: MazF cleaves cellular 466 mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol 467 Cell 2003, 12(4):913‐923. 468 

14.  Grady R, Hayes F: Axe­Txe, a broad­spectrum proteic toxin­antitoxin system 469 specified by a multidrug­resistant, clinical isolate of Enterococcus faecium. 470 Mol Microbiol 2003, 47(5):1419‐1432. 471 

15.  Pedersen K, Zavialov AV, Pavlov MY, Elf J, Gerdes K, Ehrenberg M: The bacterial 472 toxin RelE displays codon­specific cleavage of mRNAs in the ribosomal A 473 site. Cell 2003, 112(1):131‐140. 474 

16.  Neubauer C, Gao YG, Andersen KR, Dunham CM, Kelley AC, Hentschel J, Gerdes K, 475 Ramakrishnan V, Brodersen DE: The structural basis for mRNA recognition 476 and cleavage by the ribosome­dependent endonuclease RelE. Cell 2009, 477 139(6):1084‐1095. 478 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  22

17.  Hurley JM, Cruz JW, Ouyang M, Woychik NA: Bacterial toxin RelE mediates 479 frequent codon­independent mRNA cleavage from the 5' end of coding 480 regions in vivo. J Biol Chem 2011, 286(17):14770‐14778. 481 

18.  Li GY, Zhang Y, Inouye M, Ikura M: Inhibitory mechanism of Escherichia coli 482 RelE­RelB toxin­antitoxin module involves a helix displacement near an 483 mRNA interferase active site. J Biol Chem 2009, 284(21):14628‐14636. 484 

19.  Boggild A, Sofos N, Andersen KR, Feddersen A, Easter AD, Passmore LA, 485 Brodersen DE: The Crystal Structure of the Intact E. coli RelBE Toxin­486 Antitoxin Complex Provides the Structural Basis for Conditional 487 Cooperativity. Structure 2012. 488 

20.  Anantharaman V, Aravind L: New connections in the prokaryotic toxin­489 antitoxin network: relationship with the eukaryotic nonsense­mediated 490 RNA decay system. Genome Biol 2003, 4(12):R81. 491 

21.  Guglielmini J, Van Melderen L: Bacterial toxin­antitoxin systems: Translation 492 inhibitors everywhere. Mob Genet Elements 2011, 1(4):283‐290. 493 

22.  Jiang Y, Pogliano J, Helinski DR, Konieczny I: ParE toxin encoded by the broad­494 host­range plasmid RK2 is an inhibitor of Escherichia coli gyrase. Mol 495 Microbiol 2002, 44(4):971‐979. 496 

23.  Zhang Y, Inouye M: The inhibitory mechanism of protein synthesis by YoeB, 497 an Escherichia coli toxin. J Biol Chem 2009, 284(11):6627‐6638. 498 

24.  Yamaguchi Y, Park JH, Inouye M: MqsR, a crucial regulator for quorum sensing 499 and biofilm formation, is a GCU­specific mRNA interferase in Escherichia 500 coli. J Biol Chem 2009, 284(42):28746‐28753. 501 

25.  Prysak MH, Mozdzierz CJ, Cook AM, Zhu L, Zhang Y, Inouye M, Woychik NA: 502 Bacterial toxin YafQ is an endoribonuclease that associates with the 503 ribosome and blocks translation elongation through sequence­specific and 504 frame­dependent mRNA cleavage. Mol Microbiol 2009, 71(5):1071‐1087. 505 

26.  Kamada K, Hanaoka F: Conformational change in the catalytic site of the 506 ribonuclease YoeB toxin by YefM antitoxin. Mol Cell 2005, 19(4):497‐509. 507 

27.  Heaton BE, Herrou J, Blackwell AE, Wysocki VH, Crosson S: Molecular structure 508 and function of the novel BrnT/BrnA toxin­antitoxin system of Brucella 509 abortus. J Biol Chem 2012, 287(15):12098‐12110. 510 

28.  Han KD, Matsuura A, Ahn HC, Kwon AR, Min YH, Park HJ, Won HS, Park SJ, Kim DY, 511 Lee BJ: Functional identification of toxin­antitoxin molecules from 512 Helicobacter pylori 26695 and structural elucidation of the molecular 513 interactions. J Biol Chem 2011, 286(6):4842‐4853. 514 

29.  Hurley JM, Woychik NA: Bacterial toxin HigB associates with ribosomes and 515 mediates translation­dependent mRNA cleavage at A­rich sites. J Biol Chem 516 2009, 284(28):18605‐18613. 517 

30.  Garcia‐Pino A, Christensen‐Dalsgaard M, Wyns L, Yarmolinsky M, Magnuson RD, 518 Gerdes K, Loris R: Doc of prophage P1 is inhibited by its antitoxin partner 519 Phd through fold complementation. J Biol Chem 2008, 283(45):30821‐30827. 520 

31.  Winther KS, Gerdes K: Ectopic production of VapCs from Enterobacteria 521 inhibits translation and trans­activates YoeB mRNA interferase. Mol 522 Microbiol 2009, 72(4):918‐930. 523 

32.  Tsilibaris V, Maenhaut‐Michel G, Mine N, Van Melderen L: What is the benefit to 524 Escherichia coli of having multiple toxin­antitoxin systems in its genome? J 525 Bacteriol 2007, 189(17):6101‐6108. 526 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  23

33.  Datsenko KA, Wanner BL: One­step inactivation of chromosomal genes in 527 Escherichia coli K­12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 528 97(12):6640‐6645. 529 

34.  Cherepanov PP, Wackernagel W: Gene disruption in Escherichia coli: TcR and 530 KmR cassettes with the option of Flp­catalyzed excision of the antibiotic­531 resistance determinant. Gene 1995, 158(1):9‐14. 532 

35.  Christensen SK, Gerdes K: RelE toxins from bacteria and Archaea cleave 533 mRNAs on translating ribosomes, which are rescued by tmRNA. Mol 534 Microbiol 2003, 48(5):1389‐1400. 535 

36.  Masse E, Escorcia FE, Gottesman S: Coupled degradation of a small regulatory 536 RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev 2003, 17(19):2374‐537 2383. 538 

37.  Armalyte J, Jurenaite M, Beinoraviciute G, Teiserskas J, Suziedeliene E: 539 Characterization of Escherichia coli dinJ­yafQ toxin­antitoxin system using 540 insights from mutagenesis data. J Bacteriol 2012, 194(6):1523‐1532. 541 

38.  Christensen SK, Maenhaut‐Michel G, Mine N, Gottesman S, Gerdes K, Van 542 Melderen L: Overproduction of the Lon protease triggers inhibition of 543 translation in Escherichia coli: involvement of the yefM­yoeB toxin­544 antitoxin system. Mol Microbiol 2004, 51(6):1705‐1717. 545 

39.  Wen JD, Lancaster L, Hodges C, Zeri AC, Yoshimura SH, Noller HF, Bustamante C, 546 Tinoco I: Following translation by single ribosomes one codon at a time. 547 Nature 2008, 452(7187):598‐603. 548 

40.  Brock JE, Paz RL, Cottle P, Janssen GR: Naturally occurring adenines within 549 mRNA coding sequences affect ribosome binding and expression in 550 Escherichia coli. J Bacteriol 2007, 189(2):501‐510. 551 

41.  Lemke JJ, Sanchez‐Vazquez P, Burgos HL, Hedberg G, Ross W, Gourse RL: Direct 552 regulation of Escherichia coli ribosomal protein promoters by the 553 transcription factors ppGpp and DksA. Proc Natl Acad Sci U S A 2011, 554 108(14):5712‐5717. 555 

 556  557 

558 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  24

TABLE 1 Similarity and identity between the RelE‐like toxins and the RelEK‐12 and  559 

YoeBK‐12 canonical toxins  560 

 561   RelEK‐12  RelERpa  RelENsp  RelEMav  RelEO157  RelESme  RelETde  YoeBK‐12 

RelEK‐12   24  28 15 19 16 17  16RelERpa  47   28 14 13 20 20  17RelENsp  43  46  4 18 13 17  21RelEMav  27  24  7 15 13 15  19RelEO157  35  24  32 30 3 4  14RelESme  24  26  23 24 5  5  9RelETde  25  37  28 27 11 4 52YoeBK‐12  30  31  36 29 30 23 66 

 562  563 Amino acid  sequence  identity  (%) and similarity  (%) are  indicated  in grey and white, 564 

respectively,  as  determined  using  the  NEEDLE  alignment  software 565 

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/index.html 566 

567 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  25

TABLE 2 Cleavage sites the RelE‐like toxins in the lpp and ompA transcripts 568 

569  570 

 571 

 572 

 573 

 574 

 575 

 576 

 577 

 578 

 579 

 580 

Number of sites that are cleaved by the toxins in the E. coli lpp and/or ompA transcripts 581 

are indicated.  The sequence of the 3 codons that are the most frequently cleaved in the 582 

lpp and ompA transcripts is indicated as well as the number of cleaved codons over the 583 

total number of these codons in the 2 transcripts, in relative numbers (between 584 

brackets) and in %.  The last column (%) represents the proportion of these 3 cleaved 585 

codons relative to the total number of cuts mediated by the toxins.  In bold, the codons 586 

that are common to different toxins. 587 

 588 

 589 

 590 

 591 

   592 

Toxins 

    

Bacterial species 

Number of cleavage in lpp and ompA 

The 3 most frequently cleaved codons in lpp and ompA 

 lpp 

  

ompA 

 lpp and ompA

 

codon (relative number) 

codon (relative number)

codon (relative number) 

%  

RelEK‐12 E. coli   K‐12 

33  35  68   CAG 

(11/15) 73 

CUG (10/27) 37 

GCG (4/4) 100 

37 

RelEO157 E. coli 

O157:H7 19  27  46   

CUG  (18/27) 67 

CAG  (7/15) 47 

AUG  (5/9) 27 

65 

RelERpa R. 

palustris 14  41  55   

CAG  (15/15) 100 

AAA  (11/18)

61 

CCG  (6/12) 50 

58 

RelENsp Nostoc sp 

8  33  41   AAA  

(11/18) 61 

GCA (7/13) 54 

GAA  (6/8) 75 

59 

RelESme S. 

meliloti 11  11  22   

CAG  (7/15) 47 

AAA  (4/18) 22 

AUG  (3/9) 33 

63 

RelETde T. 

denticola  1  4  5 AAA (2/18) 11 

CCA(1/3) 33 

AAG (1/5) 20 

80 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

 

  26

TABLE 3 Most frequently cleaved codons and their occurrence in bacterial genomes 593 

 594 

The 3 most frequently cleaved codons were determined in the lpp and ompA transcripts 595 

(see table 2).  The occurrence of these codons is indicated in frequency per 1000 codons 596 

(0/00).    The  last  column  indicates  the  sum  of  the  prevalence  of  the  3  most  cleaved 597 

codons.  598 

Toxins Bacterial species 

Most frequently cleaved codons and their occurrence (0/00)1st 2nd 3rd Total 

RelEK‐12 E. coli   K‐12 

CUG 53.8 

GCG 34.3 

CAG 29.2  117.3 

RelEO157 E. coli 

O157:H7 CUG 51.4 

CAG 29.5 

AUG 24.7 

105.6 

RelERpa  R. palustris CCG 37.6 

CAG 26.5 

AAA 7.3 

71.4 

RelENsp  Nostoc sp GAA 46.5 

AAA 34.5 

GCA 22.6 

103.6 

RelESme  S. meliloti AUG 22.2 

CAG 24.9 

AAA 6.7 

53.8 

RelETde  T. denticola AAA 60.6 

AAG 25.6 

CCA 2.7 

89.2 

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from

on May 9, 2019 by guest

http://jb.asm.org/

Dow

nloaded from