DoYouBuzz - Make your resume easily with our …€¦ · Web viewLe but est d’obtenir une répartition aussi uniforme que possible des micro-organismes dans la quantité d’échantillon

LECAILLETEL Laura ANABIOTEC2

MISE EN PLACE DE LA NORME NF.EN.ISO 11133 : juillet 2014

Laboratoire ABIOLAB

60, Allée Saint-Exupéry

38330 Montbonnot-Saint-Martin

Maitre de stage : Natacha Berthoin

Remerciements :

Je souhaite remercier le directeur général du laboratoire, Mr Gautier, de m’avoir accepté dans sa structure. Ainsi que ma maitre de stage, Natacha Berthoin, pour m’avoir prise sous sa responsabilité et aidé pour mon thème d’étude.

Je souhaite remercier aussi les techniciennes de laboratoire, Nadia-Laure et Claire, pour m’avoir formé et aidé dans mon étude.

SOMMAIREIntroduction.......................................................................................................................................1

I. Présentation du laboratoire.......................................................................................................1

II. Thème d’étude...........................................................................................................................1

III. Synthèse bibliographique.......................................................................................................1

IV. Matériels et méthodes mises en œuvre.................................................................................1

1. Revivification et vérification des souches...............................................................................1

2. Préparation de la culture........................................................................................................1

3. Test de performance des milieux de cultures.........................................................................1

V. Résultats des tests et exploitation..............................................................................................1

VI. Conclusion - perspectives.......................................................................................................1

VII. Références bibliographiques..................................................................................................1

Introduction

J’ai effectué un stage de 12 semaines au laboratoire de microbiologie alimentaire Abiolab, à Montbonnot-Saint-Martin, mon thème de stage était basé sur la mise en place de la norme ISO 11133- Préparation, production, stockage et essais de performance des milieux de culture.

I. Présentation du laboratoire

Abiolab est un laboratoire privé d’analyses alimentaires, situé à Montbonnot-Saint-Martin, en Rhône-Alpes, il bénéficie d’un bon emplacement du fait d’être au centre de l’Inovallée, une grande zone industrielle facile d’accès en allant en direction de Chambéry par l’autoroute.

Il travaille avec des entreprises provenant de toute la région. Leur clientèle se compose de restaurateurs, d’artisans, de supermarchés ainsi que d’autres entreprises, des établissements de santé, de tourisme et autres, ceux-ci représentent au total 1600 clients. Leur activité s’étend dans tout le sud-est de la France ainsi qu’en région parisienne.

En plus de faire les analyses, Abiolab accompagne ses clients dans la maitrise sanitaire des produits alimentaires. Il propose des prestations en cohérence avec la réglementation comme des diagnostics hygiène (checklist), ou encore des formations dans la sécurité alimentaire (pour lesquels ils ne sont pas accrédités).

Abiolab a pour ambition de participer au développement économique de la région en devenant acteur majeur dans la sécurité alimentaire, pour cela il cherche à offrir une gamme complète de services, prestations de qualité, durable et constante dont le but est de satisfaire les clients. Le laboratoire a donc pour projet d’ouvrir un service de chimie alimentaire pour compléter celui de microbiologie, leur but étant de proposer la plus large gamme d’analyses alimentaires possibles. Ce nouveau service est encore en cours d’expérimentation même si des méthodes d’analyses ont déjà été mises en place.

Abiolab est en pleine expansion, il a récemment racheté ASPOSAN, le laboratoire régional des eaux. Depuis le 1er décembre, ils forment ABIOGROUP dont il existe une filiale commerciale en Suisse. Ils deviennent donc les spécialistes régionaux de la qualité et de la sécurité des denrées alimentaires ainsi que de la microbiologie environnementale (eau, air, surface). Doté d’un plateau technique de 1800 m2 et d’une équipe pluridisciplinaire de 32 personnes à ce jour, il réalise plus de 25000 analyses microbiologiques et physico-chimiques sur toutes matrices alimentaires par an.

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Ce rapprochement présente des intérêts économiques et permet d’offrir une plus large gamme de services. Il demande aussi un important travail pour harmoniser les systèmes qualités des 2 laboratoires ainsi que le développement du LIMS (système informatique permettant de gérer la traçabilité et la gestion des analyses du devis client jusqu’à l’édition du rapport d’essai).

Le laboratoire est accrédité COFRAC pour une grande quantité des analyses proposées, il est donc régulièrement soumis à des audits dont un audit interne une fois par an organisé par la responsable qualité et qui est validé par la Direction. Cette année, il souhaite une extension pour la méthode de recherche de E.coli O157 :H7. Il doit donc se conformer principalement aux normes NF EN ISO/CEI 17025, NF EN ISO 7218, aux référentiels COFRAC et la réglementation en vigueur. Pour les analyses où il n’a pas le matériel ou ne sait pas faire, il sous-traite à d’autres laboratoires.

Pour la sécurité et maintenir la confidentialité, un registre est placé à l’entrée avec toutes les entrées et sorties de personnes ne travaillant pas au laboratoire, et toute personne entrant dans le laboratoire doit signée une clause de confidentialité.

Pour garantir la qualité de ses services, le laboratoire met un point d’honneur sur la confidentialité et la traçabilité. Tout d’abord la confidentialité pour réaliser les essais en toute indépendance et impartialité. Pour cela, au moment de la réception des échantillons, après enregistrement, les échantillons sont anonymisés en leur attribuant un numéro interne de manière à ce que les techniciens ne sachent pas pour quelle entreprise ils font l’analyse et restent impartiaux. Ensuite la traçabilité, c’est ce qui permet de suivre le produit au cours des différentes étapes de l’analyse pour qu’au cas où il y ait un problème, on puisse trouver son origine. Pour cela, des fiches sont remplies tous les jours d’activités avec le numéro de lot des milieux de culture et diluants utilisés, les numéros des étuves utilisées, l’heure à laquelle ont été réalisées chaque étape et les températures des différentes salles. Tous les documents de traçabilité sont conservés 3 ans.

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Appareil servant à la recherche de E.coli O157 :H7

De la réception à la lecture des résultats

1. La réception

- Arrivée des échantillons récupérés par les préleveurs- Vérification de la température de la glacière, l’intégrité de l’échantillon et la quantité prélevée- Enregistrement du produit : sa description, son numéro interne, les analyses à faire dessus.- Mise en analyse de l’échantillon et impression des bordereaux (étiquettes avec les références

de l’échantillon, la dilution à ensemencer et le milieu à couler, que l’on colle sur les boites de Pétri).

2. Préparation de la suspension mère

Le but est d’obtenir une répartition aussi uniforme que possible des micro-organismes dans la quantité d’échantillon prélevée.

- Pesée de l’aliment (10g ou 25g selon les analyses nécessaires) directement dans le sachet pour stomacher.

- Ajout du diluant par le dilumat pour obtenir une suspension au 1/10.- Homogénéisation dans le stomacher.

3. Dilution et ensemencement

Le but des dilutions est de réduire le nombre de micro-organismes par unité de volume pour permettre, après

ensemencement et incubation, d’effectuer le dénombrement des colonies.

- Dilutions au 1/10 à chaque fois, dans du Tryptone Sel (TS).- Ensemencement en masse (par incorporation) ou en surface.- Incubation des boites pendant une durée et à une température adaptés aux souches qui

pourraient se développer sur le milieu.

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Dilumat

Stomacher

Salle de réception

Poste de dilution / ensemencement

Pour la détection de pathogènes :

- Pré-enrichissement de la suspension initiale- Isolement de la suspension mère sur milieu spécifique- Incubation - Tests de confirmation si présence de colonies sur l’isolement

4. Lecture

- Dénombrement manuel des colonies- Enregistrement de la valeur dans le LIMS (site d’enregistrement des données des échantillons,

qui donne les critères d’acceptation et met en évidence les résultats non satisfaisants) en scannant les bordereaux des boites.

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Salle d’incubation

Page du site LIMS pour l’enregistrement des résultats

Barre où apparait le numéro d’échantillon scanné correspondant à une analyse en particulier

Cadre où apparait la fiche client complète (nom et type d’entreprise, type d’échantillon,…)

Enregistrement des résultats : en noir les résultats acceptables par rapport au critère selon l’analyse, en rouge les résultats dépassant au critère

II. Thème d’étude

Présentation du thème (problématique)

Au cours de mon stage, j’ai travaillé sur la norme ISO 11133 concernant la préparation, la production, le stockage et les essais de performance des milieux de culture ; plus particulièrement sur la partie essais de performance. La norme ISO 11133 remplace les normes ISO 11133-1 et ISO 11133-2 regroupées qui ont fait l’objet d’une révision technique. Elle inclut également la norme ISO 9998 :1991 sur les milieux de culture de microbiologie destinés à l’analyse des eaux, et la remplace donc. Il s’agit surtout d’un regroupement, quelques modifications ont été faites dans les annexes comme des ajouts de milieux à tester, des ajouts ou corrections de critères, des changements de souches à tester, mais au final très peu de changements. Le laboratoire Abiolab, étant accrédité, doit suivre les normes, s’approprier les nouvelles et s’adapter aux éventuelles modifications de certaines comme c’est le cas ici. Ils ont 6 mois à partir de la date de parution, qui normalement aurait dû être en juillet 2014, pour rédiger ou modifier les procédures afin de bien respecter cette norme. Finalement, comme cette norme est passée en commission, la date de parution effective est en janvier 2015, les procédures doivent donc être mises en place d’ici juillet 2015.

Il a fallu tout d’abord remettre à jour la procédure qui avait été mise en place donc rajouter des éléments et en modifier, ainsi que tous les autres documents liés comme le tableau synthétisant les données techniques pour les tests des milieux, la fiche de résultats pour chacun des milieux ou encore la fiche de suivi des souches. Puis préparer les manipulations donc lister le matériel nécessaire et surtout les souches nécessaires. Et enfin on peut commencer à manipuler en régénérant et testant les souches pour enfin pouvoir tester les milieux de culture.

III. Synthèse bibliographique

Milieu de culture : mélange de substances, sous forme liquide, semi-solide ou solide, qui contient des constituants naturels et/ou synthétiques, permettant la croissance des micro-organismes, leur identification ou leur conservation.

Milieu prêt à l’emploi : milieu liquide, solide ou semi solide fourni dans un contenant sous forme de produit prêt à l’emploi ou utilisable immédiatement après avoir été régénéré.

Lot de milieu de culture : Unité de milieu homogène et conforme aux exigences de traçabilité, correspondant à une quantité définie de produits en vrac, de produits semi-

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finis ou finis, de type et de qualité homogènes, qui a été produite au cours d’une période définie et identifiés sous un même numéro de lot.

Performance : Capacité d’un milieu soumis à une souche test à répondre aux essais de productivité et/ou de sélectivité et/ou de spécificité en fonction des essais réalisés.

Les différents essais de performance possibles sur les milieux de culture

Productivité : Comparaison de la croissance d’un micro-organisme sur un milieu de culture par rapport à un milieu de référence par essai quantitatif.

Sélectivité : Capacité d’un milieu à favoriser la croissance de souches cibles (souche poussant normalement sur ce milieu) au détriment des souches non cibles (souche normalement inhibé sur ce milieu).

Spécificité : Capacité du milieu à donner des colonies caractéristiques du micro-organisme cible et non des micro-organismes non cibles.

IV. Matériels et méthodes mises en œuvre

1. Revivification et vérification des souches

Tout d’abord, il faut régénérer les souches (aussi appelé revivification) qui sont stockés sous forme de cryobilles, par méthode directe ou indirecte. Cette étape sert à déstresser les souches qui peuvent être en état de stress à cause du brusque changement de température nécessaire pour leur conservation.

La méthode directe consiste à déposer 3 cryobilles directement sur une gélose non sélective et mettre à incuber à une température et pendant une durée adaptées à chaque micro-organisme.

La méthode indirecte consiste à mettre 2 ou 3 cryobilles dans un bouillon non sélectif ou peu sélectif, comme le bouillon cœur-cervelle par exemple. Laisser incuber à une température et pendant une durée adaptées à chaque micro-organisme. Puis repiquer sur une gélose adaptée à la souche ou non sélective que l’on remet à incuber.

Remarque :Le choix des températures d’incubation, durées d’incubation, milieux de culture et bouillon est fait dans le but que la souche à revivifier soit dans les conditions optimales pour sa

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croissance. Elles sont, en général, données par le fournisseur de la souche dans le certificat de validation.

Après revivification, on vérifie les caractéristiques de la souche afin de voir si elle est bien pure. Pour cela, tout d’abord on regarde l’aspect des colonies, on fait une coloration de Gram pour voir sa morphologie, on teste son enzyme respiratoire (catalase/oxydase), puis on vérifie son profil biochimique grâce à une galerie API. Les résultats sont enregistrés sur des fiches de suivi. (voir ci-dessous)

FICHE DE SUIVI DES SOUCHES

Nom de la souche

N° ATCC Date de réceptionN° WDCM Mise en cryobilles

Caractéristiques de la soucheMorphologie Macroscopique :

Microscopique :Enzyme respiratoireProfil biochimique

Date Vérification des caractéristiques Conforme / Non conformeMorphologie :Enzyme respiratoire :Profil biochimique :Morphologie :Enzyme respiratoire :Profil biochimique :Morphologie :Enzyme respiratoire :Profil biochimique :

2. Préparation de la culture

Premièrement, on remet en suspension dans un bouillon une colonie issue d’un milieu gélosé. Ensuite on met le bouillon à incuber selon les températures et les durées adaptées à chaque germe, le plus souvent à 37°C pendant 18h à 24h.

Et enfin on réalise des dilutions, dans du Tryptone sel, du bouillon afin d’obtenir les concentrations de travail souhaitées (d’après la bibliographie de la procédure pré-existante, la concentration supposée à la base, après incubation, est de 106 germes/mL)

3. Test de performance des milieux de cultures

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Le laboratoire utilise uniquement des milieux prêts à l’emploi. La performance des milieux est validée par le certificat de validation du fournisseur ainsi que les contrôles à blanc effectués tous les jours d’activité. Cependant la réalisation de tests de performance de ces milieux de culture usuels est obligatoire au moins une fois par an. En fonction des milieux, des essais de productivité, de spécificité et/ou de sélectivité peuvent être effectués. Ces tests permettent de vérifier la qualité du transport et du stockage car pour les étapes précédentes un certificat est fourni.

Milieux concernés (pour Abiolab) : OAA (Compass), BP-RPF, CFC, MRS, Mossel (MYP), TBX, VRBG, VRBL, PCA, Fraser ½, MKTTn, RVS, Tryptone sel, CT-SMAC, XLD, Gélose nutritive, TSYEA, EPT

Les souches pour les différents essais changent en fonction du milieu de culture à tester, du type de micro-organisme pour lequel il est sélectif. Les souches utilisées pour chaque milieu sont indiquées dans l’annexe E de la norme ISO 11133

a) Essais de productivité

Dilution de travail : 102 UFC/mL (obtenue à partir de la solution mère en supposant qu’elle soit d’une concentration de 106 UFC/mL)

Technique :

Pour les milieux servant au dénombrement à la base, on ensemence en masse dans les milieux à tester ainsi que dans le milieu de référence, avec un inoculum correspondant à la dilution de travail de chacun des micro-organismes à tester. Puis on coule les milieux de culture (double couche si nécessaire).

Si le milieu de culture n’est pas prévu pour le dénombrement, ensemencer en surface ou par filtration sur membrane, toujours avec la dilution de travail adaptée.

Dans le cas des milieux de culture CT-SMAC, XLD, TSYEA et gélose nutritive, un essai qualitatif est suffisant donc on peut procéder comme pour la spécificité.

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Incubation :

La durée et la température d’incubation varient en fonction du milieu de culture et de la souche ensemencée. La durée peut aller de 24h à 72h et la température de 25°C à 41.5°C même si le plus couramment les températures auxquelles il faut incuber sont 30°C et 37°C.

Lecture et interprétations : (voir ci-dessous)

Il faut compter les colonies caractéristiques sur les milieux à tester ainsi que les colonies présentes sur le milieu de référence. Puis appliquer la formule suivante :

Pr= NsNo

Pr= ratio de productivité

Ns= nombre total de colonies sur le milieu de culture à tester

No= nombre total de colonie sur le milieu de culture de référence

Le Pr doit être supérieur ou égal à 0.50 pour la comparaison d’un milieu sélectif, et supérieur ou égal à 0.70 pour la comparaison d’un milieu non sélectif. Le Pr ne doit pas dépasser 1.4.

FICHE DE RESULTATS POUR UN ESSAI DE PRODUCTIVITE (essai quantitatif)

(les souches tests correspondent pour le milieu VRBL)

ESSAI DE PRODUCTIVITE

Date N° de lot Souches testsNs (nbre de colonies sur milieu à tester)

No (nbre de colonies sur TSA)

Pr(Pr=Ns/No) Satisfaisant/

Non satisfaisant

E.coli

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WDCM 00012E.coli

WDCM 00012E.coli

WDCM 00012Remarque : les colonies caractéristiques sont rouge pourpre avec ou sans halo de précipitation

Résultat satisfaisant : 1.4 ≥ Pr ≥ 0.5

Si le résultat n’est pas satisfaisant, ne plus utiliser le milieu et ouvrir une fiche de non-conformité.

b) Essais de sélectivité

Dilution de travail : 104 à 106 UFC/mL

Technique :

On fait une seule strie par micro-organisme d’essai, à la surface de la gélose, avec une anse de 1µL et une culture de travail (dilution de travail) de chacun des micro-organismes à tester. Plusieurs micro-organismes peuvent donc être testés dans une même boite du moment que les stries ne se croisent pas.

Incubation : Mêmes paramètres que pour la productivité


Le critère d’acceptation est une mesure de croissance, 0 correspond à une croissance nulle, 1 correspond à une faible croissance, 2 correspond à une bonne croissance.

FICHE DE RESULTATS POUR UNE ESSAI DE SELECTIVITE (essai qualitatif)


ESSAI DE SELECTIVITE

Date N° de lot Souches tests Présence / Absence de colonies Satisfaisant / Non satisfaisant

E.faecalisWDCM 00087

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E.faecalisWDCM 00087E.faecalis

WDCM 00087Résultat satisfaisant : Inhibition totale (0)


c) Essais de spécificité

Dilution de travail : 104 à 106 UFC/mL

Technique :

On fait un isolement en stries à la surface des milieux à tester, avec une culture de travail (dilution de travail) de chacun des micro-organismes à tester.

Incubation :

Mêmes paramètres que pour les autres tests


On regarde juste s’il y a présence ou absence de colonies caractéristiques.

FICHE DE RESULTATS POUR UN ESSAI DE SPECIFICITE (essai qualitatif)


ESSAI DE SPECIFICITE

Date N° de lot Souches testsColonies caractéristiques ? (oui/non)Si oui, présence d’autres colonies ?

Satisfaisant/Non satisfaisant

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Pseudomonas aeruginosaWDCM 00025



Remarque : les colonies caractéristiques sont de incolores à beige

Résultat satisfaisant : Présence de colonies caractéristiques seulement.


d) Cas des milieux liquides

Technique :

On ensemence un tube de milieu liquide à tester avec une culture de travail de 102 UFC/mL (1mL de culture dans 9mL de milieu) que l’on met à incuber en suivant les paramètres indiqués dans la norme selon le milieu et la souche. Après incubation, on ensemence 10µL de culture obtenue, en stries sur une gélose non sélective que l’on met elle aussi à incuber.

Lecture et interprétations :

Il faut compter les colonies obtenues sur la gélose. Le critère varie en fonction du milieu de culture et du type d’essai que l’on fait mais toujours pour un essai qualitatif. Le plus souvent, il faut qu’il y ait un nombre minimum de colonies sur un milieu gélosé en particulier.

e) Cas des diluants

Technique :

On ensemence 9mL de diluant avec 1mL de culture de travail de 104 UFC/mL. Puis on prélève immédiatement 0.1mL de diluant ensemencé et l’étale sur la surface d’une gélose non sélective (t0) que l’on met à incuber.

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On laisse les tubes de diluant ensemencés 45 min à température ambiante, on mélange avec le vortex puis on étale de nouveau 0.1mL sur la surface d’une gélose non sélective (t1) que l’on met à incuber.

Lecture et interprétations :

Il faut compter les colonies à t0 et t1. A t1 le nombre de colonies doit être à ±30% égal au nombre initial à t0.

V. Résultats des tests et exploitation

Le nombre de lots testés pour chaque milieu dépend de ce que le laboratoire avait en stock. Les stocks sont renouvelés toutes les 2 semaines grâce à un abonnement pour justement ne pas en avoir de trop. La variation des lots est donc due aux productions et ventes du fournisseur. En général, il n’y a pas beaucoup de lots différents pour chaque milieu à tester.

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VRBL :

Résultats : (tests sur 3 lots)

Test de productivité (quantitatif)

Le test a été effectué avec la souche E.coli WDCM 00012 comme indiqué dans la norme.

N° de lot 428148 502721 434315Nbre colonies sur VRBL (Ns) 236 304 266Nbre colonies sur TSA (No) 229 229 229Pr (Ns/No) 1,03 1,33 1,16

Critère d’acceptabilité : Pr ≥0.5 (et ≤1.4 comme à chaque fois)

Ici, les Pr des 3 lots sont entre 0.5 et 1.4, les résultats sont donc satisfaisants pour ces 3 lots.

Test de sélectivité

Le test a été effectué avec la souche E.faecalis WDCM 00087 comme indiqué dans la norme.

N° de lot 428148 502721 434315Présence / Absence de colonies absence absence absence

Critère d’acceptabilité : inhibition totale (0)

Ici, il y a absence de colonie sur les 3 lots ce qui correspond à une inhibition totale, les résultats sont donc satisfaisants pour ces 3 lots.

Test de spécificité

Le test a été effectué avec la souche Pseudomonas aeruginosa WDCM 00025 comme indiqué dans la norme.

N° de lot 428148 502721 434315Présence de colonies caractéristiques? oui oui ouiPrésence d'autres colonies? non non non

Critère d’acceptabilité : Présence de colonies caractéristiques seulement, c’est-à-dire des colonies incolores à beiges pour cette souche sur ce milieu.

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Milieu gélosé sélectif aux coliformes, violet, dont les colonies caractéristiques sont rouges pourpre.

Ici, il n’y a présence que de colonies caractéristiques sur les 3 lots, les résultats sont donc satisfaisants pour les 3 lots.

Conclusion

Les résultats obtenus pour les 3 tests sont satisfaisants pour les 3 lots d’après les critères indiqués dans la norme. On peut donc valider ces 3 lots, c’est-à-dire le stock, ils sont donc utilisables et performants.

CT-SMAC :

Résultats : (tests sur 2 lots)

Test de productivité (qualitatif)

Le test a été effectué avec la souche E.coli O157 :H7 WDCM 00014 comme indiqué dans la norme.

N° de lot 1003747500 1003818580Nbre de colonies >300 >300Estimation de la croissance (0;1;2) bonne croissance (2) bonne croissance (2)

Critère d’acceptabilité : bonne croissance (2)

Ici, en respectant les conditions d’incubation indiquées dans la norme, il y a plus de 300 colonies ce qui correspond à une très bonne croissance, les résultats sont donc satisfaisants pour ces 2 lots.

Test de sélectivité

Le test a été effectué avec les souches S.aureus WDCM 00034 et E.coli WDCM 00012 comme indiqué dans la norme.

N° de lotAvec S.aureus Avec E.coli Avec S.aureus Avec E.coli

Présence/Absence de colonies absence présence absence présenceSi présence, nbre de colonies / 3 colonies / 2 colonies

1003747500 1003818580

Critère d’acceptabilité : Avec S.aureus inhibition totale (0)

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Milieu gélosé précoulé sélectif à E.coli O157 :H7, rouge, dont les colonies caractéristiques sont brunes.

Avec E.coli inhibition partielle (1) (entre 1 et 15 colonies)

Ici, il y a absence de colonies de S.aureus et présence mais de très peu de colonies de E.coli, les résultats sont donc satisfaisants pour ces 2 lots.

Conclusion

Les résultats pour les 2 tests effectués sont satisfaisants pour les 2 lots d’après les critères indiqués dans la norme. On peut donc valider ces 2 lots, le stock, ils sont donc utilisables et performants.

Remarque : il n’y a pas encore de test de spécificité d’attribué à ce milieu, peut-être y en aura-t-il à la prochaine révision technique de la norme. Cependant on pourrait éventuellement le vérifier avec l’aspect des colonies de la souche E.coli O157 :H7 WDCM 00014.

TBX : résultats satisfaisants pour la productivité et la sélectivité. (tests sur 1 lot)

le stock est validé

Pour ce milieu, ainsi que pour VRBL et VRBG, qui ont été les premiers milieux testés, les boites après incubation était illisibles à cause d’un trop grand nombre de colonies ce qui rendait le dénombrement impossible. Les dilutions ont été choisies par rapport à la bibliographie de la procédure initiale qui indiquait 106 UFC/mL après incubation.

Causes possibles : mauvaise dilution, mauvais volume d’ensemencement, sous-estimation de la concentration de la solution mère

Solutions : relance du test en suivant bien la procédure mais avec une plus forte dilution

Résultats : les boites devenaient lisibles mais encore chargées donc une deuxième relance a été faite avec une dilution encore plus grande pour être dans de bonnes conditions pour le dénombrement.

Conséquences : modification des données sur la procédure pour les prochains tests.

VRBG : résultats satisfaisants pour la productivité et la sélectivité. (tests sur 1 lot)


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Milieu gélosé sélectif à E.coli, incolore, dont les colonies caractéristiques sont bleues.

Milieu gélosé sélectif aux entérobactéries, violet, dont les colonies sont roses à rouges.

CFC : résultats satisfaisants pour la productivité mais non satisfaisant pour la sélectivité. (tests sur 1 lot)

Le test de productivité a été effectué avec Pseudomonas fluorescens, il est quantitatif. Après incubation, il y a 45 colonies sur ce milieu et 41 colonies sur le milieu de référence (TSA), le Pr est donc de 1.10. Le critère étant d’avoir un Pr≥0.5, les résultats sont satisfaisants.

En revanche pour le test de sélectivité, les résultats ne sont pas satisfaisants. La souche utilisée est E.coli WDCM 00012, le test a été reproduit 8 fois au final, dans chaque boite je faisais 2 stries, 2 boites avec le complément et 2 boites sans le complément. Pour que les résultats soient satisfaisants, il faut qu’il y ait absence de colonies. La première fois, il y avait présence de colonies sur les 2 stries avec et sans complément. La deuxième fois, il y avait présence de colonies sur les 2 stries dans la boite sans complément, et plus que sur 1 seule strie sur la boite avec complément.

Causes possibles : complément contaminé, pas pris la bonne souche, souche non pure, transport qui a altéré le milieu

Le test a été refait plusieurs fois donc le problème vient probablement des conditions de transport car la souche utilisée a fonctionné pour plusieurs autres tests et si c’était le complément de contaminé, il y aurait des colonies en dehors des stries.

On peut remarquer que le complément, un antibiotique, est indispensable à la sélectivité et que le milieu sans ajout ne l’est pas du tout.

le stock n’est pas validé

Fraser ½ : résultats satisfaisants pour la sélectivité et la productivité avec Listeria monocytogenes mais non satisfaisant avec E.coli et E.faecalis. (tests sur 1 lot)

Causes possibles : pas la bonne dilution pour les 2 autres souches, pas pris les bonnes souches, souches non performantes.

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Milieu gélosé auquel on ajoute un complément sélectif aux Pseudomonas. C’est un milieu incolore donc les colonies caractéristiques sont blanches.

Après 3 relances du test de productivité le résultat est toujours le même. On peut donc éliminer ces causes car ces 2 souches servent à plusieurs autres tests qui ont fonctionnés.

Le problème venait de la méthode que j’avais mal comprise car, en effet, ça me paraissait bizarre de devoir obtenir des colonies avec E.coli et E.faecalis alors qu’à la base ce milieu est sélectif à Listeria monocytogenes donc ces 2 souches devraient être automatiquement inhibées. J’ai ensemencé une boite par souche comme pour la plupart des milieux alors qu’enfaite il fallait ensemencer toutes les souches ensemble pour qu’il y ait compétition, pour voir que, même s’il y a pleins de souches avec, ce milieu met quand même en évidence les Listeria.

Je n’ai pas pu refaire le test comme il faut par manque de temps car c’était la fin de mon stage.

le stock n’est donc pas validé

MKTTn : résultat non satisfaisant pour la productivité avec E.coli (moins de 10 colonies sur XLD) mais satisfaisants pour les tests de productivité avec Pseudomonas aeruginosa et Salmonella Typhirium et la sélectivité. (tests sur 1 lot)

La cause est la même que pour le Fraser ½ , c’est-à-dire une mauvaise compréhension de la norme et la méthode donnée, exactement la même erreur.


OAA (Compass) : résultats satisfaisants pour la productivité, la sélectivité et la spécificité. (tests sur 1 lot) le stock est validé

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Milieu gélosé sélectif aux Listeria, légèrement orangé, dont les colonies caractéristiques apparaissent bleues avec ou sans halo opaque selon l’espèce.

Milieu liquide sélectif à Listeria monocytogenes marron orangé. Isolé sur gélose OAA pour dénombrement.

Milieu liquide sélectif aux Salmonella, bleu vert opaque avec un disque blanc au fond. Isolé sur gélose XLD pour dénombrement.

BP-RPF: résultats satisfaisants pour la productivité, la sélectivité et la spécificité. (tests sur 1 lot) le stock est validé

MRS : résultats satisfaisants pour la productivité et la sélectivité. (tests sur 1 lot)


Mossel (MYP) : résultats satisfaisants pour la productivité, la sélectivité et la spécificité. (tests sur 2 lots) le stock est validé

XLD : résultats satisfaisants pour la productivité et la sélectivité. (tests sur 1 lot)


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Milieu gélosé sélectif aux Staphylococcus à coagulase positive. A la base marron très clair, les colonies caractéristiques sont noires et forment un halo opaque.

test de spécificité

Milieu gélosé légèrement orangé sélectif aux bactéries lactiques dont les colonies caractéristiques dépendent de la souche.

Milieu gélosé précoulé sélectif aux Salmonella, rose intense, dont les colonies caractéristiques ont un centre noir avec un halo rouge.

Milieu gélosé précoulé de couleur rouge sélectif aux Bacillus cereus dont les colonies apparaissent roses avec un halo de précipitation.

PCA : résultats satisfaisants pour la productivité. (tests sur 2 lots)


Gélose nutritive : résultats satisfaisants pour la productivité (tests sur 2 lots)


TSYEA : résultats satisfaisants pour la productivité. (tests sur 1 lot)


RVS : résultats satisfaisants pour la productivité et la sélectivité. (tests sur 1 lot)


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Milieu gélosé précoulé non sélectif, blanc, sur lequel les colonies apparaissent blanches opaques.

Milieu liquide sélectif aux Salmonella, bleu intense. Isolé sur gélose XLD pour dénombrement.

Milieu gélosé non sélectif, incolore, utilisé pour le dénombrement des colonies mésophiles sur lequel elles apparaissent blanches.

Milieu gélosé précoulé sélectif à Listeria monocytogenes, jaune clair, dont les colonies caractéristiques apparaissent blanches.

TS (Tryptone Sel) : résultats satisfaisants pour E.coli mais non satisfaisants pour S.aureus (pas de croissance) (tests sur 1 lot)

On ensemence la suspension en surface sur TSA à t0 puis 45min plus tard (à t1) on ensemence de nouveau. Le nombre de germes à t1 doit être égal à ±30% du nombre de germes à t0.

Pour E.coli c’est le cas mais pas pour S.aureus, il y a présence d’aucun germe.

Causes possibles : pas pris la bonne dilution, souche non performante

Après relance du test 3 fois, le résultat est toujours le même donc le problème vient probablement de la souche de S.aureus.

Solution : recommander une nouvelle souche de S.aureus.


EPT : résultats satisfaisants pour E.coli mais non satisfaisants pour S.aureus (pas de croissance) (tests sur 1 lot)

Le test ayant été effectué comme pour le TS, avec les mêmes souches, il y a eu le même problème au niveau des résultats, même après 3 relances du test.

On suppose donc que pour ce cas aussi, le problème vient probablement de la souche de S.aureus.


VI. Conclusion - perspectives

Ce stage m’a permis de voir comment est constituée une norme et à quoi ressemble un système qualité, ainsi que tout le travail qu’il faut faire pour chaque nouvelle norme.

Grâce à cette étude, je comprends mieux le lien entre le travail des techniciens et le système qualité et donc toute l’importance du système qualité dans les analyses.

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Liquide incolore, non sélectif, servant à la dilution.

Diluant non sélectif incolore.

En plus de mon thème d’étude, j’ai pu observer comment se déroule les analyses alimentaires dans le monde professionnel, en dehors de nos cours, l’organisation d’un laboratoire professionnel, toutes les contraintes auquel il doit s’adapter, toutes les normes à respecter.

Pour améliorer le système qualité, il faudrait créer ou remettre à jour toutes les procédures liées à de nouvelles normes. Pour mon sujet d’étude plus précisément, il faudrait refaire les tests avec les autres souches indiquées dans la norme, le problème étant le coût des souches, et développer des tests pour de nouveaux milieux.

Ces 12 semaines m’ont beaucoup plu, ce stage m’a permis d’acquérir pleins de nouvelles connaissances en plus de l’expérience professionnelle.

VII. Références bibliographiques

Norme :

AFNOR. Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau-Préparation, production, stockage et essais de performance des milieux de culture. Paris : AFNOR, 2014.

Documents techniques internes :

ABIOLAB. Manuel qualité. Montbonnot-saint-martin : ABIOLAB, 2013.

ABIOLAB. Utilisation et contrôle des milieux de culture. Montbonnot-saint-martin : ABIOLAB, 2012.

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