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EFFET DE L’ION Mg2f SUR LA CROISSANCE DES TBTARDS DE DISCOGLOSSUS PICTUS (OTTH) ET SUR LA CAPACITE DE LEURS MICROSOMES A SYNTHETISER LES PROTEINES

IN VITRO

CLAUDE NEAUPORT

Laboratoire de Physiologie Chimique, FacultC des Sciences, 1 rue Guy-de-la-Brosse, 75, Paris (So), France

(Recemed 27 July 1972)

Abstract-l. Inhibition of growth of tadpoles was induced by an excess or lack of Mg2+ ions in the breeding medium (mineral solutions). It was cor- related with a decrease in the ability of the isolated microsomes to synthesize proteins.

2. The action of Mg2+ ions added in vitro to the incubation system suggested that the inhibition of protein synthesis was due to an excess or a lack of micro- somal Mg2+ content.

3. The comparative action of Mg2+ and Mn”+ ions has been studied. Mn2+ ions were comparable to Mg2+ . Ions but at concentrations ten- or hundredfold less.

4. Preliminary experiments dealing with the action of Mg2+ ions on the formation of leucyl-tRNA were made.

Resume-1. Une x&s ou un deficit de Mg 2+ dans le milieu d’6levage (solution min6rale) oh se d6veloppent des t&tards de Discoglosse provoque une inhibition de la croissance des animaux et de l’aptitude des microsomes isol& g synthetiser les prodines.

2. L’action de Mg2+ surajoutk in who au milieu d’incubation montre que la diminution du taux de synthkse protCique relke d’une carence ou d’une surcharge des microsomes en ions Mg2+ selon le cas CtudX

3. L’action de l’ion Mn2+ est comparable & celle de l’ion Mg2+ a des concen- trations dix g cent fois infhrieures.

4. Une toute premi&e Ctude de la charge du tRNALeU montre, sous l’effet de Mg2+, un parallClisme entre les modifications de la synthkse prot&ique globale et celles qui affectent la quantit6 de leucyl-tRNA form&

INTRODUCTION DES T~~TARDS de Discoglossm pictus sont Clew% dans des solutions minCrales dont la composition est indiquke dans le Tableau 1. Trois milieux A, B et C sont utilisb. 11s diffkrent entre eux par la seule concentration en MgCl, et contiennent respectivement : A: 0,OS mM, B: 0,25 mM, C: 10 mM de chlorure de magnCsium. 11 avait CtC prCcCdemment montrt! en comparant diffkentes populations que l’ion Mg2+ exerce une action t&s nette sur la croissance des tctards (Neauport, 1969).

59.5

596 CLAUDE NEAUPORT

Bellec & Stolkowski (1964) et Trombert (1967) avaient auparavant montre, sur ce m&me materiel, des modifications importantes dans la croissance des tCtards en fonction des concentrations en ions K+, Caa+ et Mg2+ dans le milieu d’elevage.

La Fig. 1 rappelle les courbes de croissance comparee des trois populations A, B et C en fonction de la concentration en Mg 2+ du milieu d’elevage. On remarque, par rapport aux t&ards B (temoins), une importante inhibition de la croissance globale des tetards, soit par deficit magnesique (t&tards A ou tCtards “carences en Mg2+“) soit par surcharge magnesique (t&tards C ou t&tards “surcharges en Mgs+“).

,

650 - 0

J(timoinsJ

/ a

50 5 IO I5 20 25

en Mg2+j

Ego en jours

FIG. 1. Croissance de differentes populations de t&ards en fonction du Mgr+ du milieu d’elevage.

TABLEAU ~-COMPOSITION DES TROIS MILIEIJX D’BLEVAGE UTILIS~S

Sels (mM) A

Milieux

B C

MgCI, 0,05 0,25 10 CaCIB 1,08 1,08 1,08 KC1 1,59 1,59 1,59 NaCl* 111,3 lll,o 96,0

* Les faibles variations en NaCl n’ont pour but que d’assurer une pression osmotique identique dans chacun des milieux (abaissement cryometrique 0,48”C).

Les miheux contiennent Cgalement des oligoCl&ments: Boss-, Znr+, Cur+, MrP+, I-, Mo~O,,~-. Le pH est Bgal a 7,4.

LA CROISSANCE DES T%TARDS DE DISCOGLOSSUS PICTUS 597

Pour rechercher les mCcanismes impliques dans les phenomenes indiques, une premiere etude, a CtC faite au niveau subcellulaire. Des fractions nucleaires, mito- chondriales et microsomales ont ettc isolees a partir de t&ards Cleves dans des milieux qui different par leur concentration en MgCl,. Cette etude pr&minaire a montre que pour ce materiel, l’ion Mg 2+ Ctait fortement lie aux structures isolees et que les variations du taux de Mg a+ lie etaient surtout sensibles au niveau microsomal (Neauport & Michel, 1971).

Dans ces conditions, il Ctait interessant d’etudier la capacite des microsomes isoles a synthetiser les proteines en absence et en presence de Mg2+ surajoute au milieu d’incubation. Ce travail devait permettre d’etablir d’eventuelles correla- tions avec les phenomenes observes au niveau de la croissance globale des animaux et d’obtenir des informations sur les modalites d’action de l’ion Mg2+ dans les situations de carence et de surcharge. D’autre part, des auteurs ont suggCrC que l’ion Mn2+ pouvait remplacer l’ion Mg 2+ dans de nombreux systemes enzymatiques (Deutscher, 1967; Burkard, 1970). Nous avons recherche, in vitro, ce qu’il en Ctait sur notre materiel a propos de la synthtse proteique globale.

Microsames utilise’s MATERIELS ET METHODES

Les microsomes ont CtC isok et purifies comme indique par ailleurs (Neauport & Michel, 1971), a partir des populations de tCtards A, B et C au stade de dCveloppement IX-X (d&m suivant Taylor & Kollros, 1949).

Le fractionnement de ces microsomes sur gradient de sucrose donne un profil rep&- sent6 sur la Fig. 2. Le proiil de fractionnement n’est pas sensiblement different avec les microsomes extraits de A, B ou C. D’autre part, les dosages d’azote (Kjeldhal), de pro- teines (Lowry et. al., 1951), de RNA (Slater, 1958) et de Mg2+ (spectrophotometrie d’ab- sorption atomique) ont CtC effect& dans les dfferents culots de microsomes. La rapport de

0 II 0.5 -

E c E / ‘.

6

0

d

0.2 - I_ 0

\

I\ f 0

0 0 / -*-m-q ,

5 IO

no du tube

FIG. 2. Analyse des microsomes en gradient de sucrose. Les microsomes sont deposes sur 20 ml d’un gradient lineaire 16-34 pour cent de sucrose qui repose sur 5 ml de sucrose 2 M. Centrifugation 120 a 25.000 rev/min en rotor S.W. 25,l. Fractions de 2 ml collectees et lues B 260 mn (VASSALI, 1967). Le pit I contient essentiellement des proteines (RNA/protCines = 0,013 + 0,003). Le pit II est riche en ribosomes (RNA/protCines = 0,320 f 0,010).

598 CLAUDE NEAUPORT

la quantite de RNA & celle de proteines est le m&me pour les microsomes A, B et C et Cgal B 0,260 f 0,020 mg de RNA par mg de prodines. Le taux de Mg*+ lie aux microsomes, exprime en nmoles de Mg*+ par mg d’azote, s’etablit aux valeurs moyennes suivantes pour chaque population de t&tards: microsomes A: 410 + 45 ; microsomes B: 660 + 30; microsomes C: 920 * 50. Les microsomes sont conserves a - 20°C avant utilisation.

Milieu d’incorporation utilisk Le milieu d’incorporation utilise est voisin de celui de R. Cox et al. (1970). 11 contient

pour chaque incubation: -Des microsomes, B raison de 0,2 a 0,s mg de proteines microsomales determinCes selon

la m&ode de Lowry (1951). La Fig. 3 montre que le taux d’incorporation est lineaire quand on augmente la quantite de microsomes jusqu’a une valeur d’au moins 1 mg de protCines microsomales.

FIG. 3. Incorporation de 14C leu en fonction de la quantite de microsomes dans l’incubation.

-La fraction pH 5 enzymes. Le Tableau 2 montre que

Cette fraction est isolee selon la methode de Moldave (1963). la fraction pH 5 enzymes isolee a un effet inhibiteur sur la

synthese prodique. Cet effet disparait si on dialyse au prealable 24 h contre du Tris- HCl lOma M, pH 7,4 (6limination des molecules de PM d 10.000. Les incubations ont done 6th realisees sans pH 5 enzymes surajoute, ce materiel existant & l’etat endogene, en quantite non limitante, dans les fractions microsomales isolees. Ce fait est 21 rapprocher des resultats similaires obtenus par Unsworth & Cohen (1968) sur foie de t&tards.

-Un systeme generateur d’ATP contenant 0,5 pmole d’ATP, 10 pmoles de phosphoenol- pyruvate de sodium (PEP) et 40 pmoles de KCI. L’addition de pyruvate kinase n’ayant aucun effet sur l’incorporation (cf. Tableau 1) l’enzyme n’a pas Bte surajoute au milieu d’incubation; la pyruvate kinase endogene est su8isante.

-0,l pmole de guanosine triphosphate (GTP). -50 r-moles de chacun des vingt acides animes froids et la leucine 14C uniformement mar-

quee (foumie par le Commisariat B 1’Energie Atomique) ajoutee a raison de 50 nmoles par incubation (activite specifique 151 mCi/mmole).

200 1000

Protkes microsom, pg

Chaque incubation a un volume total de 2 ml et est tampontree a un pH de 7,4 (Tris- HCl: 1O-2 M). Le milieu ne contient pas de magnesium surajoute. Le seul Mg*+ present est celui qui est lie allx microsomes utilises. Les incorporations sont realisees B 20 -+ 1 “C.

LA CROISSANCE DES TSTARDS DR DISCOGLOSSUS PICTUS

TABLEAU 2-&!TION DU pH 5 ENZYMES SUR LE TAUX D’INCORPORATION

599

pH 5 enzymes Incorporation pH 5 enzymes Incorporation non dialyse (cpm/mg de pro- dialyse (cpm/mg de pro-

(mg protCines/ml teines microso- (mg prodines/ml t&es microso- d’incubation) males) d’ incubation) males)

0 10.400 0 9700 0,2 8100 032 9400 1 6700 1 9850

Les conditions d’incorporation sont indiquees dans le paragraphe Materiels et M&odes. La fraction pH 5 enzymes est isolee selon la technique de Moldave et dialysee 24 h contre un grand volume de Tris lOba M, pH 7,4 (fuite des molecules de PM < 10.000). Duree de l’incorporation: 60 min.

Dkermination du taux d’incorporation Les incorporations sont interrompues au temps choisi par addition de PCA 0,s N

final et aussitat portees a 4°C. Apres precipitation puis traitement a 90°C pendant 20 min (Vassali, 1967; Unsworth & Cohen, 1968), les precipites sont recueillis sur liltre Whatman GF/C, la&s avec un grand volume de PCA 0,s N a 4°C puis a l’ethanol.

Apres sechage, les mesures de radioactivite sont faites B l’aide d’un compteur type Tracerlab 1 courant gazeux et fenCtre ultra-mince (bruit de fond 15 a 30 cpm-efficacite de comptage du W = environ 15 pour cent). Les resultats sont exprimes en coups par minute et par mg de prottines microsomales utilisees.

TABLEAU 3---CARACTfiRISTIQUES DU SYSTlhIE ACELLULAIRR UTILISB

Milieu d’incubation Taux d’incorporation

(%)

- GTP - GTP, ATP, PEP, PK -PK + pH 5 enzymes (0,s mg prodines/ml) + pH 5 enzymes dialyse (0,s mg proteines/ml) + KC1 (100 mM) + CaCl, (100 mM) + RNase (100 pg/ml) + Puromycine (100 pg/ml) + Puromycine (200 pg/ml)

16 8

100 65

101 92 59

5 14 4

Le taux d’incorporation du systeme complet defini dans le paragraphe Materiels et MCthodes est arbitrairement fix& a 100 pour cent.

CaracttKstiques du syst2me acellulaire utilise’ Le taux d’incorporation a btC mesure en fonction de facteurs supprimes ou surajoutes

au milieu d’incubation precedemment d&r-ii. Le Tableau 3 donne les caracteristiques du sysdme utilisC.

600 CLAUDE NEAUPORT

Dt%ermination de la quantitt de leucyl-tRNA fomte’ La technique utilisee est celle indiquee par Vassali (1967). Des incorporations de

leucine 14C sont realisees dans le milieu precedemment defini mais en absence des acides amines froids et avec de la puromycine (200 pg/ml). D eux series d’incubations identiques sont rCalisCes conjointement. Dans la premiere on d&ermine le taux d’incorporation comme indique plus haut. Dans la seconde serie, on omet le traitement a 90°C. La difference represente le tRNA charge.

Cin&ique d ‘incorporation RESULTATS

Des cinttiques d’incorporation de leucine 14C dans les proteines ont CtC rCalisCs dans un m&me milieu d’incubation (defini dans le paragraphe Materiels et MCthodes) parallelement, pour des microsomes A, B ou C. Les incorporations sont interrompues a des temps variables et le taux de 14C leu incorpore est deter- mine.

La Fig. 4 montre les cinetiques obtenues a I’aide des trois types de microsomes. Apres une heure d’incubation, le taux d’incorporation pour chacune des popu- lations de microsomes s’etablit aux valeurs moyennes suivantes (exprimees en

10000 1

Temps en mn

FIG. 4. Cin&ique d’incorporation de 14C leu dans les proteines. Etude a l’aide des microsomes A, B et C.

cpm/mg de protCines microsomales) = microsomes A = 9000 f 500 ; microsomes B = 11.000 f 500; microsomes C = 7800 + 500. On note done par rapport aux

LA CROISS~CE DES T~TAFW DE DZSC~GL~SSUS PZCTUS 601

microsomes B (temoins), une inhibition de 18 pour cent pour les microsomes A (caren& en Mg2+) et de 29 pour cent pour les microsomes C (surcharges en Mg2+).

Action de l’ion Mg2+ surajoutb au milieu d’incubation

Les taux de Mg 2+ lies aux microsomes A, B et C &ant difftkents, il nous a paru interessant de rechercher si ce parametre etait susceptible d’expliquer les differences observees B l’aide des cinetiques d’incorporation de W leu dans les prodines. Des incubations ont CtC rCalisCes avec chaque type de microsomes a

I I I I I IO-' 2X10--M

[Mg2+l FIG. 5. Action de la concentration en Mga+ sur le taux d’incorporation des trois

populations de microsomes. Durke de l’incubation = 1 h.

diffkrentes concentrations en Mg2+ surajoute in vitro. La Fig. 5 donne le taux d’incorporation en fonction de la concentration en Mg2+ pour les microsomes A, B et C aprb 1 h d’incubation. On peut en deduire: -Que toute quantite de Mg2+ ajoutke in vitro aux microsomes B et C inhibe

l’incorporation de “C leu dans les prodines. -Que le systeme utilisant les microscomes A a un taux d’incorporation qui

augmente quand on ajoute du Mgs+ a faible concentration ( < 7,s x 1O-2 M) puis diminue pour des concentrations plus fortes.

602 CLAUDE NEAUPORT

TABLEAU ~-ACTION COMPAR~E DU Mg”+ ET Mn2+ DU MILIEU D’INCUBATION SUR LE TAUX D’INCORPORATION DES MICROSOMBS B ET A

Microsomes B (tkmoins)

Incorporation (cpm/mg de pro-

Concentration en tCines microsomales) Mg2+ ou Mn2+

(mole/l.) Mg2+ Mn8+

0 11.300 11.300 10-a - 5000 2,s x lo-” 11.200 1430 5 x 10-a - 7,s x 10-2 6900 1 10-l - - 1,s x 10-l 3350 -

Microsomes A (caren&)

Incorporation (cpm/mg de pro-

Concentration en tCines microsomales) Mg2+ ou Mn2+

(mole/l.) Mg’f Mn’+

0 9050 9050 2,s x 1O-4 - 10.800 5 x 10-4 - 10.200 10-a - 9400 2,s x 1O-3 - 6300 2,s x lo-* 10.700 4900 10-l 5600 -

Au delh de 2,s x 10e2 M, l’ion Mn”+ provoque une prkipitation dans le milieu d’incubation. Duke des incorporations: 60 min.

Action comparbe de l’ion Mn2+

L’action comparee des ions Mg 2+ et Mn2+ a CtC CtudiCe avec des microsomes A et B. Le Tableau 4 donne les taux d’incorporation de 14C leu dans les proteines apres une heure d’incubation en fonction de concentrations variables en Mg2+ ou en Mnaf. L’ion Mn2+ parait avoir une action de m&me type que celle qui a CtC observee a l’aide de l’ion Mg2+ sur la synthbe proteique mais, a des concentrations beaucoup plus faibles. Pour les microsomes B (temoins) le Mn2+ a un effet inhibiteur identique a celui du Mg2+ pour des concentrations dix fois moindres. Pour les microsomes A (caren&), l’ion Mn2+ semble, comme l’ion Mg2+, capable de faire croitre le taux de synthtse proteique mais a une concentration cent fois plus faible.

Etude de la quantitt! de leucyl tRNA form6 La quantite de leucyl-tRNA form6 a CtC mesuree avec les trois types de micro-

somes A, B et C en fonction de la concentration en Mg2+ surajoute au milieu d’incubation. Le Tableau 4 indique les resultats obtenus. 11 en ressort: -Que toute addition de Mg2+ aux microsomes B (temoins) fait decroitre la

quantite de leucyl-tRNA form& -Que dans le systeme utilisant les microsomes C, la quantite de leucyl-tRNA

form6 est plus faible que dans le systtme utilisant les microsomes B. -Que l’addition de Mg2+ aux microsomes A (carences) fait, pour une concen-

tration de 2,5 x 10m2 M, croitre la quantite de leucyl-tRNA.

LA CROISSANCE DES Tik4RD.S DE DISCOGLOSSUS PICTUS

DISCUSSIONS ET CONCLUSION

603

L’examen de la Fig. 4 rCdle une synthese proteique moindre des microsomes A et C par rapport aux microsomes B. On retrouve la, in r&o, un phenomene observe sur I’animal entier: -L’inhibition de la croissance des t&tards A et C par rapport aux tCtards B (Fig. 1).

L’etude de l’action de l’ion Mg2+ surajoute au milieu d’incubation semble indiquer que c’est bien cet ion qui est en cause dans les differences de cinetique observees (Fig. 4). En effet:

-L’addition de Mg 2+ 10-l M aux microsomes B (Fig. 5) ramene le taux d’incor- poration de ceux-ci a celui des microsomes C mesure en absence de Mg2+ sur- ajoute. L’inhibition de la synthbe prottique constatee avec les microsomes C par rapport aux microsomes B (Fig. 4) est done due 21 une surcharge en Mg2+ dans le milieu d’elevage (laquelle provoque une augmentation de la quantite de Mga+ lie dans les microsomes isolb).

-La synthbe proteique moindre constatee avec les microsomes A (Fig. 4) par rapport aux microsomes B est due a un deficit en Mg2+ puisque l’addition de 5 x 10~~ M de cet ion suffit a faire croitre le taux d’incorporation & un niveau sensiblement identique a celui des microsomes B mesure en absence de Mg2+ surajoutd (Fig. 5).

-Enfin le taux d’incorporation des microsomes B est maximal. La concentration en Mg2+ du milieu d’elevage qui assure une croissance maximale est done celle utilisee pour les t&tards B (035 mM).

L’Ctude cornparke de l’action des ions Mg 2+ et Mnaf sur le taux de synthbe proteique montre que I’ion Mn2+ semble pouvoir remplacer l’ion Mg2+ dans les

TABLEAU S-CHARGE DU tRNALEU EN FONCTION DU Mga+ SURAJOUTB AU MILIEU D’INCUBATION. BTUDE DES MICROSOMES A, B ET C

Experience

1

Incorporation B C A avec microsomes (temoins) (surcharges) (carences)

[Mg”+] en mole/l. Cpm/mg proteines microsomales

0 1260 900 -

2 0 995 620 - 10-l 720 - - 2 x 10-l 210 - -

3 0 1190 - 950 2,s x 10-a - - 1350

10-I - - 715 2 x 10-I 360 - 250

La quantite de tRNA charge est determinee par difference selon la methode de Vassali (1967) apres 1 h d’incubation. La radioactivite compde apres hydro- lyse a 90°C est soustraite de la radioactivitk comptee sans hydrolyse.

604 CLAUDE NEAUPORT

systbmes enzymatiques impliqub. Ces rksultats sont g rapprocher de ceux de Deutchtr (1967) q ui a montrd que la glutamyl tRNA synthktase de foie de rat est activCe par l’ion Mg”+ et par l’ion Mn*+ sans que l’ion MrP+ soit toutefois aussi efficace que I’ion Mg 2+. Swensson (1967) relate des faits identiques sur la methionyl tRNA synth&ase de levure: la concentration en Mn2+ assurant une formation optimale de met-tRNA est infkrieure g celle de l’ion Mg2+.

Enfin, l’examen du Tableau 5 montre un parallClisme entre les variations de la synthbe:protCique globale et la quantite de tRNALeu charg& dans les diffdrentes conditions d’incubations.

Les rhultats obtenus ici utilisent toutefois une technique trop indirecte pour que des conclusions fermes puissent en hre tirkes.

Une purification de la leucyl-tRNA synthhtase et une Ctude de l’action de l’ion Mg2+ spr l’activitk de l’enzyme sont envisagkes. La dkpendance des tRNA synthhtases ?I l’dgard de l’ion Mg”+ semble en effet variable avec l’origine de l’enzyme (Hoagland, 1960; Allende, 1965 ; Chousterman & Chapeville, 1971).

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Key Word Index-Growth; tadpoles; Discoglossus pictus; Mg2+; Mn2+; microsomes.