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ELIZABETH PARENT
DÉTERMINATION QUANTITATIVE D’ANTIBIOTIQUES (CHLORTÉTRACYCLINE,
OXYTÉTRACYCLINE, TYLOSINE) DANS QUELQUES TYPES DE FUMIERS DE FERME
ENRICHIS ARTIFICIELLEMENT
Mémoire de maîtrise présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie agricole pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DES SOLS ET DE GÉNIE AGROALIMENTAIRE FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
2009 © Elizabeth Parent, 2009
Résumé
Les hormones et les antibiotiques administrés aux animaux d’élevage peuvent
contaminer les terres agricoles et parfois les plantes lors de l’épandage du fumier. Pour
déterminer les concentrations d’antibiotiques dans les fumiers de ferme, il est important
d’élaborer une méthode d’extraction et de détection fiable, rapide et peu coûteuse. Dans la
présente étude, des méthodes d’extraction liquide et les ultrasons ont été employés pour
extraire l’oxytétracycline (OTC), la chlortétracycline (CTC) et la tylosine (TYL) dans
quelques fumiers de ferme enrichis en OTC, CTC et TYL. Plusieurs paramètres ont été
analysés pour optimiser les méthodes d’extraction d’antibiotiques développées par
Blackwell et al. (2004b) : la longueur d’onde de détection, la dégradation des antibiotiques
dans le méthanol, le type de fumiers, le temps de contact entre l’antibiotique et le fumier, la
concentration en solutés, le volume de la solution extractive, la température d’extraction et
le type de méthode SPE (Solid phase extraction). La détection a été effectuée par LC-UV.
Après un ajout de 20 ppm d’antibiotiques, les taux d’extraction de l’OTC, de la CTC et de
la TYL étaient respectivement de 79,4 ± 0,4 %, 58,9 ± 1,3 %, 40,7 ± 1,5 % pour le fumier
de porc frais et de 72,2 ± 10,8 %, 40,2 ± 3,7 % et 49,6 ± 4,2 % pour le fumier de bovin de
boucherie frais. Quant au fumier lyophilisé, les taux d’extraction étaient de 81,7 ± 32,3 %
et de 55,7 ± 4,7 % pour l’OTC et la CTC respectivement. D’autres techniques ont été
testées à savoir l’ELISA, le LC-MS et le FT-NIR. L’utilisation de l’ELISA pour la
détection de CTC et de TYL est possible, mais la variabilité entre les répétitions est élevée.
Des enrichissements allant de 1,4 à 75 ppm en CTC dans des fumiers préalablement
lyophilisés et broyés à 1mm ont été analysés par FT-NIR (Fourier transform near-
infrared). Des régions spécifiques ont été sélectionnées et le modèle de régression PLS
(Partial least square) a permis la prédiction des données (validation). Selon les lignes
directrices interprétant des indices de précision (r2, RPD, RER), le FT-NIR peut être
utilisable pour la plupart des applications, car sa classification est acceptable et son filtrage
non précis.
iii
Avant-Propos
Ce mémoire fait suite à deux années de travail, de recherche, de curiosité et de
dynamisme. Le projet ciblant initialement une simple méthode de détection des
antibiotiques nous a tôt fait comprendre que tout ne serait pas aussi simple. Cela nous a
donné l’opportunité de toucher et de découvrir plusieurs méthodes d’extraction et
techniques de détection.
Je tiens d’abord à remercier mon directeur de recherche, le Dr Antoine Karam, pour
son grand respect, ses patientes explications et sa direction dans le projet, ainsi que mes
examinateurs Dre Muriel Subirade et Dr Richard Hogue pour avoir accepté d’évaluer le
mémoire. Je remercie aussi Nicolas Samson pour le travail sur le terrain, Marie-Ève
Tremblay pour la formation sur le FT-NIR, Alain Gaudreau pour la formation et le soutien
technique avec le LC-UV, Pascal Dubé pour l’analyse au LC-MS ainsi que la Dre Claudia
Sheedy pour ses conseils dans la compréhension de la technique ELISA. Pour avoir fourni
des échantillons de fumier sans antibiotique, je remercie également la « Ferme Saint-
Joseph » de Saint-Alban dans la région de Portneuf et la « Ferme Côté et fils senc. » de
Cacouna dans la région du Bas Saint-Laurent. Enfin, je tiens à remercier nos partenaires de
la ferme Dolbec, sans eux, le projet sur la détermination quantitative d’antibiotiques dans
des fumiers de ferme n’aurait pu avoir été réalisé.
Ce mémoire est divisé en sept chapitres. Le premier débute avec une introduction, et
la présentation des hypothèses et de l’objectif du projet de recherche. Le deuxième chapitre
comporte une revue de littérature et explique les propriétés physico-chimiques des
antibiotiques. Ce chapitre aborde également les techniques d’extraction et de détection des
antibiotiques ainsi que les facteurs affectant l’extraction des antibiotiques. Les chapitres
suivants traitent de différentes méthodes utilisées pour la détection des antibiotiques. Le
chapitre trois porte sur une méthode basée sur les immunoessais (ELISA). Les deux
chapitres suivants présentent des méthodes chromatographiques : LC-MS (chapitre 4) et
LC-UV (chapitre 5). Le dernier chapitre présente une méthode spectroscopique FT-NIR
iv
(chapitre 6). Enfin, le chapitre sept est une conclusion générale qui résume les principaux
résultats en fonction des objectifs, des hypothèses et des perspectives du travail.
v
Ce mémoire est dédié à mon père
« Celui qui se perd dans sa passion a moins perdu que celui qui perd sa passion »
Alexandre Jardin
Table des matières
Résumé................................................................................................................................... ii Avant-Propos ........................................................................................................................ iii Table des matières .................................................................................................................vi Liste des tableaux................................................................................................................ viii Liste des figures ......................................................................................................................x Lexique .................................................................................................................................12 Chapitre 1: Introduction ....................................................................................................13 Hypothèses de recherche ......................................................................................................15 Objectif de recherche ............................................................................................................15 Chapitre 2: Revue de littérature........................................................................................16 2.1 Propriétés physico-chimiques des tétracyclines .........................................................16 2.2 Méthodes d’extraction et de détection des antibiotiques ..........................................19
2.2.1 Généralités ...........................................................................................................19 2.2.2 Facteurs influençant l’extraction et les composantes de l’antibiotique ...............21 2.2.3 Technologies d’extraction et de détection des antibiotiques ...............................30 2.2.4 Composantes pouvant influencer le choix de la méthode....................................40
Chapitre 3: Extraction et dosage de deux antibiotiques (chlortétracycline et tylosine) par la méthode ELISA........................................................................................................41 3.1 Matériel et Méthodes ....................................................................................................41
3.1.1 Fumiers ................................................................................................................41 3.1.2 Réactifs ................................................................................................................41 3.1.3 Matériel ................................................................................................................42 3.1.4 Méthodes ELISA .................................................................................................42
3.2 Résultats.........................................................................................................................48 3.2.1 Tests de cartouches ..............................................................................................48 3.2.2 Extraction des antibiotiques à partir de fumier de porc .......................................49
3.3 Discussion ......................................................................................................................50 3.4 Conclusion .....................................................................................................................52 Chapitre 4: Extraction et dosage de deux antibiotiques (chlortétracycline, tylosine) par LC-MS...........................................................................................................................53 4.1 Matériel et Méthodes ....................................................................................................53
4.1.1 Fumiers ................................................................................................................53 4.1.2 Réactifs ................................................................................................................53 4.1.3 Matériel ................................................................................................................54 4.1.4 Méthode LC-MS..................................................................................................54
4.2 Résultats.........................................................................................................................58 4.3 Discussion ......................................................................................................................60 4.4 Conclusion .....................................................................................................................62 Chapitre 5: Extraction et dosage de trois antibiotiques par LC-UV .............................63 5.1 Matériel et méthodes ....................................................................................................63
5.1.1 Fumiers ................................................................................................................63 5.1.2 Réactifs ................................................................................................................63 5.1.3 Matériel ................................................................................................................64 5.1.4 Méthodes d’extraction, de purification et de détection........................................64
vii
5.1.5 Expérience de sorption de la CTC dans un fumier de porc .................................71 5.2 Résultats.........................................................................................................................73
5.2.1 Extraction et dosage des antibiotiques.................................................................73 5.2.2 Adsorption de la CTC par le fumier de porc .......................................................90
5.3 Discussion ......................................................................................................................91 5.4 Conclusion .....................................................................................................................95 Chapitre 6: Détermination de la chlortétracycline par spectroscopie FT-NIR ............96 6.1 Matériel et Méthodes ....................................................................................................96
6.1.1 Fumiers ................................................................................................................96 6.1.2 Réactifs et Matériel ..............................................................................................96 6.1.3 Méthodes..............................................................................................................97
6.2 Résultats.......................................................................................................................102 6.2.1 Étude de détection des liaisons chimiques de la CTC .......................................102 6.2.2 Étalonnage et analyses multivariées de la CTC dans des échantillons de fumiers divers...........................................................................................................................106
6.3 Discussion ....................................................................................................................111 6.4 Conclusion ...................................................................................................................112 Chapitre 7: Conclusion générale .....................................................................................113 Bibliographie .....................................................................................................................116 Annexes ..............................................................................................................................130 Annexe 1. Grille du suivi des pesées à exécuter lors de l’expérience ................................130 Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm.............................131 Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm ...................132 Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm ...................133 Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm ...................134 Annexe 3. Chromatogrammes de la CTC dans l’eau (0-25 min) et extraite du fumier de porc (12-20 min) .................................................................................................................135 Annexe 4. Chromatogrammes de la CTC extraite du fumier de bovin de boucherie et de veau (12-20 min).................................................................................................................136 Annexe 5. Courbes standards de l’OTC, de la CTC à 285 nm...........................................137 Annexe 6. Courbe standard de la TYL à 285 nm ...............................................................138 Annexe 7. Courbes standards de l’OTC et de la CTC à 355 nm ........................................139 Annexe 8. Spectres et chromatogramme de la TYL analysée par LC-MS.........................140 Annexe 9 Extraction des antibiotiques à partir de fumier de porc......................................141 Annexe 10. Expériences de centrifugation (ELISA) ..........................................................142 Suite Annexe 10. Expériences de centrifugation (ELISA) .................................................143 Annexe 11. Équations de calculs des indices de précision du FT-NIR ..............................144 Annexe 12. Lignes directrices pour l’interprétation du coefficient de détermination (r2) et des ratios RDP et RER........................................................................................................145 Annexe 13. Spectres pur et différentiels de la CTC et des modifications dues à l’acétone146 Annexe 14. Programmation de l’appareil FT-NIR avec le logiciel Result Integration ......147
Liste des tableaux
Tableau 1. Ionisation de la chlortétracycline selon le pKa (Anderson et al., 2005). ...........18 Tableau 2. Solutions utilisées pour l’extraction de tétracyclines dans le fumier de porc et
leur taux de récupération...............................................................................................23 Tableau 3. Extraction de tétracyclines dans les aliments et leur taux de récupération........26 Tableau 4. Extraction de tétracyclines dans les sols et leur taux de récupération. ..............27 Tableau 5. Différentes températures et pressions pour l’extraction d’antibiotiques dans
l’environnement (sol, fumier, boue). ............................................................................29 Tableau 6. Protocole utilisant différentes méthodes publiées dans la littérature pour
l’extraction d’antibiotiques par la méthode SPE (Essai 1). ..........................................43 Tableau 7. Paramètres des procédures d’extraction et de purification des antibiotiques
(chlortétracycline, tylosine) pour la détection ELISA. .................................................45 Tableau 8. Concentrations récupérées de la chlortétracycline (enrichissement de l’eau sans
fumier avec 250 ppb) après un passage dans différentes cartouches Oasis..................48 Tableau 9. Concentrations récupérées en chlortétracycline et en tylosine après
enrichissement en fonction de la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et en fonction de la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif extrait de fumier de porc (courbe 2). ..................................................50
Tableau 10. Taux de récupération de deux antibiotiques détectés par LC-MS à partir d’échantillons de bovins de boucherie lyophilisés préalablement enrichis. .................59
Tableau 11. Paramètres de l’extraction et de la détection des antibiotiques évalués par LC-UV.................................................................................................................................66
Tableau 12. Type de méthode SPE et les modifications apportées au protocole de Blackwell et al. (2004a). ...............................................................................................69
Tableau 13. Programmation utilisée pour la quantification des antibiotiques par LC-UV. 70 Tableau 14. Principaux pics révélés par balayage du spectre d’antibiotiques (190 à 600
nm). ...............................................................................................................................73 Tableau 15. Quantité d’antibiotique (OTC, CTC) extraite du fumier de porc après
enrichissement de 20 ppm en fonction des longueurs d’onde (285 nm et 355 nm). ....75 Tableau 16. Type de matrices utilisées pour l’élaboration de trois différentes courbes
d’étalonnage et le nombre d’échantillons pour chaque type.........................................98 Tableau 17. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans
différentes matrices (eau, méthanol)...........................................................................103 Tableau 18. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans
différentes matrices (fumiers). ....................................................................................104 Tableau 19. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans
différentes matrices (fumiers). ....................................................................................105 Tableau 20. Performance du FT-NIR pour l’étalonnage de la CTC (ppm) à partir de
fumiers divers de bovin de boucherie, de bovin laitier et de veau* broyés à 1 mm...107 Tableau 21. Comparaison des techniques FT-NIR et LC-UV dans la détermination de la
CTC dans divers fumiers lyophilisés préalablement enrichis.....................................110 Tableau 22. Concentrations estimées en chlortétracycline et en tylosine après
enrichissement en fonction des valeurs d’absorbance ajustées au contrôle négatif utilisant la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie
ix
(courbe 1) et la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2). ..........................................................................................141
Tableau 23. Concentrations récupérées en chlortétracycline après enrichissement en fonction de la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et en fonction de la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2). ........................................................................142
Tableau 24. Concentrations estimées en chlortétracycline après enrichissement en fonction des valeurs d’absorbance ajustées au contrôle négatif utilisant la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2)..............143
Tableau 25. Lignes directrices pour l’interprétation du coefficient de détermination (r2).....................................................................................................................................145
Tableau 26. Lignes directrices pour l’interprétation des ratios RPD et RER dans l’industrie. ...................................................................................................................145
Liste des figures
Figure 1. Structure de la chlortétracycline...........................................................................17 Figure 2. Le Paragon CZE® 2000, un modèle de système d'électrophorèse capillaire.......20 Figure 3. Modèle Nicolet Antaris FT-NIR. .........................................................................20 Figure 4. Un modèle de High Performance Liquid Chromatography (HPLC). ..................20 Figure 5. Une plaque d’Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA).............................20 Figure 6. Compétition utilisant des antigènes marqués Ag*. ..............................................36 Figure 7. Principe de double capture (technique sandwich). ...............................................36 Figure 8. Principe de compétition avec un anticorps marqué Ab*. .....................................36 Figure 9. Taux de récupération de la tylosine (TYL) provenant de fumier de bovin de
boucherie enrichis, en fonction du temps d’extraction aux ultrasons (10, 20, 30 min).......................................................................................................................................58
Figure 10. Schéma de l'extraction des antibiotiques............................................................71 Figure 11. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) après extraction dans l’eau ou
du fumier de porc en fonction de la longueur d’onde. Extrait de fumier de porc (n = 11). Extrait aqueux (n = 5)............................................................................................76
Figure 12. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) après extraction dans l’eau ou du fumier de porc en fonction de la longueur d’onde. Extrait de fumier de porc (n = 10). Extrait aqueux (n = 5)............................................................................................76
Figure 13. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) des extraits aqueux et de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps d’attente dans le méthanol. Extrait de fumier de porc (n = 1). Extrait aqueux (n = 2). .......................77
Figure 14. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps d’attente dans le méthanol (n = 17, sauf pour la tylosine où n = 16).......................................................................................................................................78
Figure 15. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) en fonction du type de fumiers. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3). Fumier de veau lyophilisé (n = 3 à 20 ppm). ..80
Figure 16. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) en fonction du type de fumiers. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3). Fumier de veau lyophilisé (n = 3 à 20 ppm). ..80
Figure 17. Taux de récupération de la tylosine (TYL) en fonction du type de fumiers. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3). ...........................................................................................81
Figure 18. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact. Expérience 1 (n = 1). Expérience 2 (n = 1, sauf pour le temps de 15 min où n = 2).......................................82
Figure 19. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact. Expérience 1 (n = 1). Expérience 2 (n = 1, sauf pour le temps de 15 min où n = 2).......................................83
Figure 20. Taux de récupération de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact (n = 1)...............................................83
xi
Figure 21. Taux de récupération de l'oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC), de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction de la concentration en solutés de la solution extractive. Facteur 0,5 X (n = 2). Facteur 1 X (n = 8). Facteur 2 X (n = 4)....................................................................................85
Figure 22. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du volume de la solution extractive. Volumes de 8 mL et de 16 mL (n = 4, sauf pour la tylosine où n= 2). Volumes de 16, 24, 40 et 48 mL (n = 2)......................86
Figure 23. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction de la température du bain à ultrasons. Températures 25, 35, 40, 50, 60°C (n = 1). Température 43°C (n = 8). Température 45°C (n = 4). ...........................................87
Figure 24. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) après extraction dans de l'eau seulement, en fonction des types de méthodes SPE. Méthode 1 (n = 5). Méthode 2 (n = 2). Méthode 3 (n = 3). ............89
Figure 26. Quantité de chlortétracycline (CTC) adsorbée par les constituants du fumier de porc (Histogramme et échelle Y de gauche) et Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) adsorbée sur les constituants du fumier de porc (Losange et échelle Y de droite) exprimés en fonction de la quantité ajoutée .................................90
Figure 27. Données prédites versus données calculées pour la détermination de la CTC dans divers fumiers. ....................................................................................................108
Figure 28. Données prédites par validation croisée pour la détermination de la CTC dans divers fumiers. ............................................................................................................108
Figure 29. Quantification de l’OTC en fonction de l’aire sous la courbe..........................137 Figure 30. Quantification de la CTC en fonction de l’aire sous la courbe. .......................137 Figure 31. Quantification de la tylosine en fonction de l’aire sous la courbe. ..................138 Figure 32. Quantification de l’OTC en fonction de l’aire sous la courbe..........................139 Figure 33. Quantification de la CTC en fonction de l’aire sous la courbe. .......................139 Figure 34. Spectres des antibiotiques CTC (472) et TYL (918)........................................140 Figure 35. Chromatogramme de la TYL............................................................................140
12
Lexique
APCI Atmospheric pressure chemical ionization = Ionisation chimique à pression atmosphérique
CTC Chlortétracycline DOXY Doxycycline ELISA Enzyme linked immunosorbent assay = Dosage d'immunosorption liée à enzyme ESI Electrospray ionization = Ionisation avec détection de conductivité supprimée FAB Fast atom bombardment = Bombardement atomique rapide FT-NIR Fourier transform-near infrared = Proche infrarouge à transformée de Fourier FT-MIR Fourier transform-mid infrared = Moyen infrarouge à transformée de Fourier FT-MS Fourier transform-mass spectrometry = Spectrométrie de masse à transformée de
Fourier IT Ion traps = Piège d’ions LC-UV Liquid chromatography-ultraviolet = Chromatographie liquide à détecteur UV LC-MS Liquid chromatography-mass spectroscopy = Chromatographie liquide couplé à
un détecteur de masse simple quadripôle LC-MS/MS Liquid chromatography-mass spectroscopy / mass spectroscopy =
Chromatographie liquide couplé à un détecteur de masse en tandem MCAC Metal chelate affinity chromatography = Chromatographie d’affinité métal-
chélate OTC Oxytétracycline PBS Phosphate buffer saline = Tampon phosphate salin PLS Partial least square = Moindre carré partiel PRESS Prediction residual sum of squares = Somme des carrés résiduels de la prédiction RER Ratio error range = Étendue du rapport de l’erreur RPD Ratio of prediction deviation = Rapport de l’erreur-type de prédiction par
rapport à l’écart-type ou Erreur standard de prédiction RMSEC Root mean square error of calibration = Écart-type résiduel de calibration ou
Valeur moyenne de l’erreur quadratique de calibration RMSECV Root mean square error of cross-validation = Écart-type résiduel de la validation
croisée RMSEP Root mean square error of prediction = Écart-type résiduel de prédiction =
Valeur moyenne de l’erreur quadratique de prédiction SD Standard deviation = Écart-type SEC Square error of calibration = Erreur-type d’étalonnage ou Erreur quadratique de
calibration SEP Square error of prediction = Erreur-type de prédiction ou Erreur quadratique de
prédiction SPE Solid phase extraction = Extraction en phase solide SSQ Single-stage quadrupole = Simple quadripôle TOF Time-of-flight = Temps de vol TP Température de la pièce TSQ Triple-stage quadrupole = Triple quadripôle TYL Tylosine
13
Chapitre 1
Introduction
En agriculture, les antibiotiques sont utilisés non seulement pour guérir, mais aussi
comme agents prophylactiques, promoteurs de croissance et comme promoteurs d’efficacité
d’absorption de la nourriture en productions animales (Steinfeld et al., 2006). Leur
utilisation prévient plusieurs maladies chez l’animal d’élevage, lui apporte un certain
confort et améliore le rendement à la ferme. Néanmoins, leur abus de consommation et
l’application insuffisante des mesures d’hygiène ont engendré l’émergence d’une autre
menace : la résistance des micro-organismes (Levent et al., 2005 ; WHO, 2002). En effet, le
fumier utilisé comme fertilisant sur les terres agricoles est un réservoir de plasmides de
résistance aux antibiotiques transférables (Binh et al., 2008). Les statistiques sur les
antibiotiques démontrent l’ampleur d’une urgence de contrôle. En plus, un concept
menaçant a été élaboré sur la métabolisation des antibiotiques : les antibiotiques peuvent
être modifiés par oxydation, réduction, hydrolyse, conjugaison dans l’animal ; cependant ils
peuvent retrouver leur forme parentale plus toxique (Halling-Sørensen et al., 2002a).
Environ 80 % des antibiotiques administrés au bétail sont utilisés en prophylaxie ou
en promotion de croissance (Wallinga, 2002). Les animaux excrètent dans l’urine entre 50
et 80 % des composés antibiotiques sous forme presque inchangée (Aiello et al., 1998).
Pour la tétracycline administrée, jusqu’à 95 % sont excrétés (Kühne et al., 2000). Ces
antibiotiques rejetés dans le fumier et l’urine peuvent contaminer les terres et s’incruster
dans le cycle écologique. D’ailleurs, quelques recherches ont pu détecter des concentrations
de 0,005 à 20 mg/L de tétracycline, de 4,45 à 7,9 mg/L de CTC dans le fumier de porc
liquide (Kumar et al., 2004 ; Aga et al., 2003 ; Gupta et al., 2003) et de 0,1 à 46 mg/L de
CTC dans le fumier de porc lyophilisé (Martínez-Carballo et al., 2007). En conséquence,
les concentrations de tétracyclines restées à la surface du sol après des épandages répétés
sont en moyenne de 0,15 mg/kg (Hamscher et al., 2005).
14 Au Canada, il n’existe aucune restriction quant à l’usage des antibiotiques en
agriculture, mais le gouvernement assure une surveillance épidémiologique de la résistance
avec le PICRA1 et le groupe d’Edward Topp d’Agriculture et Agroalimentaire Canada qui
travaille sur la résistance des bactéries intestinales aux antibiotiques administrés aux
animaux d’élevage. Récemment au Québec, la CAAAQ2 a reçu des recommandations sur
les promoteurs de croissance (Poirier, 2007). Elles recourent au principe de précaution par
l’élimination graduelle des facteurs de croissance ; l’utilisation se base sur l’efficacité, la
dose, la durée de l’antibiotique ainsi que le rapprochement avec les molécules en thérapie
humaine (Poirier, 2007). Le Canada a su identifier des champs de recherches prioritaires,
dont celle de développer les méthodes d’analyses chimiques et biologiques (Servos et al.,
2002 ; Santé Canada, 2002). Les travaux de recherche portant sur l’extraction
d’antibiotiques de fumiers ou de sols amendés avec du fumier présentent une grande
variabilité. Le but du projet de recherche vise à optimiser une méthode de détection
d’antibiotiques afin d’établir un contrôle environnemental des antibiotiques dans les
fumiers de ferme.
1 PICRA Programme Intégré Canadien de la Résistance des Antibiotiques 2 CAAAQ Commission sur l’Avenir de l’Agriculture et de l’Agroalimentaire Québécois
15
Hypothèses de recherche
1. La méthode de Blackwell et al. (2004b) permet d’extraire l’oxytétracycline, la
chlortétracycline et la tylosine dans différents types de fumiers de ferme enrichis
artificiellement.
2. La détermination de la chlortétracycline et de la tylosine par LC-MS est influencée
par la température et le temps d’exposition du fumier enrichi d’antibiotiques dans
un bain à ultrasons.
3. La méthode ELISA peut détecter la chlortétracycline et la tylosine présentes dans le
fumier.
4. La méthode FT-NIR peut détecter la chlortétracycline dans différents types de
fumiers de ferme enrichis artificiellement.
Objectifs de recherche
1. Extraire trois antibiotiques dans quelques types de fumiers de ferme enrichis
artificiellement, et les doser à l’aide de l’une ou l’autre des méthodes suivantes :
ELISA, LC-MS, LC-UV ou FT-NIR.
2. Proposer une méthode de détection reproductible pour la détection d’au moins un
antibiotique dans quelques types de fumiers de ferme.
16
Chapitre 2
Revue de littérature
2.1 Propriétés physico-chimiques des tétracyclines
Dans la famille des tétracyclines, les composés sont amphotères et caractérisés par
trois pKa (Thiele-Bruhn, 2003). Les molécules sont hydrosolubles et non volatiles (Thiele-
Bruhn, 2003). La faible liposolubilité diminue les risques de bioaccumulation dans les
organismes. Chimiquement, les tétracyclines peuvent rester stables dans les milieux acides,
mais non dans les milieux alcalins ; elles forment aussi des sels dans les deux conditions
ioniques (Halling-Sørensen et al., 2002a). Tout comme pour les quinolones, les
tétracyclines sont photosensibles (Toriniainen et al., 1996 ; Davies et al., 1979 ; Mitscher
ed., 1978). Par contre, il a été démontré qu’une dissolution d’oxytétracycline (OTC), faisant
partie de la famille des tétracyclines, dans de l’eau Milli-Q sous condition lumineuse ne
présente pas d’effet de dégradation en cinq jours (Halling-Sørensen et al., 2002b) et que la
lumière n’était donc pas un facteur important de dégradation (Wu et Fassihi, 2005). La
photolyse des tétracyclines dépendrait d’autres facteurs dont le pH et le taux initial de
renouvellement d’oxygène (Wiebe et Moore, 1977). Des composés du groupe des
tétracyclines sont sensibles à l’hydrolyse et aux réactions d’oxydation (Halling-Sørensen et
al., 2002a). D’autre part, elles ont une certaine stabilité à travers une large gamme de
températures (Budavary ed., 1996). Le maximum d’adsorption dans le sol se trouve à un
pH de 4,3 ; elle diminue fortement à des pH au-dessus de 7 (Gu et al., 2007). Il a d’ailleurs
été observé que la sorption de l’OTC sur les solides de rivière était plus faible à pH 8,3 qu’à
pH 6,1 (Rose et Pedersen, 2005). La sorption peut s’expliquer par l’attraction
électrostatique aux charges négatives du sol et/ou par l’échange de cations (Jones et al.,
2005). Les antibiotiques peuvent migrer selon leur solubilité et leurs interactions avec la
matrice. Du côté environnemental, la sorption des tétracyclines au sol est plus forte à pH
acide. Dans un sol acide, la sorption peut diminuer avec la compétition cationique (Ter
Laak et al., 2006). L’ajout au sol de fumier enrichi en OTC a démontré une plus grande
17
concentration en surface du sol (De Liguoro et al., 2003). Dans une étude environnementale
sur les sols fertilisés avec du fumier, des concentrations de tétracyclines (TC) ont été
retrouvées dans les couches 0-10 cm (86,2 µg/kg), 10-20 cm (198,7 µg/kg) et 20-30 cm
(171,7 µg/kg) (Hamscher et al., 2002). La couche 30-90 cm et les eaux souterraines ne
contiennent pas de quantité détectable (Hamscher et al., 2002). La contamination semble
restée en surface. Dans le cas de la CTC, la translocation du fumier vers le sol minéral a été
démontrée, à de faibles niveaux de concentrations (Aust et al., 2008). Dans les sols riches
en matière organique, les tétracyclines sont susceptibles à migrer dans le profil de sol, car il
y a une suppression de la sorption avec une plus forte concentration en acides humiques
(Gu et Karthikeyan, 2008). Les facteurs influençant la sorption de l’OTC par le sol sont la
texture, la capacité d’échange de cations et le contenu en oxydes de fer et d’aluminium
(Jones et al., 2005 ; Thiele-Bruhn, 2003).
La structure moléculaire de la chlortétracycline (CTC) est constituée de quatre
anneaux à six membres en alternance de double liaison (Figure 1). La formule moléculaire
de la CTC est C22H23ClN2O8. Elle a un poids moléculaire de 478,89 g/mol (Budavary ed.,
1996).
KEGG http://www.genome.ad.jp/Fig/compound/C06571.gif
Figure 1. Structure de la chlortétracycline
18
La CTC possède trois valeurs de pKa soit 3,3, 7,3 et 9,1 et est un acide faible.
Tableau 1. Ionisation de la chlortétracycline selon le pKa (Anderson et al., 2005).
pH < pKa1 0, 0, + ionisation globale positive
pKa1 < pH < pKa2 -, 0, + ionisation globale neutre
pKa2 < pH < pKa3 -, -, + ionisation globale négative
pKa3 < pH -, -, 0 ionisation globale doublement négative
Le Kow est d’environ 0, ce qui lui confère un caractère hydrosoluble (Halling-Sørensen et
al., 2001). Sous forme d’hydrochlorure (C22H23ClN2O8*HCl), elle est encore plus
hydrosoluble et son poids moléculaire est alors de 515 g/mol.
L’action antibiotique de la CTC est à large spectre. La CTC agit en inhibant la
synthèse de protéines bactériennes. En effet, l’antibiotique empêche la liaison du ARN-
aminoacyl avec la partie A de la sous-unité 30S du ribosome (Chopra, 1985). Les
tétracyclines sont en général utilisées pour contrôler plusieurs bactéries Gram-positif et
Gram-négatif, et quelques protozoaires (Speer et al., 1992 ; Kiatfuengfoo et al., 1989). Le
substrat auréomycine (nom de commerce : chlortétracycline) a été isolé de l’actinobactérie
Streptomyces aureofaciens (Budavary ed., 1996 ; Duggan, 1948). Il est toxique pour la
moitié de la population de rats à une concentration de 10 300 mg/kg (Budavary ed., 1996).
À la ferme, l’utilisation de la CTC a un effet sur la croissance et sur l’efficacité
d’absorption de la nourriture pour les bovidés et les porcs (Gustafson et Kiser, 1985 ;
Bartley et al., 1953 ; Jukes et al, 1950). L’antibiotique prévient aussi les abcès du foie des
ruminants et la pneumonie par invasion de Mycoplasma hyopneumoniae (Gustafson et
Kiser, 1985 ; Switcher et Ross, 1975). Le coefficient de distribution (Kd) de la CTC se situe
entre 400 et 1620 L/kg. Par rapport à la tylosine (TYL) qui a un Kd de 8-128 L/kg, la CTC
s’adsorbe plus rapidement aux solides. Les forces de dispersion, les interactions polaires et
les ponts hydrogènes peuvent contribuer à diminuer la sorption pour une meilleure
solubilité (Pharmasolve, 1999). La stabilité de certains antibiotiques dans le sol a été
examinée et suggérée comme suit, par ordre de persistance : chlortétracycline > bacitracine
19
> érythromycine > bambermycine > tylosine > pénicilline et streptomycine (Gavalchin et
Katz, 1994). La persistance varie en fonction de l’antibiotique, mais aussi en fonction de la
matrice dans laquelle il se retrouve.
2.2 Méthodes d’extraction et de détection des antibiotiques
2.2.1 Généralités
Une seule méthode ne peut détecter les nombreuses classes d’antibiotiques présents
dans un produit. La première étape est donc de faire un screening test pour détecter la
présence d’antibiotiques (Neubert, 2006, entretien de Michael Petz). Le brilliant black test
est un milieu réducteur révélant les antibiotiques par un changement de couleurs (McEwen
et al., 1992). La deuxième étape est de faire des tests d’inhibition microbiologique qui
permettent de déterminer certains groupes d’antibiotiques. Cette technique est la base du
test de détection d’antibiotiques de l’Eclipse 100, créé par Zeu-Inmunotec. D’autres
techniques de détection ont été suggérées. Entre autres, un système d’électrophorèse
capillaire tandem spectrométrie de masse a été utilisé par Lara et al. (2006) afin de détecter
les fluoroquinolones dans le lait (Figure 3). Le test est d’une durée de 4 h. Puis, des tests
ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) (Figure 5), très sensibles, ont été
expérimentés ; néanmoins, ils sont difficilement quantitatifs (Aga et al., 2003). La HPLC
(High performance liquid chromatography) (Figure 4) et le MS (Mass spectroscopy)
permettent de détecter les antibiotiques ainsi que leur concentration respective. La HPLC a
une bonne sensibilité et une haute sélectivité (O’Connor et al., 2007), mais la méthode est
aussi laborieuse dans la préparation des échantillons et la séparation des antibiotiques.
D’ailleurs, l’utilisation de la SPE (solid-phase extraction) avec les cartouches SAX et HLB
est souvent une étape de purification et de concentration de l’échantillon ajoutée pour une
meilleure détection à la HPLC. Pour ce qui est de la spectroscopie à proche infrarouge, à
notre connaissance, Sivakesava et Irudayaraj (2002) sont les seuls à l’avoir expérimentée
pour la détection de la tétracycline, dans le lait. Cette technologie peut analyser plusieurs
échantillons en peu de temps, lorsque le spectrophotomètre est calibré adéquatement. Les
modèles de spectroscopie FT-MIR (Fourier Transform Mid-Infrared) et FT-NIR (Fourier
20
Transform Near Infrared) (Figure 3) avec le modèle de régression PLS (Partial Least
Square) avaient été utilisés.
©Beckman Coulter
Figure 2. Le Paragon CZE® 2000, un modèle de système d'électrophorèse capillaire.
Figure 3. Modèle Nicolet Antaris FT-NIR.
http://www.uams.edu/metabolites/images/Shimadzu%20HPLC.jp
Figure 4. Un modèle de High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Figure 5. Une plaque d’Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA).
http://www.poultry-health.com/library/serodiss/elisa.htm
© PerkinElmer
21
2.2.2 Facteurs influençant l’extraction et les composantes de l’antibiotique
2.2.2.1 Les solvants d’extraction
La solubilité des tétracyclines est plus élevée dans les alcools comme le méthanol et
l’éthanol et varie dans les solvants organiques comme l’acétate d’éthyle, l’acétone,
l’acétonitrile (O’Neil ed., 2001; Mitscher ed., 1978). L’acétate d’éthyle a d’ailleurs été
exploité avec succès comme solvant d’extraction dans plusieurs publications ; néanmoins il
a été aussi critiqué pour un faible pourcentage de récupération dans le sol (Jacobsen et al.,
2006). D’autres solvants ont été testés : méthanol, acétonitrile, sulfoxide de diméthyle
(DMSO), acétone, dichlorométhane, tétrahydrofurane, isopropanol, méthyl t-butyl éther
(MTBE), hexane (Jacobsen et al., 2006). Les solvants les plus polaires sont les plus
prometteurs : méthanol, acétone, DMSO (Jacobsen et al., 2006). Le méthanol ajouté
d’acide trichloroacétique (TCA) a mieux performé que l’éthyle d’acétate et l’acétonitrile
dans le cas d’extractions dans le sérum (Iwaki et al., 1993). La solubilisation de la CTC par
divers solvants semble prendre cette tendance : méthanol > acétonitrile = 2-propanol >
acétone > acétate d’éthyle (Lindsey et al. 2001). La CTC est insoluble dans l’hexane
(Anderson et al., 2005). Elle a une solubilité de 0,5-0,6 mg/mL dans l’eau et est
relativement soluble dans le méthanol (Budavary ed., 1996). En utilisant la forme
hydrochlorure de la CTC, à 28°C, la solubilité augmente à 8,6 mg/mL dans l’eau, à 17,4
mg/mL dans le méthanol et à 1,7 mg/mL dans l’éthanol (Budavary ed, 1996).
Des cosolvants permettent d’augmenter la solubilité en réduisant la tension
interfaciale entre le caractère hydrophobe du soluté et la solution aqueuse (Yalkowsky et
al., 1975). L’ajout de 2-pyrrolidone a pu augmenter la solubilité de l’OTC sur toute
l’étendue de pH ; son efficacité se trouve surtout dans la zone plus acide et neutre
(Tongaree et al., 1999). À pH acide, l’OTC possède plusieurs protons à donner et des
groupes accepteurs qui interagissent avec la 2-pyrrolidone (Tongaree et al., 1999). La
forme zwitterion de l’OTC forme des interactions moléculaires et des auto-associations en
présence de cations (Tongaree et al., 1999). Néanmoins, ces interactions sont plus
22
négligeables dans les solvants polaires, l’eau interagissant alors avec le complexe (Day et
al., 1978). La 2-pyrrolidinone ne peut être considérée, car sa forme ressemble à celle de la
CTC ; dans des techniques comme l’ELISA, elle pourrait interférer dans les résultats.
Les solvants acides et organiques ainsi que la chaleur sont aussi utilisés pour la
précipitation des protéines (Anderson et al., 2005). L’acétonitrile a démontré une certaine
déprotéinisation et est utilisé dans plusieurs publications à cette fin (Blackwell et al.,
2004b ; Furusawa, 2004 ; Kawata et al., 1996).
2.2.2.2 Le pH de la solution extractive
La chlortétracycline est plus soluble à un pH basique > 8,5 (Budavary ed., 1996).
Cependant, elle y est instable (Stephens et al., 1954 ; Waller et al., 1952), surtout à des pH
entre 10 et 14 (Budavary ed., 1996). Au-dessus d’un pH de 8, l’anneau de la CTC s’ouvre.
À un pH < 3, l’antibiotique se déshydrate (Mitscher ed., 1978 ; McCormick et al., 1968).
De ce fait, des produits de dégradations se forment en fonction du pH. À des pH acides (2 à
6), l’épimérisation peut se produire en condition aqueuse et former des epiTCs et des keto-
CTC (Halling-Sørensen et al., 2002a ; Kühne et al., 2000). Celles-ci peuvent retrouver leur
forme initiale sous des conditions alcalines spécifiques et en présence d’un métal
complexant (Mitscher ed., 1978). Dans des conditions très acides, des anhydroTCs peuvent
aussi apparaître ; celles-ci restent en majorité stables. À un pH de 2, la tétracycline a une
forte solubilité (Wu et Fassihi, 2005), mais cette condition oblige la détection de produits
de dégradation dans la méthode. À un pH > 6,5, les produits sont principalement des iso-
TC, iso-CTC, keto-CTC, iso-OTC (Halling-Sørensen et al., 2002a). Certains résidus de
dégradation conservent un potentiel inhibiteur ou de résistance, sur les bactéries du sol ou
de la boue ; c’est le cas plus faiblement des iso-CTC et des ter-OTC (terrinolide : potentiel
inhibiteur imposé seulement contre les bactéries de boues) et plus fortement des
anhydroTC, anhydroCTC (Halling-Sørensen et al., 2002a).
En laboratoire, un tampon acétate de pH 8 avec un mélange de méthanol et d’eau
50 :50 exploite la propriété de solubilité à pH basique afin d’extraire des tétracyclines
23
(O’Connor et al., 2007). Néanmoins, un solvant alcalin co-extrait une portion significative
de la matière organique naturelle du sol ou du fumier, ce qui la rend peu apte à la détection
sans purification (Dams et al., 2003; Schnitzer, 1978). L’utilisation de cartouches comme la
Oasis HLB a été popularisée dans les revues scientifiques. Néanmoins, certaines cartouches
apportent une surévaluation des concentrations lors de la détection par ELISA (Koivunen et
al., 2006).
Les méthodes élaborées dans la littérature présentent des solutions extractives avec
des pH variables (Tableau 2).
Tableau 2. Solutions utilisées pour l’extraction de tétracyclines dans le fumier de porc et leur taux de récupération.
Auteurs Type de
fumier Tampon d'extraction Composés
Taux de
récupération
(%)
Martínez-
Carballo et al.,
2007
Fumier de porc
liquide
Acétonitrile acidifié avec un
tampon acétate pH 4,5
TC, CTC,
OTC
91, 94, 88
Brambilla
et al., 2007
Fumier de porc
liquide
Tampon citrate pH
4,7/acétate d’éthyle
OTC 83-86
Kumar et al.,
2004
Fumier de porc
liquide
Eau Nanopure acidifée avec
40 % H2SO4 :EDTA
TC 95-122
Jacobsen
et al., 2006
Fumier de porc
lyophilisé
0,2 M acide citrique pH
4,7/0,2 M acide citrique :
Méthanol 80 %
TC, OTC,
CTC, DOXY,
ETC, EOTC,
ECTC
69-93, 42-54, 76-
228, 98-138, 29-
58,
62-99, 24-97
Blackwell
et al., 2004b
Fumier de porc
liquide
EDTA : Tampon McIlvain
pH 7
OTC 77-102
24 Pour l’extraction des antibiotiques du groupe tétracycline dans le sol, les pH varient
entre < 2 et 8. La plupart des extractions procèdent avec une solution acide. Pour ce qui est
du fumier, la revue de littérature couvre moins de méthodes publiées qu’avec le sol. Tout
comme pour le sol, les extractions dans le fumier sont aussi basées en majorité sur un pH
acide. Dans certains cas, la méthode semble apporter une surévaluation de la récupération
de l’antibiotique contenu dans le fumier. Pour Jacobsen et al. (2004), la dégradation de
l’antibiotique se produisant avant lyophilisation pourrait en être la cause, alors que dans le
cas de Kumar et al. (2004), ce serait la méthode de détection ELISA. Les procédures
appliquées par les équipes de Blackwell, Martínez-Carballo ainsi que de Brambilla sont peu
affectées par la surévaluation.
Finalement, les pH présentés pour l’extraction des tétracyclines dans le sol et le
fumier diffèrent grandement, soit de < 2 à 8 en passant par les pH 3,5 ; 4 ; 4,7 ; 7 et 7,8.
2.2.2.3 La nature de la matrice
La chlortétracycline (CTC) et d’autres antibiotiques peuvent être détectés dans les
aliments comme le lait, le miel, les œufs et les tissus d’animaux par des méthodes
officielles (ACIA, 2007). En plus, des méthodes de détection ont été publiées dans les cas
du plasma et de l’urine (Nelis et al., 1992 ; Koivunen et al., 2006). Chez l’humain, la CTC
a une demi-vie de 5,6 h dans le sang (Rogalski, 1985). Par comparaisons de méthodes
(Tableau 3), les antibiotiques semblent plus facilement extraits du miel et des graines que
du lait, des œufs, des reins et du plasma. L’extraction des antibiotiques à partir de muscles
et de tissus d’animaux marins a engendré les plus faibles pourcentages de récupération
(Tableau 3). Plusieurs procédés de purification ont été utilisés, principalement la filtration,
la centrifugation et la SPE. Brambilla et al. (2007) ont purifié les échantillons par MCAC et
Farrington et al. (1991) avec des colonnes de sépharose et de résine. Pour ce qui est de
l’environnement, des études ont déterminé la présence d’antibiotiques dans les eaux de
surface et souterraines, les sols, les fumiers et même les plantes (Davis et al., 2006 ; Boxall
et al., 2006 ; Kumar et al., 2005 ; Hamscher et al., 2005 ; Migliore et al., 1996). La
tétracycline peut subir des dégradations considérables (Kühne et al., 2000).
25 Dans la mise au point d’une méthode d’extraction pour fins d’analyse, la sorption de
l’antibiotique à la matrice est à considérer. En effet, la CTC interagit fortement avec les
ions métalliques divalents, surtout le magnésium et le calcium (Choudhary et al., 1996) et
avec des parties déprotonées d’acides humiques, comme des groupes fonctionnels
carboxyliques (Gu et al., 2007). Le sol adsorbe plus l’OTC et la CTC avec un contenu en
argile et en oxydes, comme l’oxyde de fer (Carlson et al., 2006 ; Jones et al., 2005 ; Simon,
2005 ; Figueroa et MacKay, 2005 ; Blackwell et al., 2004b). Les acides humiques et
fulviques contenus dans le fumier à respectivement 0,70-2,47 % et 0,50-1,00 % contiennent
des groupes fonctionnels comme des acides carboxyliques et des phénols qui peuvent se
lier aux sites des tétracyclines, sulfonamides et de la TYL en faisant des ponts hydrogène et
des échanges d’ions (Jacobsen et Halling-Sørensen, 2006). Donc, les tétracyclines
interagissent fortement principalement avec la matière organique naturelle et les
composants argileux dans le sol (Kulshrestha et al., 2004). Une comparaison entre
différents types de sols (Tableau 4) permet de constater un taux d’extraction des
tétracyclines plus élevé dans les textures sableuses sans argile. D’autre part, des interactions
hydrophobes et électrostatiques, des forces de Van der Waals ainsi que des réactions de
complexassions en surface peuvent accentuer la sorption des antibiotiques avec la matière
organique (Jones et al., 2005). La sorption dans le sol se fait en 10 min pour la CTC et une
suggestion de 4 h de temps de contact pour l’évaluation d’un ensemble d’antibiotiques a été
émise (Allaire et al., 2006). Pour ce qui est de la dégradation, un entreposage à la noirceur
et sous -80°C d’une solution diluée dans l’eau en fait la prévention pour une durée de 60
jours (Allaire et al., 2006). L’entreposage de la solution durant 48 h à la température de la
pièce (TP) ne semble pas affecter l’antibiotique (Allaire et al., 2006). Le temps de contact
entre l’antibiotique et le fumier après enrichissement doit donc être ajusté en fonction de la
sorption et de la dégradation de la CTC afin d’en évaluer un taux de récupération le plus
proche possible de la réalité environnementale.
26
Tableau 3. Extraction de tétracyclines dans les aliments et leur taux de récupération.
Auteurs Types de
matrice Tampon d'extraction Composés
Taux de
récupération
(%)
Lara et al.,
2006
Lait de bovin Techniques de purification :
Ammonium/Cartouches MAX
et HLB
Quinolones
81-110
Hassouan et al.,
2007
Œufs entiers de
poule
Techniques de purification :
Ammonium/acétonitrile/dichlo
rométhane
Quinolones
70-98
Farrington et
al., 1991
Lait de bovin
Reins de porc
Muscles de truite
Tampon succinate pH 4,0 CTC, OTC,
TC
59, 80, 59
73, 75, 63
56, 75, 58
Capone et al.,
1996
Tissus de crabe
ou d’huître
Sédiments
Tampon McIlvain pH 4,0
OTC
65-80
50-70
Nelis et al.,
1992
Plasma de bovin Tampon de phosphate et de
sulfite pH 5,4
Acétate d’éthyle/alcool
isopropyl
OTC
80
Geertsen et
Pedersen, 2000
Miel Tampon McIlvain/EDTA pH
4,5 TC
75-94
Brambilla et al.,
2007
Graines de maïs Tampon citrate pH 4,7 OTC
83-85
27
Tableau 4. Extraction de tétracyclines dans les sols et leur taux de récupération3.
* Sol fertilisé au fumier † Matière organique ‡ Carbone organique
3 Adapté de O’Connor et Aga, 2007
Auteurs Types de sol Tampon d'extraction Composés Taux de récupération
(%) 1 M acide citrique pH < 2/acétone avec acide formique pH 4
103, 108, 99Aga et al., 2005
Loam limoneux* (0,54-1,14)†
Tampon McIlvain pH 7,8 avec EDTA/Méthanol
CTC, OTC, TC -
O’Connor et al., 2007
Oakville, sable (0,52)‡
CR, sable loameux (7,5)‡ Drummer, loam limono-argileux (2,4)‡
5 % acétate de sodium/EDTA/Méthanol pH 8
CTC, OTC
40-78, 51-6568-76, 22-33
44-105, 38-56
Blackwell et al., 2004b
Sable loameux (1,3)‡ Loam sableux (1,3)‡ Loam sablo-argileux (3,5)‡ Loam argileux (2,2)‡
Méthanol/EDTA/Tampon McIlvain pH 7
OTC
58-6365-7527-3138-51
De Liguoro et al., 2003
Sols* Méthanol/Tampon phosphate pH 2,5
OTC 81
Hamscher et al., 2002
Sable* (1,8)† 1 M citrate pH 4,7/acétate d'éthyle CTC, OTC, TC
57-76, 67-86, 34-47
Jacobsen et al., 2004
Sable Sable loameux
Méthanol/0,2 M Tampon d'acide citrique pH 4,7 CTC, OTC
33-76, 102-277
43-51, 63-81Carlson et Mabury, 2006
Loam sableux 1 M citrate pH 5,8 : acétate d’éthyle
CTC 55
Martínez-Carballo et al., 2007
Sols arables lyophilisés*
Méthanol/EDTA/Tampon McIlvain pH 6
CTC, OTC, TC
66, 66, 74
Brambilla et al., 2007
Sol de maïs* Tampon citrate pH 4,7/acétate d’éthyle
OTC 85-87
Davis et al., 2006
Loam sablo-argileux (1,8)†
Tampon McIlvain pH 4,0 CTC, TC
64-90, 82-91
Sassman et al., 2005
Plusieurs sols A1A2, 41 % argile (1,38)‡ A3A2, 82 % argile (0,70)‡
0,5 M NaCl/0,25 M acide oxalique/acétate d’éthyle CTC
945977
28
2.2.2.4 La température et la pression atmosphérique
La chaleur peut convertir les tétracyclines en épimères et en forme anhydroTCs
(Blackwood et al., 1985 ; Mitscher ed., 1978). Ainsi, pour l’utilisation du système
Accelerated system extraction (ASE), il est utile d’ajuster les paramètres de températures et
de pression. L’extraction des antibiotiques utilisant ce système est la Pressurized Liquid
Extraction (PLE).
Pour les tétracyclines (Tableau 5), la plupart des extractions se font à la température
de la pièce (TP), car la chaleur peut affecter la molécule. Néanmoins, il a été démontré
qu’une température de 75°C sous une pression de 2500 psi durant 5 min n’affecte pas
l’OTC, mais qu’au-dessus de cette valeur, une forte détérioration se présente (Jacobsen et
al., 2006). La structure des antibiotiques et leur extraction semblent peu affectées entre les
pressions 500 et 2500 psi (Jacobsen et al., 2006).
D’autres antibiotiques tels les sulfonamides (Tableau 5) sont extraits utilisant
l’ASE, avec une température de 200°C (Stoob et al., 2006). Par contre, une autre étude a
révélé qu’au-dessus de 100°C, la sulfaméthoxazole était détruite (Göbel et al., 2005). Les
fluoroquinolones sont quant à elles extraites à 100°C sur plusieurs cycles (Golet et al.,
2002). Enfin, les antibiotiques ont une sensibilité thermique propre à chacun et ce, en
fonction des paramètres de l’extraction.
29
Tableau 5. Différentes températures et pressions pour l’extraction d’antibiotiques dans l’environnement (sol, fumier, boue).
*Tylosine (TYL), Sulfadiazine (SDZ), Sulfaméthazine (SMZ), Sulfadoxine (SDX), Sulfaméthoxine (SMX),
Sulfaméthoxazole (SMXZ), Sulfathiazole (STZ)
2.2.2.5 La force ionique
La famille des tétracyclines se lie fortement aux groupes silanol et aux protéines et
forme des complexes chélateurs avec des ions métalliques divalents et ß-dikétones (Oka et
al., 2000). La présence de cations multivalents inhibe d’ailleurs le potentiel antibiotique des
tétracyclines notamment en le rendant moins disponible (Froehner et al., 2000). Dans les
sols, un mécanisme formant des liaisons ioniques entre l’antibiotique et les métaux
Auteurs Type de matrice
Température(°C)
Pression Composés* Taux de récupération
(%) Jacobsen et al., 2006
Fumier de porc lyophilisé
75 2500 psi TC, OTC, CTC, TYL, SDZ, SMZ, SDX
69-93, 42-54, 76-228, 9-35, 59-73, 84-109, 82-101
Aga et al., 2005
Sol loam limoneux
60/30 1500 psi CTC, OTC, TC -
O’Connor et al., 2007
Sol (2,6% de OC ; 19% d’argile)
60 104 bar TC, OTC, CTC, DOXY
99, 99, 92, 99
Thorsten et al., 2003
Sol fertilisé de fumier
100 140 bar Bêta-lactames, Macrolides, Sulfonamides, Fluoroquinolone, TC
-
Stoob et al., 2006
Sols fertilisés avec du fumier
200 100 bar SDZ, SMX, SMZ, SMXZ, STZ
62-93 sauf SMXZ (41)
Göbel et al., 2005
Boues de rejet 100 100 bar Sulfonamides, Macrolides, Triméthoprime
78-142
Golet et al., 2002
Boues de rejet non traitée et traitée
100 100 bar Ciprofloxacine, Norfloxacine
80-89, 84-88
Peru et al., 2006
Fumier de porc 100 1500 psi Macrolides 84, 77
30
(calcium, magnésium) qui sont à leur tour associés à la matière organique est proposé par la
littérature (Gu et al., 2007 ; Loke et al., 2002). L’ajout de calcium au sol augmente la
sorption des tétracyclines pour des pH > 5 (Gu et al., 2007 ; Jones et al., 2005). L’ajout de
CaCl2 ou de NaCl augmente la force ionique et facilite la désorption de l’OTC (Ter Laak et
al., 2006 ; Sassman et al., 2005). Le magnésium forme le plus important complexe avec
l’OTC devant le calcium (Tongaree et al., 1999) et le calcium devant le potassium
(Sassman et al., 2005). Dans l’eau, le magnésium aide à la solubilité de l’OTC pour toute la
gamme de pH (Tongaree et al., 1999). Le calcium favorise la solubilité de l’OTC à pH 7-8
tandis que le zinc, sous pH 7 (Tongaree et al., 1999). Une extraction de sulfonamides dans
le fumier de ferme a d’ailleurs été proposée en ajoutant du NaCl à l’échantillon (Haller et
al., 2002).
Finalement, l’échange ionique à l’intérieur de la matrice semble être un élément
controversé dans l’extraction des antibiotiques. L’ajout d’EDTA au sol est aussi débattu,
parfois il apporte un effet bénéfique en brisant le lien avec le métal (Long et al., 1990),
parfois, il n’en apporte aucun (Stoob et al., 2006). L’ajout d’acide citrique et de phosphate
de potassium au sol est bénéfique à la récupération de la tétracycline (TC) contenue dans
les eaux de lagune (Zhu et al., 2001).
2.2.3 Technologies d’extraction et de détection des antibiotiques
2.2.3.1 Les ultrasons et la pression liquide (extraction)
Le bain à ultrasons et la méthode PLE (Pressurized liquid extraction) sont deux
techniques d’extraction proposées pour récupérer les antibiotiques contenus dans une
matrice complexe. Il semble que l’élévation de la température pourrait permettre de retirer
plus efficacement les antibiotiques. En effet, l’augmentation de la température entraîne une
meilleure solubilité d’un contaminant ; par exemple l’atrazine est plus soluble à 125°C
(1780 µg/mL) qu’à 50°C (70 µg/mL) (King, 2006). La majorité des extractions
mentionnées dans la littérature utilisent la technique PLE pour bénéficier de cette approche;
31
la pression permet l’augmentation de la température sans ébullition de la solution
extractive.
Il a été rapporté que le bain à ultrasons a engendré de bons résultats lors de
l’extraction d’antibiotiques provenant d’œufs et de lait (Furusawa, 2004) et lors de
l’extraction de pesticides dans le sol (Sun et al., 1998 ; Babié et al., 1998). Le bain à
ultrasons est un instrument moins dispendieux que la PLE et ne requiert pas de larges
volumes de solvants (Blackwell et al., 2004b). Pour l’extraction de l’OTC dans le fumier,
les taux de récupération sont élevés dans l’étude de Brambilla et al. (2007) (83-86 %) et
dans celle de Blackwell et al. (2004b) (77-102 %). Les solutions extractives ainsi que la
méthode de purification diffèrent dans les deux cas. La méthode avec les ultrasons a été
comparée à la technique PLE pour l’extraction des sulfonamides, macrolides et
triméthoprime contenus dans des boues activées (Göbel et al., 2005). Les ultrasons ont
engendré des taux de récupération significativement moins élevés que la technique PLE. Il
est à noter que les conditions et les solvants comparés n’étaient pas les mêmes.
Durant les traitements aux ultrasons, une température de 60°C et un temps de 30
minutes permet d’optimiser l’extraction de composés tels les anthraquinones (hydrocarbure
aromatique polycyclique provenant de plantes) (Hemwimol et al., 2006). La température
ainsi que les solvants organiques contribuent au phénomène de cavitation acoustique
(diminution des bulles pour former une vague de son adéquate) des ultrasons (Toma et al.,
2001). Une dilution de la matière organique peut aussi être bénéfique, car cela permet une
meilleure diffusion des substances dissoutes de l'intérieur de la cellule vers le milieu
d'extraction, évitant ainsi l’absorption des ondes par la matière organique totale (Vilarem et
al., 1997). Néanmoins, une trop grande dilution accumule une perte d’énergie dans le
milieu d’extraction (Vilarem et al., 1997). Enfin, la vaisselle de plastique peut absorber
l’énergie ultrasonique et du matériel en verre est alors recommandé (Song et al., 2007).
32
2.2.3.2 HPLC (détection)
La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC, high
performance liquid chromatography) est une technique qui permet la séparation analytique
des constituants d’un mélange. Comme dans toutes les techniques de séparations
chromatographiques, le mélange est d’abord dissous dans une phase liquide ou gazeuse
(phase mobile) (Voet et Voet, 1998). Cette solution est ensuite filtrée dans une colonne
dotée d’un support solide poreux (phase stationnaire) (Voet et Voet, 1998). La phase
stationnaire ralentit plus ou moins la migration des substances en fonction de propriétés
propres aux solutés (Voet et Voet, 1998). Dans la HPLC, la séparation peut être fondée sur
l’adsorption, l’échange d’ions, l’exclusion par la taille, les interactions hydrophobes et la
polarité (Voet et Voet, 1998). Les avantages de la HPLC sont : une haute résolution, une
certaine rapidité, une forte sensibilité et une possibilité d’automatisation (Voet et Voet,
1998). Plusieurs types de chromatographie en phase liquide existent : la chromatographie
d’absorption (liquide/solide), de partage (liquide/liquide), d’échange d’ions et d’exclusion.
Le système HPLC est couramment utilisé dans la séparation des antibiotiques (Martel,
2007). Les détecteurs couplés à la HPLC utilisés pour quantifier les antibiotiques sont
surtout ceux de type spectromètre de masse (MS), à absorption aux ultraviolets (UV) et de
type UV à barrette de diodes (DAD). D’autres détecteurs existent : les détecteurs à
absorption visible, à indice de réfraction, à fluorescence et le détecteur d’évaporation à
diffusion de la lumière (DEDL) (Voet et Voet, 1998 ; Dreux et Lafosse, 1992; Waters,
2009).
2.2.3.2.1 LC-UV
Couplé à la HPLC, la détection UV est une technique sensible, sélective et fiable.
La technique mesure la différence d’absorbance entre le solvant avec le soluté et le solvant
seul (Dubreui, 2003). L’ajout du DAD apporte les renseignements spectraux des
substances, mais son emploi est plus difficile (Dubreui, 2003). L’avantage du HPLC-UV
est qu’il est facile d’entretien et d’utilisation, qu’il est peu sensible aux variations de
33
température et de débit, et qu’il peut être utilisé en mode gradient d’élution (Dubreui,
2003). L’inconvénient majeur est que les substances doivent être chromophores.
2.2.3.2.2 LC-MS
Le spectromètre de masse (MS) permet de déterminer de faibles traces d’un
composé particulier provenant d’un mélange complexe avec plus de rapidité et de précision
que les techniques classiques (Voet et Voet, 1998 ; Prakash et al., 2006). Pour utiliser le
MS, l’effluent de la phase mobile provenant de la HPLC doit d’abord être vaporisé et
ionisé. Il existe plusieurs techniques d’ionisation douces associées au MS : le fast atom
bombardment (FAB), la matrix assisted laser desorption–ionization (MALDI),
l’atmospheric pressure ionization (API) qui comporte l’atmospheric pressure chemical
ionization (APCI) et l’electrospray ionization (ESI) (Prakash et al., 2006). L’APCI et l’ESI
sont les plus ubiquitaires (Prakash et al., 2006). Pour ce qui est de l’APCI, l’éluat passe par
un capillaire de verre rempli de gaz de transport et est chauffé à haute température (450-
550°C) (Prakash et al., 2006). La vapeur remplie de molécules se dirige vers l’électrode à
décharge couronne (Prakash et al., 2006). Une décharge d’une forte différence de potentiel
(de 4 à 6 kV) est alors appliquée (Prakash et al., 2006; Zaikin et Halket, 2006). L’air
ambiant à proximité de l’électrode est ionisé et devient une source potentielle d’électrons
qui participent à des réactions chimiques afin d’ioniser les molécules (Prakash et al., 2006).
Pour ce qui est du ESI, cette technique permet de vaporiser les molécules sans qu’elles ne
se décomposent sous l’effet de la chaleur (Voet et Voet, 1998). En premier lieu,
l’échantillon passe dans un capillaire métallique rempli de gaz N2 (Prakash et al., 2006).
Puis, une pulvérisation (2-8 kV) est administrée à l’échantillon (Prakash et al., 2006),
« formant ainsi de très fines gouttelettes chargées d’où le solvant s’évapore rapidement »
(Voet et Voet, 1998). Les gouttes chargées s’accumulent pour engendrer une charge
répulsive : l’« explosion Coulombique » (Prakash et al., 2006). Les molécules sont alors
dissoutes dans la phase gazeuse sous forme d’ions positifs ou négatifs, selon la polarité du
voltage, et introduites dans le spectromètre de masse (Voet et Voet, 1998; Prakash et al.,
2006). Pour ce qui est du FAB, il est souvent associé au tandem MS (LC-MS/MS ou TSQ).
34
Dans le premier MS, la macromolécule préalablement dissoute dans un solvant peu volatile
(glycérol), est bombardée par un rayon d’atome (Ar, Xe) (Voet et Voet, 1998). Cette étape
entraîne des ions dans la solution de glycérol (M et H+) (Voet et Voet, 1998). Elle permet
alors de sélectionner l’ion « M » d’intérêt parmi les autres ions et les agents contaminant
(Voet et Voet, 1998). Puis, l’ion sélectionné entre dans une cellule de collision où il
s’entrechoque avec des atomes de gaz chimiquement inertes (He, Ar, N2) (Voet et Voet,
1998 ; Prakash et al., 2006). L’ion accumule de l’énergie et cela provoque une
fragmentation à chacune de ses extrémités pour engendrer une série d’ions de plus en plus
petits (Voet et Voet, 1998). Les fragments de la molécule permettent d’identifier la
molécule et de déterminer, par exemple, les acides aminés contenus dans un polypeptide
(Voet et Voet, 1998).
Après vaporisation et ionisation, les effluents de la HPLC se dirigent vers
l’analyseur de masse et enfin vers le détecteur. Il existe plusieurs types d’analyseurs de
masse : le single-stage quadrupole (SSQ), le triple-stage quadrupole (TSQ), le ion traps
(LCQ et LTQ), le quadrupole time-of-flight (Q-TOF) et le Fourier transform-mass
spectrometry (FT-MS), aussi nommé FT-ionization cyclotron resonance (FT-ICR) (Prakash
et al., 2006). Le SSQ est la technique communément appelée LC-MS lorsque couplé à la
HPLC. Il est composé d’un quadripôle simple. Le quadripôle possède quatre électrodes et
chaque paire opposée est connectée électriquement (John Innes Centre, 2009). La machine
contient une source d’ion de mode linéaire (Q0) et une lentille qui transporte les ions à
l’analyseur de masse SSQ (Q1) (Prakash et al., 2006). Dans le Q1, les ions sont filtrés en
fonction de leur stabilité de trajectoire et de leur ratio masse/charge ; seulement certains
ions atteignent le détecteur. Le SSQ peut générer une fragmentation, mais elle est non
spécifique (Prakash et al., 2006). Ce problème est outrepassé avec le TSQ qui possède deux
quadripôles (Prakash et al., 2006). Le TSQ a en plus du Q0 et du Q1, une cellule de
collision (Q2) et un second analyseur de masse (Q3). Les ions filtrés entre dans la cellule de
collision et sont fragmentés dans le premier MS. Dans le second MS, les fragments d’ions
sont filtrés à nouveau, ce qui augmente la précision et la sélectivité par rapport au SSQ. Les
inconvénients de cette méthode restent le coût très élevé des appareils et leurs plus faibles
sensibilités par rapport à d’autres séquenceurs comme la dégradation d’Edman (Voet et
35
Voet, 1998). De leur côté, les ions traps (IT-MS) sont composés d’une source d’ion, d’un
quadrupole ion trap, d’un analyseur de masse (Prakash et al., 2006) et souvent, d’un
spectromètre de masse supplémentaire (MS-MS). Les IT-MS suivent un mode linéaire
comme le SSQ et le TSQ (Prakash et al., 2006). Ils ont l’avantage d’être sensibles,
spécifiques et rapides, et ce sans filtration des ions (Prakash et al., 2006). Dans les IT-MS,
les ions entrent dans un champ électrique provoqué par un voltage de fréquences radio
créés par des changements d’amplitudes dans le potentiel (pulsations) (Prakash et al.,
2006). La différence principale entre les types d’IT-MS LCQ et LTQ mentionnés se situe
dans leur géométrie ; le LCQ a une géométrie 3D traps, alors que le LTQ possède une 2D
traps, ce dernier peut entreposer plus d’ions avant l’apparition d’une surcharge (Prakash et
al., 2006). Pour ce qui est du TOF, il permet d’augmenter la sensibilité et la résolution (± 5-
10 ppm) (Prakash et al., 2006). Cette résolution peut aussi s’avérer être un désavantage, car
le bruit de fond en est augmenté. La machine comporte une source d’ion, un TOF MS
contenant un propulseur d’ions, un réflectron qui inverse la trajectoire des ions et un
détecteur (Prakash et al., 2006), et souvent un quadripôle (Q) supplémentaire connecté à
une cellule de collision (Q-TOF). Dans le Q-TOF, les ions sont propulsés par une énergie
cinétique égale ; la vélocité de la molécule dépend alors du ratio masse/charge (les grosses
molécules sont plus lentes) (Ferrer et Thurman, 2003). Enfin, le FT-MS est le plus sensible
et le plus précis des MS. Il peut analyser des solutions complexes sans chromatographie
préalable. Les tétracyclines ont été analysées avec les différents types d’ionisation décrits
précédemment et les types d’analyseur de masse SSQ, TSQ et LCQ.
De façon générale, un désavantage du ESI se trouve dans sa sensibilité aux
suppressions ou aux augmentations de l’ionisation dues aux interférences des acides
humiques contenus dans le sol (Gustavsson et al., 2001 ; Mallet et al., 2004). L’APCI
démontre de son côté une augmentation d’ionisation (Liang et al., 2003). Dans l’analyse de
tétracyclines, le LCQ utilisé semble être plus sensible à la suppression ou à l’augmentation
d’ionisation que le SSQ (O’Connor et al., 2007). Ceci était possiblement dû soit aux
agrégats formés autour des molécules de tétracyclines en solution, ce qui les rendait moins
aptes à la formation de gaz et d’ionisation, soit à la position orthogonale de l’ESI
(O’Connor et al., 2007).
36
2.2.3.3 ELISA
Les tests ELISA font appel à des techniques variées utilisant la fixation directe
d’anticorps (Ab) ou d’antigènes (Ag), les molécules cibles (Janeway et al., 2003). Les
ELISA se fondent sur trois principes réactionnels :
1. Une compétition utilisant des antigènes marqués Ag* (Figure 6).
2. Une double capture utilisant des anticorps marqués Ab*, à l’origine de la
technique sandwich (Figure 7).
3. Une compétition utilisant des Ab* (Figure 8).
(Martel, 2007)
Figure 6. Compétition utilisant des antigènes marqués Ag*.
Figure 7. Principe de double capture (technique sandwich).
Figure 8. Principe de compétition avec un anticorps marqué Ab*.
L’anticorps au fond du puit
capte directement l’antigène
provenant de l’échantillon qui
est ensuite révélé par un second
anticorps.
Ag marqué Antigène de
ajouté l’échantillon Les anticorps provenant du kit et
ceux de l’échantillon
compétitionnent. Plus il y a
d’antigènes dans l’échantillon,
moins le signal sera élevé lors de
la détection de l’échantillon.
Figure 9 : Principe de
compétition avec un
anticorps marqué Ab*
Les antigènes provenant de
l’échantillon compétitionnent
avec des antigènes liés à des
anticorps marqués et
engendrent une diminution du
signal durant la détection.
La détection par ELISA peut être appliquée comme méthode alternative dans les
études sur le devenir et le transport des antibiotiques dans l’environnement (Aga et al.,
2003). Cependant, les anticorps peuvent interagir par réactions croisées avec plusieurs
produits structurellement semblables aux tétracyclines, entre autre les épimères de
tétracyclines et les sous-produits de dégradation (Aga et al., 2005). Ces réactions croisées
engendrent une augmentation de la concentration en antibiotiques par rapport au LC-MS
(Aga et al., 2005). Il est à noter que l’utilisation de cartouches peut apporter aussi certaines
contraintes. En effet, la cartouche HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) apporte une
surévaluation avec le système ELISA, alors que la MCX (Mixed-mode Cation eXchange)
engendre une bonne récupération dans le cas de l’urine (82 %) (Koivunen et al., 2006).
Enfin, la technique ELISA est considérée comme fiable, rapide et peu coûteuse (Dolliver et
al., 2008), mais elle surestime la concentration en antibiotiques par rapport aux techniques
actuelles de LC-MS (Aga et al., 2005).
2.2.3.4 FT-NIR
« La spectroscopie proche infrarouge permet de connaître la composition chimique
des aliments et matières premières beaucoup plus rapidement que les dosages biochimiques
classiques » (Bertrand, 2002). Un spectromètre, lorsque bien étalonné, peut réaliser
plusieurs analyses sans coût additionnel. La région du proche infrarouge couvre les
longueurs d’onde entre 800 et 2500 nm (4000-12 500 cm-1) alors que l’infrarouge moyen
couvre de 2500 à 25 000 nm (400-4000 cm-1) (Bertrand, 2006). Pour schématiser le
fonctionnement de la spectroscopie de vibrations, Bertrand (2002) imagine une molécule
comme un ensemble d’atomes reliés entre eux par des ressorts. « Chaque ressort vibre à
une fréquence donnée qui dépend du groupe chimique impliqué dans la liaison » (Bertrand,
2002). Par exemple, s’il n’existe que deux masses reliées entre elles par une liaison, une
seule fréquence lui est propre et détermine un modèle harmonique (Loi de Hooke). Dans la
réalité, les liaisons inter-atomiques regroupent plutôt des fréquences de vibrations
fondamentales, harmoniques et des bandes de liaison (Bertrand, 2002). Le modèle
d’oscillateur anharmonique permet de constater cette diversité de fréquences de vibration
38
(Bertrand, 2002). Les longueurs d’onde de la fondamentale, de la première harmonique et
de la deuxième harmonique sont respectivement λ0, λ0/2, λ0/3 (Bertrand, 2002). Le proche
infrarouge caractérise les bandes harmoniques et de combinaison. Les absorptions des
groupements C-H, O-H, N-H et de diverses molécules comme CONH2(R) peuvent être
détectées par FT-NIR.
À des fins de connaissance générale, l’eau provoque de fortes bandes d’absorption à
970 nm (10 309 cm-1), 1190 nm (8403 cm-1), 1440 nm (6944 cm-1), 1940 nm (5155 cm-1) et
les bandes à 970 nm (10 309 cm-1) et 760 nm (13 160 cm-1) sont les 2e et 3e harmoniques.
Les protéines sont à 1523, 1600, 2050, 2180 nm où la bande à 2180 nm est utilisée pour
l’analyse et celle à 1680 nm sert de bande de référence de la ligne de base du spectre. Les
lipides sont à 1734, 1765, 2304, 2348 nm. Enfin, les glucides se trouvent entre 2070 et
2110 nm ; ces bandes de vibrations sont des groupements OH et CO. L’erreur d’analyse
augmente lorsque des produits hétérogènes ou des mélanges d’aliments sont analysés. Pour
permettre de prédire la concentration du produit ciblé, l’algorithme de PLS (Partial Least
Square), contrairement à la méthode classique CLS (Classic Least-Square), a l’avantage
d’être insensible aux impuretés (Cai et Singh, 2004). Le choix du modèle peut se faire à
l’aide du coefficient de corrélation r2 et de la PRESS (Prediction residual sum of squares)
afin d’optimiser le nombre de facteurs en jeu. Le choix du modèle se fait aussi en fonction
de l’erreur standard de calibration (SEC) et de la répétitivité (SD) pour évaluer la
calibration, et de l’erreur standard de prédiction (SEP) pour estimer la précision de la
validation4 (Sivakesava et Irudayaraj, 2002). En plus, une validation croisée (cross-
validation) permet d’évaluer les standards de la courbe de calibration en les validant un à
un et engendre des indices de précision r2 et RMSECV (Root mean squared error of cross-
validation). Afin de comparer ces termes d’erreur entre eux, le rapport de l’erreur standard
de prédiction (RPD) et l’étendue du rapport de l’erreur (RER) sont fortement suggérés5
(Malley et al., 2004 ; Tremblay, 2008). Pour établir une courbe d’étalonnage adéquate, il
faut d’abord collecter une série d’échantillons représentatifs, comportant typiquement entre
50 et plusieurs centaines de produits de même nature (Bertrand, 2002). Les échantillons
4 Les formules de SEC, SEP et de SD sont reproduites en annexe 11. 5 Les formules de RDP et RER et les lignes directrices pour leurs interprétations sont présentées en annexe 11.
39
doivent être analysés par une méthode de référence. Un test de faisabilité est suggéré avant
de débuter cette partie onéreuse de la méthode, afin de déterminer si la détection est
d’abord possible. Les échantillons sont ensuite divisés : une série de calibration et une série
de validation (du tiers à la moitié de la totalité) (Leeson et al., 2000). Ensuite, les indices de
précision sont évalués et des transformations peuvent être apportées aux spectres. Les
transformations qui peuvent être effectuées afin d’optimiser la méthode sont : le lissage
pour éliminer le bruit de fond, les dérivées première ou seconde pour raffiner et révéler
certains pics, la correction de la ligne de base et les corrections multiplicatives (Heise et
Winzen, 2006). Aussi, le choix de régions spécifiques dont les effets linéaire ou
quadratique peuvent être retirés et l’ajustement de la linéarité de la courbe ont une influence
sur la précision de la méthode.
Le FT-IR (Fourier transform infrared) est une technologie utilisant l’infrarouge à
des fins d’analyses dans les régions du visible et de l’infrarouge loin, moyen et proche. Le
FT-NIR (Fourier transform near infrared) ainsi que le FT-MIR (Fourier transform mid
infrared) couvrent respectivement les régions du proche infrarouge et du moyen infrarouge.
Déjà, ces technologies ont permis l’analyse de composés dans le lait : taux en protéines,
gras, humidité, sucres, caséines, cholestérol et antibiotiques comme la tétracycline (Hansen
et al., 1999 ; Rodriguez-Otero et al., 1997 ; O’Sullivan et al., 1999 ; Tsenkova et al., 1999 ;
Luginbühl, 2002 ; Paradkar et Irudayaraj, 2002 ; Sivakesava et Orudayaraj, 2002 ; Sorensen
et al., 2003). Des analyses ont aussi été adaptées au fromage (Rodriguez-Saona et al.,
2006). Du côté microbiologique, les bandes FT-IR ont pu détecter les changements
structuraux dans les antibiotiques lorsqu’ils s’activaient en présence de bactéries et de
champignons (Aghatabay et al., 2008). En plus, dans une perspective environnementale, le
FT-IR a été utilisé pour déterminer les interactions entre l’OTC et la matière organique
dans le sol (Kulshrestha et al., 2004). Enfin, le FT-NIR est une méthode non destructive du
matériel à analyser. C’est un appareil sélectif et à analyse rapide, néanmoins il est peu
sensible dans sa détection.
40
2.2.4 Composantes pouvant influencer le choix de la méthode
Les résidus de fumier de porc contiennent en majorité des protéines, quelques
carbohydrates et un peu de lipides, contrairement aux rejets citadins qui contiennent une
quantité appréciable de lipides (44-82 %) (Sophonsiri et Morgenroth, 2004). Les lipides
représentent environ 1,5 à 2 % des composés dans le fumier de porc (Druzian et al., 2007)
et ils s’élèvent à 2,6-8,6 % dans les fumiers de veau (Xiying et al., 2005). Le fumier de porc
contient sur matière sèche 22-25 % de protéines brutes et 40 % de fibres totales : 20 %
d’hémicellulose, 13 % de cellulose et 5 % de lignine (Chen et al., 2003). Une étape de
purification pour retirer les protéines est souvent nécessaire afin de diminuer les
interférences. La déprotéinisation est accomplie en présence d’acide et de solvants
organiques comme l’acétonitrile et la chaleur (Anderson et al., 2005). D’un côté, les alcools
montrent une incompatibilité chimique avec les protéines (précipitation) (Fliss, 2007) ; de
l’autre, les acides permettent d’hydrolyser les protéines et les polysaccharides ainsi que
d’abîmer les parois cellulaires (Martel, 2007). La méthode d’extraction devra donc
permettre d’extraire le plus efficacement possible en fonction des propriétés de la matrice,
des types de solvants, du pH, de la température et pression, de la force ionique et de la
technique d’extraction : ultrasons ou PLE. La méthode de détection devra être précise et
avoir une bonne exactitude.
41
Chapitre 3
Extraction et dosage de deux antibiotiques (chlortétracycline et tylosine) par la méthode ELISA
3.1 Matériel et Méthodes
3.1.1 Fumiers
Des fumiers de porc ont été échantillonnés à la « Ferme Saint-Joseph » de la région
de Portneuf, Québec, Canada. Les fumiers de porc sont exempts d’antibiotique et
contiennent de la paille. Les échantillons frais ont immédiatement été congelés dans des
pots ‘Masson’ en verre, puis transportés dans une glacière jusqu’au laboratoire. Le fumier a
été dégelé avant l’extraction.
3.1.2 Réactifs
Les produits chimiques utilisés comprenaient l’hydrochlorure de chlortétracycline
~80 %, la tylosine en solution (8 mg/mL), l’acide formique, l’acide citrique monohydrate
ACS, le sel Na2EDTA dihydrate USP/FCC, l’acide orthophosphorique (H3PO4), le
phosphate de sodium dibasique anhydreux (Na2HPO4), l’acétonitrile, le méthanol, le
carbonate de sodium anhydreux ACS (Na2CO3), l’hydrogéno-carbonate de sodium
(NaHCO3), le chlorure de sodium, le dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4), le
chlorure de potassium et le tween 20. Tous les standards et les solvants étaient de type
analytique ou de qualité HPLC. L’eau était de type Millipore.
42
3.1.3 Matériel
Pour extraire et purifier les antibiotiques, un bain à ultrasons de modèle 550HT, des
cartouches Oasis HLB 200 mg/ 6cc, des filtres de fibres de verre AP15 et des filtres faits de
membrane cellulosique à 0,45 µm ont été utilisés. Le kit ELISA expérimenté pour la
détection des tétracyclines était le Ridascreen Tetracyclin de r-biopharm. Les kits ELISA
testés pour la détection de la TYL étaient le Tylosin kit de Tecna et le Tylosin one-step
ELISA de International Diagnostic. La vaisselle a été lavée avec un savon spécial, le Liqui-
Nox, et rincée avec de l’eau déminéralisée. La vaisselle a aussi été rincée avec du méthanol.
3.1.4 Méthodes ELISA
3.1.4.1 Tests de performance des cartouches
Afin de mieux cerner la performance de différentes cartouches SPE Oasis
proposées par le fabricant, trois types de cartouches ont été testés selon des méthodes
proposées par la littérature. Il s’agit de la MCX (Mixed-mode cation exchange and
Reversed-Phase Sorbent for Basic Compounds), la MAX (Mixed-mode anion exchange and
Reversed-Phase Sorbent for Acidic Compounds) et la HLB (Hydrophilic-lipophilic
balance). Le produit MCX permet de garder les composés alcalins et de retirer les produits
neutres ou acides de l’extrait. La solution devrait être à pH acide pour obtenir un maximum
de rétention. Le produit MAX retient les composés pharmaceutiques acides. La solution
devrait être à pH alcalin pour maximiser la rétention. Le produit HLB est recommandé pour
retenir plusieurs antibiotiques, qu’ils soient acides, neutres ou basiques. Pour une meilleure
rétention de la CTC, la solution devrait être acide (Jacobsen et al., 2006). Dans le cas de
l’élution, l’acide oxalique est conseillé, car il permet de se lier aux groupes silanol (Oka et
al., 1984 ; Oka ed., 1995). Blackwell et al. (2004b), Aga et al. (2005) et Jacobsen et al.
(2006) ont publié des expériences avec une cartouche sacrifice SAX (Strong Anion
eXchange) de Supelco ou Isolute insérée au-dessus d’une cartouche HLB afin d’éliminer
une partie de la matière organique. Les protocoles utilisés diffèrent de ceux suggérés par la
compagnie, car ils sont inspirés de plusieurs travaux de recherche (Tableaux 6 et 7).
43
Tableau 6. Protocole utilisant différentes méthodes publiées dans la littérature pour l’extraction d’antibiotiques par la méthode SPE (Essai 1). Noms Auteurs Mode opératoire Contrôle positif
- Solution mère (250 µg/L) dans eau déminéralisée, sans filtration
Contrôle négatif
- Méthanol dilué 1 :1000 dans le tampon McIlvain pH 7 (16,47 mL de 0,2 M Na2HPO4 mélangé à 3,53 mL de 0,1 M d’acide citrique)
Oasis HLB
Kumar et al., 2004 ; Davis et al., 2006 ; Protocole de la cie Ridascreen
1. Diluer 10 mL de contrôle positif dans 90 mL de tampon ajusté à pH 2,4 + 0,1 M Na2EDTA
2. Préconditionner : 10 mL de méthanol, d’eau déminéralisée et de tampon ajusté à pH 2,4 100 mL de solution extractive diluée, 1 mL/min Rincer avec 5 mL d’eau déminéralisée Sécher au vacuum pendant 15 min 3. Éluer avec 2 x 5 mL de méthanol/20 mM acide oxalique, 15 gouttes/min Diluer 1 :1000 pour le test ELISA avec du tampon McIlvain pH 7
Oasis MCX
Idem HLB 1. Diluer 10 mL de contrôle positif dans 90 mL de tampon ajusté à pH 2,4 2. Préconditionner et sécher au vacuum 3. Éluer et diluer 1 :1000 (idem HLB)
Oasis MCX + HLB
Geertsen et al., 1998
1. Diluer 10 mL de contrôle positif dans 90 mL de tampon ajusté à pH 2,4 2. Préconditionner et sécher 3. Éluer HLB avec 50 mL d’acétate d’éthyle : méthanol (90 :10) + sans
éluer 4. Retirer la HLB Laver avec 5 mL d’eau Sécher pendant 15 min au vacuum 5. Éluer et diluer 1 :1000 (idem HLB)
Oasis MAX
Peru et al., 2006 ; Lara et al., 2006
1. Diluer 10 mL de contrôle positif dans 90 mL de tampon ammonium ajusté à pH 9 + 0,1 M Na2EDTA
2. Préconditionner : 10 mL de méthanol, d’eau et de tampon pH 8 (ajusté jusqu’à pH 9) + 0,1
M Na2EDTA 100 mL de solution extractive diluée, 1 mL/min Rincer avec 5 mL d’eau Sécher pendant 15 min au vacuum 3. Éluer et diluer 1 :1000 pour le test ELISA
Oasis MAX + HLB
Peru et al., 2006 ; Lara et al, 2006 Idem HLB
1. Diluer 10 mL de contrôle positif dans 90 mL de tampon ammonium ajusté à pH 9 + 0,1 M Na2EDTA
2. Préconditionner : 10 mL de méthanol, d’eau et de tampon à pH 2,4 (HLB) et à pH 9
(MAX) 100 mL de solution extractive diluée, 1 mL/min Rincer avec 2 mL d’eau Sécher pendant 15 min au vacuum 3. Éluer MAX avec 4 mL de méthanol/20 mM acide oxalique, 15
gouttes/min 4. Retirer MAX Rincer avec 2 mL d’eau Sécher pendant 15 min au vacuum 5. Éluer HLB (idem HLB) Diluer 1 : 9 pour le test ELISA
44
3.1.4.2 Extraction des antibiotiques contenu dans du fumier de porc
Le suivi des poids et des volumes se fait avec une grille (Annexe 1) afin de préciser
les volumes totaux récoltés lors du calcul de la concentration finale en antibiotique. La
méthode d’extraction des antibiotiques se résume comme suit :
A) Enrichissement du fumier
1. 2 g de fumier frais sont pesés et mis dans un tube à centrifuger en verre de 50 mL.
2. Les échantillons de fumiers sont enrichis par les antibiotiques directement dans les
tubes (Les antibiotiques CTC + TYL ont été ajoutés à du méthanol, puis dilués en
série dans de l’eau Millipore).
3. Les suspensions sont agitées sur un agitateur horizontal durant 4 h au froid à l’aide
d’ice packs.
4. Les tubes sont conservés au réfrigérateur pendant la nuit.
B) Extraction de l’antibiotique
5. 4 mL de solution extractive est ajouté au fumier enrichi.
6. Les suspensions sont mélangées au vortex pendant 30 sec.
7. Elles sont ensuite déposées dans un bain à ultrasons à des temps variés (Tableau 7).
8. Les suspensions sont centrifugées et le surnageant est décanté dans un Erlenmeyer
d’une capacité de 125 mL.
9. Les étapes 5 à 8 sont répétées avec les autres solutions extractives (Tableau 7) et les
surnageants sont combinés ensemble.
10. 5 mL du surnageant est prélevé et introduit dans un tube de verre d’une capacité de
15 mL.
11. 50 µL d’acétonitrile est ajouté afin de précipiter les protéines.
12. La solution est mélangée au vortex pendant 30 sec et est laissée au repos pendant 10
min.
13. La solution est enfin filtrée et diluée dans un tampon Phosphate Buffer Saline (PBS)
(Volume de 50 mL : 4 g de NaCl, 0,1 g de KH2PO4, 0,575 g de Na2HPO4, 0,1 g KCl
complété avec de l’eau déminéralisée).
14. La solution est bien mélangée, puis dosée avec les kits ELISA.
45 Différents paramètres ont été testés lors de l’extraction de la chlortétracycline et de
la tylosine (Tableau 7). Ces paramètres ont été choisis en fonction de plusieurs travaux de
recherche : Blackwell et al. (2004b) ; Aga et al. (2003) ; O’Connor et al. (2007) ; Jacobsen
et al. (2006) ; Aga et al. (2005).
Tableau 7. Paramètres des procédures d’extraction et de purification des antibiotiques (chlortétracycline, tylosine) pour la détection ELISA.
Chlortétracycline
Paramètres Test de cartouche
Essai 1
Test de cartouche
Essai 2 Méthode 1 Méthode 2
Tylosine
Solution extractive no1*
Voir Tableau 6
Tampon McIlvain pH 8,0
+ 0,01 M Na2EDTA
Tampon McIlvain pH 8,0
+ 0,01 M Na2EDTA
50 % Tampon carbonate pH
9,3 + 50 %
Méthanol
Tampon carbonate pH
9,0 + 0,01 M Na2EDTA
+ 2 g/L tween 20
Solution extractive no2†
Voir Tableau 6
Tampon McIlvain pH 5
33,3 % Tampon McIlvain pH 2,5
+ 66,6 % Méthanol
+ 2 g/L tween 20
20 % Tampon 1 M d’acide
citrique + 80 %
Méthanol
20 % Tampon 1 M d’acide
citrique + 80 %
Méthanol Solution extractive no3†
Voir Tableau 6
20 % Tampon McIlvain pH 2,4
+ 80 % Méthanol
- Tampon 1 M acide citrique
-
Bain à ultrasons
Voir Tableau 6
10 min, 35°C 15 min, TP 30 min, 60°C 15 min, 35°C
Centrifugations Voir Tableau 6
1200 rpm, 15 min
1200 rpm, 15 min
3000 rpm, 15 min
3000 rpm, 15 min
Filtration Voir Tableau 6
Filtre de membrane
cellulosique (0,45 µm)
Avec/sans HLB
Filtre AP15 + Filtre de membrane
cellulosique (0,45 µm)
- -
Dilution Voir Tableau 6
10 X / 200 X 16 X 20 X 16 X
Ajustement de pH vers la neutralité avant la détection par ELISA
Voir Tableau 6
NON NON OUI NON
* Un volume de 4 mL a été ajouté pour toutes les expériences, à l’exception du test de cartouche avec 8 mL. † Un volume de 4 mL a été ajouté pour toutes les expériences, à l’exception du test de cartouche avec 5 mL.
46
3.1.4.3 Détection de la chlortétracycline (Ridascreen Tetracyclin)
Le kit de Ridascreen utilise la compétition avec des anticorps marqués (Figure 8)
par un anticorps secondaire pour la révélation de la concentration en tétracycline. Tous les
réactifs étaient inclus dans le kit à l’exception du tampon de lavage. Les puits étaient
recouverts de tétracycline conjuguée à une protéine. Les échantillons et les standards (50
µL) étaient d’abord ajoutés aux puits. Puis, une solution d’anticorps anti-tétracycline fut
rapidement additionnée aux puits (50 µL). La tétracycline fixée au puits et celle provenant
de l’échantillon ou du standard compétitionnent pour se lier aux anticorps. Le tout était
incubé durant 1 h avant l’exécution de trois étapes de lavage avec du tampon PBS (0,55 g
de NaH2PO4* H2O + 2,85 g de Na2HPO4 * 2 H2O + 0,1 % de tween 20). Une solution de
peroxydase et d’anticorps secondaires conjugués (100 µL) se liant aux anti-tétracyclines a
ensuite été ajoutée et une incubation de 1 h a de nouveau suivie. Trois autres étapes de
lavage ont été procédées pour ensuite ajouter aux puits des solutions de peroxyde d’urée et
de tétraméthylbenzidine dans des proportions 1 :1 (50 µL chacune). Enfin, une dernière
incubation de 30 min et la réaction a été arrêtée par l’ajout de 1 M H2SO4 (100 µL).
L’absorbance a été mesurée à 450 nm. Tous les échantillons et les standards ont été évalués
en duplicata.
3.1.4.4 Détection de la tylosine (Tylosin kit de Tecna, Tylosin one-step ELISA de International Diagnostic)
Seulement la méthode du kit Tecna est élaborée dans la présente étude. En effet,
malgré le suivi des indications de la compagnie, le kit d’International Diagnostic n’a pas pu
engendrer une courbe standard adéquate et il n’est donc pas nécessaire de spécifier la
méthode. Le kit de Tecna utilise la compétition (Figure 6) pour la révélation de la
concentration en tylosine. Tous les réactifs du kit Tecna étaient inclus dans le kit, sauf les
standards, et doivent être dilués. Une courbe standard a été préparée. Les puits étaient
recouverts d’anticorps ayant une grande affinité à la tylosine. Le tampon est d’abord ajouté
aux puits (20 µL), suivi du standard ou de l’échantillon (20 µL). Puis, une solution
d’enzymes se conjuguant aux anticorps fixés aux puits et n’ayant pas été liés à la tylosine
47
de l’échantillon ou du standard a été introduite (100 µL). Il y a alors une compétition entre
l’enzyme et la tylosine en solution pour les anticorps. Le tout a été légèrement agité. Une
incubation sans agitation de 10 min à la température de la pièce a ensuite été faite et les
puits ont subi trois lavages (300 µL chacun). Dans la noirceur, la solution de
développement qui contient le chromogène s’attachant à l’enzyme conjuguée à l’anticorps a
été ajoutée aux puits et le tout a été agité doucement. Une dernière incubation de 10 min et
la réaction a été arrêtée par la solution stop (50 µL). L’absorbance a été mesurée à 450 nm.
Tous les échantillons et les standards ont été évalués en duplicata.
3.1.4.5 Calculs
Les calculs ont été faits en fonction du poids de la solution d’antibiotiques ajoutée
aux échantillons et non en fonction du poids de fumier (Annexe 1). Le fumier était
considéré ici comme une matrice de sorption, faisant obstacle à la récupération de
l’antibiotique. Le taux de récupération était donc basé sur la récupération de la
concentration d’antibiotique initiale. Puisque les volumes de surnageants combinés ne sont
pas égaux, le dosage ELISA a été associé à une quantité d’antibiotique et non à une
concentration (Annexe 1). Ceci afin de réduire les sources d’erreur d’estimation du taux de
récupération des antibiotiques selon les protocoles employés. Il est à noter que les
caractéristiques intrinsèques des fumiers, la nature des tampons de trempage et d’extraction
des différents protocoles d’extraction et la vitesse de centrifugation varie entre les
protocoles et par conséquent, sont autant de sources importantes de variabilité intra-essais
et inter-essais lorsque le volume total combiné des surnageants est considéré.
48
3.2 Résultats
3.2.1 Tests de cartouches
Les tests de cartouches ont été pris en charge afin de valider leur efficacité réelle et
de vérifier le bon type de cartouches à utiliser avec la technique ELISA. Les méthodes et
les contrôles ont été décrits aux tableaux 6 et 7 de la section précédente. Les cartouches
HLB ont été celles récupérant le plus haut taux de CTC avec le moins de variabilité entre
les répétitions (Tableau 8). Une dilution de 200 X a permis d’éviter la surévaluation de la
cartouche. Dans une autre direction, une dilution sans purification préalable par le système
de cartouches a apporté une récupération de 112 % (Tableau 8).
Tableau 8. Concentrations récupérées de la chlortétracycline (enrichissement de l’eau sans fumier avec 250 ppb) après un passage dans différentes cartouches Oasis.
Concentration de CTC après enrichissement†
(ppb) Type de cartouche
Essai 1*
(n = 3)
Essai 2
(n = 3)
CTRL + 183 ± 109 125,8
CTRL - 1,62** -
HLB 135 ± 29 312 ± 61
MCX 304 ± 177 -
MCX + HLB avec élution de MCX 1295 -
MCX + HLB sans élution de MCX 4239 ± 75 -
MAX 1348 ± 151 -
MAX + HLB 1996 ± 1086 -
Sans cartouche - 279 ± 67***
† L’élution a été faite avec 0,03 mM d’acide oxalique afin d’éviter une chute abrupte de pH. Les échantillons
ont été dilués 10 X avec du tampon PBS.
* Les échantillons étaient préalablement dilués 200 X avec du tampon PBS.
** Le contrôle négatif n’a qu’une seule répétition.
*** Les échantillons étaient préalablement dilués 20 X avec du tampon pH 3,5 et 10 X avec du tampon PBS.
49
3.2.2 Extraction des antibiotiques à partir de fumier de porc
Pour déterminer les interférences, deux courbes standards ont été comparées. La
première utilise les standards concentrés du kit qui ont été dilués dans le tampon ELISA
fourni par la compagnie (courbe 1). La deuxième prend aussi les standards concentrés du
kit ; ceux-ci ont été dilués dans la solution du contrôle négatif (matrice de l’extraction sans
enrichissement en antibiotique) (courbe 2). Les échantillons de fumier ont été enrichis selon
les concentrations de la courbe standard. Les concentrations de la courbe standard de la
tétracycline et de la tylosine diffèrent. En effet, ces dernières sont suggérées par la
compagnie du kit ELISA pour représenter leurs concentrations dans des conditions
alimentaires et environnementales. Les résultats en absorbance ont été comparés en
fonction de la courbe 1, puis en fonction de la courbe 2.
De façon générale, la courbe utilisant le contrôle négatif comme diluant au lieu du
tampon PBS fournit des résultats se rapprochant plus de la concentration en antibiotiques
ajoutée, surtout dans le cas de la tylosine (Tableaux 9 et 22). Cette dernière (courbe 2)
inclut la matrice de fumier sans antibiotique directement dans sa courbe et permet ainsi
d’éviter les erreurs d’absorbance dues au bruit de fond. Les résultats de la courbe 2 ont été
calculés en fonction de la courbe 1. Puis, ces valeurs ont été remplacées par les
concentrations théoriques d’antigènes ajoutés aux échantillons standards de la courbe 1
pour déterminer la concentration en antibiotiques de l’extrait de fumier. Les tableaux 23 et
24 de l’annexe 10 présente le détail des résultats. Un ajustement du pH vers la neutralité a
permis d’éviter une surévaluation due à la destruction des anticorps. Dans un autre contexte
appliquant aussi de faibles dilutions, une centrifugation a pu diminuer le bruit de fond
(Annexe 10).
50
Tableau 9. Concentrations récupérées en chlortétracycline et en tylosine après enrichissement en fonction de la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et en fonction de la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif extrait de fumier de porc (courbe 2).
Courbe 1
(ppb)
Courbe 2
(ppb)
Concentration de
l’antibiotique selon
la courbe 1
(ppb) †
Concentration de
l’antibiotique selon
la courbe 2
(ppb) †
Essai CTC TYL CTC TYL CTC TYL
1 2 3 1* 2* 3** 1* 2* 3** 1* 2* 3**
0 0 0,057 - 0,69 0,021 - 0,73 0,011 - -
0,05 1 0,094 - 0,84 - - 1,66 - 0,069 0,89
0,15 5 0,20 - 1,96 0,45 - 11,89 0,18 0,14 16,02
0,45 10 0,59 - 5,64 0,56 - 16,48 0,24 0,14 25,60
1,35 50 0,83 - 12,42 0,33 - 25 0,11 0,53 46,60
4,05 100 1,61 - 21,89 0,44 - 37,16 0,19 0,40 78,12 † Les tirets indiquent des résultats hors de la courbe standard.
* Extraction de la chlortétracycline CTC (essai 1 : Méthode 1 du Tableau 7, essai 2 : Méthode 2 du Tableau 7)
** Extraction de la tylosine TYL (essai 3 : Méthode Tylosine du Tableau 7).
3.3 Discussion
La cartouche est utilisée pour purifier et concentrer l’échantillon ; la compagnie
explique que ce produit permet de dessaler les peptides et de récupérer les métabolites de
fluide biologique. Le passage des solutions de CTC semble le plus fiable dans la
cartouche HLB, car ses résultats ont été plus constants. Selon Himmelsbach (2005), 88,9
% des antibiotiques sont récupérés avec cette cartouche, ce qui se rapproche de la
moyenne des expériences exécutées (89,4 %). Les autres colonnes MCX et MAX
présentent une notable surévaluation de la concentration en antibiotique qui pourrait être
due à certaines contaminations détectées par ELISA. Structurellement, les cartouches
51
MAX et MCX diffèrent principalement par un anion chloré et un anion sulfate. Koivunen
et al. (2006) ont décelé des problèmes de surévaluation au niveau de la purification de
l’urine avec les colonnes MCX et HLB. Ces dernières possédaient une surévaluation d’au
moins 276 %. Ces auteurs ont réussi à faire diminuer le pourcentage de surévaluation
uniquement dans le cas de la MCX. La surévaluation peut aussi provenir de sous-produits
de dégradation de CTC détectés par l’ELISA (Aga et al., 2003) ou des interférences dues
à la matrice. Afin de minimiser les effets du background, Kumar et al. (2004) ont proposé
la formule ci-après pour augmenter la sélectivité du test ELISA.
Valeur d’inhibition = [(OD du contrôle négatif de la courbe sans fumier – OD de l’échantillon négatif avec
fumier/ OD de l’échantillon négatif avec fumier]*100
En soustrayant 100 % moins la Valeur d’inhibition, nous obtenons le % détecté sans
interférence. Cette formule n’a pas été utilisée dans la présente étude, car nous avons
privilégié une courbe de standards dilués directement dans l’extrait de fumiers (i.e.,
contrôle négatif).
Plusieurs auteurs utilisent des dilutions de 16 X ou 20 X avant de procéder à la
détection de l’antibiotique par ELISA afin de diminuer les interférences (Aga et al., 2003 ;
Dolliver et al., 2008). Une dilution de 200 X a dans notre cas permis de diminuer les
interférences en plus d’éviter la destruction des anticorps due à l’acidité du milieu. Puisque
les résultats de récupération de l’antibiotique utilisant la cartouche ou la dilution
s’équivalent, nous avons décidé de retirer l’étape du passage par HLB. Cette étape causait
une certaine lourdeur dans le protocole. En plus, la détection de l’antibiotique n’a pas
besoin de concentration, car l’ELISA possède une très petite limite de détection (0,05 ppb)
pouvant directement détecter la présence de tétracycline dans l’environnement. Pour ce qui
est de l’extraction (Tableaux 7 et 9), l’utilisation du bain à ultrasons durant 10-15 min, à
35°C semble suffisant dans la récupération des antibiotiques CTC et TYL. Dans la même
direction, le tampon McIlvain de pH 5 augmente le taux de récupération, alors que les
solutions de pH 9,0 ne semblent pas améliorer l’extraction par rapport à un pH de 8,0. Puis,
la filtration et la centrifugation permettent de diminuer les interférences. Enfin, dans une
étude de Morin et al., les anticorps peuvent reconnaître sans distinction plusieurs spores
52
fongiques retrouvés dans le sol. De ce fait, l’ELISA utilisant des anticorps pour la
quantification des antibiotiques distingue la CTC et la TYL difficilement dans le fumier et
il en résulte de fortes variations dans les concentrations détectées.
3.4 Conclusion
La détection des antibiotiques à partir d’une matrice aussi complexe que le fumier
constitue un défi. La méthode de détection ELISA utilisée est une bonne approche pour
déterminer de faibles concentrations d’antibiotiques. Des facteurs tels l’acidité et la matière
organique peuvent interférer et faire varier les valeurs. Pour une meilleure précision, les
échantillons peuvent être ajoutés aux puits en triplicata. La purification des échantillons
peut être améliorée par la filtration via l’utilisation de cartouches et de filtres, par la
centrifugation ou par la dilution. La méthode de détection ELISA est peu coûteuse et
relativement rapide. Néanmoins, le test de performance des cartouches démontre une
grande variabilité entre les répétitions et les essais présentent une sous-évaluation de la
concentration extraite à partir de 1,35 ppm. Dans les circonstances, il a été jugé utile
d’évaluer d’autres méthodes telles que la chromatographie en phase liquide couplée à la
spectrométrie de masse ou couplée à un détecteur UV.
53
Chapitre 4
Extraction et dosage de deux antibiotiques (chlortétracycline, tylosine) par LC-MS
4.1 Matériel et Méthodes
4.1.1 Fumiers
Des fumiers de bovin de boucherie exempts d’antibiotique ont été échantillonnés à
la « Ferme Saint-Joseph » de la région de Portneuf, Québec, Canada. Les échantillons frais
ont immédiatement été congelés dans des pots ‘Masson’ en verre, puis transportés dans une
glacière jusqu’au laboratoire. Les fumiers ont été lyophilisés à l’aide d’un lyophilisateur
Flexi-Dry MP Modèle FD-3-85A-MP (FTS Systems), puis broyés à 2 mm à l’aide d’un
broyeur à plantes.
4.1.2 Réactifs
Les produits chimiques utilisés comprenaient l’hydrochlorure de chlortétracycline
~80 %, la tylosine en solution (8 mg/mL), l’hydrochlorure de doxycycline ≥ 98 %, l’acide
formique, l’acide citrique monohydrate ACS, le sel Na2EDTA dihydrate USP/FCC, l’acide
orthophosphorique (H3PO4), le phosphate de sodium dibasique anhydreux (Na2HPO4),
l’acétonitrile, le méthanol, le carbonate de sodium anhydreux ACS (Na2CO3), l’hydrogéno-
carbonate de sodium (NaHCO3), le chlorure de sodium, le dihydrogénophosphate de
potassium (KH2PO4), le chlorure de potassium et le tween 20. Tous les standards et les
solvants étaient de type analytique ou de grade HPLC. L’eau était de type Millipore.
54
4.1.3 Matériel
Pour extraire et purifier, un bain à ultrasons de modèle 550HT, des cartouches Oasis
HLB 200 mg/ 6cc et des filtres mini-uniprep sans seringue à 0,2 µm en PVDF avec un
contenant en polypropylène ont été utilisés. L’évaporateur de solvants était un Reacti-
Therm Dry Block heating modules (Pierce). La colonne pour le LC-MS était la BDS
Hypersil C8 100 X 2,1 (Thermo Walthman, MA). Le LC est un Agilent 1100 et le MS, un
Leco Unique TOF, avec un autosampler (Model 717 ; Waters Milford, MA) et un détecteur
(Modem Tm 996 de chez Waters). La vaisselle était composée de polypropylène ou de
verre afin de minimiser la sorption de la CTC sur les parois (Ciarlone et al., 1990). Toute la
vaisselle a été lavée avec un savon spécial, le Liqui-Nox, puis rincée avec de l’eau
déminéralisée. La vaisselle a aussi été rincée avec du méthanol ou de l’éthanol 70 %.
4.1.4 Méthode LC-MS
4.1.4.1 Extraction des antibiotiques contenus dans le fumier de porc
Le suivi des poids et des volumes se fait avec une grille (Annexe 1). La méthode
d’extraction des antibiotiques se résume comme suit :
A) Enrichissement du fumier
1. 2 g de fumier frais sont pesés et mis dans un tube à centrifuger en verre de 50 mL
(Noter le poids exact en Annexe 1).
2. Les échantillons de fumiers sont enrichis par les antibiotiques directement dans les
tubes. L’enrichissement s’est fait avec l’ajout de 2 mL d’une solution de
concentration en antibiotiques connue (200 ppm, 1000 ppm, 5000 ppm de CTC par
matière sèche de fumier ; 160 ppm, 800 ppm, 4000 ppm de TYL par matière sèche
de fumier) et diluée dans du méthanol. De l’acétone a été ajouté jusqu’à saturation
de l’échantillon (méthode inspirée de O’Connor et al., 2007 ; Li et al., 1996 ; Ball et
Roberts, 1991).
55
3. Le tout a été mélangé au vortex et laissé ouvert sous la hotte, à la noirceur, pendant
une nuit (O’Connor et al., 2007 ; Li et al., 1996 ; Ball et Roberts, 1991).
4. Pour assurer un équilibre des antibiotiques s’appareillant aux conditions
environnementales, les échantillons étaient laissés au repos pour une autre période
(24 h) à la température de la pièce et à la noirceur (O’Connor et al., 2007 ; Li et al.,
1996 ; Ball et Roberts, 1991).
B) Extraction des antibiotiques contenus dans du fumier
5. 2 g de fumier lyophilisé est pesé et mis dans un tube à centrifuger en verre de 50
mL.
6. Les échantillons de fumier sont enrichis directement dans les tubes.
7. Les suspensions de fumier sont laissées au repos sous la hotte pendant une nuit.
8. 8 mL de solution d’humidification du fumier et d’équilibration de pH (1 M d’acide
citrique monohydrate + 1 M Na2HPO4 dans de l’eau) est ajoutée aux suspensions de
fumier.
9. Les suspensions sont mélangées au vortex 30 sec et sont laissées au repos pendant 5
min.
10. 6 mL de la solution extractive (50 % de tampon citrate pH 3,0 [0,2 M d’acide
citrique, 0,042 M Na2HPO4] + 50 % d’acétonitrile) est ajoutée à la suspension de
fumier.
11. La suspension est mélangée au vortex pendant 30 sec, puis déposée dans un bain à
ultrasons pendant 10, 20 ou 30 min, à 75°C
12. La suspension est mélangée au vortex pendant 1 min.
13. Les suspensions de fumier sont centrifugées à 3400 rpm, pendant 5 min et le
surnageant est décanté dans un Erlenmeyer d’une capacité de 500 mL.
14. 6 mL de la deuxième solution extractive (20 % 1 M de tampon citrate [1 M d’acide
citrique, 0,05 M Na2HPO4] + 80 % méthanol) est ajouté à l’échantillon de fumier.
Le tout est mélangé au vortex pendant 30 sec et déposé dans un bain à ultrasons
pendant 10, 20 ou 30 min, à 60°C.
15. Les suspensions de fumier sont centrifugées à 3400 rpm pendant 5 min, puis le
surnageant est décanté dans le même Erlenmeyer.
56
16. Au culot est ajouté 6 mL de la troisième solution extractive (50 % tampon carbonate
de pH 9,3 [0,2 M NaHCO3, 22 mM Na2CO3, 0,02 M Na2EDTA] + 50 % de
méthanol). Le tout est mélangé au vortex pendant 30 sec et déposé dans un bain à
ultrasons pendant 10, 20 ou 30 min, à 60°C.
17. Les suspensions de fumier sont centrifugées à 3400 rpm pendant 5 min, puis le
surnageant est décanté dans le même Erlenmeyer.
18. 5 mL du surnageant combiné est ensuite prélevé et mis dans un tube de verre de 15
mL.
19. 50 µL d’acétonitrile est ajouté au prélèvement. Le tout est mélangé au vortex
pendant 30 sec et laissé au repos pendant 10 min. L’ajout d’acétonitrile et le temps
de repos permet de faire précipiter les protéines.
20. Avant l’utilisation de la cartouche (méthode SPE), l’échantillon est dilué dans de
l’eau déminéralisée jusqu’à 220 mL puis est ajusté à un pH de 3,0 avec de l’acide
formique 1 N. (Noter les poids concernant la SPE en Annexe 1)
21. Un standard interne ayant une concentration légèrement plus élevée que la plus forte
concentration d’antibiotique à détecter (10 000 ppm de doxycycline) est ajouté.
22. La cartouche HLB est conditionnée avec 2 x 3 mL de méthanol et 2 x 3 mL d’eau
Millipore.
23. L’échantillon est ajouté à la cartouche et laissé écouler à un débit de 5 mL/min.
24. La cartouche est rincée avec 10 mL d’eau Millipore.
25. Elle est séchée durant 15 min. Le tube est alors changé pour un autre tube propre.
26. L’élution se fait avec 2 x 3 mL de méthanol.
27. Le méthanol est évaporé.
28. 1 mL de méthanol est ajouté et la solution est filtrée avec les mini-seringues.
29. Les antibiotiques contenus dans la solution de méthanol sont enfin dosés au LC-MS.
4.1.4.2 Détection des antibiotiques par LC-MS
La détection par LC-MS a été réalisée selon les directives préconisées par Díaz-
Cruz et al. (2003). Les standards formant la courbe de calibration étaient les solutions
mères (dilution de CTC dans de l’acétone seulement) utilisées pour l’enrichissement des
57
fumiers préalablement conservés à –20°C. Lors du passage au LC-MS, les solvants
permettant la séparation des antibiotiques étaient : 0,5 % d’acide formique dans de l’eau
(solvant A) et 0,5 % d’acide formique dans de l’acétonitrile (Solvant B). Les solutions à
doser ont subi une purification par SPE, une évaporation, puis une filtration. Trois
répétitions ont été exécutées pour chacune des concentrations. Un autre paramètre a été
évalué en parallèle : la durée de l’exposition des solutions à doser aux ultrasons, soit 10 min
(1e répétition), 20 min (2e répétition) ou 30 min (3e répétition). Un seul type de fumier
biologique a été utilisé, soit le fumier de bovin de boucherie lyophilisé.
58
4.2 Résultats L’utilisation du LC-MS avait comme but de déterminer si une une valeur extrême
d’un paramètre d’extraction (temps d’exposition aux ultrasons, température) pouvait
engendrer une extraction d’une quantité importante d’antibiotiques. Les résultats du taux de
récupération de la TYL en fonction du temps d’exposition dans un bain à ultrasons sont
présentés à la Figure 9. La CTC n’a pas été détectée et seule la TYL y est représentée.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
Concentration de tylosine ajoutée au fumier (ppm)
Air
e s
ou
s la
co
urb
e
Courbe standard 10 min d'exposition aux ultrasons
20 min d'exposition aux ultrasons 30 min d'exposition aux ultrasons
Figure 9. Taux de récupération de la tylosine (TYL) provenant de fumier de bovin de boucherie enrichis, en fonction du temps d’extraction aux ultrasons (10, 20, 30 min).
59 La méthode d’extraction utilisée a produit un taux de récupération de la TYL se
situant entre 1,3 et 22 %. Le taux de récupération de la CTC était nul (Tableau 10).
Les résultats montrent que la méthode d’extraction élaborée en fonction des
paramètres les plus extrêmes de la littérature n’était pas à privilégier. La CTC se dégrade
peu importe le temps d’exposition aux ultrasons. Quant à la TYL, seules les concentrations
les plus élevées restent détectables. Les données du Tableau 10 laissent indiquer qu’elle se
dégrade avec l’augmentation du temps d’exposition dans un bain à ultrasons. Un temps
d’extraction aux ultrasons moins élevé a donc permis une meilleure récupération des
antibiotiques. Les spectres des antibiotiques CTC et TYL ainsi que le chromatogramme de
la TYL sont présentés en annexe (Annexe 8).
Tableau 10. Taux de récupération de deux antibiotiques détectés par LC-MS à partir d’échantillons de fumier de bovin de boucherie lyophilisé préalablement enrichis.
Temps d'extraction aux ultrasons
(min) Taux de récupération des antibiotiques
(%) CTRL- N/A
Concentration A* CTC Tylosine 10* N/A N/A 20 N/A N/A 30 N/A N/A
Concentration B** CTC Tylosine 10 N/A N/A 20 N/A 1,3 30 N/A 1,36
Concentration C*** CTC Tylosine 10 N/A 21,8 20 N/A 17,6 30 N/A 4,82
* Concentrations : 200 ppb de CTC, 160 ppb de tylosine
** Concentrations : 1000 ppb de CTC, 800 ppb de tylosine
*** Concentrations : 5000 ppb de CTC, 4000 ppb de tylosine
60
4.3 Discussion
L’élaboration du présent protocole se base principalement sur les tampons
d’extraction (ingrédients, pH). Le choix des solutions d’extraction a été fait en fonction de
la littérature (Aga et al., 2005; Ötker et al., 2007; Hemwimol et al., 2006; Jacobsen et al.,
2006; O’Connor et al., 2007). Trois tampons ont été utilisés afin d’extraire le maximum de
CTC possible. La première solution permet de solubiliser la CTC et la TYL sous forme
protonée. Le deuxième mélange méthanol/tampon a été utilisé par Jacobsen et al. (2006)
qui ont souligné l’importance de la proportion 80 : 20 pour une meilleure efficacité. Son pH
de 2,4 a été utilisé par De Liguoro et al. (2003) afin d’extraire la TYL du miel. Ce pH
permet de récupérer les antibiotiques sous leur forme complètement protonée. Aga et al.
(2005) ont aussi utilisé une solution très acide (1 M acide citrique) et ont obtenu une
récupération presque totale de l’antibiotique avec des échantillons de sol. En parallèle,
Sassman et al. (2005) n’ont pas observé de résultats équivalents avec la solution de 1 M
d’acide citrique ; ils n’ont récupéré que 3,5 % de la CTC dans un sol canadien. Malgré
plusieurs variabilités du taux de récupération dans la littérature, tous s’accordent sur une
meilleure solubilisation de la CTC à pH basique. D’ailleurs, le dernier tampon (50 %
tampon carbonate + 50 % de méthanol) a un pH basique de 9,3. Un pH basique permet
d’extraire plus de CTC qu’un pH acide (Ter Laak et al., 2006 ; Sassman et al., 2005). En
effet, la CTC est à ce moment repoussée par les forces présentes provenant des autres
composantes du milieu et augmente sa solubilité.
Les résultats démontrent un faible taux de récupération suite à l’extraction
sélectionnée. Plusieurs paramètres peuvent expliquer ce faible taux : le pH des solutions, la
température, le temps d’incubation aux ultrasons et le temps d’attente avant la détection (16
h). Le pH des solutions n’est probablement pas la principale cause de dégradation de la
CTC. Plusieurs auteurs rapportent la stabilité des tétracyclines à pH acide (Iwaki et al.,
1992 ; Blanchflower et al., 1989). Peña et al. (1999) ont pu démontrer une absence de perte
des tétracyclines dans un tampon McIlvain de pH 4 durant une période de trois jours. Il a
aussi été prouvé que la CTC était plus persistante à pH 3-4 qu’à des pH supérieurs
61
(Søeborg et al., 2004). Or, dans le présent projet, l’extraction n’utilise qu’un seul pH
basique et il n’y prend place qu’à la fin ; le pH n’est donc pas la cause principale de la
dégradation.
La température et le temps d’exposition dans un bain à ultrasons ont pu favoriser la
dégradation des antibiotiques. En effet, à partir de 10 min, plus le temps d’exposition
augmente, plus la perte en antibiotiques augmente. Selon Jacobsen et al. (2006), la
température n’engendre pas de dégradation à 75°C, durant 5 min. Par contre, pour une
durée de 10 min d’incubation aux ultrasons, les températures de 60°C et de 75°C semblent
être trop élevées. D’ailleurs, les résultats obtenus par LC-UV ont montré une amélioration
au-dessus de 35°C, mais aussi une détérioration à partir de 60°C (Chapitre 5). Sans
utilisation des ultrasons, Simon (2005) a dû faire l’extraction de l’OTC à la température de
la pièce pour une période optimale de 2 h avec une solution de 1 M MgCl2 pH 8
(récupération de 60 à 113 % pour des concentrations de 5 à 10 ppm). Les ultrasons
permettent donc de diminuer grandement le temps d’extraction avec un maximum de 10
min.
D’autres facteurs restent à considérer : le temps d’attente dans le méthanol et
l’évaporation de la solution. Le temps d’attente avant la détection peut être critique, comme
l’ont déjà indiqué les tests de 24 h et 48 h au LC-UV (Chapitre 5). Ce paramètre peut être
une cause de la dégradation des antibiotiques. Les éluats ont été placés à –20°C durant 16
h, dans un solvant de méthanol pur, puis laissés évaporés pendant 3 h. Or, les expériences
sur le LC-UV ont permis d’observer une tendance vers une perte d’au moins la moitié de la
concentration des antibiotiques extraits de fumier à chaque jour et lorsqu’il n’y a que du
méthanol pur sans fumier (standards), en 24 hrs, la CTC et la TYL sont éliminées (Chapitre
5). Les concentrations des extraits de fumiers et des standards ont probablement été
réduites avant détection. En plus, la limite de détection étant maximisée à 200 ppb dans
l’eau, le LC-MS n’a pas pu détecter la plupart des antibiotiques dans une matrice d’extrait
de fumiers, moins pure que de l’eau. Pour ce qui est de l’évaporation, certains auteurs n’ont
rapporté aucune perte des tétracyclines, alors que d’autres indiquent une perte d’environ 30
% dans le méthanol pur (Onji et al., 1984). Si le méthanol était mélangé à de l’acide
62
oxalique, les pertes de tétracyclines auraient été dues à l’acidité (Mulders et Van de
Lagemaat, 1990 ; Ikai et al., 1987), ce qui n’est pas le cas présent. L’évaporation ne devrait
donc pas être une cause majeure de perte pour cette expérience. Enfin, la forte température,
le temps d’exposition aux ultrasons et le temps d’attente prolongé dans le méthanol ont
contribué à diminuer le taux d’extraction de la CTC.
4.4 Conclusion
Le LC-MS de type TOF est une technique dispendieuse avec une limite de détection
de 200 ppb. La détection par LC-MS nous a permis de déceler des lacunes dans les
méthodes d’extraction et de conservation. Des traitements trop sévères durant l’extraction,
dont la température et le temps d’exposition aux ultrasons, ainsi que la possibilité d’un
temps d’attente trop long dans le méthanol ont engendré une forte perte des antibiotiques
ciblés. Étant donné qu’il est difficile de déterminer la quantité d’antibiotique par LC-MS
dans un bruit de fond élevé, la méthode de Blackwell et al., 2004b utilisant la LC-UV a été
essayée.
63
Chapitre 5
Extraction et dosage de trois antibiotiques par LC-UV
5.1 Matériel et méthodes
5.1.1 Fumiers
Les fumiers de porc et de bovin de boucherie exempts d’antibiotique proviennent de
la « Ferme Saint-Joseph » de la région de Portneuf, Québec, Canada. Les fumiers de bovin
laitier et de veau exempts d’antibiotique proviennent de la « Ferme Côté et fils » de
Cacouna, Québec, Canada. Tous les fumiers sauf le fumier de bovin de boucherie étaient
mélangés avec de la paille. Les échantillons ont immédiatement été congelés dans des pots
‘Masson’ en verre, puis transportés dans une glacière jusqu’au laboratoire. Le fumier a été
décongelé avant chaque expérience. Le fumier de veau a été lyophilisé à l’aide d’un
lyophilisateur Flexi-Dry MP Modèle FD-3-85A-MP (FTS Systems).
5.1.2 Réactifs
Les réactifs chimiques utilisés étaient l’hydrochlorure de doxycycline ≥ 98 %, de
chlortétracycline ~80 %, d’oxytétracycline, d’oxytétracycline de qualité BioChemika, la
tylosine en solution (8 mg/mL), l’acide citrique monohydrate ACS, le sel Na2EDTA
dihydrate USP/FCC, le tetrahydrofurane (THF), l’acide trifluoroacétique (TFA), l’acide
orthophosphorique (H3PO4), l’acétate de sodium trihydrate (NaOAc*3H2O), le phosphate
de sodium dibasique anhydreux (Na2HPO4), l’acétonitrile et le méthanol. Tous les
standards et les solvants étaient de type analytique ou de qualité HPLC.
64
5.1.3 Matériel
Le matériel utilisé comprenait un bain à ultrasons de modèle 550HT, des tubes à
centrifuger de 15 mL en verre, des vials ambrés de 1 mL, des filtres de nylon de membrane
hydrophilique 0,2 μm/46 mm, des filtres mini-uniprep sans seringue à 0,2 µm (en PVDF)
avec un contenant en polypropylène, des cartouches Isolute SAX 200 mg/3 mL et Oasis
HLB 200 mg/ 6cc. Pour les spectres qualitatifs des antibiotiques, le spectrophotomètre UV-
visible utilisé était un Hewlett Packard. Pour les analyses HPLC-UV, les systèmes utilisés
étaient un détecteur Waters 986 Tunable absorbance, un contrôleur Waters 600, un
dégazeur X-Act (Jour research), un échantillonneur automatique Waters 717 plus. Le
matériel procuré pour le HPLC était une colonne Genesis C18 (4,6 X 150 mm, 4 μm), une
colonne de garde C18 (10 x 4 mm, 4 μm) et un soutien de la colonne (10 mm). La vaisselle
était lavée avec un savon spécial, le Liqui-Nox d’Alconox et rincée avec de l’eau
déminéralisée. Puis, la vaisselle était aussi rincée avec du méthanol ou de l’éthanol 70 %.
5.1.4 Méthodes d’extraction, de purification et de détection
5.1.4.1 Enrichissement en antibiotiques des fumiers
Le suivi des poids et des volumes se fait avec une grille (Annexe 1).
L’enrichissement se définit ici comme l’ajout d’une solution de concentration connue
d’antibiotiques à un échantillon de fumier (2 g). La vaisselle a été rincée avec une solution
de méthanol saturée en EDTA (Hamscher et al., 2002). Une solution contenant les
antibiotiques était préparée. Les antibiotiques CTC et OTC furent d’abord pesés (0,05 g) et
dilués dans 100 mL d’eau Millipore. La solution a ensuite été agitée durant 5 min, à 250
rpm sur un agitateur par mouvement circulatoire. Puis, dans une dilution de 10 X, la TYL
en solution 8 mg/mL a été ajoutée. Des dilutions successives ont été réalisées afin obtenir
des concentrations finales de 1, 5 et 20 mg/L. La suspension de fumier a été agitée et
laissée au repos pendant 1 h à la température de la pièce.
65
5.1.4.2 Solutions
1. Tampon McIlvain : 0,2 M d’acide citrique (4,2 g dans 100 mL) et 0,4 M Na2HPO4
(5,68 g dans 100 mL).
2. Solution extractive : 0,1 M EDTA/ tampon McIlvain 50 :50. Un volume de 35,3 mL
de 0,2 M acide citrique est mélangé à 164,7 mL de 0,4 M Na2HPO4. Le tampon
McIlvain est ajouté à la solution 0,1 M EDTA (3,72 g dans 100 mL) dans une
proportion de 50 :50.
5.1.4.3 Paramètres de la méthode de détection
Dans la méthode de détection, les longueurs d’onde utilisées ont d’abord été
comparées (285 nm et 355 nm). Ensuite, les paramètres de l’extraction suivants ont été
testés : la dégradation des antibiotiques dans le méthanol, le type de fumier de ferme, le
temps de contact entre l’antibiotique et le fumier, la concentration en solutés de la solution
extractive, le volume de la solution et la température lors de l’extraction aux ultrasons.
Enfin, plusieurs méthodes d’extraction en phase solide (SPE) ont été évaluées. Les
paramètres d’extraction et de détection sont résumés au Tableau 11. Ils sont présentés en
ordre chronologique d’essais. La méthode générale est présentée à la Figure 10.
66
Tableau 11. Paramètres de l’extraction et de la détection des antibiotiques évalués par LC-UV.
Paramètre analysé Description Longueurs d’onde utilisées (nm)
285 nm 355 nm
Dégradation des antibiotiques dans le méthanol (h)
Expérience 1 (Enrichissement dans de l’eau et extraction) : 10 à 28 h Expérience 2 (Enrichissement dans le fumier de porc et extraction): 0,7 à 7,1 h
Type de fumier de ferme Fumier de porc Fumier de bovin de boucherie Fumier de veau lyophilisé
Temps de contact entre l’antibiotique et le fumier (min)
Expérience 1 : 15, 60, 80 min Expérience 2 : 0, 15, 60, 120, 180, 240 min
Concentration en solutés de la solution extractive (facteur multiplicateur X)
0,5 X 1 X 2 X
Volume de la solution extractive ajoutée (mL)
8, 16, 24, 32, 40, 48 mL
Température de l’eau du bain à ultrasons (°C)
25, 35, 40, 43, 45, 50, 60 °C
Type de méthode d’extraction en phase solide (SPE) selon le conditionnement et le rinçage des cartouches
Voir Tableau 12 pour Méthodes 1 à 4
67
5.1.4.4 Extraction des antibiotiques
(Blackwell et al., 2004b)
Le suivi des poids et des volumes se fait avec une grille (Annexe 1). La méthode
d’extraction des antibiotiques se résume comme suit :
A) Enrichissement des fumiers
1. 2 g de fumier frais ou lyophilisé sont pesés et mis dans un tube à centrifuger en
verre de 50 mL.
2. Les échantillons de fumiers sont enrichis par les antibiotiques directement dans les
tubes.
B) Extraction de l’antibiotique
3. Un volume de 8 mL (16 mL, 24 mL, 32 mL, 40 mL, 48 mL aussi testés) de solution
extractive est ajouté au fumier enrichi.
4. Les suspensions de fumier sont mélangées au vortex pendant 30 sec.
5. Les suspensions de fumier sont placées dans un bain à ultrasons durant 10 min à la
température de la pièce (25, 35, 40, 45, 50, 60°C aussi testés).
6. Elles sont centrifugées à ~ 1200 g (3000 rpm), pendant 15 min.
7. 5 mL (ou selon le volume de solution extractive initialement ajoutée soit 9 mL, 13
mL, 17 mL, 21 mL, 25 mL) du surnageant combiné sont prélevés et introduits dans
un tube de verre de 15 mL (ou 50 mL).
8. 50 µL d’acétonitrile et 50 µL d’acide phosphorique (ou selon le volume de solution
extractive initialement ajoutée soit 90, 130, 170, 210, 250 µL) sont ajoutés au
prélèvement afin de précipiter les protéines.
9. Le tout est mélangé au vortex pendant 30 sec et est laissé au repos pendant 10 min.
Une étape de centrifugation (5 min, à 3000 rpm) non mentionnée dans la méthode de
Blackwell et al. (2004b) fut ajoutée au protocole. En effet, le sel d’EDTA ainsi que d’autres
composés de la matrice ont précipité en milieu acide ; ceux-ci bloquaient alors les pores de
la cartouche SAX et l’échantillon stagnait sans possibilité d’élution.
68
5.1.4.5 SPE (Solid Phase Extraction ou Extraction en phase solide)
L’extraction à phase solide a été réalisée selon la procédure décrite par Blackwell et
al. (2004a) avec quelques modifications (Tableau 12). Ces modifications se trouvent au
niveau du préconditionnement des cartouches ainsi qu’au niveau de leur rinçage. Les
cartouches placées en tandem SAX-HLB ont été préconditionnées avec 5 mL de méthanol
et 5 mL de solution extractive acidifiée (10 mL/min). Puis, le volume de 5 mL
d’échantillon a été versé dans les cartouches et son débit était contrôlé à 1 mL/min (les
débits sont suggérés par la compagnie Waters). La cartouche SAX a ensuite été retirée. La
cartouche HLB a été rincée à 10 mL/min avec 5 mL d’une solution McIlvain acidifiée, 2,5
mL de 0,1 M NaOAc, 5 mL d’eau et 2 mL de solution à 20 % de méthanol. La cartouche a
été séchée à l’aide d’une pression sous vide durant 10 min. Le tube de réception fut par la
suite changé pour un tube propre préalablement pesé. L’élution s’est faite avec 2 x 1 mL de
méthanol à 1 mL/min. Une étape de filtration à 0,2 μm avec des mini-seringues a été
additionnée en prévention d’un bris de la colonne HPLC.
69
Tableau 12. Type de méthode SPE et les modifications apportées au protocole de Blackwell et al. (2004a).
Type de méthode
Mode opératoire
Méthode 1 Blackwell et al., 2004a, protocole original
Méthode 2
Préconditionnement : 3 mL de méthanol, 3 mL d'eau Millipore, 3 mL de
solution extractive acidifiée (débit de 10 mL/min).
Rinçage de HLB : 4 mL de solution 5 % méthanol, 4 mL de 0,1 NaOAc,
4 mL d'eau Millipore et 1 mL de solution 20 % méthanol.
Méthode 3 Préconditionnement : 3 mL de méthanol, 3 mL d'eau Millipore, 3 mL de
solution extractive acidifiée (débit de 10 mL/min)
Rinçage de HLB : 1 mL de solution 5 % méthanol, 1 mL de 0,1 NaOAc,
1 mL d'eau Millipore et 1 mL de solution 20 % méthanol.
Méthode 4 Rinçage de SAX et HLB : 5 mL de tampon acidifié. Retirer SAX. 1 mL
de solution 5 % méthanol, 1 mL de 0,1 NaOAc, 1 mL d'eau Millipore et 1
mL de solution 20 % méthanol.
70
5.1.4.6 Dosage par LC-UV
(Blackwell et al., 2004b)
La méthode du LC-UV utilisait trois solvants pour faire son gradient d’élution :
THF (solvant A), acétonitrile (solvant B), 0,05 % TFA dans de l’eau Millipore et filtré à 0,2
μm (solvant C). Le débit est resté à 1 mL/min tout le long de l’expérience. La
programmation s’est exécutée comme au Tableau 13. Tous les solvants étaient
préalablement dégazés dans un bain à ultrasons avant l’analyse. La température de
l’échantillonneur automatique variait entre 6 et 8 °C.
Tableau 13. Programmation utilisée pour la quantification des antibiotiques par LC-UV.
Durée (min) Solvant A (%) Solvant B (%) Solvant C (%)
0-4 5 2,5 92,5
4-18 5 75 20
18-20 5 2,5 92,5
20-25 (équilibration) 5 2,5 92,5
Une grille (Annexe 1) permet d’apporter une meilleure précision au cours de
l’exécution de l’expérience. Par le suivi des pesées et non de volumes théoriques, les
données permettent un calcul plus précis de la dilution finale de l’échantillon.
71
Figure 10. Schéma de l'extraction des antibiotiques.
5.1.5 Expérience de sorption de la CTC dans un fumier de porc
5.1.5.1 Méthode de sorption de l’antibiotique dans un fumier de porc
Un volume de 20 mL de solutions avec des concentrations croissantes en CTC (20
ppm, 10 ppm, 5 ppm et 1 ppm) a été ajouté à 2,0 g de fumier de porc (frais ou lyophilisé),
puis mélangé par vortex. Un temps de contact d’une heure a été accordé, puis la suspension
de fumier a été centrifugée à 3000 rpm, pendant 15 min. La suspension a ensuite été
décantée dans un autre tube et conservée pour le dosage de l’antibiotique dans le surnageant
par LC-UV. Un volume d’eau (20 mL) a été ajouté au culot de fumier et mélangé au vortex
pour éliminer l’excès d’antibiotique n’ayant pas réagi avec le fumier. Après 30 min, la
suspension de fumier a été centrifugée. Le surnageant fut alors jeté. La quantité adsorbée de
72
l’antibiotique par le fumier a été par la suite extraite de la même façon que décrite
précédemment (sections 5.1.4.4 à 5.1.4.6). La température d’extraction était de 41,5°C, le
tampon d’extraction était de concentration en solutés 2 X et le volume de la solution
extractive était de 8 mL. Il est à noter que la température du bain à ultrasons avait été
préalablement ajustée à 43°C, mais l’eau n’avait en fait qu’atteint réellement 41,5°C.
5.1.5.2 Calculs
Les calculs ont été faits en fonction du poids de la solution d’antibiotiques ajoutée
aux échantillons (Annexe 1). Le fumier était considéré ici comme une matrice de sorption,
faisant obstacle à la récupération de l’antibiotique. Le taux de récupération était donc basé
sur la récupération de la concentration d’antibiotiques initiale.
Les calculs de la section 5.1.5 sont définis comme suit :
1) Adsorption de l’antibiotique par les constituants du fumier (Phase 1)
Qajoutée = Quantité d’antibiotique ajoutée au fumier (mg/kg)
C = Concentration de l’antibiotique dans la solution d’équilibre (mg/kg)
Quantité adsorbée = Qajoutée – C
Quantité d’antibiotique adsorbé (%) = Quantité adsorbée X 100
Qajoutée
2) Extraction de l’antibiotique adsorbé par le fumier (Phase 2)
Quantité d’antibiotique désorbée = Quantité dosée dans l’extrait (mg/kg)
% de l’antibiotique désorbé = Quantité désorbée (Phase 2)
Quantité adsorbée (Phase 1)
73
5.2 Résultats
5.2.1 Extraction et dosage des antibiotiques
Les spectres des trois antibiotiques testés (OTC, CTC, TYL) ont été effectués à une
concentration de 20 ppm (Tableau 14).
Tableau 14. Principaux pics révélés par balayage du spectre d’antibiotiques (190 à 600 nm).
Type d’antibiotique Longueur d’onde du pic (nm) Absorbance du pic
250 0,61569
277 0,57055 OTC
355 0,46181
229 0,72935
275 0,57749 CTC
369 0,41209
290 0,49203
485 0,00047112 TYL
581 0,0013204
Les expériences d’extraction et de détection par LC-UV ont suivi le protocole établi
par Blackwell et al. (2004b). Les résultats sont présentés sous forme de taux de
récupération d’antibiotiques après leur ajout dans une matrice de fumier de ferme. Les
chromatogrammes figurent à l’annexe 3. Un paramètre a d’abord été testé : la longueur
d’onde de détection. Puis, plusieurs variables ont été évaluées : la dégradation des
antibiotiques dans le méthanol, le type de fumier de ferme, le temps de contact entre
l’antibiotique et le fumier, la concentration en solutés de la solution extractive, le volume
de la solution, la température lors de l’extraction au bain à ultrasons et le type de méthode
SPE.
74
5.2.1.1 Longueur d’onde de détection
Une courbe standard a d’abord été déterminée avec la LC-UV pour deux longueurs
d’onde : 285 nm et 355 nm (Annexes 5, 6 et 7). Deux courbes standards diluées dans l’eau
et une courbe diluée dans le méthanol ont été comparées. La moyenne des deux courbes
standards diluées dans l’eau a été sélectionnée afin de prédire la concentration des
antibiotiques, à partir de l’aire sous la courbe des pics détectés par LC-UV. La courbe
diluée dans le méthanol présentait de l’instabilité et a ainsi été rejetée (Annexe 7).
Les longueurs d’onde ont aussi été comparées dans les extraits de fumier de porc,
après enrichissement de 20 ppm en OTC et en CTC (Tableau 15, Figures 11 et 12). Les
échantillons détectés à 355 nm ont engendré un pourcentage de récupération des deux
antibiotiques (OTC, CTC) moins élevé qu’avec une détection à 285 nm. Les taux de
récupération à partir d’extraits de fumier de porc en fonction de la longueur d’onde de
détection ont donc résulté comme suit : 285 nm (8,1 à 90,6 %) > 355 nm (0 à 54,1 %) pour
l’OTC (Figure 11) et 285 nm (9,5 à 88,4 %) > 355 nm (0 à 32,8 %) pour la CTC (Figure
12).
75
Tableau 15. Quantité d’antibiotiques (OTC, CTC) extraits du fumier de porc après enrichissement de 20 ppm en fonction de deux longueurs d’onde (285 nm et 355 nm).
Quantité extraite
(ppm)
Taux de
récupération
(%)
Taux
d’adsorption
(%) Antibiotique
Quantité ajoutée
(ppm)
285 nm 355 nm 285 nm 355 nm 285 nm 355 nm
20 4,84 3,52 24,2 17,6 75,8 82,4
20 3,2 2,24 16 11,2 84 88,8
20 1,62 1,34 8,1 6,7 91,9 93,3
20 13,36 5,48 66,8 27,4 33,2 72,6
20 18,12 2,54 90,6 12,7 9,4 87,3
20 8,52 8,22 42,6 41,1 57,4 58,9
20 9,86 8,76 49,3 43,8 50,7 56,2
20 3,94 0 19,7 0 80,3 100
20 8,56 5,26 42,8 26,3 57,2 73,7
20 5,16 5,7 25,8 28,5 74,2 71,5
20 5,2 5,74 26 28,7 74 71,3
20 10,34 10,82 51,7 54,1 48,3 45,9
OTC
20 4,84 3,52 24,2 17,6 75,8 82,4
20 2,82 1,74 14,1 8,7 85,9 91,3
20 2,34 0 11,7 0 88,3 100
20 1,9 0,5 9,5 2,5 90,5 97,5
20 8,04 3,16 40,2 15,8 59,8 84,2
20 17,68 1,5 88,4 7,5 11,6 92,5
20 5,04 6,56 25,2 32,8 74,8 67,2
20 20,2 3,02 101 15,1 -1 84,9
20 4,22 4,32 21,1 21,6 78,9 78,4
20 4,84 0,608 24,2 3,04 75,8 96,96
20 7,48 6,48 37,4 32,4 62,6 67,6
CTC
20 2,82 1,74 14,1 8,7 85,9 91,3
76
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Taux de récupération à 285 nm
Ta
ux
de
ré
cup
éra
tio
n à
35
5 n
m
Extrait de fumier de porcs Extrait aqueux
Figure 11. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) après extraction dans l’eau ou du fumier de porc en fonction de la longueur d’onde. Extrait de fumier de porc (n = 11). Extrait aqueux (n = 5).
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Taux de récupération à 285 nm
Tau
x de
réc
upé
rati
on à
355
nm
Extrait de fumier de porcs Extrait aqueux
Figure 12. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) après extraction dans l’eau ou du fumier de porc en fonction de la longueur d’onde. Extrait de fumier de porc (n = 10). Extrait aqueux (n = 5).
77
5.2.1.2 Dégradation des antibiotiques dans le méthanol
Lorsque les antibiotiques testés en combinaison étaient extraits de l’eau (milieu
aqueux sans fumier), la dégradation des antibiotiques était plus rapide que lorsqu’ils étaient
extraits du fumier de porc. Les extraits aqueux ont montré qu’un temps d’attente de 28 h
détruisait les antibiotiques (Figure 13). La Figure 13 démontre aussi la dégradation de
l’OTC extraite du fumier de porc en fonction du temps d’attente dans le méthanol. Les
extraits de fumier de porc sont passés d’un taux de récupération de 16-24,2 % pour l’OTC,
de 11,7-14,1 % pour la CTC et de 34,4-39,5 % pour la TYL à 0 % pour les trois
antibiotiques en 52 h (Annexe 2). Une exception au niveau d’un extrait de fumier de porc
ayant prédisposé d’un temps de contact de 180 min a vu son faible taux de récupération
diminuer de 1 % seulement après 52 h (Annexe 2). En revanche, les résultats de la Figure
14 ont démontré qu’un temps d’attente de 7 h n’a pas d’effet significatif sur la dégradation
des antibiotiques dans le méthanol. Un temps d’attente maximal de 7 h a d’ailleurs été
adopté afin de minimiser cette dégradation.
0
20
40
60
80
100
120
9 28 52
Temps de contact entre l'OTC et le fumier (min)
Tau
x d
e ré
cup
érat
ion
de
l'OT
C (
%)
Extrait de fumier de porcs avec temps de contact de 15 min
Extrait de fumier de porcs avec un temps de contact de 180 min
Extrait aqueux
Figure 13. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) des extraits aqueux et de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps d’attente dans le méthanol. Extrait de fumier de porc (n = 1). Extrait aqueux (n = 2).
78
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8
Temps d'attente dans le méthanol (h)
Ta
ux
de
réc
up
éra
tio
n d
e l'O
TC
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8
Temps d'attente dans le méthanol (h)
Tau
x d
e ré
cup
érat
ion
de
la C
TC
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8
Temps d'attente dans le méthano l (h)
Ta
ux
de
réc
up
éra
tio
n d
e la
TY
L (
%)
Figure 14. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps d’attente dans le méthanol (n = 17, sauf pour la tylosine où n = 16).
79
5.2.1.3 Type de fumier
Les taux de récupération des trois antibiotiques (OTC, CTC, TYL) sont présentés
dans les Figures 15, 16, et 17. Les différents types de fumier ont influencé les extractions
des trois antibiotiques. Pour ce qui est de l’OTC et de la CTC, le pourcentage de
récupération a été plus élevé dans l’extrait de fumier de veau lyophilisé et ensuite, dans
l’extrait de fumier de bovin de boucherie. Pour la TYL, il est à noter que dans le fumier de
veau lyophilisé, elle n’a pas pu être détectée adéquatement, car un produit coextrait
masquait son pic d’élution. Par contre, une détection de la TYL dans les autres extraits de
fumier a pu indiquer une meilleure récupération dans le fumier de bovin de boucherie.
Enfin, c’est dans le fumier de porc que le taux d’extraction des trois antibiotiques a été le
plus faible (Figures 15, 16 et 17). Les taux de récupération en fonction du type de fumier
ont donc résulté comme suit : Fumier de veau lyophilisé (44,6 à 104 %) > Fumier de bovin
de boucherie frais (61,2 à 82,8 %) > Fumier de porc frais (26,0 à 62,7 %) pour l’OTC. Puis
pour la CTC, le taux de récupération a suivi le même ordre : Fumier de veau lyophilisé
(52,4 à 61,1 %) > Fumier de bovin de boucherie frais (34,4 à 55,8 %) > Fumier de porc
frais (26,4 à 46,4 %). Enfin, la tylosine a résulté aussi dans un ordre similaire, en excluant
le fumier de veau lyophilisé : Fumier de bovin de boucherie frais (45,6 à 69,5 %) > Fumier
de porc frais (17,9 à 36,2 %). Sur le chromatogramme à 1 ppm, les taux de récupération
dans les fumiers outre celui de porc s’élevent au-dessus de 100 %. Ils sont dus à des
largeurs de pics trop importantes qui faussent les données. Pour les concentrations de 1
ppm, il n’est pas possible de faire des déterminations correctes.
80
0
20
40
60
80
100
120
140
1
Quantité d'OTC ajoutée (ppm)
Tau
x d
e ré
cup
érat
ion
de
l'OTC
(%
)
Fumier de porcs Fumier de bovins de boucherie Fumier de veaux
5 20
Figure 15. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) en fonction du type de fumier. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3). Fumier de veau lyophilisé (n = 3 à 20 ppm).
0
10
20
30
40
50
60
1 5 20
Quantité de la CTC ajoutée (ppm)
Tau
x d
e ré
cup
érat
ion
de
la C
TC (
%)
Fumier de porcs Fumier de bovins de boucherie Fumier de veaux
Figure 16. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) en fonction du type de fumier. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3). Fumier de veau lyophilisé (n = 3 à 20 ppm).
81
0
20
40
60
80
100
120
1 5 20
Quantité de TYL ajoutée (ppm)
Tau
x de
réc
upé
rati
on
de
la T
YL
(%
)
Fumier de porcs Fumier de bovins de boucherie
Figure 17. Taux de récupération de la tylosine (TYL) en fonction du type de fumier. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3).
5.2.1.4 Temps de contact entre l’antibiotique et le fumier
Le temps de contact peut affecter le taux de récupération des antibiotiques, soit en
entraînant une dégradation chimique ou biologique, soit en engendrant une élévation de
leur sorption par les composantes du fumier. Les figures 18, 19 et 20 présentent le taux de
récupération de chaque antibiotique en fonction du temps de réaction et le calcul s’est fait
avec la concentration en antibiotiques initiale, soit 20 ppm. Deux expériences sont
comparées. Les paramètres qui diffèrent entre les deux expériences sont cités comme suit :
Expérience 1 : Temps d’attente dans le méthanol de 9 à 10,8 h, Méthode de SPE no 2,
Température du bain à ultrasons de 23°C.
Expérience 2 : Temps d’attente dans le méthanol de 0,6 à 9,5 h, Méthode de SPE no 3,
Température du bain à ultrasons de 35-42°C.
82 Pour l’OTC, il y a eu une baisse du taux de récupération à partir d’un temps de
contact de 120 min (Figure 18). Dans le cas de la CTC, une diminution du taux de
récupération a été observée à 120 min, mais aucune tendance générale n’est démontrée
(Figure 19). Pour la TYL, la donnée à 120 min étant manquante, c’est à 180 min qu’une
diminution dans la récupération de l’antibiotique a été observée (Figure 20). Puisque
l’article de Blackwell et al. (2004b) ne mentionne pas le temps de réaction (temps de
contact) à opter, une durée d’une heure a été retenue afin d’exécuter cette partie du
protocole. Dans le cas de l’OTC, les taux de récupération en fonction du temps de contact
ont donc résulté comme suit : 60 min (16 et 82,9 %) > 15 min (24,2 et 73,3 %) > 0 min
(66,8 %) > 240 min (52,2 %) > 180 min (8,1 et 48,4 %) > 120 min (42,6 %). Dans le cas de
la CTC, les taux de récupération en fonction du temps de contact ont donc résulté comme
suit : 60 min (11,7 et 47,3 %) > 0 min (40,2 %) > 15 min (14,1 et 37,9 %) > 240 min (36,1
%) > 180 min (9,5 et 30,9 %) > 120 min (25,2 %). Enfin, dans le cas de la TYL, les taux de
récupération en fonction du temps d’attente dans le méthanol ont donc résulté comme suit :
15 min (39,5 %) > 60 min (34,4 %) > 180 min (15,1 %).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 15 60 120 180 240
Temps de contact entre l'OTC et le fumier
Tau
x d
e ré
cup
érat
ion
de
l'OTC
(%
)
Expérience 1 Expérience 2
Figure 18. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact. Expérience 1 (n = 1). Expérience 2 (n = 1, sauf pour le temps de 15 min où n = 2).
83
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 15 60 120 180 240
Temps de contact entre la CTC et le fumier (sec)
Tau
x d
e ré
cup
érat
ion
de
la C
TC
(%)
Expérience 1 Expérience 2
Figure 19. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact. Expérience 1 (n = 1). Expérience 2 (n = 1, sauf pour le temps de 15 min où n = 2).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
15 60 180
Temps de contact entre la TYL et le fumier (sec)
Tau
x d
e ré
cup
érat
ion
de
la T
YL
(%)
Expérience 1
Figure 20. Taux de récupération de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact (n = 1).
84
5.2.1.5 Concentration en solutés de la solution extractive
La concentration en solutés (agents chélateurs, sels du tampon) de la solution
extractive peut aussi être un facteur de variation. Il est à noter que la concentration 0,5 X a
une covariante : la méthode SPE no 3, au lieu de la méthode no 4. Pour ce qui est de l’OTC,
une diminution de la moitié de la concentration en solutés de la solution extractive (0,5 X)
par rapport à celle proposée par Blackwell et al. (2004a) a amélioré le taux de récupération
de l’extraction, surpassant quelque peu la double concentration (2 X) (Figure 21). Pour la
TYL, la concentration qu’ont utilisée Blackwell et al. (2004a) semble avoir été la plus
bénéfique (Figure 21), néanmoins la moitié de cette concentration n’a pas été évaluée.
Enfin, la CTC n’a démontré aucune influence engendrée par la concentration des solutés
(Figure 21). En résumé, il est incertain que la concentration diminuée de moitié par rapport
à Blackwell et al. (2004a) n’ait pas été influencée par la covariable (Voir 5.2.1.8 Type de
méthode SPE), mais il a été ici montré que le taux de récupération en antibiotiques de la
concentration 2 X (58,1 à 74,8 %) > concentration 1 X (26,0 à 44,7 %) dans le cas de
l’OTC ; il est égal dans le cas de la CTC et l’inverse pour la TYL, soit avec une
concentration 1 X (27,5 à 36,2 %) > concentration 2 X (10,7 à 28,8 %).
85
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0,5 1 2
Concentration en solutés de la solution extractive (facteur multiplicateur X)
Tau
x de
réc
upé
rati
on d
es
anti
bio
tiqu
es (%
)
OTC CTC TYL
Figure 21. Taux de récupération de l'oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC), de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction de la concentration en solutés de la solution extractive. Facteur 0,5 X (n = 2). Facteur 1 X (n = 8). Facteur 2 X (n = 4).
Blackwell et al. (2004a)
86
5.2.1.6 Volume ajouté de la solution extractive
Les données de la figure 22 montrent que le volume du tampon d’extraction influe
sur le taux de solubilisation des antibiotiques. Un plus grand volume permet une plus
grande capacité de solubilisation. Les extractions ont engendré de meilleurs résultats avec
un volume de solution extractive plus élevé. Une addition de 24 mL au fumier de porc a
engendré un taux de récupération amélioré et un faible écart-type pour l’extraction des trois
antibiotiques (Figure 22). En résumé, les taux de récupération en antibiotiques ont résulté
comme suit : Volume ajouté de 48 mL (70,5 à 93,1 %) = 40 mL (78,4 à 83,8 %) = 24 mL
(79,1 à 79,7 %) > 32 mL (54,1 à 83,5 %) = 16 mL (74,3 à 76,6 %) > 8 mL (40,6 à 74,8 %)
pour l’OTC. Pour la CTC, les taux de récupération en ordre décroissant sont un volume de
48 mL (65,7 à 65,8 %) > 40 mL (51,6 à 59,8 %) = 32 mL (34,6 à 67,0 %) = 24 mL (57,9 à
59,8 %) > 16 mL (49,7 à 51,5 %) > 8 mL (21,1 à 50,6 %). Pour la TYL, les taux de
récupération en ordre décroissant sont un volume de 32 mL (42,2 à 47,1 %) > 24 mL (40,0
à 42,1 %) = 16 mL (38,9 à 41,9 %) > 8 mL (10,7 à 12,7 %).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
8 16 24 32 40 48
Volume ajouté en solution extractive (mL)
Ta
ux
de
ré
cup
éra
tio
n d
es
a
nti
bio
tiq
ue
s (
%)
OTC CTC TYL
Figure 22. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du volume de la solution extractive. Volumes de 8 mL et de 16 mL (n = 4, sauf pour la tylosine où n= 2). Volumes de 16, 24, 40 et 48 mL (n = 2).
Blackwell et al. (2004a)
87
5.2.1.7 Température d’extraction
Comme l’indiquent les données de la Figure 23, la température peut affecter le taux
de récupération des antibiotiques. Le bain ultrasons a été ajusté à diverses températures afin
de vérifier son efficacité (25, 35, 40-45, 50 et 60°C). Pour ce qui est de l’OTC, de la CTC
et de la TYL, une température variant entre 40 et 50°C a affecté positivement le
pourcentage de récupération, avec une tendance à la diminution du taux de récupération à
60°C (Figure 23). En résumé, les taux de récupération en antibiotiques ont résulté comme
suit : 43°C (46,3 %) > 40°C (32,5 %) > 50°C (32,0 %) > 45°C (28,9 %) > 60°C (25,8 %) >
25°C (19,7 %) > 35°C (19,3 %) pour l’OTC. Pour la CTC, les taux de récupération en ordre
décroissant sont : 43°C (38,0 %) > 50°C (32,8 %) > 40°C (30,6 %) > 45°C (28,3 %) > 60°C
(21,1 %) > 25°C (14,3 %) > 35°C (13,6 %). Enfin, pour la tylosine, les résultats sont : 40°C
(30,4 %) = 45°C (30,3 %) = 50°C (30,3 %) > 60°C (27,9 %) = 43°C (27,4 %) > 35°C (21,0
%) > 25°C (20,2 %).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
25 35 40 43 45 50 60
Température (°C)
Tau
x de
réc
upé
rati
on
des
ant
ibio
tiqu
es
(%)
OTC CTC TYL
Figure 23. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction de la température du bain à ultrasons. Températures 25, 35, 40, 50, 60°C (n = 1). Température 43°C (n = 8). Température 45°C (n = 4).
88
5.2.1.8 Type de méthode SPE
Différentes méthodes de conditionnement et de rinçage ont été expérimentées. Les
méthodes ont d’abord été testées avec de l’eau, puis avec des extraits provenant de fumier
de porc (Figures 24 et 25). La méthode 1 est celle appliquée par Blackwell et al. (2004a).
Les méthodes 2 et 3 ont une covariante, celle de la concentration en solutés équivalente à la
moitié de celle élaborée par Blackwell et al (2004a) par rapport à une concentration de 1 X
pour les méthodes 1 et 4. La méthode 2 a engendré le meilleur taux de récupération pour ce
qui est de l’extraction des antibiotiques contenus dans l’eau. Dans un ordre décroissant, en
fonction du taux de récupération des antibiotiques à partir de l’eau, les résultats se
présentent comme suit : la méthode 2 (102 à 108 %) > méthode 3 (81,5 à 98,6 %) >
méthode 1 (48,2 à 74,3 %) (Figure 24). En ce qui concerne l’OTC contenu dans le fumier
de porc, la méthode 3 a permis d’apporter une récupération plus élevée par rapport à la
méthode 1. Dans un ordre décroissant, les taux de récupération des méthodes sont :
méthode 3 (59,3 à 82,9 %) > méthode 4 (40,4 à 51,7 %) > méthode 1 (26,0 à 42,8 %). Pour
la CTC et la TYL, leur taux de récupération est demeuré constant avec les méthodes
testées. Il est à noter que dans le cas d’extrait de fumier, aucune des méthodes SPE testées
n’a pu engendrer des spectres LC-UV sans bruit de fond et ce, même à 355 nm (Annexes 3
et 4).
89
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Type de méthode SPE
Tau
x de
réc
upé
rati
on
des
an
tib
ioti
ques
(%)
OTC CTC TYL
Figure 24. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) après extraction dans de l'eau seulement, en fonction des types de méthodes SPE. Méthode 1 (n = 5). Méthode 2 (n = 2). Méthode 3 (n = 3).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 3 4
Type de SPE
Tau
x de
réc
upé
rati
on
des
an
tib
ioti
ques
(%)
OTC CTC TYL
Figure 25. Taux de récupération de l'oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction des types de méthodes SPE. Méthode 1 (n = 6). Méthode 3 (n = 2). Méthode 4 (n = 8).
Blackwell et al. (2004a)
90
5.2.2 Adsorption de la CTC par le fumier de porc
L’adsorption de la CTC par le fumier de porc a été très élevée, d’environ 100 %
pour toutes les concentrations ajoutées (Figure 26). Pour ce qui est de l’extraction des
antibiotiques adsorbés, une tendance générale a été observée : à l’exception de la
concentration de 5 ppm, le taux de récupération de la CTC a diminué en fonction de
l’augmentation de la concentration adsorbée (Figure 26). Le taux de récupération s’élevant
au-dessus de 100 % est dû à un large pic sur le chromatogramme à 1 ppm; cette
concentration engendre donc un calcul de l’aire sous la courbe moins précis que pour les
concentrations 5 et 20 ppm.
90
92
94
96
98
100
102
104
106
108
110
1 5 10 20
Quantité de CTC ajoutée (ppm)
Qu
an
tité
de
CT
C a
ds
orb
ée
p
ar
le f
um
ier
de
po
rc (
%)
0
20
40
60
80
100
120
140
Ta
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de
ré
cu
pé
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on
de
la
CT
C a
ds
orb
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pa
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fu
mie
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orc
(%
)
CTC adsorbée par le fumier de porc
CTC adsorbée extraite du fumier de porc
Figure 26. Quantité de chlortétracycline (CTC) adsorbée par les constituants du fumier de porc (Histogramme et échelle Y de gauche) et Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) adsorbée sur les constituants du fumier de porc (Losange et échelle Y de droite) exprimés en fonction de la quantité ajoutée.
91
5.3 Discussion
Le développement d’une méthode de détection d’antibiotiques provenant d’une
matrice comme le fumier est complexe. Dans la détection, plusieurs impuretés et produits
de dégradation provenant de l’antibiotique acheté peuvent interférés avec les pics des
antibiotiques. Par exemple, l’OTC présente souvent deux impuretés en tandem dans son
pic : l’epi-OTC et la décarboxamidoOTC (Rupp et Anderson, 2005 ; Khan et al., 1987).
Une complète séparation de six impuretés a été faite pour les préparations pharmaceutiques,
utilisant une colonne X-Terra et une détection LC-MS/MS (Lykkeberg et al., 2004). La
dégradation de l’antibiotique dans le méthanol a été importante et il a été évalué que le
temps de suspension acceptable dans le méthanol est de 7 h et le temps critique est de 28 h
(Figures 13 et 14). Pourtant, certains auteurs ont déterminé une meilleure stabilité pour ce
qui est de l’OTC dans le méthanol. En effet, avec un pH entre 3 et 9, à 5°C, l’OTC reste
stable pendant 30 jours (Simon, 2005 ; Budavary ed, 1989). Pour détecter les tétracyclines,
les longueurs typiques de lecture se situent entre 350 et 365 nm en solution acide
(Anderson, 2005). Pourtant, nos résultats démontrent que la détermination des antibiotiques
était plus efficace à 285 nm qu’à 355 nm (Figures 11 et 12). D’ailleurs, le spectre de chaque
antibiotique indique une plus grande absorbance à 285 nm (Tableau 14). D’autre part,
Blackwell et al. (2004b) ont observé une absence du bruit de fond à 355 nm pour le fumier
de porc. Or, bien qu’il y ait diminution du bruit de fond, une absence n’a pas été constatée
pour les fumiers de bovin de boucherie et de veau (Annexe 4). La doxycycline, utilisée
dans plusieurs recherches (Aga et al., 2005 ; O’Connor et al., 2007 ; Jacobsen et al., 2006),
n’a pas pu être prise comme standard interne, car elle présentait des pics qui se
superposaient à ceux de la CTC (Annexe 3). Pour une meilleure séparation, Simon (2005) a
utilisé une solution mixte de tampon TFA et de méthanol dans des proportions 55 : 45, avec
un ajout d’EDTA ; l’élution était de 1 h.
Dans l’étape de l’extraction, plusieurs variables peuvent influencer les taux de
récupération des antibiotiques. D’abord, le type de fumier à extraire est un facteur qui
influe le taux de récupération des antibiotiques. En effet, le type de matrice permet
92
d’adsorber ou de fixer de façon plus ou moins importante les antibiotiques ; plus
l’antibiotique est fortement fixé par le fumier, plus le taux d’extraction (récupération) de
l’antibiotique est faible. Pour ce qui est de l’extraction, le fumier de bovin de boucherie ne
contenait pas de la paille ; néanmoins, ceci n’a influencé ni la sorption ni le taux de
récupération des antibiotiques. Du côté de la détection, le type de fumier a aussi joué un
rôle dans les variations du bruit de fond sur les spectres de LC-UV. L’élution de composés
non désirables ont affecté la qualité des spectres ; en conséquence, ces composés ont rendu
la quantification des antibiotiques plus difficile (Annexes 3 et 4). Dans le fumier de veau
lyophilisé, la TYL n’a pas été quantifiée, car elle était cachée par le bruit de fond engendré
par des contaminants (Blackwell et al., 2004b) (Annexe 4). La lyophilisation a permis de
concentrer de façon importante les contaminants. Les trois antibiotiques ont été plus
facilement extraits à partir de l’eau. Pour ce qui est de l’OTC et de la CTC, le taux de
récupération est comme suit : eau > fumier de veau lyophilisé > fumier de bovin de
boucherie > fumier de porc. Pour ce qui est de la TYL, l’ordre était comme suit : eau >
fumier de bovin de boucherie > fumier de porc. Selon O’Connor et al. (2007), une méthode
ne peut être transférée à d’autres types de sols ; la méthode a été développée pour un seul
type de fumier, le fumier de porc. Cet énoncé ne semble pas être appliqué aux types de
fumier. Dans le cas présent, la méthode de Blackwell et al. (2004b) avait été élaborée pour
l’extraction de l’OTC et de la TYL du fumier de porc. Pourtant, le taux de récupération à
partir de fumier de porc était plus bas que pour les fumiers de bovin de boucherie et de
veau.
Ensuite, le temps de contact entre l’antibiotique et le fumier affecte aussi
l’extraction en diminuant le taux de récupération après 1 h de contact (Figures 18, 19 et 20).
La perte pourrait être expliquée par la dégradation des antibiotiques dans le fumier ou par
une sorption accentuée. Dans un sol amendé en fumier, une diminution dans le taux
d’extraction d’antibiotiques comme les sulfonamides apparaît légèrement après 10 min, et
plus modérément après un jour ; les temps de contact testés étaient 5 min, 10 min, 30 min,
240 min, 1 jour, 3 jours et 7 jours (Hamscher et al., 2005). Les taux de récupération plus
faibles obtenus après 15 min coïncident avec ceux de Hamscher et al. (2005). Il est aussi
rapporté que la demi-vie de la TYL dans le fumier de porc est de 7,6 jours (Teeter et
93
Meyerhoff, 2003), alors qu’elle est de 30 jours pour la CTC (De Liguoro et al., 2003).
Ainsi, les réductions observées peuvent être dues à la forte adsorption des antibiotiques par
les constituants du fumier. De nombreux travaux de recherche ont démontré que la matière
organique (MO) peut jouer un rôle important dans l’adsorption des antibiotiques (Tolls,
2001 ; Jones et al., 2005). Les résultats de MacKay et Canterburry (2005) indiquent que la
MO peut constituer une importante phase adsorbante des antibiotiques dans les sols et les
sédiments. L’adsorption de la tétracycline par les substances humiques peut avoir lieu via
un pont cationique (MacKay et Canterburry, 2005). En effet, la MO réagit indirectement
avec les antibiotiques via la complexassion des métaux qui se lient avec les ligands des
antibiotiques (Turel et Bukovec, 1996 ; Turel, 2002 ; Gu et al., 2007). Dans le fumier, elle a
d’ailleurs été observée pour la CTC avec 99 % de sorption (Figure 26).
Il a aussi été démontré que l’extraction de la CTC obtenait un meilleur taux de
récupération avec des concentrations en antibiotiques moins élevées (Figure 26). D’un autre
côté, lorsque l’ajout en CTC était de 1 ppm, la détection était plus difficile et
l’approximation de la concentration en CTC extraite était alors surévaluée.
En plus, la solution d’extraction est plus efficace lorsqu’elle est deux fois moins
concentrée que celle proposée par Blackwell et al. (2004b) dans le cas de l’OTC (Figure
21). Pour la CTC, la concentration en solutés n’influence pas son taux de récupération
(Figure 21). Dans le cas de la TYL, la procédure de Blackwell et al. (2004b) a obtenu un
moins bon taux de récupération avec une solution deux fois plus concentrée (Figure 21). En
outre, le volume de la solution d’extraction engendre une meilleure solubilisation à 24 mL
pour les antibiotiques OTC et CTC, ce qui fait un rapport 1 :16 avec l’échantillon de fumier
(Figure 22). Pour la TYL, un volume de 16 mL apporte une amélioration dans la
solubilisation (Figure 22). En effet, une dilution de la matière organique permet une
meilleure efficacité des ultrasons (Vilarem et al., 1997) et une dissolution plus performante.
Selon Hamscher et al. (2005), des traitements plus agressifs comme l’utilisation de
solvants plus forts, d’ultrasons et de températures élevées n’augmentent pas le taux de
récupération des sulfonamides. Néanmoins, ces paramètres ont pu fournir une amélioration
94
dans l’extraction des antibiotiques utilisés dans la présente étude. Dans la littérature, les
températures d’extraction varient entre 30° et 75 °C, pour une durée de 5 min, avec la
technologie PLE (O’Connor et al., 2007 ; Jacobsen et al., 2006 ; Aga et al., 2005). Avec le
bain à ultrasons, les résultats ont démontré un effet optimal entre 40° et 45 °C pour une
durée de 10 min (Figure 23). Une température optimale de 43°C, entre 40° et 50°C, a été
retenue dans la présente étude.
La méthode SPE entraîne aussi une variation, surtout au niveau de l’OTC. Pour les
échantillons d’eau (sans fumier), un plus grand volume de rinçage semble favoriser le taux
de récupération des antibiotiques. Pour les trois antibiotiques, la méthode 2 (Tableau 12) est
la plus efficace (Figure 24). Avec une cartouche de type C18, Zhu et al. (2001) ont obtenu
des résultats semblables à la méthode 2, avec des taux de 88 à 110 % dans la récupération
des TC, OTC et CTC provenant d’eaux de lagune (Quantités ajoutées variant de 0,2 à 20
ppb). Dans les extraits de fumier de porc, la méthode 3 (Tableau 12) semble favoriser une
récupération de l’OTC et de la CTC (Figure 25). La TYL est mieux récupérée avec la
méthode 1 qu’avec la méthode 4 (Figure 25). La méthode 2 n’a pas été testée avec les
extraits de fumier, mais elle a obtenu le meilleur taux de récupération dans l’eau, devançant
la méthode 3 ; elle est donc celle à privilégier.
Enfin, le temps de rétention des différents antibiotiques par HPLC peut varier d’une
expérience à l’autre, ce qui apporte une difficulté additionnelle dans leur identification. Une
suggestion serait donc d’ajouter les standards des antibiotiques à quantifier dans un volume
d’échantillon extrait avant détection, en concomitance avec ce même extrait sans ajout
(Lindsey et al., 2001).
La méthode de Blackwell et al. (2004b) optimisée permet de récupérer 82 ± 16 % de
l’OTC ajouté et 65,8 ± 0,1 % de la CTC ajoutée au fumier de porc (60 min de temps de
contact, 48 mL de solution extractive, méthode SPE no 4, concentration en solutés de 2 X,
20 ppm ajouté au fumier). La TYL a, quant à elle, été extraite à 45 ± 3 % (60 min de temps
de contact, 32 mL de solution extractive, méthode SPE no 4, concentration en solutés de 2
X, 20 ppm ajouté au fumier). La méthode SPE no 2 pourrait ici améliorer les résultats.
95
Dans les fumiers de bovin de boucherie, avec un volume de solution extractive de 8 mL
(41°C, méthode SPE no 4, concentration en solutés de 2 X, 60 min de temps de contact, 20
ppm ajouté au fumier), le taux de récupération était pour l’OTC, la CTC et la TYL
respectivement de 72 ± 11 %, 40 ± 4 % et 50 ± 4 % (20 ppm ajouté), de 73 ± 5 %, 37 ± 3
%, 65 ± 5 % (5 ppm) et de 134 ± 11 %, 54 ± 3 %, 114 ± 8 % (1 ppm). Dans le fumier de
veau, avec un volume de solution extractive de 8 mL (41°C, méthode SPE no 4,
concentration en solutés de 2 X, 60 min de temps de contact, 20 ppm ajouté au fumier), le
taux de récupération de l’OTC et de la CTC étaient respectivement de 82 ± 32 % et de 56 ±
5 %. Un volume de solution extractive d’au moins 24 mL et la méthode SPE no 2 auraient
pu optimiser les résultats.
5.4 Conclusion La méthode de Blackwell et al. (2004b) modifiée permet de récupérer plus de 77 %
de l’OTC ajouté et plus de 60 % de la CTC ajoutée au fumier de porc, au moins 72 % de
l’OTC et 37 % de la CTC ajoutés au fumier de bovin de boucherie ainsi que 82 % de
l’OTC et 56 % de la CTC ajoutés au fumier de veau lyophilisé. La TYL a quant à elle été
extraite à 41 % dans le fumier de porc et au moins 45 % dans le fumier de bovin de
boucherie. Ces résultats ont été obtenus après modifications de plusieurs paramètres par
rapport au protocole original : le temps de contact entre l’antibiotique et le fumier, le type
de méthode SPE, la température d’extraction, la concentration en solutés et le volume de
solution extractive. Enfin, le temps d’incubation dans le bain à ultrasons pourrait être à
considérer dans les paramètres d’extraction à évaluer (Chapitre 4). L’évaluation de la
méthode de Blackwell et al. (2004b) permet donc d’apporter de nouvelles informations sur
l’extraction et la détection des antibiotiques dans des fumiers de ferme du Québec.
96
Chapitre 6
Détermination de la chlortétracycline par spectroscopie FT-NIR
6.1 Matériel et Méthodes
6.1.1 Fumiers
Les fumiers de porc, de bovin de boucherie et de porcelet sans antibiotique
proviennent de la « Ferme Saint-Joseph » de la région de Portneuf, Québec, Canada. Les
fumiers de bovin laitier et de veau exempt d’antibiotique proviennent de la « Ferme Côté et
fils » de Cacouna, Québec, Canada. Tous les fumiers sauf le fumier de bovin de boucherie
contenaient de la paille. Les échantillons de fumier ont immédiatement été congelés. Au
laboratoire, les fumiers ont été lyophilisés à l’aide d’un lyophilisateur Flexi-Dry MP
Modèle FD-3-85A-MP (FTS Systems).
6.1.2 Réactifs et Matériel
Les réactifs chimiques utilisés comprenaient l’hydrochlorure de chlortétracycline
~80 %, l’acétone ACS, le méthanol de type HPLC et l’eau Millipore. Des cuvettes de
chemin optique 5 mm et 1 mm en quartz ont été utilisées pour les échantillons liquides. Le
spectromètre était un FT-NIR Nicolet Antaris (Thermo electron corporation). Les logiciels
Result Integration et Result Operation version 2.1 Build 75 ont permis de faire la
programmation et la transformation de Fourier des spectres, alors que le document TQ
Analyst version 7.1.0.32 Release a été utilisé pour l’interprétation PLS des spectres. La
vaisselle a été lavée à l’aide d’un savon spécial, Liqui-Nox (Alconex).
97
6.1.3 Méthodes
6.1.3.1 Enrichissement en antibiotiques des fumiers
Les échantillons étaient d’abord lyophilisés. Ils étaient ensuite broyés à 2 mm et 1
mm à l’aide d’un broyeur à plantes et homogénéisés pour permettre une meilleure
répartition au niveau des composantes. La vaisselle était composée de polypropylène ou de
verre, afin de minimiser la sorption de la CTC sur les parois (Ciarlone et al., 1990). La
dissolution de la CTC s’est faite dans de l’eau Millipore, du méthanol ou de l’acétone en
fonction de la matrice à doser. Les matrices utilisées pour l’étalonnage du spectromètre
infrarouge sont présentées au Tableau 16. Pour le fumier lyophilisé, la CTC a été diluée
successivement dans de l’acétone. L’enrichissement s’est fait en ajoutant différents
volumes de solutions de différentes concentrations dans 3 à 5 g de fumier lyophilisé, allant
de 1,39 à 75 ppm. Les suspensions de fumiers ont été séchées à 35°C dans un incubateur
jusqu’à évaporation de l’acétone.
98
Tableau 16. Type de matrices utilisées pour l’élaboration de trois différentes courbes d’étalonnage et le nombre d’échantillons pour chaque type.
Type de matrices Nombre d’échantillons par
courbe d’étalonnage (n)
1e courbe d’étalonnage (Eau)
Eau seule 3
Eau + CTC 17
Total 20
2e courbe d’étalonnage (Méthanol)
Méthanol seul 3
Méthanol + antibiotique 97
Méthanol + antibiotique + fumier* 2
Total 102
3e courbe d’étalonnage (Fumier lyophilisé et broyé à 1 mm)
Fumier de bovin de boucherie + CTC 1
Fumier de bovin laitier + CTC 24
Fumier de veau + CTC 28
Total 53
Échantillons tests hors de la 3e courbe d’étalonnage
Fumier de porc seul 1
Fumier de veau + concentration inconnue en CTC 2
Fumier de bovin de boucherie seul 1
Fumier de bovin laitier seul 4
Fumier de veau seul 4
Fumier de bovin de boucherie + fort enrichissement en
CTC 1
Fumier de bovin laitier + fort enrichissement en CTC 1
Fumier de veau seuls + fort enrichissement en CTC 1
* Extrait de fumier et élution dans le méthanol (Chapitre 5).
99
6.1.3.2 Étalonnage du spectromètre proche infrarouge
6.1.3.2.1 Acquisition de spectres
Les spectres des échantillons d’eau et de méthanol ont été engendrés par absorbance
via des cuvettes avec un chemin optique de 1 mm et de 5 mm. Dans le cas des spectres des
échantillons de fumier lyophilisé et broyé, ils ont été produits par facteur de réflexion
diffuse (Log 1/R), avec l’aide d’une sphère d’intégration. Trente balayages de l’échantillon,
placé sur une fenêtre de saphir d’un réceptacle rotatif (spin sample cup), ont été effectués, à
une résolution de 2 cm-1 (4 cm-1 et 32 cm-1 aussi testées). Les lectures ont été prises en
triplicata, totalisant le nombre de spectres à 90 par échantillon. Le gain était à 1 X (2 X
aussi testé). La moyenne des spectres de même concentration a été utilisée pour
l’étalonnage (merge like standards).
6.1.3.2.2 Tests de faisabilité et détection de liens chimiques propres au CTC
Une étude de faisabilité a été requise afin de déterminer si le FT-NIR était en
mesure de détecter la CTC dans l’eau, le méthanol et le fumier lyophilisé. Pour ce faire, les
spectres d’un échantillon sans antibiotique ont été comparés à ceux d’un échantillon
enrichi. S’il y avait une différence significative entre les spectres sans et avec CTC, c’est
que la CTC était détectée par l’appareil et l’élaboration d’une courbe de calibration pouvait
poursuivre. La courbe d’étalonnage a été élaborée en premier lieu avec 20 échantillons pour
chacune des trois matrices (Eau, méthanol, fumiers lyophilisés). Des régions ont ensuite été
suggérées par le FT-NIR et les liens chimiques détectés dans ces régions ont été déterminés
en fonction de la littérature (Workman et Weyer, 2008). Enfin, 33 échantillons ont été
ajoutés à la courbe de fumier pour un total de 53 échantillons (Tableau 16).
100
6.1.3.2.3 Élaboration des courbes de calibration et de validation
Les échantillons ont été subdivisés en deux groupes : un groupe d’étalonnage
représentant 70 % des échantillons et un groupe de validation constitué de 30 % des
échantillons (Martens et Jensen, 1982 ; Tremblay, 2008). La distribution des échantillons a
été faite au hasard avec la commande du logiciel TQ Analyst (Select standards). Un total de
35 échantillons de fumier a été utilisé pour la calibration, 18 pour la validation et 10 ont été
ignorés des courbes (Tableau 16). Les échantillons ignorés ont été considérés comme
valeurs extrêmes par la commande spectrum outliers. Trois types de fumier ont été utilisés
comme variables indépendantes dans la calibration et la validation afin de mesurer la
concentration en CTC. Il s’agit du fumier de bovin de boucherie, du fumier de bovin laitier
et du fumier de veau. Les fumiers de porc et de porcelet ont été utilisés à des fins
d’exploitation des courbes après la finalité de l’étalonnage, mais ils n’en font pas partie. La
méthode statistique PLS a été utilisée pour prédire la concentration contenue dans l’extrait.
6.1.3.2.4 Transformations des spectres
La ligne de base (baseline) a d’abord été référencée à zéro pour tous les spectres de
fumier par la commande Baseline correction (Piercewise linear correction, minimum in
range : 4507-5361 cm-1, 5361-7585 cm-1). Les spectres ont été étudiés en fonction de
différents prétraitements mathématiques [lissage (Savitzky-Golay filter, Datapoints : 9,
Polynomial order : 3), dérivés première et seconde]. Aussi, deux techniques pour
l’élaboration de la courbe standard ont été testées : 1) la technique de centrage en fonction
de la médiane (mean centering technique) et 2) une combinaison de cette dernière en
concomitance avec la technique de mesure de la variance (variance scaling technique). Les
régions comportant des liens aromatiques ont été choisies en se référant au livre de
Workman et Weyer, 2008. Plusieurs paramètres ont été considérés afin de privilégier la
détection de la CTC seulement. Il s’agit de la variance de l’acétone dans des échantillons
sans antibiotique (Paramètre 1), la variance de la CTC dans des échantillons de fumier
(Paramètre 2) et les régions d’absorbance de l’eau (Annexe 13). Les régions du paramètre 2
101
ont d’abord été sélectionnées. Puis, les régions du paramètre 1 et les régions d’absorbance
de l’eau leur ont été retirées. Cette approche a été exécutée afin d’éviter la prédiction
d’acétone à laquelle la CTC avait été diluée et ajoutée aux fumiers ou d’eau au lieu de
CTC. Les régions spectrales finales utilisées étaient : 5049-5115 cm-1, 5645-5700 cm-1,
5935 cm-1 et 5975-6005 cm-1. Le niveau de bruit de fond (noise level) avait été évalué.
Toutes les régions spectrales avaient un type de baseline à None. En plus de ce type de
baseline, le pic à 5935 cm-1 avait une exemption de la linéarité (Linear removed) variant de
5930 à 5940 cm-1 afin d’améliorer la prédiction. La précision de la calibration et celle de la
validation ont été faites à l’aide de l’analyse de leur coefficient de détermination (r2) ainsi
que des rapports RPD (Rapport de l’erreur-type de prédiction par rapport à l’écart-type) et
RER (Étendue du rapport de l’erreur) (Malley et al., 2004) (Annexe 12). « Un coefficient
de corrélation supérieur à 0,95, un RPD au-dessus de 3 ainsi qu’un RER supérieur à 10
étaient considérés comme très bon. Cependant, des valeurs de r2 de plus de 0,90, de RPD
entre 2 et 3 et de RER entre 7 et 10 étaient considérées comme bonnes. En deçà de ces
valeurs, l’étalonnage n’était pas considéré comme suffisamment précis » (Tremblay, 2008 ;
Malley et al., 2004 ; Stenberg et al., 2004). Les indices RMSEC (Valeur moyenne de
l’erreur quadratique de calibration), RMSEP (Valeur moyenne de l’erreur quadratique de
prédiction) et RMSECV (Écart-type résiduel de la validation croisée) ont aussi été
examinés (Annexe 11). Les spectres des échantillons de fumier sans antibiotique, des
échantillons de fumier ayant des concentrations en CTC validées par LC-UV et des
échantillons de fumier fortement enrichis en CTC ont été enregistrés afin de valider
l’étalonnage, à titre d’échantillons et non de validation.
102
6.2 Résultats
6.2.1 Étude de détection des liaisons chimiques de la CTC
Plusieurs moyens ont été utilisés pour détecter la CTC par l’appareil FT-NIR. En
premier lieu, divers types de matrices et plusieurs concentrations en CTC ont été utilisées.
Nous avons détecté une différence entre une matrice sans antibiotique et une matrice
enrichie en CTC pour l’eau, le méthanol et différents types de fumier.
Différents liens chimiques ont été détectés en fonction de la matrice utilisée
(Tableaux 17, 18 et 19). Un intervalle de spectres de 32 cm-1 dans le méthanol avec une
cuvette de 5 mm a permis de détecter les liaisons C-H aromatiques de la CTC, en plus de la
liaison CONH2. Un chemin optique de 1 mm avec le méthanol n’a pas pu faire la détection
d’une liaison spécifique à la molécule cible (Tableau 17). Comme l’indique la Figure 1
(Chapitre 2 : Revue de littérature), les liaisons possibles attribuées à la CTC seraient :
CONH2, CH aromatiques, un méthyle relié à un amide, CO, la présence de chlore et des
OH (aussi reliés à l’eau). En ce qui concerne la dilution dans l’eau, la CTC y est détectée,
peu importe le chemin optique (Tableau 17).
Quant aux fumiers lyophilisés, la combinaison d’un broyage à 1 mm et d’un
intervalle à 2 cm-1 évite en général la détection de l’eau par rapport à un broyage à 2 mm
avec un intervalle à 4 cm-1 (Tableaux 18 et 19). De plus, le FT-NIR ne montre aucune
détection de liens chimiques spécifiques à la CTC, contenue dans le fumier de bovin de
boucherie, dans la combinaison d’un broyage à 2 mm et d’un intervalle à 4 cm-1. De façon
générale, la CTC a pu être détectée à des concentrations de l’ordre du ppm (Figure 27) et de
façon peu ou pas précise dans l’ordre du ppb (données non montrées).
En général, les liens chimiques ont été détectés par le FT-NIR dans les cas de toutes
les matrices testées, sauf pour : 1) la solution de méthanol avec un chemin optique de 1 mm
avec un intervalle de spectres de 2 cm-1 et 2) le fumier de bovin de boucherie broyé à 2 mm
103
avec un intervalle de spectres de 4 cm-1. D’autres essais ont ensuite été entrepris afin de
connaître leur efficacité quant à la quantification de la CTC.
Tableau 17. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans
différentes matrices (eau, méthanol).
Matrice Caractéristiques
Solutions mères de CTC dans l’eau
Intervalle des spectres (cm-1) 2 2 - Chemin optique de la cuvette (mm) 1 5 - Région suggérée par l’appareil FT-NIR (cm-1)
3897-3928 4497-4567 -
Liens chimiques détectés* C-H aromatique
(aryl)
CONH2 C-H aromatique
(aryl) -
Solutions mères de CTC dans le méthanol
Intervalle des spectres (cm-1) 2 2 32 Chemin optique de la cuvette (mm) 1 5 5 Région suggérée par l’appareil FT-NIR (cm-1)
4344-4353 4386-4398 4402-4416
4381-4551 4736-4921
Liens chimiques détectés* C-H (Amides) CONH2
CONH2 C-H
aromatique (aryl)
* Référence : Workman et Weyer, 2008
104
Tableau 18. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans différentes matrices (fumiers).
Matrice Caractéristiques
Fumier de bovin de boucherie‡ enrichi
Intervalle des spectres (cm-1) 2 4 -
Grosseur du broyage (mm) 1 2 -
Région suggérée par l’appareil FT-NIR (cm-1) 4217-4299 5430-6009 6010-6033
5110-5180 -
Liens chimiques détectés correspondant à la CTC ou à l’eau*
CH aromatique (aryl)
Eau, O-H CH3 aromatique
C-H ketone CH3Cl
Eau C=O O-H
-
Fumier de bovin laitier₫ enrichi
Intervalle des spectres (cm-1) 2 4 -
Grosseur du broyage (mm) 1 2 -
Région suggérée par l’appareil FT-NIR (cm-1) 4350-4367 5758-5781
4000-5178 -
Liens chimiques détectés correspondant à la CTC ou à l’eau*
C-H aromatique (aryl)
CONH2
CH3 aromatique
Eau (2 liaisons) O-H
Amine aromatique CONH2
N-H/C=O C-H aromatique
(aryl)
-
Fumier de veau₫ enrichi
Intervalle des spectres (cm-1) 2 4 -
Grosseur du broyage (mm) 1 2 -
Région suggérée par l’appareil FT-NIR (cm-1) 4198-4692 9944-9956
4275-5174
Liens chimiques détectés correspondant à la CTC ou à l’eau*
C-H aromatique (aryl) C-H O-H
CONH2
C-H aromatique (aryl) C-H O-H
CONH2 N-H/C=O
Amide aromatique C=O Eau
-
* Référence : Workman et Weyer (2008). ‡ Les fumiers de bovin de boucherie sans antibiotique proviennent de la Ferme St-Joseph.
₫ Les fumiers de bovin laitier et de veau sans antibiotique proviennent de la Ferme Côté et fils.
105
Tableau 19. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans différentes matrices (fumiers).
Matrice Caractéristiques
Fumier de porc‡ enrichi
Intervalle des spectres (cm-1) 2 4 4 Grosseur du broyage (mm) 1 1 2 Région suggérée par l’appareil FT-NIR (cm-1) 4000-9893
9849-9856 9883-9895 9918-9928
5110-5180
Liens chimiques détectés correspondant à la CTC ou à l’eau*
Plusieurs Amine
aromatique C=O Eau
Fumier de porcelet‡ enrichi
Intervalle des spectres (cm-1) 2 - - Grosseur du broyage (mm) 1 - - Région suggérée par l’appareil FT-NIR (cm-1)
4368-4456 - -
Liens chimiques détectés correspondant à la CTC ou à l’eau*
C-H aromatique (aryl)
CONH2
O-H
- -
* Référence : Workman et Weyer, 2008. ‡ Les fumiers de porc et de porcelet sans antibiotique proviennent de la Ferme St-Joseph.
106
6.2.2 Étalonnage et analyses multivariées de la CTC dans des échantillons de fumiers divers6
Lors de l’étalonnage, tous les paramètres ont été testés pour tracer la courbe de
calibration, dont la transformation, les techniques de mesure centrale ou de la variance et
l’ajout d’un gain de 2 X lors de la prise spectrale. Seuls les paramètres les plus efficaces ont
été considérés et représentés, soit aucune transformation des spectres, l’application d’une
technique de mesure centrale uniquement et la prise spectrale avec un gain 1 X (Tableau
20). Les coefficients de détermination ont indiqué que la courbe de calibration permettait
une utilisation ubiquitaire, alors que la validation croisée indiquait une utilisation possible
pour la plupart des applications, incluant la recherche (Figures 27 et 28, Tableau 20).
L’interprétation de l’indice RER de l’étalonnage était acceptable avec un filtrage et un
filtrage non précis de la CTC dans les cas respectifs de la courbe de calibration et de la
validation croisée. Pour ce qui est de l’indice RPD, il signale une courbe satisfaisante pour
la courbe de calibration et une courbe acceptable dans le cas de la validation croisée. Selon
Malley et al. (2004) et Stenberg et al. (2004), la courbe de calibration est modérément
réussite, alors que la courbe de validation croisée est modérément utilisable. En ajoutant le
coefficient de détermination, la courbe de calibration devient très bonne, alors que la
courbe de validation croisée est utilisable (Tremblay, 2008). Enfin, la courbe d’étalonnage
est utilisable pour la quantification de la CTC.
6 Voir Tableaux 24 et 25 de l’annexe 12 pour l’interprétation des indices.
107
Tableau 20. Performance du FT-NIR pour l’étalonnage de la CTC (ppm) à partir de fumiers divers de bovin de boucherie, de bovin laitier et de veau* broyés à 1 mm.
Paramètres statistiques de validation Prétraitement
F RMSEC RMSEP r2 RPD RER
Fumiers divers**
Aucun 9 1,57 5,59 0,997 3,10 10,7
Validation croisée
Aucun 9 9,22 - 0,902 2,01 7,90
* Nb d’échantillons : 53, fumiers de bovin de boucherie (3), de bovin laitier (23), de veau
(27).
**Autres traitements : intervalle de spectres de 2 cm-1, modèle PLS, technique de centrage
en fonction de la médiane (mean centering technique), correction de l’équation de la courbe
(post-prediction correction) avec une constante de 0,000276, correction de la ligne de base
(Pierce linear correction), sélection de régions spécifiques.
F: Nombre de facteurs, RMSEC : Root mean square error of calibration, RMSEP: Root
mean square error of prediction, r2: Coefficient de corrélation, RPD : Ratio of prediction
deviation, RER : Ratio error range, RMSECV: Root mean square error of cross-
validation.
108
Figure 27. Données prédites versus données calculées pour la détermination de la CTC dans divers fumiers.
Figure 28. Données prédites par validation croisée pour la détermination de la CTC dans divers fumiers.
Afin de déterminer si la courbe pouvait afficher des concentrations exactes de CTC,
deux échantillons de fumier de veau lyophilisé ont été pris au hasard parmi ceux qui ont été
utilisés lors de l’élaboration de la courbe d’étalonnage. Ils ont été enrichis en CTC ajoutée
sous forme de poudre afin d’éviter l’obtention d’une concentration sous la limite de
détection de l’appareil. Ces échantillons enrichis ont ensuite été soumis aux étapes
d’extraction de l’antibiotique puis la concentration en CTC des extraits a été quantifiée par
109
LC-UV (Chapitre 5). En concomitance, les spectres des deux échantillons ont été balayés et
enregistrés par FT-NIR. Les résultats du Tableau 21 indiquent que les deux échantillons ont
affiché des concentrations déduites de la courbe d’étalonnage par FT-NIR supérieures aux
valeurs obtenues par LC-UV. Il est possible que la méthode d’extraction de la CTC
préconisée par Blackwell et al., 2004b) ait solubilisé la CTC avec un taux de récupération
de 52,4 à 61,1 % (55,7 % en moyenne), ce qui ajusterait les valeurs entre 37,64 et 43,89
ppm pour l’échantillon inconnu no 1, puis entre 47,46 et 55,34 ppm de CTC pour
l’échantillon inconnu no 2. Avec ces valeurs, le résultat engendré par FT-NIR serait alors
satisfaisant. En plus de la vérification de la courbe d’étalonnage à l’aide de ces deux
échantillons de concentrations différentes en CTC, plusieurs autres échantillons de fumier
sans antibiotique ont été enrichis en CTC, puis la concentration de CTC a été quantifiée.
Les échantillons sans antibiotique (témoins) ont tous été négatifs, i.e. le FT-NIR a démontré
l’absence de CTC dans le fumier. En ce qui concerne les échantillons enrichis en CTC sous
forme de poudre, les valeurs de CTC décelées excèdent celles de la courbe d’étalonnage
dans tous les cas, sauf celui de l’échantillon de fumier de porcelet. Il est à noter que ce type
de fumier ne faisait pas partie de la courbe d’étalonnage.
110
Tableau 21. Comparaison des techniques FT-NIR et LC-UV dans la détermination de la CTC dans divers fumiers lyophilisés préalablement enrichis.
Type de fumiers
Quantité de CTC ajoutée
(mg/kg)
Méthode d’extraction et de quantification de la CTC par
LC-UV*
Quantification (mg/kg) de la CTC par FT-NIR
Veau À déterminer 23 33,39 ± 6,64 Veau À déterminer 29 44,01 ± 8,29 Veau 0 Non réalisé 0** Bovin laitier 0 Non réalisé 0** Bovin de boucherie
0 Non réalisé 0**
Porc 0 Non réalisé 0** Porcelet 0 Non réalisé 0** Veau 200 Non réalisé 158,01 ± 59,13 Bovin de boucherie
200 Non réalisé 149,17 ± 73,71
Porcelet† 100 Non réalisé 18,41 ± 37,77
† Le fumier de porcelet ne fait pas partie de la courbe de calibration. Il présente donc des
erreurs relativement grandes.
* L’extraction et la détection ont été faites en fonction de la méthode de Blackwell et al.
(2004b) après modification (concentration en solutés du solvant d’extraction : 2 X,
température d’extraction : 41°C). Le taux de récupération après enrichissement de 20 ppm
était de 55,7 %.
* Les chiffres tels qu’affichés par l’appareil FT-NIR sont : -9,32 ± 8,79 (veaux), -16,9
4 ± 8,13 (bovins laitiers), -55,45 ± 20,93 (bovins de boucherie), -52,37 ± 17,86 (porcs), -
80,00 ± 23,63 (porcelets).
111
6.3 Discussion
L’essai de détection de la CTC dans une matrice d’eau pure, de méthanol et dans
divers fumiers par le FT-NIR est faisable. Ainsi, l’identification de l’antibiotique peut se
faire par l’appareil FT-NIR. Les liens chimiques de la CTC sont détectés dans la plupart
des cas. L’évaluation directe dans le fumier lyophilisé et l’élévation de la limite de
détection dans l’ordre des ppm ont permis d’améliorer la méthode de détection de la CTC.
L’étalonnage est considéré acceptable pour la validation croisée et satisfaisante pour la
validation. Plusieurs paramètres peuvent différer entre les études et être considérés afin
d’apporter des améliorations : les instruments utilisés, la résolution spectrale, le ratio
signal/bruit de fond, les régions de longueurs d’onde, l’état physique et la préparation des
échantillons, la géométrie de mesure, les chimiométries et les méthodes de références
(Malley et al., 2004). La méthode de référence est ici la principale cause d’erreurs,
puisqu’elle est basée sur l’enrichissement via un solvant facilement évaporable. Bien que
non disponible, l’utilisation d’une méthode reconnue aurait apporté plus de précision.
L’acétone a aussi pu apporter des modifications structurales dans les fumiers. D’ailleurs,
Jacobsen et al. (2006) proposent d’ajouter des solutions de concentrations connues en CTC
dilué dans de l’eau avant lyophilisation. En plus du manque de méthodes de références
reconnues, le nombre d’échantillons était relativement restreint. Par comparaison, Stenberg
et al. (2004) ont utilisé 249 échantillons dont le quart servait à la validation interne de la
courbe de calibration. Dans une autre direction, lorsque seulement quelques longueurs
d’onde sont sélectionnées, la préparation de l’échantillon est aussi critique (Leeson et al.,
2000). Les molécules aromatiques, comme la CTC, engendrent des vibrations C-H entre
autres entre 5455 et 6078 cm-1 (Workman, 1996). Par contre, plusieurs régions étant
associées aux cétones : 5898, 5908, 5948, 5960 cm-1, et une région étant associée à l’eau :
5587 cm-1 (Workman, 2008) interfèrent avec la détermination de constituants organiques
(Malley et al., 2005). Avec une augmentation du nombre d’échantillons et l’utilisation
d’une méthode d’enrichissement sans acétone, cette région (5455 à 6078 cm-1) pourrait être
utilisée afin de quantifier la CTC ; elle englobe d’ailleurs certaines bandes de l’étude.
112 En résumé, la méthode d’enrichissement, la détermination d’une méthode de
référence reconnue et l’augmentation du nombre d’échantillons afin d’élargir la région de
longueurs d’onde sont suggérés afin d’améliorer l’étalonnage.
6.4 Conclusion
La détection de la CTC dans le fumier par FT-NIR est une avenue intéressante. La
CTC a pu être quantifiée dans les fumiers enrichis provenant de deux fermes. Les indices
r2, RER et RPD pour la courbe de calibration ont engendré une satisfaction du filtrage de la
CTC, alors que la validation croisée a générée une acceptation du filtrage. Enfin, le FT-NIR
est une technique de détermination de la CTC simple, rapide et peu coûteuse ; elle est une
méthode à considérer pour la quantification de cet antibiotique.
113
Chapitre 7
Conclusion générale
Le mémoire porte sur la mise au point de quelques méthodes de détection de trois
antibiotiques dans des types de fumiers enrichis artificiellement. Cette recherche est
particulièrement d’actualité, car les antibiotiques présents dans les fumiers peuvent
contaminer les terres agricoles ce qui peut engendrer un problème environnemental majeur.
Pour atteindre cet objectif, nous avons optimisé et comparé plusieurs méthodes analytiques.
La technique ELISA a permis de détecter de faibles concentrations de
chlortétracycline (CTC) et de tylosine (TYL) dans des extraits de fumier, mais les résultats
quantitatifs sont variables. L’étape SPE n’est pas nécessaire pour l’ELISA, mais la
centrifugation et la filtration permettent de diminuer les interférences. Le LC-MS peut
détecter des concentrations d’antibiotiques avec une plus grande précision à 1 ppm, jusqu’à
200 ppb. Par contre, un bruit de fond trop élevé ne permet pas de faire des déterminations
correctes. Le LC-UV permet la détection de l’oxytétracycline (OTC), de la CTC ainsi que
de la TYL et la limite de détection se situe entre 1 et 5 ppm. Un bruit de fond apparaît et
l’ajout des antibiotiques doit être essentiel pour déterminer leur temps d’élution. Puis,
l’extraction, basée sur la méthode Blackwell et al. (2004b), a été améliorée. Les résultats
ont montré que la nature de la matrice influence l’extraction. Un temps de contact entre
l’antibiotique et le fumier diminue le taux de récupération après 1 h. D’ailleurs, une forte
sorption de la CTC par les constituants du fumier a été observée (99 %). Un volume de
solution extractive de 24 mL, une température de 43°C dans le bain à ultrasons et la
méthode SPE no 2 (Tableau 12) sont les paramètres optimaux pour extraire les
antibiotiques du fumier. Enfin, le FT-NIR permet de détecter la CTC dans le fumier
lyophilisé.
La méthode LC-UV semble détecter de façon reproductible les trois antibiotiques.
La technique ELISA est variable dans ses résultats, mais pourrait être améliorée avec une
114
meilleure purification et une augmentation des répétitions (triplicata au lieu de duplicata).
Le LC-MS TOF est grandement affecté par le bruit de fond des extraits et une meilleure
purification y est aussi de mise. Le FT-NIR est considéré comme précis dans sa calibration,
mais non précis dans sa validation croisée. Cette approche peut être améliorée avec
l’augmentation du nombre d’échantillons dans la courbe de calibration (i.e. 100
échantillons).
La méthode de Blackwell et al. (2004b) a permis d’extraire l’OTC, la CTC et la
TYL dans différents types de fumier de ferme enrichis artificiellement. Elle permet de
récupérer plus de 77 % de l’OTC ajouté, plus de 60 % de la CTC et 41 % de la TYL dans le
fumier de porc. La détermination de la CTC et de la TYL par LC-MS est influencée par la
température et le temps d’exposition du fumier enrichi d’antibiotique dans un bain à
ultrasons. En effet, le LC-MS a permis d’observer que des conditions trop sévères peuvent
altérer les antibiotiques. La température de 43°C du bain à ultrasons semble être la
température la plus adaptée pour retirer un pourcentage de récupération optimal, tandis que
les températures de 35°C et moins ou de 60°C récupèrent moins d’antibiotiques surtout
dans le cas du CTC et de l’OTC.
La méthode FT-NIR peut détecter la CTC dans différents types de fumier de ferme
enrichis artificiellement. Toutefois, la détection des liens chimiques par le FT-NIR est
influencée par un ensemble de facteurs dont la finesse de mouture des fumiers (1 et 2 mm)
et l’intervalle des spectres (2 et 4 cm-1). Des recherches approfondies portant sur la relation
entre la finesse de mouture et l’intervalle des spectres sont souhaitables.
Les caractéristiques intrinsèques des fumiers, la nature des tampons de trempage et
d’extraction des différents protocoles d’extraction et la vitesse de centrifugation qui varie
entre les protocoles sont autant de sources de variabilité intra-essais et inter-essais lorsque
le volume total combiné des surnageants est considéré. Les méthodes de détermination d’un
antibiotique nécessitant l’extraction de l’antibiotique de la matrice solide puis son dosage
sont plus laborieuses que les méthodes de détermination directe de l’antibiotique dans la
115
matrice solide. D’autres travaux de recherche sont nécessaires pour améliorer davantage la
précision quant à la quantification des antibiotiques dans les fumiers.
116
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130
Annexes
Annexe 1. Grille du suivi des pesées à exécuter lors de l’expérience
Nom no
Poids de l’eau fortifiée ajouté à
l’échantillon (g)
Poids du fumier
(g)
Poids du tube à centrifuger en
verre (g)
Poids du tampon d’extraction +
Poids du fumier + Poids de l’eau
fortifiée + Poids du tube
(g)
Poids du tube à centrifuger en
plastique (g)
Poids total du surnageant récolté
après centrifugation à
1500 rpm (g)
Poids du tube propre
SPE (g)
Poids du tube SPE
avec l’éluat (g)
P20a 1 2,008 2,025 13,958 26,217 5,188 11,444 8,555 11,267
Exemple de calculs pour déterminer la concentration finale en antibiotiques :
1 ppm = 1 μg/g de solution antibiotique
Quantité de CTC ajoutée = 20 ppm diluée dans de l’eau
Poids de la solution à doser (g) = 2,008
Poids total de matière (eau fortifiée + fumier + tampon) (g) = 26,217 - 13,958 = 12,259
Poids de la solution prélevée pour le passage dans la cartouche (g) =
11,444 - 5,188 = 6,256
Poids du méthanol utilisé pour extraire l’antibiotique de la cartouche (g) = 2,712
Conversion du méthanol en eau exprimée en poids (g) = 2,712 x 5 g / 3,9 g = 3,5
Quantité d’antibiotique calculée = quantité dosée x facteur de dilution x facteur
d’amplification
Quantité dosée (de la courbe standard) = 5,8 ppm x (12,259 g/2,008 g) x (3,5 g/6,256 g) =
19,8 ppm
131
Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm
Variables
Taux de récupération
des antibiotiques
(%) Composants
Temps d'attente dans le
méthanol (h)
Temps de contact après
enrichissement (min)
Volume de solution
extractive ajouté (mL)
Température d'extraction
(°C)
Méthode SPE
Type de matrice
d'extraction
Concentration en solutés de la
solution extractive
(X)*
OTC CTC TYL
Concentration d'antibiotique
initiale ajoutée (ppm)
0 à 11 heures d'attente dans le méthanol OTC, CTC, TYL
9 15 8 23 2 fumier de
porc 0,5 24,2 14,1 39,5 20
OTC, CTC, TYL
9,4 60 8 23 2 fumier de
porc 0,5 16 11,7 34,4 20
OTC, CTC, TYL
9,9 180 8 23 2 fumier de
porc 0,5 8,1 9,5 15,1 20
OTC, CTC, TYL
10 15 8 23 2 eau 0,5 108,2 96,7 97,7 20
OTC, CTC, TYL, DOXY
10,8 15 8 23 2 eau 0,5 101,7 80,3 75,1 20
OTC, CTC 0,6 15 8 35 3 fumier de
porc 0,5 87,3 38,8 - 20
OTC, CTC 1 15 8 38 3 fumier de
porc 0,5 59,3 37 - 20
OTC, CTC 1,9 0 8 35 3 fumier de
porc 0,5 66,8 40,2 - 20
OTC, CTC 5,7 60 8 42 3 fumier de
porc 0,5 82,9 47,3 - 20
OTC, CTC 6,6 180 8 40 3 fumier de
porc 0,5 48,4 30,9 - 20
OTC, CTC 7 240 8 40 3 fumier de
porc 0,5 52,2 36,1 - 20
OTC, CTC 7,4 240 8 40 3 eau 0,5 90,6 88,4 - 20
OTC, CTC 9,5 120 8 40 3 fumier de
porc 0,5 42,6 25,2 - 20
OTC, CTC, TYL
3,3 0 8 36 3 eau 1 98,6 96 83,9 20
OTC, CTC, TYL
3,8 0 8 36 3 eau 1 82,5 82,8 78,2 5
OTC, CTC, TYL
4,2 0 8 36 3 eau 1 81,5 82,4 64 1
OTC 0,1 60 8 40 1 eau 1 48,2 - - 20 OTC 1 60 8 40 1 eau 1 60,5 - - 5 OTC 1,4 60 8 40 1 eau 1 49,3 - - 1 OTC, CTC 1,9 60 8 40 1 eau 1 74,3 70,6 - 20, 20 OTC, CTC 2,3 60 8 40 1 eau 1 56,4 47,2 - 5, 20 OTC, CTC, TYL
3,1 60 8 25 1 fumier de
porc 1 19,7 14,3 20,2 20
OTC, CTC, TYL
4,2 60 8 35 1 fumier de
porc 1 19,3 13,6 21 20
OTC, CTC, TYL
4,7 60 8 40 1 fumier de
porc 1 32,5 30,6 30,4 20
OTC, CTC, TYL
5,1 60 8 45 1 fumier de
porc 1 42,8 101 27,5 20
OTC, CTC, TYL
5,6 60 8 50 1 fumier de
porc 1 32 32,8 30,3 20
OTC, CTC, TYL
6 60 8 60 1 fumier de
porc 1 25,8 21,1 27,9 20
* Concentration 1 X établie en fonction de l’article de Blackwell et al. (2004a)
132
Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm
Variables
Taux de récupération des
antibiotiques (%)
Composants
Temps d'attente dans le
méthanol (h)
Temps de contact après
enrichissement (min)
Volume de
solution extractive
ajouté (mL)
Température d'extraction
(°C)
Méthode SPE
Type de matrice
d'extraction
Concentration en solutés de la
solution extractive
(X)*
OTC CTC TYL
Concentration d'antibiotique
initiale ajoutée (ppm)
OTC, CTC, TYL
1 60 8 45 1 fumier de
porc 1 26 24,2 29,8 20
OTC, CTC, TYL
1,4 60 8 45 1 fumier de
porc 1 32 33,8 35,5 20
OTC, CTC, TYL
1,9 60 8 45 1 fumier de
porc 1 28,4 26,4 28,4 20
OTC, CTC, TYL
2,3 60 8 45 1 fumier de
porc 1 29 28,6 27,6 20
OTC, CTC, TYL
0,7 60 8 43 4 fumier de
porc 1 42,4 37,8 21,9 5
OTC, CTC, TYL
1,1 60 8 43 4 fumier de
porc 1 40,4 38,6 20,9 5
OTC, CTC, TYL
1,6 60 8 43 4 fumier de
porc 1 41,5 33,8 23,9 5
OTC, CTC, TYL
2 60 8 43 4 fumier de
porc 1 51,7 37,4 34,1 1
OTC, CTC, TYL
2,5 60 8 43 4 fumier de
porc 1 62,7 33,2 17,9 1
OTC, CTC, TYL
2,9 60 8 43 4 fumier de
porc 1 43,8 38,8 24 1
OTC, CTC, TYL
3,4 60 8 43 4 fumier de
porc 1 44,7 39,4 36,2 20
OTC, CTC, TYL
3,8 60 8 43 4 fumier de
porc 1 43,3 44,7 34,9 20
OTC, CTC, TYL
0,7 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 61,2 36,2 45,6 20
OTC, CTC, TYL
1,1 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 82,8 43,6 53,9 20
OTC, CTC, TYL
1,6 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 72,7 40,9 49,3 20
OTC, CTC, TYL
2 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 78,5 34,4 69,5 5
OTC, CTC, TYL
2,4 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 70,5 36 65,6 5
OTC, CTC, TYL
2,9 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 68,8 40,3 59,9 5
OTC, CTC, TYL
3,3 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 125,2 50,3 121 1
OTC, CTC, TYL
3,8 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 130,7 54,3 116 1
OTC, CTC, TYL
4,2 60 8 41 4 fumier de bovin de boucherie
2 147 55,8 106 1
* Concentration 1 X établie en fonction de l’article de Blackwell et al. (2004a)
133
Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm
Variables
Taux de récupération des
antibiotiques (%)
Composants
Temps d'attente dans le
méthanol (h)
Temps de contact après
enrichissement (min)
Volume de
solution extractive
ajouté (mL)
Température d'extraction
(°C)
Méthode SPE
Type de matrice
d'extraction
Concentration en solutés de la solution extractive
(X)*
OTC CTC TYL
Concentration d'antibiotique initiale ajoutée
(ppm)
OTC, CTC 0,2 60 8 41 4 fumier de
veau lyophilisé
2 44,6 53,5 - 20
OTC, CTC 4,7 60 8 41 4 fumier de
veau lyophilisé
2 96,5 61,1 - 20
OTC, CTC 4,3 60 8 41 4 fumier de
veau lyophilisé
2 104 52,4 - 20
CTC 2,7 60 8 41 4 fumier de
veau lyophilisé
2 N/A N/A N/A inconnu: 29
CTC 3,3 60 8 41 4 fumier de
veau lyophilisé
2 N/A N/A N/A inconnu: 23
OTC, CTC, TYL
7,1 60 8 41 4 fumier de
porc 2 58,6 31,1 22,6 20
OTC, CTC, TYL
6,5 60 8 41 4 fumier de
porc 2 58,1 46,4 28,8 20
OTC, CTC, TYL
5,2 60 8 36 4 fumier de
porc 2 52,5 35,7 31,3 20
OTC, CTC, TYL
6 60 8 36 4 fumier de
porc 2 52,6 47,8 38,5 20
OTC, CTC, TYL
0,2 60 8 40,5 4 fumier de
porc 2 60,8 38,3 10,7 20
OTC, CTC, TYL
0,6 60 16 40,5 4 fumier de
porc 2 74,3 49,7 41,9 20
OTC, CTC, TYL
1,1 60 24 40,5 4 fumier de
porc 2 79,1 59,8 42,1 20
OTC, CTC, TYL
1,5 60 32 40,5 4 fumier de
porc 2 83,5 64,6 42,2 20
OTC, CTC, TYL
2 60 8 40,5 4 fumier de
porc 2 74,8 50,6 12,7 20
OTC, CTC, TYL
2,4 60 16 40,5 4 fumier de
porc 2 76,6 51,5 38,9 20
OTC, CTC, TYL
2,8 60 24 40,5 4 fumier de
porc 2 79,7 57,9 40 20
OTC, CTC, TYL
3,3 60 32 40,5 4 fumier de
porc 2 83,5 67 47,1 20
* Concentration 1 X établie en fonction de l’article de Blackwell et al. (2004a)
134
Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm
Variables
Taux de récupération
des antibiotiques
(%) Composants
Temps d'attente dans le
méthanol (h)
Temps de contact après
enrichissement (min)
Volume de
solution extractive
ajouté (mL)
Température d'extraction
(°C)
Méthode SPE
Type de matrice
d'extraction
Concentration en solutés de la solution extractive
(X)*
OTC CTC TYL
Concentration d'antibiotique initiale ajoutée
(ppm)
OTC, CTC 1,3 60 8 41 4 fumier de
porc 2 40,6 21,1 - 20
OTC, CTC 1,8 60 32 41 4 fumier de
porc 2 76,9 57,1 - 20
OTC, CTC 2,2 60 40 41 4 fumier de
porc 2 83,8 59,8 - 20
OTC, CTC 2,7 60 48 41 4 fumier de
porc 2 70,5 65,8 - 20
OTC, CTC 3,1 60 8 41 4 fumier de
porc 2 62,8 34,6 - 20
OTC, CTC 3,6 60 32 41 4 fumier de
porc 2 54,1 34,6 - 20
OTC, CTC 4 60 40 41 4 fumier de
porc 2 78,4 51,6 - 20
OTC, CTC 4,4 60 48 41 4 fumier de
porc 2 93,1 65,7 - 20
28 heures d'attente dans le méthanol OTC, CTC, TYL
29,4 15 15 23 3 fumier de
porc 0,5 11 6,1 17,5 20
OTC, CTC, TYL
28,1 15 15 23 3 eau 0,5 0 0 0 20
OTC, CTC, TYL, DOXY
29 15 15 23 3 eau 0,5 0 0 0 20
52 heures d'attente dans le méthanol OTC, CTC, TYL
51,8 15 15 23 3 fumier de
porc 0,5 0 0 0 20
OTC, CTC, TYL
52,3 60 60 23 3 fumier de
porc 0,5 0 0 0 20
OTC, CTC, TYL
52,8 180 180 23 3 fumier de
porc 0,5 7,4 8,5 14,1 20
*Concentration 1 X établie en fonction de l’article de Blackwell et al. (2004a).
135
Annexe 3. Chromatogrammes de la CTC dans l’eau (0-25 min) et extraite du fumier de porc (12-20 min)
Ligne rouge pointillée : eau ; Ligne violette tiret-point : OTC, CTC, TYL à des concentrations de 20 ppm ; Ligne bleue continue : OTC, CTC, DOXY, TYL à des enrichissements de 20 ppm, sauf pour la DOXY (200 ppm).
Ligne violette pointillée : OTC, CTC extraits du fumier de porc (Enrichissement de 20 ppm, 355 nm) ; Ligne rouge continue : OTC, CTC, TYL dans l’eau (20 ppm, 285 nm) ; Ligne bleue continue : Fumier de porc sans antibiotique (285 nm) ; Ligne orange continue : OTC, CTC, TYL extraits du fumier de porc (Enrichissement de 20 ppm, 285 nm).
136
Annexe 4. Chromatogrammes de la CTC extraite du fumier de bovin de boucherie et de veau (12-20 min)
Ligne violette pointillée : OTC, CTC extraits du fumier de bovin de boucherie (Enrichissement de 20 ppm, 355 nm) ; Ligne rouge continue : OTC, CTC, TYL dans l’eau (20 ppm, 285 nm) ; Ligne bleue continue : Fumier de bovin de boucherie sans antibiotique (285 nm) ; Ligne orange continue : OTC, CTC, TYL extraits du fumier de bovin de boucherie (Enrichissement de 20 ppm, 285 nm).
Ligne violette pointillée : OTC, CTC extraits du fumier de veau lyophilisé (Enrichissement de 20 ppm, 355 nm) ; Ligne rouge continue : OTC, CTC, TYL dans l’eau (20 ppm, 285 nm) ; Ligne bleue continue : Fumier de veau lyophilisé sans antibiotique (285 nm) ; Ligne orange continue : OTC, CTC, TYL extraits du fumier de veau lyophilisé (Enrichissement de 20 ppm, 285 nm).
137
Annexe 5. Courbes standards de l’OTC, de la CTC à 285 nm
y = 57860x
R2 = 0,9996
y = 64928xR2 = 0,9996
y = 69720x
R2 = 0,9995
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
0 10 20 30 40 50 60Concentration (ppm)
Air
e so
us la
co
urb
e
Courbe standard eau Courbe standard eau 2 Courbe standard méthanol
Figure 29. Quantification de l’OTC en fonction de l’aire sous la courbe.
y = 52426x
R2 = 0,9994
y = 55122xR2 = 0,9998
y = 60323x
R2 = 0,9979
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
0 10 20 30 40 50 60
Concentration (ppm)
Air
e so
us
la c
ourb
e
Courbe standard eau Courbe standard eau 2 Courbe standard méthanol
Figure 30. Quantification de la CTC en fonction de l’aire sous la courbe.
138
Annexe 6. Courbe standard de la TYL à 285 nm
y = 57862x
R2 = 0,9999
y = 46827x
R2 = 0,9998
y = 48787x
R2 = 0,938
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
0 10 20 30 40 50 60
Concentration (ppm)
Air
e s
ou
s la
co
urb
e
Courbe standard eau Courbe standard eau 2 Courbe standard méthanol
Figure 31. Quantification de la tylosine en fonction de l’aire sous la courbe.
139
Annexe 7. Courbes standards de l’OTC et de la CTC à 355 nm
y = 65108x
R2 = 0,9992
y = 74271x
R2 = 0,9997
y = 38484x
R2 = 0,9628
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
0 10 20 30 40 50 60
Concentration (ppm)
Air
e s
ou
s l
a c
ou
rbe
Courbe standard eau Courbe standard eau 2Courbe standard méthanol
Figure 32. Quantification de l’OTC en fonction de l’aire sous la courbe.
y = 45709xR2 = 0,999
y = 47933x
R2 = 0,9994
y = 24942xR2 = 0,9623
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
0 10 20 30 40 50 60
Concentration (ppm)
Air
e so
us la
co
urb
e
Courbe standard eau Courbe standard eau 2 Courbe standard méthanol
Figure 33. Quantification de la CTC en fonction de l’aire sous la courbe.
140
Annexe 8. Spectres et chromatogramme de la TYL analysée par LC-MS
Figure 34. Spectres des antibiotiques CTC (472) et TYL (918).
Figure 35. Chromatogramme de la TYL.
141
Annexe 9 Extraction des antibiotiques à partir de fumier de porc
Tableau 22. Concentrations estimées en chlortétracycline et en tylosine après enrichissement en fonction des valeurs d’absorbance ajustées au contrôle négatif utilisant la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2).
Valeur d’absorbance brute
moyenne
Valeur d’absorbance
corrigée † Essai
Concentration
d’antigènes
ajoutés (ppb) Courbe
1
Courbe
2 Inconnu
Courbe
2 Inconnu
Concentration
estimée des
antigènes
détectés †
(ppb)
Pourcentage
de
récupération†
(%)
0 0.599 1.075 1.155 -* 1.075 0,011 -
0,05 1.189 0.986 - -* - - -
0,15 0.907 0.850 0.900 -* 0.820 0,18 120
0,45 0.716 0.650 0.864 -* 0.784 0,24 53
1,35 0.512 0.585 0.960 -* 0.880 0,11 8,1
Mét
hode
1
4,05 0.382 0.463 0.892 -* 0.812 0,19 4,7
0 - 0.901 0.901 -** 0.901 0 -
0,05 - 0.809 0.758 -** 0.758 0,069 138
0,15 - 0.651 0.674 -** 0.674 0,14 93
0,45 - 0.531 0.671 -** 0.671 0,14 31
1,35 - 0.384 0.509 -** 0.509 0,53 39
Chl
orté
trac
ycli
ne
Mét
hode
2
4,05 - 0.274 0.543 -** 0.543 0,40 9,9
0 1.361 0.804 0.844 1.361 0.804 - -
1 1.040 0.777 0.654 1.334 0.614 0,89 89
5 0.611 0.622 0.293 1.179 0.253 16,02 320
10 0.405 0.433 0.237 0.990 0.197 25,60 256
50 0.215 0.293 0.166 0.850 0.126 46,60 93
Tyl
osin
e
100 0.201 0.215 0.118 0.772 0.078 78,12 78
† La courbe 2 a été corrigée en fonction de la courbe 1. L’inconnu a été corrigé en fonction de la courbe 2
seulement.
* La courbe 2 n’a pas pu être comparée à la courbe 1, car le CTRL- de cette dernière ne suit pas une
absorbance acceptable.
** La courbe 1 n’a pas été établie par manque de puits dans le kit ELISA.
142
Annexe 10. Expériences de centrifugation (ELISA)
Les échantillons ont été extraits de fumier de porc avec 4 mL de tampon carbonate
pH 9 + 0,01 M Na2EDTA + 2 g/L de tween 20. Puis, ils ont été rincés avec 2 mL de
solution 0,01 M Na2EDTA. Une deuxième extraction s’est faite avec 4 mL d’un mélange
de 20 % de 0,2 M (essai 1) ou de 1 M (essai 2) d’acide citrique avec 80 % de méthanol. Un
dernier rinçage avec 2 mL de solution à 0,2 M ou 1 M d’acide citrique a été fait. Les deux
extractions ont été exécutées dans le bain à ultrasons pour une durée de 15 min, à 35°C. Un
ajustement du pH vers la neutralité a été réalisé pour l’essai 2.
Tableau 23. Concentrations récupérées en chlortétracycline après enrichissement en fonction de la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et en fonction de la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2).
Courbe 1
(ppb)
Courbe 2
(ppb)
Récupération en
antibiotique
selon la courbe
1
(ppb) †
Récupération en
antibiotique,
avec
centrifugation,
selon la courbe 1
(ppb) †*
Récupération
en antibiotique
selon la courbe
2
(ppb) †
Essai 1 2 1 2 1 2 1 2
0 0,055 2,31 0,19 4,02 0,12 1,91 -
0,05 0,12 3,21 0,18 4,56 - 0,55 0,036 -
0,15 0,22 - 0,32 2,74 0,26 0,75 0,086 -
0,45 0,55 3,38 0,20 3,08 - 1,33 0,044 -
1,35 1,22 4,07 0,44 4,10 - 0,92 0,14 -
4,05 1,85 5,24 1,33 3,97 0,89 1,06 0,77 -
† Les tirets indiquent des résultats hors de la courbe standard.
* La centrifugation était de 1200 rpm, 15 min.
143
Suite Annexe 10. Expériences de centrifugation (ELISA)
Tableau 24. Concentrations estimées en chlortétracycline après enrichissement en fonction des valeurs d’absorbance ajustées au contrôle négatif utilisant la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2).
Valeur d’absorbance brute moyenne Valeur d’absorbance
corrigée †
Inconnu* Inconnu*
Concentration
estimée des
antigènes
détectés†
(ppb)
Pourcentage de
récupération†
(%)
Concentration
d’antigènes
ajoutés
(ppb) Courbe
1
Courbe
2
NC C
Courbe
2
NC C NC C NC C
0 1.857 1.455 1.498 1.639 1.857 1.857 1.857 0,19 0,12 - -
0,05 1.638 1.230 1.547 - 1.632 1.906 - 0,18 - 360 -
0,15 1.249 1.043 1.356 1.414 1.445 1.715 1.632 0,32 0,26 213 173
0,45 0.736 0.767 1.470 - 1.169 1.126 - 0,20 - 44 -
1,35 0.492 0.525 1.265 - 0.927 0.884 - 0,44 - 11 -
Ess
ai 1
4,05 0.375 0.402 0.914 1.036 0.804 0.761 1.254 1,33 0,89 33 22
0 1.820 0.743 0.596 0.795 1.820 1.820 -** 4,02 1,91 - -
0,05 1.496 0.657 0.563 1.126 1.734 1.787 -** 4,56 0,55 9120 1100
0,15 1.206 0.717 0.690 1.036 1.794 1.914 -** 2,74 0,75 1827 500
0,45 0.742 0.664 0.689 0.913 1.741 1.913 -** 3,08 1,33 684 296
1,35 0.502 0.612 0.610 1.008 1.689 1.834 -** 4,10 0,92 304 68
Ess
ai 2
4,05 0.383 0.542 0.616 0.969 1.619 1.840 -** 3,97 1,06 98 27
† Les inconnus et la courbe 2 ont été corrigés en fonction de la courbe 1.
* L’inconnu NC est l’extrait de fumier de porc non centrifugé. L’inconnu C est l’extrait de fumier de porc
centrifugé.
** La courbe 2 n’a pas pu être comparée à la courbe 1, car le CTRL- de cette dernière ne suit pas une
absorbance acceptable.
144
Annexe 11. Équations de calculs des indices de précision du FT-NIR
Conversion des longueurs d’onde : υ (cm-1) = 107/λ (nm)
Calculs de SEC/SEP/RMSEC/RMSEP
7
11
x : Références y : Valeurs prédites SEC : Erreur quadratique de calibration ; n: Nombre d’échantillons dans la calibration ; f : Nombre de facteurs utilisés dans le modèle de calibration. SEP : Erreur quadratique de prédiction ; n: Nombre d’échantillons dans la validation. RMSEC : Valeur moyenne de l’erreur quadratique de calibration. RMSEP : Valeur moyenne de l’erreur quadratique de prédiction.
Calcul de l’écart-type (SD)
11
SD : Écart-type ; n: Nombre d’échantillons dans la calibration ; xi,j est la ieme répétition du jeme échantillon.
Calcul de RPD
RPD = SD/SEP
RPD : Rapport de l’erreur-type de prédiction par rapport à l’écart-type ; SD : Écart-type de la différence entre les valeurs de références et les valeurs prédites de la série validation ; SEP : Valeur de références de la série validation par le SEP.
Calcul de RER
RER = Valeur maximale-Valeur minimale
SEP
RER : Étendue du rapport de l’erreur.
7 Tremblay, 2008
145
Annexe 12. Lignes directrices pour l’interprétation du coefficient de détermination (r2) et des ratios RDP et RER
Tableau 25. Lignes directrices pour l’interprétation du coefficient de détermination (r2)8.
r2 Interprétation
0,25 et - Non utilisable pour un étalonnage NIR
0,26-0,49 Corrélation faible : chercher les raisons
0,50-0,64 Précision des résultats obtenus douteuse
0,65-0,81 Utile pour des approximations
0,82-0,90 Utilisable pour la plupart des applications, incluant la recherche
0,91-0,96 Utilisable dans la majorité des applications, incluant le contrôle de
qualité
0,97 et + Utilisable partout
Tableau 26. Lignes directrices pour l’interprétation des ratios RPD et RER dans l’industrie9.
Valeur RPD Valeur RER Classification Application
0,0-1,9 6 et - Très faible Non recommandé
2,0-3,0 7-9 Acceptable Filtrage non précis
3,1-4,0 10-20 Satisfaisant Filtrage
4,1-6,4 21-30 Bon Contrôle de qualité
6,5-8,0 31-40 Très bon Contrôle de procédé
8,1 et + 41 et + Excellent Partout
8 Adapté de Williams, 2001 ; Malley et al., 2004 ; Marie-Ève Tremblay, 2008 9 Adapté de William, 2001 ; Malley et al., 2004 ; Stenberg et al., 2004 ; Marie-Ève Tremblay, 2008
146
Annexe 13. Spectres pur et différentiels de la CTC et des modifications dues à l’acétone
Ligne violette : Spectre direct de la CTC pure en poudre ; Ligne rouge : Spectre différentiel de la CTC dans le fumier de veau (Spectre saturé en CTC – Spectre sans antibiotique) ; Ligne bleue : Spectre différentiel des modifications dues à l’acétone dans le fumier de veau.
Charte des bandes d’absorption NIR (Thermo electron corporation).
147
Annexe 14. Programmation de l’appareil FT-NIR avec le logiciel Result Integration
