Effet du rayonnement ionisant sur l’ADN cellulaire ...inac.cea.fr/Phocea/file.php?file=Seminaires/233/t233_1.pdf · CHAPITRE VII : Partie expérimentale ... FapydAdo : 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine

Université Paris XIFaculté de Médecine Paris-Sud

THESE

pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université Paris XI Spécialité : [Radiobiologie]

présentée et soutenue publiquement

parJean-Pierre Pouget

Date de soutenance : le 7 mars 2000

Effet du rayonnement ionisant sur l’ADN cellulaire :mesure des bases puriques et pyrimidiques modifiées

Titre :

Directeur de thèse : Monsieur Jean Cadet

JURY

Monsieur J.-M. CossetMadame E. SageMonsieur P. GauduchonMadame M. Gardès-AlbertMonsieur J.-L. Ravanat

PrésidentRapporteurRapporteurExaminateurExaminateur

Monsieur J. Cadet Examinateur

Thèse préparée au sein du laboratoire des Lésions des Acides NucléiquesService de Chimie Inorganique et Biologique/Département de Recherche Fondamentale

sur la Matière Condensée, Commissariat à l’Energie Atomique, Grenoble

« Car, enfin, qu’est ce que l’homme dans la nature ? Un néant

à l’égard de l’infini, un tout à l’égard de l’infini, un tout à

l’égard du néant, un milieu entre rien du tout. Infiniment

éloigné de comprendre les extrêmes, la fin des choses et leurs

principes sont pour lui invinciblement cachés dans un secret

impénétrable, également incapable de voir le néant d’où il est

tiré, et l’infini où il est englouti. »

Blaise Pascal, Pensées

J’exprime toute ma gratitude,

à Monsieur Jean Cadet pour m’avoir accueilli dans son laboratoire. Je le remerciepour sa disponibilité, ses compétences scientifiques ainsi que pour laconfiance qu’il m’a témoigné en toute circonstance .

à Madame Evelyne Sage, à Madame Monique Gardès-Albert ainsi qu’à MonsieurPascal Gauduchon pour avoir accepté de juger ce travail.

à Monsieur Jean-Marc Cosset qui a bien voulu présider mon jury de thèse et pour sonsoutien au cours de ces quatre années.

J’exprime ma profonde reconnaissance,

à Madame Marie-Jeanne Richard qui m’a accueilli au sein du Laboratoire de Biologiedu Stress Oxydant, pour nos nombreuses discussions et pour sonesprit critique,

à Monsieur Serge Boiteux pour le don des enzymes de réparation Fpg et endo III,

à Monsieur Jean-Luc Ravanat, à Monsieur Thierry Douki et à Madame SylvieSauvaigo, pour leurs nombreux conseils et pour leur aide tout au longde ces trois années, ainsi que pour nos mémorables déplacements.

Je remercie Monsieur Serge Candeias pour m’avoir accueilli dans son laboratoire de culturescellulaires.

J’adresse mes plus vifs remerciements,

à Messieurs les Professeurs Vrousos et Bolla, chefs du service de Radiothérapie duCHU Michallon, pour avoir mis à ma disposition les accélérateurslinéaires de particules et la source d’irradiation de cobalt 60,

à Madame le Docteur H. Kollodié du service de Radiothérapie pour son soutien,

aux radiophysiciens du service de Radiothérapie, Mesdames Andrée Dusserre et CécileCohard ainsi qu’à Monsieur Jean-Yves Giraud, pour leurscompétences et pour leur aide lors de la mise en place des séancesd’irradiations.

Je remercie chaleureusement Mesdames Jacqueline Méo, Sandra Grange, Lise Ydoux duLBSO et Madame Francette Odin pour les soins qu’elles ont apporté àmes cultures cellulaires.

Mes remerciements s’adressent aussi,

à Mademoiselle Isabelle Testard et à Monsieur Emmanuel Balanzat pour leur accueilau sein du Centre Interdisciplinaire de Recherche avec les Ions lourds(CIRIL) et pour la mise en place des scéances d’irradiations,

à Monsieur Dimitri Angelov pour ses compétences et la disponibilité dont il a faitpreuve lors des irradiations lASER des échantillons.

Je remercie Monsieur Maurice Berger pour m’avoir permis de partager son bureau à monarrivée et pour nos discussions Lozériennes.

Je remercie aussi tous mes compagnons de paillasse mais plus particulièrement SandrineFrelon pour son aide dans les mesures par CLHP-SM/SM, Anne-Gaëlle Bourdat pour son soutien dans ma recherche d’emploi, VictorDuarte et Florence Rivière pour leur disponibilité, Anthony Romieupour le Scientifique qu’il est, Thierry Delatour et Cédric D’Ham pourl’excursion « Néron », enfin Christine Didier et Eric Jourdan pourleur accueil au sein du LBSO.

Je remercie Madame Zohra Termache pour sa formidable efficacité et pour sa disponibilité.

« Calogero Tornabene » me remercie pour tous les conseils que je lui ai donné sur la vie. Jele remercie quant à moi pour les fournitures de petit matériel avant 15heures ... et pour les bons moments que nous avons passés ensemble.

Enfin, je dédie ces années à Marie-Claude et à la mémoire de mon père

- Sommaire -CHAPITRE I : Etude bibliographique

I. Rayonnements ionisants et Société __________________________________________________10

II. Effets des rayonnements ionisants __________________________________________________33

III. Rayonnements ultra-violets et visible ______________________________________________51

IV. La réponse du matériel biologique face aux rayonnements______________________________55

OBJECTIFS DE L’ÉTUDE ____________________________________________ 63

CHAPITRE II : Mise au point de méthodes chromatographiques

I. La technique de postmarquage et les méthodes immunologiques __________________________67

II. Optimisation de la méthode d’extraction de l’ADN cellulaire ____________________________70

III. Utilisation de la technique de CG-SM ______________________________________________78

IV. Utilisation de la technique de CLHP-SM/SM ________________________________________86

V. Conclusion ___________________________________________________________________102

CHAPITRE III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulairepar des méthodes chromatographiquesI. Formation de dommages de bases dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnementγ du 60Co _______________________________________________________________________104

II. Ionisation de l’ADN cellulaire par des impulsions UV LASER __________________________109

III. Formation des dommages de bases dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement UVA ____114

IV. Formation des dommages de bases dans l’ADN de monocytes photosensibilisés____________114

V. Discussion des résultats _________________________________________________________117

CHAPITRE IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes

I. Méthodes de mesure des coupures de brins de l’ADN __________________________________129

II. Optimisation de la mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes____________134

III. Utilisation de la méthode des comètes couplée à Fpg et endo III ________________________141

IV. Méthode des comètes en milieu neutre_____________________________________________149

V. Expériences mettant en jeu la réparation des lesions___________________________________152

VI. Discussion des résultats ________________________________________________________153

CHAPITRE V : Calibration de la méthode des comètes et aspects mécanistiques

I. Principe de la calibration de la méthode des comètes ___________________________________160

II. Calibration ___________________________________________________________________166

III. Expression des dommages ______________________________________________________170

IV. Discussion des résultats ________________________________________________________173

CHAPITRE VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire

I. Brefs rappels bibliographiques sur les ions lourds _____________________________________180

II. Mesure de la 5-HmdUrd, de la 5-FordUrd, des diols de thymidine, de la 8-oxodGuo et de la 8-oxodAdo par CLHP-SM/SM________________________________________________________182

III. Utilisation de la méthode modifiée des comètes _____________________________________184

IV. Discussion des résultats _______________________________________________________185

CONCLUSION ET PERSPECTIVES_____________________________________ 188

CHAPITRE VII : Partie expérimentale

I. Produits chimiques _____________________________________________________________194

II. Lignée et culture cellulaire_______________________________________________________194

III. Courbe de survie cellulaire______________________________________________________194

IV. Irradiations et réactions de photosensibilisation______________________________________195

V. Méthode de Microélectrophorèse sur gel____________________________________________198

VI. Méthode d’extraction de l’ADN cellulaire__________________________________________200

VII. Analyses chromatographiques___________________________________________________201

VIII. Stabilité des dérivés Fapy purines en milieu alcalin _________________________________208

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES __________________________________ 211

TABLE DES MATIÈRES________________________________________________ 234

Liste des principales abréviations

ADN : acide désoxyribonucléiqueA. O. : acridine orangeARN : acide ribonucléiqueATP : adénosine triphosphateBSA : albumine de sérum de veauBSTFA : N-bis(triméthylsilyle)trifluoroacétamideD. O. : densité optiqueCIPR : commission internationale de protection contre les rayonnementsC18 : groupements octadécylsilylesCG-SM : chromatographie gazeuse couplée à une détection par spectrométrie

de masseCLHP-DE : chromatographie liquide couplée à une détection électrochimiqueCLHP-DE-UV : chromatographie liquide couplée à une détection électrochimique et

ultra-violetteCLHP-SM/SM : chromatographie liquide couplée à une détection par spectrométrie de

masse en mode tandemCSB : cassure simple brinCDB : cassure double brinCB : somme des coupures simple et double brin et des sites alcali-labilesCBP : cyclobutadipyrimidinesdAdo : 2’-désoxyadénosinedCyd : 2’-désoxycytidinedGMP : 2’-désoxyguanosine monophosphatedGuo : 2’-désoxyguanosinedR : 2-désoxyribosedThd : 2’-désoxythymidineEBR : efficacité biologique relativeendo III : endonucléase IIIeV : électronvoltFapyAde : 4,6-diamino-5-formamidopyrimidineFapydAdo : 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine 2’-désoxyadénosineFapyGua : 2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidineFCS : sérum de veau foetal5-FordUrd : 5-formyl-2’-désoxyuridineFpg : formamidopyrimidine glycosylaseGy : Gray5-HmdUrd : 5-(hydroxyméthyl)-2’-désoxyuridineJ : JouleMRM : « multiple reaction monitoring »MTBDSTFA : N-tertbutyldiméthylsilyl-N-méthyl-trifluoroacétamideMTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium5-OHdUrd : 5-hydroxy-2’-désoxyuridine8-OxoAde : 8-oxo-7,8-dihydroadénine

8-OxodAdo : 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyadénosine8-OxodGuo : 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyguanosine8-OxoGua : 8-oxo-7,8-dihydroguaninePBS : solution saline isotonique à base de phosphatePRV : phosphodiestérase de rate de veauPVS : phosphodiestérase de venin de serpentRMN : résonance magnétique nucléaireRNase : ribonucléaseR. B. : rose bengalSAL : site alcali-labileSIM : « single ion monitoring »TEL : transfert d’énergie linéiqueTg : diols de thymineuma : unité de masse atomiqueUNSCEAR : « United Nation Scientific Committee on the Effects of Atomic

Radiation »UV : ultra-violetUVA : ultra-violet de type A

- Chapitre I -

Etude bibliographique

Chapitre I : Etude bibliographique 10

I. RAYONNEMENTS IONISANTS ET SOCIETE

A. IntroductionLa découverte des rayons X en 1895, celle du radium et du polonium par Pierre et Marie

Curie en 1898 et la découverte de la radioactivité de l’uranium en 1896 par Becquerel, ont donné le

signal de progrès qui vont révolutionner la physique et la médecine du 20ème siècle. En 1897,

Thomson découvre l’électron à partir d’expériences effectuées sur l’ionisation des gaz. Il inaugure

une voie qui conduira à la détermination de son rôle dans la matière et à l’électronique. Planck

propose la mécanique quantique en 1903. Einstein établit l’équivalence matière-énergie en 1905 et

ouvre la voie de l’énergie nucléaire. Il met en évidence, la même année, la double nature

corpusculaire et ondulatoire des photons. La structure des atomes est avancée par Rutherford en 1912

à partir d’expériences effectuées à l’aide d’un faisceau de particules alpha dirigé contre une mince

feuille d’or. Le domaine médical a bénéficié également très tôt de ces avancées scientifiques. La

Radiologie va naître sous l’impulsion de Barthélémy et Oudin qui obtiennent la première radiographie

en 1896. Les images ne sont encore que des projections où se superposent tous les tissus traversés. La

même année, la radiothérapie apparaît à Lyon sous l’initiative de Despeignes. Elle rend compte de la

possibilité de traiter un cancer sans intervention chirurgicale. La dosimétrie biologique fait son

apparition (1902) avec l’utilisation de l’érythème cutané comme référence. L’Institut du Radium, qui

s’appellera plus tard Institut Curie, est fondé en 1914. Regaud et ses collaborateurs montrent en 1919,

à la fondation Curie, l’influence du fractionnement de dose qui permet de favoriser les tissus sains au

détriment des tissus cancéreux, plus radiosensibles.

La radiobiologie naît dans ces années et se présente rapidement comme une science puissante.

Elle va permettre l’étude du cycle cellulaire et de ses mécanismes de régulation. Elle prend tout son

essor avec la découverte de la molécule d’ADN. La biologie moléculaire a également vu son domaine

d’études étendu par l’utilisation d’isotopes radioactifs pour le marquage de molécules.

Les premiers érythèmes et leucémies radio-induits, mis en évidence chez les utilisateurs de

rayons X, vont conduire en 1921 les radiologues anglais, à mettre en place le « Comité pour la

protection contre les rayons X et le radium ». Définir des règles de radioprotection est alors une

priorité. La CIPR (Commission Internationale de Protection Radiologique) est créée en 1928 à

Stockholm à l’occasion du deuxième Congrès international de Radiologie. Sa mission est d’édicter les

premières réglementations en matière de protection contre les effets immédiats des rayonnements

ionisants. Regroupant des experts de toutes nationalités, ses travaux, complétés par ceux de

l’UNSCEAR (United Nations Scientific Committee on Effects of Atomic Radiation) servent

aujourd’hui encore à l’établissement des réglementations en vigueur dans tous les pays. Elles sont

reprises sous un aspect pratique par les directives d’Euratom qui obligent les états signataires à les

appliquer.

11 Chapitre I : Etude bibliographique

La dosimétrie utilisée jusque là en radiothérapie, était basée sur la dose seuil d’apparition de

l’érythème (DSE). La DSE correspondait à la dose unique de rayons X nécessaire pour provoquer un

érythème. Elle sera remplacée par une approche plus physique de cette discipline. Ainsi, la

Commission Internationale des Unités et grandeurs Radiologiques (ICRU) créée en 1925 donne une

première définition du roentgen qui sera complétée en 1927. Mais, il faut attendre 1950 pour que le

concept de dose absorbée fasse son apparition.

Les conséquences dramatiques des bombardements d’Hiroshima et Nagasaki en 1945 et la

prise de conscience par l’opinion publique des potentialités de l’énergie nucléaire ont accéléré la mise

en place de règles de radioprotection. Ces règles doivent assurer la protection du public et des

travailleurs. Elles s’appliquent également au domaine médical dans le respect du rapport

bénéfice/risque. Toutes ces normes évoluent au fil des progrès de la connaissance scientifique des

effets biologiques des rayonnements.

L’étude de ces effets sur l’homme peut être abordée d’un point de vue clinique,

épidémiologique ou encore fondamental. C’est dans cette dernière démarche que s’inscrivent les

travaux rapportés dans ce mémoire. Nous allons, en effet, nous intéresser dans cette étude, au dosage

des lésions induites par le rayonnements gamma du cobalt 60 sur la molécule d’ADN. Pour cela, notre

exposé s’articulera autour de deux approches. La première consiste à effectuer des mesures directes

des dommages de l’ADN à l’aide de méthodes physico-chimiques. La deuxième repose sur

l’utilisation de méthodes dédiées à la mesure des coupures de brin de l’ADN. Afin de mieux

comprendre l’effet du rayonnement gamma, nous aurons également recours à d’autres systèmes

induisant des lésions de l’ADN tels que le rayonnement ultra-violet de type A, le rayonnement UV

LASER, un flux de particules de 12C6+ ou encore à des réactions de photosensibilisations. Le choix de

ces agents oxydatifs sera développé dans les chapitres IV, V et VI de ce travail.

B. Rayonnements ionisantsAvant d’aborder les effets des radiations ionisantes sur l’ADN, nous allons définir ce qu’est

un rayonnement ionisant et en donner les principales caractéristiques. Il est nécessaire de connaître la

façon dont le rayonnement interagit avec la matière pour pouvoir aborder les notions de base de la

dosimétrie. Il est aussi important de pouvoir relier un effet observé à la dose. Un des enjeux de la

Radiobiologie est de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à la formation des lésions de

l’ADN et d’autres constituants cellulaires. De manière complémentaire, il est intéressant de savoir

dans quelles proportions ces lésions sont formées et aussi de connaître les mécanismes de réponse des

cellules, tissus ou organismes, face à ces dommages. Si les effets des fortes doses sont de mieux en

mieux cernés, beaucoup de questions concernant les effets des faibles doses restent en suspend. La

connaissance de ces effets est primordiale afin de déterminer les risques éventuels associés aux

nombreuses applications industrielles et médicales des rayonnements ionisants.


1. Définition d’un rayonnement ionisant On entend par rayonnement ionisant tout rayonnement susceptible d’arracher un électron à la

matière. L’atome le plus facilement ionisable étant le potassium, avec une énergie d’ionisation de 4,3

eV, tout rayonnement d’une longueur d’onde inférieure à 288 nm peut être considéré comme ionisant.

Cette longueur d’onde correspond à la limite inférieure du spectre solaire au niveau de la mer.

Toutefois, lors de l’interaction du rayonnement avec la matière, toute l’énergie n’est pas déposée sur

une cible unique. Des phénomènes d’excitation de la matière ont lieu et conduisent à une perte

d’énergie de l’onde incidente. On considère qu’il faut environ 35 eV pour ioniser la matière ce qui

correspond à un rayonnement dont la longueur d’onde est inférieure à 35,4 nm.

Cette énergie est à comparer avec les énergies de liaison C-C (3,6 eV) et celle de la liaison O-H (5,16

eV) (Tableau I). Elle est suffisante pour entraîner la dissociation des molécules. Bien qu’elle paraisse

faible (quelques électronvolts), au niveau d’une mole, elle représente des énergies considérables. Une

énergie de 1 eV par atome représente 96,5 kJ.mol-1 (23 kilocalories par mole).

Tableau I : Quelques énergies physiologiques d’après L. Stryer, la Biochimie, Flamarion Médecine

Sciences (Paris)

Energie thermique < 1 kcal/mole < 4,8 kJ.mol-1

Liaison faible 3 kcal/mole 12,5 kJ.mol-1

ATP 12 kcal/mole 50 kJ.mol-1

Lumière verte 52 kcal/mole 217 kJ.mol-1

Liaison C-C 83 kcal/mole 347 kJ.mol-1

2. Quelques notions de base de physique nucléaireLes rayonnements ionisants trouvent leur origine dans un phénomène physique : la radioactivité.

a) La radioactivité

(1) Historique

La radioactivité, propriété essentiellement nucléaire a été découverte par Becquerel, bien

avant que la structure intime de l’atome soit connue. Ayant posé à l’obscurité un composé d’uranium

sur une plaque photographique enveloppée de papier noir, il observa après développement une image.

Il en conclut que l’uranium émettait un rayonnement capable de traverser le papier en l’absence de

fluorescence. La radioactivité était découverte.


(2) Qu’est ce que la radioactivité ?

(a) L’atome

Quel que soit son état, liquide, gazeux ou solide, la matière est un assemblage d’atomes.

L’atome est constitué d’un noyau très dense de très petite dimension (10-13 m) contenant des nucléons.

Ces nucléons peuvent être électriquement neutres, ce sont des neutrons (N) ou électriquement positifs

(Z), ce sont des protons. Autour du noyau gravitent Z électrons de charge opposée à celle du proton de

façon à assurer la neutralité de l’atome. A est le nombre de masse tel que A = Z + N. On caractérisera

un nucléide X par A et Z : On le note X (A, Z).

(b) Lois fondamentales

La physique nucléaire et les désintégrations radioactives obéissent à des principes ou lois

fondamentales que nous allons énumérer brièvement.

1) Equivalence de la masse et de l’énergie :

A toute masse mo correspond une énergie E (c, vitesse de la lumière)

E = mo.c2

L’unité d’énergie est l’électronvolt (eV).

1 eV = 1,602 10-19 J

On peut exprimer les masses des atomes en unité de masse atomique (uma) :

1 uma = masse d’un atome de 12C/12 = 1,660 10-27 kg

Par équivalence masse-énergie, on en déduit que :

1 uma = 931,502 MeV/c2

2) Conservation de la charge

3) Conservation du nombre de nucléons

4) Conservation de l’énergie

Chaque particule possède une énergie somme de son énergie de masse au repos et de son

énergie cinétique :

E = moc2 + Ecin. = mc2 ➊

où m est la masse relativiste,

mo

(1-β2)↔m =

avec β = v/c.


5) Conservation de l’impulsion

Une particule en mouvement a une impulsion :

p = mv ➋

Des équations ➊ et ➋ on déduit une relation très importante reliant l’énergie à l’impulsion :

E2 = (pc)2 + (moc2)2 ➌

6) Dualité onde-corpuscule

A toute onde électromagnétique peut être associé un corpuscule appelé photon d’énergie

quantifiée E (Einstein, 1905) :

E = hν ➍

où h = 6,62 10-34 J.s, est la constante de Planck et ν, la fréquence du rayonnement.

Des équations ➌ et ➍ , on déduit :

E = pc ↔ p= E/c =hν/c= h/λ

où λ est la longueur d’onde associée à une particule en mouvement (de Broglie, 1924).

(c) Stabilité des noyaux

Des lois précédentes, il découle qu’un noyau (A, Z) au repos a une énergie :

M(A,Z)c2 = ZMpc2 + NMnc2 - B

avec :

Mpc2 : énergie de masse du proton,

Mnc2 : énergie de masse du neutron,

B : énergie de liaison totale des A nucléons.

Il a été montré que dans le cas de noyaux naturels, l’énergie moyenne de liaison des nucléons,

égale à B/A variait peu en fonction de A. Cette énergie est très élevée et proche de 8 MeV. Elle

s’explique par l’existence d’une force attractive intense et de courte portée entre les nucléons appelée

interaction nucléaire forte. Elle assure la cohésion des nucléons entre eux, et est proportionnelle à A.

Par opposition, le noyau est aussi l’objet d’interactions coulombiennes fortes qui entraînent une

répulsion des protons entre eux et qui est proportionnelle à Z. Un noyau est stable tant que l’équilibre

entre ces deux forces est respecté, i.e. tant que le rapport entre le nombre de protons et de neutrons

suit une ligne dite ligne de stabilité bêta. Il est instable ou radioactif dans le cas contraire. Pour

retrouver sa stabilité, il doit alors céder une partie de son énergie interne en émettant un rayonnement

particulaire ou photonique.

(3) Définition de l’activité et de la période radioactive

Un noyau instable modifie sa structure pour retrouver sa stabilité. Toutefois il n’est pas

possible pour un noyau donné de connaître l’instant où cette transformation va se produire. On ne

peut définir que la probabilité de désintégration, λ. Elle s’exprime en s-1 et est appelée constante

radioactive.


Si on considère une population de N noyaux instables, le nombre de ceux qui disparaissent pendant

l’unité de temps est égal à λN. On parle d’activité, A, de cette substance. L’activité correspond donc

au nombre de désintégrations subies par unité de temps. Cette valeur varie au cours du temps et suit

une loi exponentielle.

A(t) = λ.N = A0. e-λt

où A0 représente l’activité initiale à un instant t donné.

L’unité de radioactivité est le Becquerel (Bq) et correspond à une désintégration par seconde. La

période radioactive est la durée nécessaire pour que la moitié des noyaux présents initialement se soit

désintégrée.

T = ln2/λ

(4) Isotopes stables et isotopes radioactifs

Parmi toutes les possibilités de grouper des protons et des neutrons, seules certaines

configurations sont stables. On en connaît aujourd’hui 274 sur les 2000 noyaux artificiels et naturels.

51 noyaux naturels sont instables.

b) Différents modes de radioactivité

La ligne de stabilité bêta définit une zone étroite dans un diagramme N-Z où Z est porté en

abscisse et N en ordonnée (Figure 1). Seuls les noyaux les plus légers ont tendance à avoir un nombre

égal de protons et de neutrons.

N = ZZone 1

Zone 2

Zone 3

Z

N

80400

Z = 83

β+ ou capt. électronique

β-

α

β-

40 N + Z = A =cte

120

140

ou fis

sion

Figure 1 : Les désintégrations radioactives : évolution vers la stabilité

Lorsque Z augmente, la répulsion coulombienne augmente aussi. Cette force peut être

neutralisée par l’ajout de neutrons au noyau, ce qui a pour conséquence d’augmenter la cohésion du


noyau. Tous les atomes instables cherchent à se rapprocher de cette ligne. Le processus physique qui

leur permettra de s’en rapprocher est appelé radioactivité ou désintégration radioactive. On distingue

ainsi trois zones qui vont conduire à trois types de désintégration. Les zones 1 et 2 regroupent de

façon prépondérante la plupart des noyaux instables. La zone 1 regroupe les noyaux possédant trop de

neutrons (désintégrations β-) et la zone 2 ceux possédant trop de protons (désintégrations β+). La zone

3 concerne les noyaux les plus lourds qui peuvent se désintégrer par émission α ou par fission.

C. Le cobalt 60Nous allons à travers l’exemple du cobalt 60 aborder quelques notions de dosimétrie. Le 60Co

a été utilisé dans tout ce travail comme la source de rayonnement gamma.

1. Schéma de désintégration du 60CoLe cobalt 60 est un élément de transition appartenant au groupe VIII de la classification

périodique des éléments, de numéro atomique 27 et de nombre de masse 60. Il est instable et se

désintègre selon le schéma suivant (Figure 2):

2626,1 KeV

2505,7 KeV

2158,8 KeV

1332,5 KeV

60Co

60Ni stable

0 KeV

β1

β2

β3

β4

5,271 ans

γ2

γ1 γ4

γ3 γ6

γ5

γ7

2823,6 KeV

100 %

100 %

100 %

Figure 2 : Schéma de désintégration du cobalt 60

2. Désintégration ββββ-

Le 60Co est un émetteur β−. Au cours de la désintégrations β-, un neutron se transforme en un

proton avec émission d’un électron. Ainsi, le nucléide (A, Z) est converti en nucléide (A, Z+1).

n →→→→ p + e -+ νννν

L’énergie libérée par la réaction est constante mais elle se répartie de façon aléatoire entre l’électron

émis et l’anti-neutrino. Lorsque l’on représente la distribution énergétique des électrons émis, on

obtient un spectre continu entre une énergie nulle (l’anti-neutrino emporte toute l’énergie) et une

énergie maximale, Emax de 318 keV (l’électron emporte toute l’énergie). L’énergie moyenne emportée


par l’électron est Emax/3. Dans le cas du 60Co, cette désintégration aboutit majoritairement à deux états

excités du noyau fils.

3. Emission gammaA la suite de la désintégration radioactive β-, le noyau se retrouve dans un état excité. Pour

retrouver son niveau fondamental, il cède ce trop plein d’énergie par l’émission d’une onde

électromagnétique appelée photon γ, caractéristique de la transition. Cette désexcitation du noyau peut

s’effectuer en une seule ou plusieurs étapes. L’émission β- du 60Co est ainsi suivie de l’émission de

deux photons γ sous forme de cascade d’énergies respectivement égales à 1173,2 keV et 1332,5 keV.

D. Coefficients d’interactionLes rayonnements peuvent être classés en rayonnements directement ionisants qui délivrent

leur énergie à la matière, et en rayonnements indirectement ionisants (x, γ) qui sont susceptibles de

transférer une importante fraction ou la totalité de leur énergie en une seule interaction à des

particules chargées. Lorsqu’un rayonnement pénètre dans un milieu matériel, il a une certaine

probabilité d’interagir avec les atomes du milieu traversé et de leur transférer de l’énergie. Les

échanges énergétiques sont explicités à l’aide de coefficients.

1. Pouvoir massique total de ralentissementLe pouvoir massique total de ralentissement d’un matériau, relatif à des particules chargées,

d’un certain type et d’une énergie donnée est égal à :

=Sρ

dEρ dl

dE est l’énergie perdue au cours de la traversée d’une distance dl dans un matériau de masse

volumique ρ. Ce coefficient correspond à une force de freinage et s'exprime en J.m2.kg-1 , en pratique

en MeV.cm2g-1. Dans le cas de l’interaction d’électrons d’énergie moyenne de 100 keV avec les

tissus, la valeur de ce coefficient est de 20,8 MeV.cm2g-1 (Tableau II).

Tableau II: Pouvoir de ralentissement des électrons (en MeV.cm2g-1)

Energie (keV) Cuivre Air Tissus

10 13,26 19,69 22,90

1000 1,26 1,66 1,82

2000 1,27 1,68 1,81


2. Coefficient massique de transfert d’énergie µtr/ρρρρCe coefficient, relatif à des rayonnements indirectement ionisants est égal, pour un matériau

donné, à:

=1

ρENµtrρ

dEtrdl

....

Il s’exprime en cm2.g-1. E est l’énergie de chaque particule, N est le nombre de particules. dEtr/EN est

la fraction de l’énergie transférée aux électrons secondaires au cours d’interactions se produisant à la

traversée d’une distance dl dans le matériau de masse volumique ρ. Le coefficient massique

d’absorption d’énergie prend en compte la fraction g, d’énergie transmise aux électrons secondaires

mais perdue sous forme de rayonnement de freinage. Dans le cas de l’interaction des photons du

cobalt 60 avec les tissus, g est égal à zéro et µtr/ρ = 0,0300 cm2.g-1 (Tableau III).

=µenρ

µtrρ

(1-g)

Tableau III: Coefficient massique d’absorption en énergie (en cm2.g-1)

Energie (keV) Cuivre Air Tissus

10 160 4,5401 4,8242

1000 0,0257 0,0279 0,0307

2000 0,0216 0,0260 0,0258

E. Nature des interactionsAfin d’aborder les notions de dosimétrie, il est nécessaire de préciser comment les

rayonnements électronique et photonique interagissent avec la matière.

1. Interaction des particules chargéesLa force d’interaction dominante est l’interaction coulombienne entre la particule incidente et

les électrons du milieu. Le ralentissement de l’électron dans la matière est caractérisé par S, pouvoir

de ralentissement exprimé à l’aide de la formule de Bethe :

dEdx

S = - = 4 π εοmοv2e 4.z2.Z. N . ln (2 mov 2

I

(- ln 1- v2 v2

c 2 (( (

c 2

(

-

mo, e : masse au repos et charge de l’électron, respectivement,

v, z : vitesse et charge de la particule, respectivement,

N, Z : densité et numéro atomique des atomes du milieu, respectivement,


I : constante caractéristique de l’espèce atomique considérée, définie comme une énergie moyenne

d’excitation et d’ionisation des atomes du milieu.

a) Electrons de faible énergie : collision

Les électrons interagissent essentiellement avec les électrons de la matière par répulsion

coulombienne. Chaque interaction donne lieu à un défléchissement de leur trajectoire et leur parcours

dans la matière suit une ligne brisée dont chacune des angulations représente une ionisation ou une

excitation. On peut appliquer la formule de Bethe relative au pouvoir de ralentissement des électrons

tant que l’énergie de ces derniers est faible (< 50 keV).

Les électrons peuvent également interagir avec les noyaux par diffusion élastique. L’électron diffuse

mais sans perte d’énergie appréciable. La probabilité de ce phénomène varie comme le carré du

numéro atomique Z du matériau et comme l’inverse de l’énergie de l’électron.

b) Electrons de grande énergie : freinage

Pour des énergies supérieures à 50 keV, les électrons peuvent être considérés comme

relativistes. Le rayonnement de freinage (Bremsstrahlung) est le type d’interaction prédominante. Il

affecte les électrons de grande énergie cinétique qui, au voisinage des noyaux, subissent une brusque

accélération (répulsion coulombienne) en s’accompagnant d’un changement de direction et de

l’émission d’une onde électromagnétique. L’énergie emportée par cette dernière entraîne un

ralentissement de l’électron.

c) Pouvoir de ralentissement total

Il prend en compte les deux types d’interaction, collision (col.) et freinage (frein.) :

= dE dl

dEdl ][ ] [+

col. frein.

Sρ[ ] 1

ρ ( ) = E.Z700

E est l’énergie de l’électron incident (MeV). Z et ρ sont respectivement, le numéro atomique et la

masse volumique du milieu traversé. 700 est un facteur déterminé expérimentalement. On définit pour

chaque matériau une énergie critique qui sépare les deux domaines de prédominance, ionisation-

excitation et freinage (Figure 3).


0,5 5 500500

0,050,005

collision

10

15

5

plomb

dE

dx

(

(

-1 ρ(M

eV/g

/cm

2 )

Energie (MeV)

Tota

l

rayo

nnem

ent

Figure 3 : Pouvoir de ralentissement massique des électrons dans le plomb

2. Interaction du rayonnement γγγγ avec la matièreLes rayonnements électromagnétiques peuvent en une seule interaction céder toute leur

énergie au milieu ou bien parcourir une longue distance sans interagir. L’interaction avec la matière

peut s’effectuer selon trois processus principaux : l’effet photoélectrique, la diffusion Compton et

l’effet de création de paires. Le coefficient linéique d’interaction, µl, caractérise la probabilité

d’interaction, pi, d’un rayonnement par unité de longueur d’un matériau traversé. µl =dN/(dl N) =

pi/dl. On utilise très souvent µm/ρ, coefficient massique d’atténuation, où ρ est la masse volumique de

l’écran.

a) Nature des interactions

(1) Diffusion Compton

Dans le cas de la diffusion Compton, une partie de l’énergie du photon incident est cédée à un

électron du cortège électronique. Le photon d’énergie hν change de direction et repart avec une

énergie hν’ inférieure à hν. L’électron cible est extrait du cortège avec une énergie cinétique et dans

une direction déterminée. L’énergie du photon incident, E, se distribue sur le photon diffusé, on la

note Es, et sur l’électron Compton, on la note Ea. On peut définir une énergie moyenne diffusée au

cours de chaque interaction. Lorsqu’un faisceau primaire, constitué de N photons d’énergie E traverse

un écran matériel d’épaisseur ∆X, il subit une atténuation en nombre (loi d’atténuation d’un faisceau

de photons) et une atténuation en énergie (perte d’énergie égale à ∆N.E). La perte en nombre peut

s’exprimer à l’aide de la section efficace σ =∆N/(N.X) où ∆N est le nombre de photons ayant interagi.

L’énergie perdue par le faisceau est égale au produit de l’énergie moyenne perdue au cours de chaque

interaction par le nombre de photons ayant interagi :

∆N.E = ∆N.Es + ∆N.Ea

En divisant par le produit N. E, on obtient :


N E∆N.Es + ∆N.EaN.E N.E

∆N.E = σdX = σsdx +σadx=

On définit deux coefficients σs et σa caractéristiques, respectivement, de la diffusion et de l’absorption

Compton.

Eσs =

σ.EsE

σa =σ.Eaet

(2) Effet Photoélectrique

Il s’agit de l’absorption complète du photon par le milieu traversé. Le photon incident cède

toute son énergie à un électron qui se trouve éjecté de son orbitale atomique. Le réarrangement

électronique s’accompagne de l’émission d’électrons Auger et de photons X. En appliquant le même

raisonnement et formalisme que précédemment, l’atténuation représentant la diminution en nombre de

photons primaires, d’énergie E est caractérisée par τ =∆N/(N.X). L’énergie des électrons secondaires

est absorbée localement et le coefficient d’absorption photoélectrique s’écrit :

1 - W + f. W EE

τa = ( (

τ

E: énergie du photon incident,

w : énergie moyenne emportée par les photons X,

f : probabilité d’émission d’électrons Auger.

Le coefficient de diffusion photoélectrique τs peut s’exprimer ainsi:

W - f. W EE

τs = ( (

τ

(3) Effet de création de paires ou de matérialisation

Lorsqu’un photon pénètre dans le champ coulombien d’un noyau, il peut disparaître en se

convertissant en un électron et en un positon. Le photon incident doit au moins posséder une énergie

supérieure à 1,022 MeV. Le coefficient de l’effet de matérialisation s’écrit : π =∆N/(N.X).

Le coefficient d’absorption de matérialisation qui représente la part d’énergie absorbée localement

s’écrit :

E - 1,02E

πa = ( (

π

Le coefficient de diffusion de matérialisation est défini de la manière suivante :

Eπs =π.1,02


b) Importance relative des différents effets

Le coefficient massique d’atténuation global µ/ρ est la somme des coefficients massiques

d’atténuation propres à chaque type d’interaction. De la même manière, il sera possible de définir le

coefficient d’absorption massique global d’absorption µtr/ρ comme étant la somme de σa, τa et πa.

1 - W + f W EE

( (

τE

σ.Ea+ +E - 1,02E

µtr/ρ = ( (

πρ ρ ρ

En considérant les 3 principaux types d’interaction des photons avec la matière, on peut diviser le

domaine d’énergie en trois catégories (Figure 4) : celui où l’effet photoélectrique prédomine (E<E1),

celui relatif à l’effet Compton pour E1<E>E2 et celui de l’effet de matérialisation. Les valeurs de E

dépendent du milieu traversé. Pour l’aluminium, E1 = 60 keV et E2 vaut 18 MeV. Dans le plomb, les

valeurs des énergies sont respectivement de 500 keV et de 5 MeV.

Effet photoélectriquedominant

Production de paires

dominante

Effet Comptondominant

0,01 0,05 0,1 5 10 50 1001

Num

éro

atom

ique

de

l’abs

orbe

ur

Energie du photon incident (MeV)

Figure 4 : Importance relative des trois modes d’interaction des photons avec la matière

F. Notions de radiométrieL’action du rayonnement sur la matière se traduit en terme d’effets par l’apparition d’ions, de

radicaux ou de molécules excitées. L’importance des espèces ainsi produites dépend de la quantité

d’énergie cédée par le rayonnement au milieu. Cette valeur est estimée à l’aide de grandeurs

physiques, telles que le Kerma et la Dose absorbée. Nous allons présenter ces grandeurs dans les

paragraphes suivants.

1. Les unités de radiométrie

a) Champ de rayonnement

Pour connaître l’action d’un rayonnement dans un milieu donné, on définit un espace, le

champ de rayonnement. Ce dernier est caractérisé par une fonction mathématique Φu qui représente le

nombre de particules N se propageant en un point P de l’espace de coordonnée r, dans une direction u,


dans un angle solide dΩ, autour de u, avec une énergie E à l’instant t. Cette fonction s’appelle

distribution angulaire de fluence (Figure 5).

θ

z'

y'x'z

y

x

φ

P

r

dΩ

u

Φ : Nombre de particules traversantune sphère élémentaire de diamètre da (L-2)

Fluence de particules

Φ =dNda

N : Nombre de particules émises transféréesou reçues pendant un intervalle de temps dt (T--1)

Flux de particules

N = dNdt

Figure 5 : Définition du champ de rayonnement

A partir du champ de rayonnement on définit l’énergie rayonnante, ainsi que les flux et

fluences énergétiques de particules.

Re: Energie totale des particules émise, transférée, reçue (J)

Energie rayonnante

Re =∫ E.dEdNdE

.

R: Energie totale des particules émise, transférée, reçue (W) ,pendant un intervalle de temps dt

Flux énergétique

.d2NdE

R =E.dEdt∫

Fluence énergétiqueR: Energie totale des particules émisetransférée, recue dans une sphère élémentairede diamètre da (J.m-2 )

d2NdE

R= E.dEda∫

ΦE: Nombre de particules traversant une sphèreélémentaire de section diamétrale da, d'énergie comprise entre E et E+ dE

Fluence différentielle en énergie

ΦE =d2NdE da

b) Dose absorbée et Kerma

L’énergie communiquée par un rayonnement ionisant à un volume de matière cible est :

ε = Re- Rs + ΣQ

ε est une quantité stochastique avec :

Re : énergie rayonnante entrant dans le volume,


Rs : énergie rayonnante sortant du volume,

ΣQ : somme des énergies rayonnantes produites après déduction de la somme des énergies

rayonnantes utilisées dans des transferts internes au volume de matière.

L’énergie spécifique communiquée Z (en Gray) est une quantité stochastique :

εZ =m

La dose absorbée D dans un volume de matière de masse dm est :dεD =dm

= Zlim0m →

ε : énergie moyenne communiquée est une quantité déterministe,

Z : énergie moyenne communiquée est une quantité déterministe.

(1) Particules chargées

=∫ E.dEdNdE

. ∫ (E-∆E).dEdNdE

.-s Rε = e - R ∫ ∆E.dEdNdE

.=

où ∆E est la fraction d’énergie perdue par chaque particule chargée d’énergie E.

∆E = Scoll..l , avec l, longueur moyenne des cordes d'une sphère de rayon R, égale à 4/3 R.

DTRdε=dm

= Z =lim0m →

∫ 1.dNdE

.a

Sρ[ ]

coll..dElim

0m →= ∫ 2d

aSρ[ ]

coll..dE où a est la surface diamétrale i.e. a = πRlim[ Ν.]

dE

da.dEor ΦE = d2N , on en déduit que :

coll.Sρ

[∫ ] .ΦE.dEDMR=

DMR, dose absorbée relative à la matière (par exemple pour un tissu T, on la note DTR) et à un

rayonnement R. Son unité est le Gray (Gy).


(2) Rayonnements électromagnétiques

Il faut déterminer la relation entre la fluence de photons primaires en un point M d’un

matériau et l’énergie transférée en ce même point par ces photons primaires aux électrons secondaires

mis en mouvement. On considère un photon d’énergie E pénétrant dans une sphère élémentaire dont

le diamètre est très inférieur au libre parcours moyen de ce photon dans le milieu. Celui-ci à la suite

d’une interaction communique une énergie moyenne Etr à la matière de la sphère.

Le coefficient de transfert d’énergie est donné par la formule :

= dEtr où dx représente la longueur l de la corde moyenne découpée par le photonE.dx

µtr (E)

L’énergie moyenne transférée est dans ce cas égale à :

Etr(E) = µtr(E).E.l

L’énergie totale transférée par l’ensemble des photons est :

dΕdN(E) .dE où dN(E) est le nombre de photons avec une énergie comprise entre E et E + dEEtr(E)Etr(E) .=

La définition du Kerma est :

dEtrdmK= = lim

Etrm→0 m

En remplaçant Etr(E) par son expression (vide supra) et en considérant que l = 4/3R = V/a

K =∫ da

µtr (E)ρ

.E. dElim[ Ν (E)]dE

or ΦE = dad N(E)= lim

aN(E)

K =∫ µtr (E)ρ

.E. dEE Φ .

Son unité est le Gray (Gy).

2. Energie transférée et énergie absorbée localementLe faisceau primaire transfère une partie de son énergie au cours d’interactions avec la

matière. Cette énergie est communiquée à des électrons secondaires sous forme d’énergie cinétique

qui est progressivement absorbée par le milieu au cours du ralentissement des électrons. L’énergie

transférée aux électrons peut être élevée et le parcours des électrons dans la matière peut être grand si

bien que l’énergie transférée peut être très différente de l’énergie absorbée localement.

Toutefois, lorsque les conditions d’équilibre électronique sont satisfaites on peut considérer

que l’énergie transférée et l’énergie absorbée sont égales. Dans ces conditions, et seulement dans ces

conditions, on peut connaître la dose absorbée localement. Elle est donnée par l’expression suivante :


DTR =∫ µen(E)ρ

.E. dEE Φ .

3. Variation de la dose en fonction de la profondeurDans le cas de l’interaction des électrons émis par le cobalt 60 avec les tissus, le rayonnement

de freinage est nul et le principal mode d’interaction des électrons reste le mode par collision. Par

ailleurs, le parcours maximal de ces électrons est de 66 cm dans l’air et de 0,85 mm dans l’eau. Par

conséquent, dans la plupart des conditions expérimentales, la composante électronique de l’émission

du 60Co sera négligeable.

Profondeur (cm)

Figure 6 : Rendement en profondeur de la dose (dans 2 mm de cuivre)

Dans la Figure 6, on représente la courbe de rendement en profondeur de la dose établie par

simulation Monte Carlo, lors de l’interaction des photons du cobalt 60 avec le cuivre. La dose

augmente donc jusqu’à ce que l’équilibre électronique soit atteint et diminue ensuite du fait de

l’atténuation du faisceau de photons incidents.

G. La qualité du rayonnement et la radiosensibilité des tissusLorsqu’on s’intéresse aux effets biologiques des rayonnements ionisants, la dose absorbée ne

suffit pas toujours à expliquer les dommages produits. Elle ne donne qu’une vision macroscopique du

dépôt d’énergie et ne rend pas compte de l’hétérogénéité de ce dépôt d’énergie.

Pour illustrer cela, prenons par exemple une dose de 1 Gy (1 J.kg-1) délivrée à un tissu (ρ = 1) (1). Il

faut 35 eV pour créer une ionisation : le nombre de paires d’ions créées est de 1,841017. Le litre n’est

pas le volume d’intérêt pour le radiobiologiste. Considérons un cylindre cible correspondant à un

maillon élémentaire de la molécule d’ADN, d’une hauteur de 1,7 nm et de rayon 2 nm. Le volume V

s’exprime par :


V =π d2

4. h = 534, 1 nm3 et 103 cm3 =10 24 nm3

ce qui représente 9,8 10-7 ionisations pour le volume considéré. La grande majorité des mailles est

donc épargnée. Pour l’ADN (2 109 nm de long), ce sont 1152 ionisations qui auront été produites. Cet

exemple illustre bien l’importance de la distribution spatiale des ionisations (notion de volume cible)

Une forte densité d’ionisation s’accompagnera de dommages nombreux et d’une plus grande difficulté

pour la cellule pour réparer ces lésions.

1. Le Transfert d’Energie Linéique (TEL)Pour tenir compte de la distribution spatiale des ionisations, la notion de TEL a été introduite.

Le Transfert d’Energie Linéique (TEL ou L∆) correspond à la quantité d’énergie cédée par une

particule chargée lors de collisions avec des électrons en traversant une distance dl, collisions au

cours desquelles, les pertes d’énergies sont inférieures à ∆.

L∆ =dEdx ∆ et L = Scoll.∞

Le TEL moyenne la valeur du dépôt d’énergie dE sur tout le parcours dx et ne prend pas en compte :

- la perte d’énergie par les électrons secondaires,

- la variation intrinsèque tout au long du parcours,

- la longueur et la non linéarité de la trajectoire.

2. L’Efficacité Biologique Relative (EBR)L’EBR permet, à effets biologiques identiques, de comparer deux rayonnements. Elle découle

de la notion de TEL (2).

EBR = dose absorbée d'un rayonnement de référence

dose absorbée de rayonnement conduisant aux mêmes effets biologiques

Si on s’intéresse aux effets aléatoires, on parlera de facteur de qualité (Q(L)) qui est déduit des

valeurs des EBR pour les effets stochastiques. La relation entre facteur de qualité Q et TEL est

donnée dans le Tableau IV (3).


Tableau IV : Expression du facteur de qualité Q en fonction du TEL (3)

Transfert d’Energie Linéique

L (keV.µm-1) Q (L)< 10 1

10 - 100 0,32 L -2,2

> 100 300 /(L)1/2

Le cobalt 60 avec un TEL de 0,2 keV/µm possède un facteur de qualité de 1. La CIPR 60 a

introduit la notion de facteur de pondération pour le rayonnement, Wr. Ceci évite certaines

imprécisions dues à l’application formelle du facteur Q. Toutefois, Q et Wr donnent dans la plupart

des cas des valeurs très proches (Tableau V).

Tableau V : Valeurs du facteur Wr en fonction de la nature du rayonnement (3)

Nature du rayonnement Facteur Wr

Photons 1

Electrons 1

Neutrons E < 10 keV 5

10 keV < E < 100 keV 10

100 keV < E < 2 MeV 20

2 MeV < E < 20 MeV 10

> 20 MeV 5

Protons E > 2 MeV 5

Particules αααα, fragments de fission 20

Noyaux lourds 20

3. La dose équivalenteLa dose équivalente HTR dans un tissu irradié T par un rayonnement R est le produit de la dose

absorbée DTR par le facteur de pondération Wr. Son unité est le Sievert (Sv).

4. La dose efficaceLa dose efficace E est le produit de la dose équivalente par un facteur de pondération

tissulaire WT (qui prend en compte la radiosensibilité du tissu face aux effets stochastiques) propre à

chaque tissu. Son unité est le Sievert (Sv). On a ΣWT = 1.

E = WT.Wr.DTR


Les organes les plus radiosensibles sont pourvus pour les effets stochastiques d’un coefficient élevé

(Tableau VI).

Tableau VI : Valeur de Wt selon le tissu ou l’organe (3)

Tissu ou organe Facteur Wt

Gonades 0,20

Moelle osseuse 0,12

Colon 0,12

Poumon 0,12

Thyroïde 0,05

Peau 0,01

5. Les grandeurs opérationnellesLes grandeurs opérationnelles de la radioprotection, les seules grandeurs qui soient

effectivement mesurables, sont basées sur le concept d’équivalent de dose. Pour que ces grandeurs

soient acceptables en terme de radioprotection des individus, ces grandeurs doivent toujours être

supérieures aux grandeurs primaires, HTR, E. A partir de mesures de grandeurs physiques (Kerma,

fluence de particules ou dose) effectuées par les instruments de radioprotection, un facteur de

conversion (qui prend en compte la qualité du rayonnement), permet d’obtenir la valeur de la

grandeur opérationnelle qu’il s’agisse d’équivalent de dose personnel (dans le cas de la dosimétrie

individuelle), d’équivalent de dose ambiant ou d’équivalent de dose directionnel (dans le cas de la

dosimétrie de zone).

H. Sources d’expositionSi notre modèle de travail est le rayonnement gamma du cobalt 60, les sources de

rayonnements auxquelles les individus peuvent être soumis sont diverses et sont classées en plusieurs

catégories (Figure 7). Il nous paraît important d’en donner ici quelques exemples. Pour une activité de

radioéléments donnée, les limites d’exposition fixées par la réglementation peuvent être atteintes pour

des durées d’exposition très variables selon la nature du radionucléide rencontré. De plus, la

connaissance de ces sources d’exposition permet de définir ce que l’on entend par faible dose selon

que l’on est industriel, médecin ou scientifique. On considère cependant, en radioprotection, qu’une

faible dose est comprise entre 1 et 30 mSv.


applications médicales

1,2 mSv (31,3%)

autres (indutries, etc.)

0,01 mSv (0,3%)radon

1,3 mSv (37%)

rayonnements telluriques

0,46 mSv (13,2%)

rayonnements cosmiques

0,39 mSv (11%)

radionucléides de l'organisme

0,23 mSv (6,5%)

Figure 7 : Composantes moyennes de l’exposition humaine en France (4)Nous allons présenter ces différents composantes.

1. Sources d’irradiation industriellesLe cycle du combustible nucléaire met en jeu les plus grosses quantités de matières

radioactives. Toutefois, la mise en place par cette industrie de moyens de radioprotection très

importants fait que la plupart des accidents industriels d’irradiation sont liés à l’industrie non

nucléaire utilisant des sources radioactives (appareils de gammagraphie par exemple).

a) Industrie électronucléaire

L’exposition du public, minime (200 µSv) en condition normale, est liée aux rejets d’effluents

radioactifs gazeux ou liquides des centrales ou usines de retraitement (Figure 8). Ces effluents

contiennent de nombreux radionucléides émetteurs de rayonnement alpha, gamma ou bêta. Avec des

expositions comprises entre 4 mSv et 25 mSv, ce sont les mines d’uranium qui constituent la partie du

cycle où l’exposition des travailleurs est la plus élevée. Cette exposition est due au radon, émetteur

alpha et à ses descendants. Les mineurs d’uranium ont d’ailleurs fait l’objet de plusieurs études

épidémiologiques (5, 6).


produits de fission (β, γ) (β, γ) (β, γ) (β, γ) 133Xe, 85Kr, 131I, 137Cs, 90Sr, etc.

58Co et 60Co, 51Cr, 59Fe, 3H, etc.

produits d’activation (β, γ) (β, γ) (β, γ) (β, γ)

242Pu, Pu, Pu, Pu, 242 237238 239 240 241 Pu, Np,

241Am, Cm et 244Cm, etc.

transuraniens (α, γ) (α, γ) (α, γ) (α, γ)

1 à 200 µSv

population la plus exposée

Extractiondéchets

centralenucléaire

Fabricationdu combustible

Retraitement

Enrichissement

222Rn, 220Rn, 218Po (αααα)

214Bi, 214Pb, 234Th, 234mPa (ββββ)

exposition des travailleurs (5 à 30 mS v)

85Kr, 129I, 3H

134Cs, 241 137 Cs, Am

effluents gazeux

effluents liquides

239Pu

235U

effluents gazeux et liquides

Xe, Kr, 133 85 131I, 137 129Cs, 134 Cs I

Figure 8 : Exposition générée par l’industrie nucléaire

b) Applications en sources scellées et non scellées

On trouve de nombreuses autres applications industrielles des rayonnements ionisants (γ, X,

électrons ou neutrons) qui en fonctionnement normal ne présentent pas de danger pour le public. C’est

par exemple, la radiographie industrielle (contrôle des soudures et d’éléments de structure), les

techniques analytiques (cristallographie, analyse de minerais par fluorescence, dosage de pesticide par

capture électronique, etc.), les jauges radiométriques, les applications en agro-alimentaire

(stérilisation des aliments, accroissement de la durée de conservation par ionisation, etc.), la

stérilisation du matériel médical, etc..

2. Sources d’irradiation médicalesL’irradiation médicale avec 1,2 mSv par an est la deuxième source d’exposition du public

dans les pays développés. Les rayonnements ionisants sont utilisés au sein de trois disciplines :

radiodiagnostic (radiographie conventionnelle, mammographie, scanographie, l’angiographie et la

radiologie interventionnelle), radiothérapie et curiethérapie et enfin médecine nucléaire (Figure 9).


Applications médicales (1,2 mSv)

? mSv.an-1 )(0,2

visées diagnostique et curative(sources non scellées)

100 µSvmédecine nucléaire

exposition interne

rayonnements β, γ123I99mTc, 59Fe, 201Tl ,

131I51Cr, 133

Xe,

16,7 mSv.an -1)(0,3

Scintigraphie thyroïdienne 0,24 mSv Scintigraphie myocardique 23 mSv

radiodiagnostic1 mSv

0,3 mSv (radiographie dentaire)6 mSv (tomodensitométrie pelvienne)10,9 mSv (urographie intraveineuse)

exposition externe

rayonnement X

visée diagnostique(sources scellées)

radiographie conventionnelle

mammographiescannographie

angiographie

radiologie interventionnelle

38,4 mSv.an-1)(0,2

1,4 mSv.an-1)(0,2

1

visée curative(sources scellées)

radiothérapie0,01 µSv

exposition externe

curiethérapie99,99 µSv

exposition interne

rayonnement X rayonnements β , X, - γ192Ir, 137Cs, 125I,

5,6 mSv.an -1)(0,2

20 Gy à 70 Gy (2 Gy/scéance)

1 1

gamme de dose efficace reçue par la catégorie professionnelle la plus exposée

1

dose efficace reçue par le patientIV ème Conférence Internationale de l'ACOMEN,Grenoble 5-7 mai 1993

20 Gy à 70 Gy 1

Figure 9 : Sources d’irradiation médicales

L’exposition de la population qui résulte de ces activités dépend, d’une part, du nombre d’actes et de

la dose délivrée au cours d’un acte. La nature des rayonnements utilisés est rapportée dans la Figure 9

ci-dessus.

3. Sources d’irradiation naturellesL’homme a de tout temps été exposé à des rayonnements ionisants, de par son environnement

et de par les atomes qui le constituent (Figure 10) (4, 7, 8). Les radionucléides primordiaux qui

constituent l’écorce terrestre (l’235U, l’238U, le 232Th) mais aussi le potassium 40, présent dans l’eau et

dans l’air sont responsables de l’exposition externe.

A cette composante tellurique, s’ajoute la composante cosmique constituée essentiellement, lors de

son arrivée sur Terre de protons, photons γ, neutrons (Figure 10). La composante la plus importante,

de l’exposition naturelle, est d’origine interne. Elle résulte surtout de l’inhalation du 222Rn et de ses

descendants métalliques (9, 10). Appartenant à la famille de l’238U, le 222Rn est un gaz émetteur alpha,

qui se désintègre avec une période de 3,8 jours. La contribution de ses éléments de filiation, le 218Po,

le 214Bi et le 214Po, est beaucoup plus importante que celle du radon lui-même. A côté du radon inhalé,

on trouve des radionucléides présents tout au long de la chaîne alimentaire et qui sont ingérés. Ils

contribuent pour 0,3 mSv à l’exposition interne de l’homme due à la présence d’environ 4500 Bq de40K, 3700 Bq de 14 C, et 13 Bq de 226Ra.


γγγγrayonnement solaire

(protons)

Homme

238U, 235U, 232Th, 40K (sol)

238U, 235U, 232Th, 40K (eau, air)

β β β β +

π +π +π +π +

γγγγ

nβ β β β - β β β β +

protons(87%)

alphas (12%)

noyaux lourds (C, O, N, Fe, Ca)

π°π°π°π°n p

p

20 Km

Rayonnementcosmique secondaire (10 2 à 105 MeV)

Rayonnement2 13

cosmique primaire (10 à 10 MeV)

60 Km d'altitude

5 Km

gerbes d'Auger

νννν

exposition externe tellurique 0,46 mSvRadon 222

Radon 222

exposition interne 1,3 mSv

aliments et descendants

et descendants

10 éruptions de basseénérgie/an (10 à 100 MeV)

4 à 5 éruptions de hauteénérgie/an (GeV)

Rayonnement capté par le champ géomagnétique terrestre

(ceintures de Van Allen)e-, p

Soleil

exposition externe cosmique 0,39 mSv

Figure 10 : Sources d’exposition naturelles

II. EFFETS DES RAYONNEMENTS IONISANTS

Après avoir évoqué la nature des rayonnements auxquels notre organisme est soumis, et la

façon dont ils interagissent avec la matière, nous allons maintenant présenter les conséquences

biologiques de ces interactions. Il est aujourd’hui admis que l’ADN est la molécule cible des effets

biologiques produits par les rayonnements ionisants. Une dose de 250 Gy délivrée au cytoplasme n’a

pas d’effet sur la prolifération cellulaire alors qu’une dose de 1,5 Gy délivrée au noyau empêche la

division de 50% des cellules. Toutefois, plusieurs travaux ont également souligné l’implication des

structures membranaires, en particulier de la membrane nucléaire, dans les effets biologiques des

rayonnements ionisants.

A. Effets direct et indirect du rayonnement gamma du 60Co Les effets des rayonnements ionisants sur la molécule cible peuvent être produits par

interaction directe du rayonnement avec la molécule ou par l’intermédiaire de l’eau environnant la

molécule (11).

1. Effet directIl résulte d’un dépôt d’énergie sur le substrat qui peut conduire à une ionisation ou à une

excitation de la matière.

2. Effet indirectIl résulte de l’interaction du rayonnement avec la molécule d’eau (Figure 11).


Excitation Ionisation

H2O* H2O°+ + e-sec

-

Durée de vie de l'événement (s)

H3O+ + °OHDissociation

+ H2OSolvatation

H2 H2O2

10-17à 10-16

-1410

10-13

0.3 x 10 -12

-1110 à 10

-7

Recombinaison

e-aq

(2,7)

(0,4) (0,7)

H° + °OH(0,6) (0,6)

(2,7) (2,7)

H2ORayonnements

ionisants

Etape prédiffusionnelle

Etape diffusionnelle

Etape de recombinaison

( ) : rendements radiolytiques des espèces exprimés en nombre de molécules/100 eV

Figure 11 : Radiolyse de l’eau d’après (12)

C’est le type d’interaction prédominante observée avec les rayonnements à faible TEL,

comme les rayonnements gamma ou électronique. On estime, en effet qu’environ 75% des

interactions des rayons γ avec la matière se font par cette voie (13). La radiolyse de l’eau comporte

plusieurs étapes qui conduisent à la formation d’espèces radicalaires et ioniques (°OH et H°, e-aq, H+)

selon les processus décrits ci-dessus. Lors de leur formation, ces espèces ne sont pas distribuées de

façon homogène dans le milieu. Elles s’accumulent dans des zones appelées grappes qui sont situées à

l’extrémité des trajectoires des électrons secondaires. Au cours de l’étape de diffusion, leur

concentration décroît dans ces zones par réaction de recombinaison radicalaire, avec formation de H2,

H2O2, mais aussi par diffusion dans tout le milieu ou encore par réaction avec des solutés éventuels.


3. Trace d’un rayonnement de faible TEL

hν

hν hν'

hν'

Figure 12 : Trace d’un rayonnement à faible TEL dans le noyau cellulaire (14)

La Figure 12 représente la répartition des ionisations produites par un rayonnement de faible

TEL dans un volume cible donné. On distingue les grappes d’ionisations présentes à l’extrémité des

trajectoires des électrons secondaires. Une répartition des ionisations beaucoup plus dense et moins

dispersée est observée avec des rayonnements de TEL plus élevé (14-17).

B. Effets sur les membranesLes membranes étant constituées d’un double feuillet phospholipidique, les radicaux générés

lors de la radiolyse de l’eau, en particulier les radicaux hydroxyle sont susceptibles de réagir avec les

chaînes d’acides gras insaturés au niveau des doubles liaisons. Outre l’altération de la membrane, les

peroxydes formés par cette réaction, ou les produits de dégradation de ces dérivés comme le

malonedialdéhyde (MDA) (18) ou le 4-hydroxynonenal (4-HNE) (19) peuvent modifier à leur tour

l’ADN. Toute altération de la membrane par les radicaux peut en particulier être responsable de la

modification des flux calciques, lesquels sont impliqués dans les mécanismes apoptotiques (20).

C. Effets sur l’ADN

1. Structure de l’ADNLa transmission des caractères héréditaires d’une génération à une autre repose sur la

transmission d’une molécule, présente dans toutes les formes du règne vivant, l’acide

désoxyribonucléique (ADN). Mise en évidence dès la fin du XIXème siècle par Miescher, Altmann et

Kossel, l’ADN à été modélisé en 1953, par Watson et Crick (Figure 13). Cette molécule universelle

contient, sous forme d’un code appelé code génétique, toutes les informations nécessaires à la vie et

les caractéristiques de chaque individu. L’ADN se présente sous la forme d’un polymère constitué par

l’enchaînement de nucléotides. Le nucléotide est lui-même une entité constituée d’un phosphate relié

à un sucre, le 2-désoxyribose lui même relié par une liaison N-glycosidique à une base. Des liaisons

phosphodiester en 3’ et 5’ des 2-désoxyriboses relient ensuite les nucléotides entre eux. L’ADN

comprend 4 bases principales, dont l’enchaînement définit le code génétique. L’adénine (A) et la


guanine (G) qui constituent les bases puriques et la thymine (T) et la cytosine (C) qui constituent les

bases pyrimidiques. La polymérisation des nucléotides permet la constitution d’un brin orienté 5’-3’

caractérisé par la succession des nucléotides (A , T , G , ou C).

Extrémité 5'OH

2)

sucre

phosphate

base

N

NH

OHO P

O

OO

O

OH3C

N

N

OHO P

O

OO

O

NH2

N

NO

O

OPOOH

N

N

NH2

O

OO

O

NH

NN

N

NH2

Adénine

Guanine

Thymine

Cytosine

Bases pyrimidiques

Bases puriques

Extrémité 3'OH1) 2)

Figure 13 : Structure de l’ADN

Le brin ainsi formé adopte une structure hélicoïdale qui s’associe de façon complémentaire à

un deuxième brin d’ADN antiparallèle.

Chaîne sucre-phosphate

Liaisons hydrogènes

Base

pas d’hélice(3,4 nm)

3)

Figure 13 : Structure de l’ADN (suite)

Cette association se fait par l’intermédiaire de liaisons hydrogène entre bases

complémentaires. Les bases complémentaires sont respectivement la guanine et la cytosine (reliées

par trois liaisons hydrogène), l’adénine et la thymine (reliées par deux liaisons hydrogène). Six

milliards de paires de bases constituent le génome humain et sont réparties dans 23 paires de

chromosomes. L’ADN est ensuite associé chez les eucaryotes à des protéines, les histones pour


constituer une fibre de chromatine de 30 nm de diamètre. Cette dernière structure est présente quelle

que soit la phase du cycle cellulaire. Toutefois, lorsque la cellule se divise, elle est condensée dans

une nouvelle structure, le chromosome. L’ADN nucléaire humain déroulé représenterait une double

hélice de 1,8 m. Cette double hélice doit être condensée d’environ 1000 fois pour tenir dans un noyau

interphasique de 6 µm de diamètre et de 6000 à 10000 fois dans le chromosome métaphasique.

L’ADN apparaît comme une structure dynamique et non statique dont la conformation et l’hydratation

peuvent influer sur la radiosensibilité cellulaire (21).

2. Fonctions de l’ADN

a) Activité homolytique : la réplication

Plusieurs complexes enzymatiques (hélicases, ADN polymérases, ligases) interviennent au

cours de chaque division cellulaire pour synthétiser une copie fidèle de la molécule d’ADN détenue

par la cellule mère. Cette copie dite semi-conservative s’effectue par ouverture de la double hélice et

synthèse d’un nouveau brin par complémentarité avec le brin parental. Des systèmes de réparation

présents dans les cellules assureront la rigoureuse duplication de l’information génétique.

b) Activité hétérolytique : la transcription

La deuxième fonction de l’ADN est de coder pour des protéines. Une partie de l’ADN

seulement, dite partie codante, va être transcrite en ARN. A l’instar de l’ADN, l’ARN ou acide

ribonucléique est aussi constitué d’un enchaînement de nucléotides, mais le 2-désoxyribose est ici

remplacé par un ribose et la thymine par l’uracile. De plus, il se présente sous la forme d’une chaîne

monobrin. Après transcription, l’ARN pourra, chez les eucaryotes être maturé avant d’être traduit en

protéine au niveau de structures appelées ribosomes. Le code génétique assure la correspondance

entre une information détenue au niveau de l’ADN sous forme d’une séquence de nucléotides et un

acide aminé essentiel qui participera à l’élaboration d’une protéine. L’enchaînement de trois bases (A,

T, G, C) suffit à coder les 20 acides aminés qui sont les motifs de base des protéines.

3. Lésions radio-induites de l’ADN

a) L’effet indirect

Les espèces radicalaires °OH, H° et les électrons solvatés produits au cours de la radiolyse de

l’eau peuvent réagir avec les bases ou avec le 2-désoxyribose de la molécule d’ADN.


coupure de chaîne(simple brin)

pontageADN-protéine

coupure de chaîne(double brin)formation

de site abasique

modification de la base(oxydation, alkylation,

réarrangements)

TT A

A

AX

C

Figure 14 : Lésions radio-induites de l’ADN

Le produit de ces réactions conduit à la formation de coupures simple ou double brin, de

bases modifiées, de sites abasiques et de pontages entre ADN et protéines (Figure 14) (22-25) .

(1) Les coupures de brins

(a) Les coupures simple brin (CSB)

Leur nombre est estimé à environ 1000 par cellule de mammifère et par Gy pour un

rayonnement de faible TEL (14, 26). Elles sont dues à la rupture des liaisons phosphate-sucre (25,

27) consécutivement à un arrachement d’un atome d’hydrogène du sucre par le radical °OH.

L’arrachement d’un atome d’hydrogène du 2-désoxyribose par le radical 5-hydroxy-5,6-

dihydropyrimid-6-yle peut aussi conduire à la formation d’une coupure de chaîne de l’ADN (28, 29).

Toutefois, ce processus est peu efficace. Le taux de formation des cassures simple brin est linéaire

avec la dose et est plus faible lorsque le TEL du rayonnement augmente. Il s’agit de lésions

relativement vite réparées (en moins d’une heure) et qui ont peu d’impact en matière de létalité

cellulaire.

(b) Les coupures double brin (CDB)

Il s’agit sans doute d’une catégorie de lésions parmi les plus délétères. Elles correspondent àune rupture des deux chaînes en des sites proches l’un de l’autre. Leur nombre est estimé entre 40 et

100 dans une cellule de mammifère par Gy de rayonnement de faible TEL (14). Deux mécanismes

sont avancés pour expliquer leur formation. Le premier suppose l’action d’un seul radical °OH sur le

2-désoxyribose (30) avec transfert du radical sur le deuxième brin. Le deuxième implique l’attaque de

l’ADN par plusieurs radicaux hydroxyle dans des zones rapprochées (31). La réparation des CDB, qui


peut être relativement longue, intervient comme un critère important dans la radiosensibilité cellulaire

(32-35). L’efficacité de leur formation augmente avec l’augmentation du TEL.

(2) Les bases modifiées

De nombreuses bases modifiées par l’irradiation gamma ont été identifiées (24, 25, 36, 37).La nature des produits obtenus dépend des propriétés redox des espèces mises en jeu et de leurenvironnement (présence d’oxygène ou non). Le nombre de bases modifiées radio-induites est estiméà environ 2000 par cellule eucaryote par Gy de rayonnement de faible TEL.

(a) Les bases pyrimidiques modifiées (pour revue (38))

Les modifications résultent essentiellement de l’attaque des radicaux hydroxyle sur le cyclearomatique des pyrimidines (Figures 15 et 16). Les radicaux °OH étant très électrophiles, cetteattaque s’effectue préférentiellement en position 5 du cycle de la thymine et de la cytosine. L’additiondu radical °OH sur la liaison 5,6 pyrimidique conduit à la formation de radicaux 5-hydroxy-6-yle ou6-hydroxy-5-yle.

HN

NO

OCH3

OH

HH

°

O2

HN

NO

OCH3OH

OO°H

H

O2

OH

OHH

CH3

O

O N

HN

HNH

HN

O

O

OHCH3

HNH2

O

H

HN

NO

OCH3OH

OOHH

H

HN

NO

OCH3OH

O

HN

NO

OCH3

H

H

HN

NO

OCH3OH

HH

O2H°

H°

O2

H

HN

NO

OCH3H

HH

°OH

HN

NO

OCH3

OH

OOHH

H

HN

NO

OCH3

OH

OO°H

H

HN

NO

OCH3

HOH

°

H

°OH35%60%

HN

NO

OCH2OOH

H

HN

NO

OCH2°

H

HN

NO

OCH2OH

H

HN

NO

OCHO

H5-formyluracile5-(hydroxyméthyl)uracile

°OH5%

Thymine

5,6-dihydrothymine

5-hydroxy-5,6-dihydrothymine

5-hydroxy-5-méthylhydantoïne diols de thymineformylamine

O2

HN

NO

OCH2OO°

H

Figure 15 : Schéma d’oxydation de la thymine proposé par Cadet et al. (38)


On note aussi la formation d’un radical allylyle lorsque le radical °OH réagit avec le

groupement méthyle de la thymine par arrachement d’un atome d’hydrogène. En milieu aéré, les

radicaux formés réagissent avec le dioxygène pour former des radicaux peroxyles (39, 40). Ces

derniers peuvent être transformés en hydroperoxydes consécutivement à une réaction de transfert

d’électron au radical superoxyde, suivie d’une réaction de protonation. Ces peroxydes qui ont été

isolés et caractérisés dans le cas de la thymine et de la thymidine sont instables (39, 41). Ils se

décomposent en divers produits par perte d’un atome d’oxygène ou d’une molécule d’eau, ouverture

de cycle et transposition.

N

NO

NH2

N

NO

NH2

H

OHH

°

N

NO

NH2

OOH

OHHH

H

H

H

H

OO°H

OH

H

NH2

O N

N

OH° OH°90% 10%

réaction de cyclisation

N

NO

NH2

OHHH

OOH

H

H

HOO°H

OH

NH2

O N

N

N

N

O

O OHH

H

H

HNH2

O

H

HN

NO

O

HOHOH

HN

NO

NH2OH

H

N

NO

NH2

HOHOH

H

H- NH3

H2O H2O

5-hydroxyhydantoïne formylamine

diols d'uracile 5-hydroxycytosine

O2O2

Cytosine

N

NO

NH2

OHH

H

H

°

Figure 16 : Schéma d’oxydation de la cytosine proposé par Cadet et al. (38)

L’addition de l’e-aq sur la cytosine ou la thymine conduit à la formation après protonation de

radicaux 5,6-dihydropyrimid-5 yle. Ces radicaux peuvent être réduits ou oxydés pour donner

respectivement les 5,6-dihydropyrimidines et les 5,6-dihydroxy-5,6-dihydropyrimidines. L’attaque des

bases par les radicaux H° peut avoir lieu parallèlement en milieu hypoxique ou anoxique conduisant à

des produits d’addition préférentielle sur le C-5.


(b) Les bases puriques modifiées (pour revue (38))

L’addition des radicaux °OH peut avoir lieu en position 4 ou 8 des purines (38). L’addition

des radicaux °OH en position 8, conduit à la formation d’un radical neutre intermédiaire, qui selon la

nature du milieu, oxydant ou réducteur, pourra donner, respectivement, la 8-oxo-7,8-dihydroguanine

(et la 8-oxo-7,8-dihydroadénine dans le cas de l’adénine) ou le 2,6-diamino-4-hydroxy-5-

formamidopyrimidine (4,6-diamino-5-formamidopyrimidine dans le cas de l’adénine) (Figures 17 et

18) (38, 42). Des réactions de cyclisation entre la position 5’ du sucre et 8 de la base se produisent de

manière compétitive (43-45).

NH

NN

N

O

H NH2

HN

N N

N°O

OHH

HH2N

Oxydation Réduction

HN

N N

N

O

HH2N

+°

+H2O/-H+

(ADN)

(-e-)Guanine

radical neutreréducteur

cation radical

°OH

°OH

HN

N NH

N

O

H2N OH

°

N

N NH

N

O°

H2N

radical neutreoxydant

- H+

- H2O

N

NO NH2

H2N

H2O

O2

O

NO

H2N

NH2

NH2 oxazolone

imidazolone

2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine (FapyGua)

HHN

N NH2

N

O

O

HH2N

HHN

N N

N

O

O

HH2N

8-oxo-7,8-dihydroguanine(8-oxoGua)

Figure 17 : Schéma d’oxydation de la guanine proposé par Cadet et al. (38)

Ces réactions, initiées par arrachement d’un atome d’hydrogène en position 5’ du sucre, sont

favorisées en milieu anoxique. Elles peuvent conduire à la formation de nucléosides cycliques (liaison

covalente entre les positions 5’ et 8). L'addition du radical °OH en position 4 de la guanine conduit à

la formation d'oxazolone, après déshydratation du radical guanyle formé initialement. Cela implique

dans une étape ultérieure la fixation de O2 et plusieurs transpositions. Dans le cas de l'adénine un

schéma d'oxydation similaire a été déterminé puisque l'attaque de la base en position 8 par le radical


hydroxyle conduit à la formation de 8-oxo-7,8-dihydroadénine ou de 4,6-diamino-5-

formamidopyrimidine (Figure 18). Toutefois, les produits issus de l'attaque en position 4, n'ont

toujours pas été caractérisés. La formation de 2-hydroxyadénine a également été proposée (46, 47).


N

N N

N

NH2

H

+°

+H2O/-H+

(ADN)

(-e-)

8-oxo-7,8-dihydroadénine(8-oxoAde)

4,6-diamino-5-formamidopyrimidine (FapyAde)

Adénine


cation radicalN

N NH

N

NH2

OH

°

N

N N

N°NH2

OHH

H

N

NHN

N

NH2

- H2O-H°

°OH

°OH

HN

N NH

N

O

N

N NH

N

NH°

HN

N NH2

N

NH2

O

H

HN

N NH

N

NH2

O

Figure 18 : Schéma d’oxydation de l’adénine proposé par Cadet et al. (38)

(3) Pontages ADN-protéines

Des pontages intra-chaîne ou inter-chaînes ou entre l’ADN et les protéines environnantes

peuvent aussi se former sous l’effet du rayonnement ionisant. Dans ce cas, le radical hydroxyle peut

être impliqué (48). Le nombre des pontages radio-induits entre ADN et protéines est d’environ 30 par

cellule par Gy de rayonnement de faible TEL. Ils peuvent se former (en absence d’oxygène) lorsque

deux radicaux sont générés à la fois sur l’ADN et au niveau des acides aminés constitutifs des

protéines proches de l’ADN. Des travaux ont mis en évidence la formation de pontage entre la

tyrosine et la thymine (49, 50) mais aussi entre d’autres acides aminés et la thymine ou la cytosine

(49-51).


(4) Altération des sucres

L’attaque du 2-désoxyribose par les radicaux °OH qui se traduit initialement par un

arrachement d’un atome d’hydrogène, peut conduire à :

- une libération du sucre entraînant la formation d’une coupure de brin,

- un sucre altéré mais toujours relié en 3’ et 5’ au squelette phosphodiester (site abasique),

- un sucre altéré et seulement relié en 3’ ou 5’ au squelette phosphodiester (formation d’une

coupure de brin).

Plusieurs produits d’altération ont été identifiés (25, 52).

b) L’effet direct (pour revue (38))

Des travaux sur des composés modèles et sur l’ADN isolé ont montré que les effets direct

(ionisation) et indirect du rayonnement gamma conduisaient à la formation de bases modifiées

identiques mais produites en quantités différentes (53). L’effet direct consiste en un arrachement

d’électron avec formation d’un cation radical.

(1) Le 2-désoxyribose

Cet effet peut concerner le 2-désoxyribose et conduire à la formation d’un cation radical qui

après déprotonation et réaction avec l’oxygène, conduit à une coupure de la chaîne d’ADN.

(2) La 2’-désoxyguanosine

La guanine qui possède le potentiel d’oxydation le plus bas est la plus sensible aux réactions

d’ionisation. Le schéma d’oxydation par un électron de la guanine proposé par Cadet et al. (38) est

présenté dans la Figure 17. La perte d’un électron par la guanine conduit à la formation d’un cation

radical qui peut perdre un proton pour conduire à la formation d’oxazolone ou s’hydrater pour

engendrer la 8-oxodGuo et la FapyGua.

(3) La 2’-désoxyadénosine

Le cation radical obtenu par arrachement d’un électron à la base de la 2’-désoxyadénosine

peut perdre un proton pour donner un radical aminyle qui peut se désaminer et donner l’hypoxanthine.

Le radical cation peut aussi s’hydrater et conduire à la formation de 8-oxodAdo et de FapydAdo.

(4) La 2’-désoxythymidine

L’arrachement d’un électron de la thymidine conduit à la formation d’un cation radical qui

peut perdre un proton ou bien s’hydrater en respectivement le radical intermédiaire 5-méthyl-2’-

désoxyuridyle (dans 30% des cas) ou le radical 6-hydroxy-5,6-dihydrothymidyl-5-yle (dans 70% des

cas). Dans le premier cas, la réaction de l’oxygène avec le radical formé conduit à la formation de 5-

HmdUrd ou de 5-FordUrd. Dans le second cas, la réaction de l’oxygène avec le radical en position 6


conduit à la formation de 5-hydroperoxy-6-hydroperoxy-5,6-dihydrothymidine. La dégradation de cet

intermédiaire a déjà été discuté dans la présentation de l’effet indirect.

(5) La 2’-désoxycytidine

Le cation radical formé par arrachement d’un électron à la base de la 2’-désoxycytidine peut

perdre un proton au niveau de l’amine exocyclique en position 4 ou au niveau du carbone 1 du 2-

désoxyribose. Les radicaux ainsi produits (17% au total des réactions) conduiront à la formation (en

présence de dioxygène) de 2-désoxy-D-ribono-1,4-lactone et de cytosine ou de 2’-désoxyuridine.

Toutefois, la réaction majoritaire du cation radical de la cytosine est une hydratation en position 6

pour donner le radical intermédiaire 6-hydroxy-5,6-dihydro-2’désoxycytidyl-5yle.

4. Lésions spontanées de l’ADNLes constituants de l’ADN cellulaire sont en permanence l’objet d’altérations chimiques

(Tableau VII). Ces modifications constituent le « bruit de fond ou niveau basal de lésions ». 2000 à 10

000 purines sont ainsi libérées « spontanément » de l’ADN cellulaire chaque jour et forment des sites

abasiques. Cette libération des bases résulte de la rupture des liaisons N-glycosidiques. Cette réaction

d’hydrolyse affecte plus les purines que les pyrimidines (54). Des réactions de désaminations de

l’adénine, de la guanine et de la cytosine se produisent pour former respectivement l’hypoxanthine, la

xanthine et l’uracile. Des coupures de brin de l’ADN peuvent également se former. Il est intéressant

de comparer le niveau basal des produits d’oxydation de l’ADN cellulaire à celui induit par une dose

de rayonnement (13, 55).

Tableau VII : Nombre de dommages de l’ADN par cellule de mammifère

Lésions spontanées

Evénement par heure par année dommages del’ADN/cGy

cassures simple et double brin ≈ 5 103 ≈ 4,4 107 10

dépurination ≈ 1,5 103 ≈ 1,4 107 0,4

pertes de bases ≈ 1,25 103 ≈ 1,1 107 9,5

Total ≈≈≈≈ 8,0 103 ≈≈≈≈ 7 107 20

Les doses rencontrées en radioprotection sont pour une année de l’ordre du mGy. En

prenant une marge de sécurité (100 lésions produites par centiGray) pour tenir compte d’autres

lésions comme les pontages ou modifications de bases qui ne sont pas répertoriées dans ce Tableau,

une exposition de cet ordre se traduit par la formation additionnelle de 100 lésions au niveau basal

d’environ 7 107 lésions. Bien sûr, cette comparaison n’est donnée qu’à titre indicatif. La seule


comparaison des taux de formation des lésions ne prend pas en compte la nature de ces lésions (sites

multi-lésés par exemple, etc.) ni le caractère global de l’irradiation (atteintes des tissus et des grandes

fonctions physiologiques de l’organisme). Une telle comparaison signifierait en effet qu’un individu

pourrait recevoir une dose un million de fois plus élevée sans aucun risque, ce qui n’est pas le cas.

D. Effets d’une irradiation sur les chromosomes : Aberrationschromosomiques

Nous ne détaillerons pas ce type de lésions. Toutefois, comme il s’agit de dommages très

importants dans les effets des ions lourds, nous en donnerons néanmoins les principales

caractéristiques. L’utilisation de coloration au GIEMSA, de coloration différentielle (bandes R et S),

l’utilisation de 5-bromodésoyuridine ou de l’hybridation fluorescente in situ (FISH), ont permis la

mise en évidence des remaniements des chromosomes après irradiation.

1. Nature des aberrationsSi l’irradiation a lieu avant la phase S du cycle cellulaire, il peut s’agir d’échanges

intrachromosomiques (délétion, anneau centrique, etc.), d’échanges interchromosomiques

(dicentriques, etc.). Si l’irradiation a lieu après la phase S, en G2, les aberrations induites sont de type

chromatidiennes (lacunes, fragments, etc.) (56). Dans ce cas, une chromatide seulement sur les deux

de chaque chromosome sera touchée. Plusieurs mécanismes conduisant à la formation des aberrations

chromosomiques ont été proposés. Ils sont rapportés dans les travaux de Sax (57) qui sont aujourd’hui

confirmés par d’autres études (58), et dans les investigations de Revell (59). Il semble cependant que

l’événement prépondérant soit la formation d’une cassure double brin (60). Les échanges

chromosomiques sont le résultat d’une cassure de chromatide suivie par la fusion des extrémités

coupées. Certaines cassures ne sont pas réparées et donnent lieu à la formation de fragments.

2. Transmission des aberrations à la descendanceSeules les aberrations stables (translocations, inversions) seront transmises à la descendance

et pourront être mises en évidence plusieurs générations cellulaires post-irradiation. Les aberrations

les plus complexes (anneaux dicentriques, acentriques) comportant au moins trois points de cassures

sont difficilement transmissibles (61).

3. Dosimétrie biologiqueL’étude des remaniements chromosomiques, et en particulier des dicentriques, montre que la

fréquence d’apparition de cette dernière classe de lésions est dose-dépendante avec une relation

linéaire quadratique. La persistance de ces lésions, pendant plusieurs semaines, au sein des

chromosomes de lymphocytes d’un individu irradié permet de remonter à la dose reçue (62).


E. Effets d’une irradiation sur le corps humainL’atteinte des constituants cellulaires (ADN, membranes cellulaire et nucléaire, etc. ) se

traduit au niveau de l’organisme par l’apparition de symptômes cliniques que l’on peut classer en

deux catégories (Figure 19) (63-65).

Irradiation globale

effets aléatoires

dose seuil ?probabilité d’apparition = f (dose)

délai d’apparition long (plusieurs années)

effets déterministes

dose seuil d’apparitioneffet = f (dose)

délai d’apparition court

syndrome hématopoïétiquehémorragie, infection (2< dose < 10 Gy)

syndrome nerveux(50 Gy < dose)

syndrome prodromafatigue, nausées (dose < 2Gy)

syndrome gastrointestinalnausées, vomissement, diarrhées hémorragiques10 < dose < 50 Gy)

cancers mortels (4,0 10 -2 /Sv)

cancers non mortels (0,8 10-2/Sv)

effets héréditaires (0,8 10-2/Sv)

détriment 5,610-2/Sv (travailleurs, CIPR 60)

Figure 19 : Effets d’une irradiation globale sur l’homme

1. Effets déterministesLeurs principaux aspects sont indiqués sur la Figure 19. Les signes cliniques qui les

caractérisent peuvent être regroupés au sein de 4 syndromes indissociables les uns des autres. Ils

s’inscrivent dans une chronologie post-irradiation qui comporte trois phases. Une phase initiale

d’apparition des symptômes suivie d’une période de latence plus ou moins longue et enfin une phase

aiguë ou critique où les atteintes tissulaires s’expriment.

2. Effets aléatoiresLes effets aléatoires ou tardifs ont pour conséquence l’apparition de cancers et d’effets

héréditaires (3, 64, 66, 67).

a) Instabilité génique-chromosomique

Il s’agit de morts cellulaires, de mutations, de transformations cellulaires ou encore

d’instabilité chromosomique pouvant apparaître plus de 100 générations cellulaires après l’exposition

au rayonnement. L’origine de cette instabilité est encore méconnue même si la mutation de gènes

intervenant dans le maintien de cette stabilité est avancée (68).


b) Cancérogenèse : Effet somatique

Ce terme recouvre un grand nombre de maladies (plus d’une centaine). Ces maladies résultent

toutes d’une prolifération anarchique de cellules conduisant à l’apparition d’une tumeur. Chaque

cancer présente ses caractéristiques propres mais les mécanismes qui engendrent les tumeurs

présentent des similitudes. Si cette prolifération reste confinée, on parlera de tumeur bénigne, si elle

s’étend de manière anarchique, on parlera de tumeur maligne.

(1) Approche épidémiologique

Le premier type d’effets associé à l’exposition à des rayonnements ionisants est le cancer

radio-induit. Le premier cancer radio-induit (cancer de la peau) reconnu date de 1902. De nombreux

travaux ont depuis établi des corrélations entre exposition au rayonnement ionisant et cancer (69, 70).

S’il est démontré qu’au delà d’une dose estimée à environ 500 mSv, la probabilité d’apparition d’un

cancer augmente avec la dose délivrée, aucun excès de tumeurs et leucémies n’a pu être démontré

pour des doses inférieures à 200 mSv. Il s’agit donc, pour mettre en place un système de protection

des travailleurs comme du public, de savoir si l’on peut extrapoler les données obtenues aux fortes

doses (> 500 mSv) au domaine des faibles doses (< 200 mSv) et s’il existe une dose minimale pour

l’apparition des cancers (notion de seuil). Les différents moyens d’analyse reposent sur des études

épidémiologiques mais aussi sur des travaux effectués en laboratoire (expérimentations animales ou

transformation de cellules). Les principales études épidémiologiques reposent sur l’analyse des

données concernant la cohorte des survivants d’Hiroshima-Nagasaki (71, 72), les malades traités par

radiothérapie (73), les radiologistes (74), les travailleurs du nucléaire (75), et certaines populations

vivant dans des zones à fortes exposition naturelle (plateau du Kérala en Inde) (10).

(2) Approche moléculaire de la radiocancérogenèse

(a) le cancer

Le nombre de cellules transformées est indépendant du nombre de cellules irradiées. Une

tumeur provient d’une seule cellule dont la division échappe à tout contrôle. La division cellulaire

étant sous le contrôle de gènes, c’est la modification du code génétique (mutation) de ces gènes qui

est responsable de l’initiation du processus tumoral (76-78). Ce processus implique plusieurs étapes

(79). Plus de 250 gènes sont aujourd’hui connus comme étant impliqués dans le contrôle de la

prolifération, i.e. dans le contrôle de la signalisation intercellulaire et du cycle cellulaire. Ces gènes

sont classés en deux catégories :

- Les oncogènes (PDGF, erb-B, RET, Ki-ras, N-ras, c-myc, N-myc, Bcl-2, MDM2, etc.) qui

favorisent la croissance cellulaire,

- Les antioncogènes ou gènes suppresseurs de tumeurs (NF-1, NF-2, RB, p53, etc.).

(b) le cancer radio-induit


S’il est difficile de distinguer un cancer radio-induit d’un autre, l’étude de certains gènes

semble indiquer que le spectre de mutations induit par le rayonnement ionisant diffère du spectre de

mutations spontanées. L’étude des remaniements chromosomiques observés dans certains cancers

suggère deux processus possibles de cancérisation. Le cancer peut être initié par activation d’un

oncogène (une translocation spécifique active un oncogène) ou par inactivation d’antioncogènes. On

considère, pour des raisons de balistique, qu’il est plus facile à un rayonnement de produire la perte

d’une fonction que la création d’une nouvelle. Il a en effet été constaté que les rayonnements ionisants

produisent surtout des délétions qui aboutissent à la perte de fonction d’un allèle (80). Chaque gène

comportant deux allèles, la perte d’un seul ne s’accompagnera pas, la plupart du temps, d’une perte de

fonction du gène. La phase de promotion du cancer ne sera atteinte que si l’allèle restant subit à son

tour une mutation dans un délai plus ou moins long. La cellule acquerra une totale indépendance et ne

répondra plus à aucun contrôle de son environnement au cours de la phase suivante, dite de

progression. Les cancers radio-induits ne devraient survenir que chez les personnes âgées ou irradiées

relativement jeunes. C’est bien le cas de carcinomes, de certains sarcomes ou leucémies.

Une deuxième caractéristique de l’effet des rayonnements ionisants est l’instabilité

chromosomique qu’ils génèrent. Il faut attendre 20 à 30 générations après l’irradiation pour qu’une

mutagenèse très forte se produise. Des dicentriques, des délétions sont alors susceptibles de se

produire.

c) Effets génétiques héréditaires

Les effets héréditaires regroupent l’ensemble des mutations pouvant être transmises à la

descendance. Du fait de l’existence de mutations spontanées au sein de la population, il est difficile

d’estimer le risque héréditaire d’un agent mutagène pour les générations futures. Les mutations

spontanées sont essentiellement générées au cours de l’étape de réplication de la molécule d’ADN. Ce

taux est d’environ une mutation par milliard de bases copiées. Une naissance sur 10 viable est

porteuse d’une anomalie génétique et représente en quelque sorte « le bruit de fond » naturel

d’anomalies génétiques (Figure 20) (4).

anomalies/naissance viable

Mendéliennes Chromosomiques

0,4 %autosomiques récessives 0,25 %

autosomiques dominantes 0,9 %

liées au chromosome X 0,1 %

affections multifactorielles

9 %

Figure 20 : Anomalies génétiques de la population


Aucun effet héréditaire n’a été montré dans la cohorte des survivants d’Hiroshima - Nagasaki,

même chez les individus irradiés à forte dose. De ce fait, l’estimation du risque pour les besoins de la

radioprotection est effectuée à partir des études animales.

F. Radioprotection : Les trois principesL’établissement de normes de Radioprotection repose sur les données scientifiques apportées

par les études cliniques, épidémiologiques ou fondamentales. Ces normes réglementaires sont basées

sur les rapports de la CIPR (3) et prennent en compte les effets déterministes et les effets aléatoires

des rayonnements ionisants.

1. Les effets déterministesCe sont les effets les mieux connus. Ils apparaissent comme nous l’avons vu au delà d’une

dose seuil, relativement élevée, et leur gravité est fonction de la dose et du débit de dose. La

réglementation fixe en fait des limites d’exposition très inférieures à leur dose-seuil d’apparition.

2. Les effets aléatoiresExiste-t-il un seuil d’apparition des effets tardifs ? Tant que la démonstration n’en a pas été

faite, la radioprotection applique le principe de précaution. Toute irradiation est susceptible d’engager

un processus cancéreux. Toutefois, ce principe est indissociable du principe de responsabilité basé à

la fois sur la notion de transfert de risque et de prise en compte des facteurs économiques liés à

l’activité mettant en jeu les rayonnements ionisants.

a) Démarche ALARA

Ces principes débouchent sur la démarche ALARA (« As Low As Reasonably Achievable »),

qui sous-entend de réduire les expositions à un niveau aussi faible que les contraintes économiques le

permettent.

Une limite est ainsi fixée. Au dessus de la limite, on trouve le domaine des expositions

inacceptables. En dessous, on trouve le domaine des expositions tolérables. Le risque est dit accepté

pour toutes les expositions situées sous le niveau ALARA.

b) Choix des limites

Elles reposent d’une part sur les données épidémiologiques (qui permettent d’estimer le risque

lié à une exposition) et d’autre part sur le risque que la société est prête à accepter. Pour évaluer le

risque lié à l’exposition aux rayonnements ionisants, on utilise la notion de détriment. Le détriment

prend en compte les effets tardifs (génétiques et carcinogénétiques mortels et non mortels). Le

détriment est ainsi estimé pour le travailleurs à 5,610-2 Sv-1, ce qui veut dire que sur une population de

100 000 personnes ayant reçu une dose efficace de 1 mSv, 5,6 cancers seraient induits par les

rayonnements ionisants. Néanmoins, une limite d’exposition de 20 mSv correspondrait à un risque de

20 10-3 4 10-2, soit 8 décès pour 10 000 travailleurs. 4 10-2 Sv-1 représente le risque de cancers

mortels. L’abaissement des limites d’exposition à 20 mSv/an, fixé par la nouvelle directive, tolère un


risque de décès huit fois supérieur à celui rencontré dans l’industrie du bâtiment (qui est pourtant

l’industrie estimée être la plus dangereuse).

Partant de cette démarche, la directive de la CIPR 60 pose trois principes liés à l’utilisation des

rayonnements ionisants.

3. JustificationToute activité mettant en œuvre des rayonnements ionisants doit être justifiée par le bénéfice

qui en est retiré.

4. LimitationAucun individu ne doit être soumis à un risque jugé inacceptable.

5. OptimisationLe niveau des expositions, le nombre de personnes exposées, et la probabilité des expositions

doivent être aussi bas que raisonnablement possible compte tenu des facteurs économiques et sociaux.

6. Limites d’exposition des travailleursLes travailleurs exposés aux rayonnements ionisants sont classés en deux catégories en

fonction des doses d’exposition qu’ils sont susceptibles de recevoir (81). Ce classement conditionne

leur suivi médical et les taches qu’ils sont susceptibles d’effectuer. La CIPR 60 recommande de ne

pas dépasser 100 mSv sur cinq ans pour les travailleurs de catégorie A tout en ne dépassant pas 50

mSv par an (3). Elle recommande une limite d’exposition de 1 mSv par an pour le public, ce qui est

déjà inférieur à l’exposition naturelle.


III. RAYONNEMENTS ULTRA-VIOLETS ET VISIBLE

Nous présentons dans ce sous-chapitre quelques données bibliographiques relatives aux

rayonnements ultra-violets et visible et à leurs effets biologiques.

A. IntroductionLe nombre croissant de 5 à 7% par an de cancers de la peau (carcinomes et mélanomes) et de

cataractes pose un problème de santé publique (82). Cette augmentation a conduit les pouvoirs

publics à mettre en place des campagnes de prévention des risques liés à une exposition au

rayonnement solaire et en particulier au rayonnement UV dont l’implication dans les processus de

cancérogenèse est désormais établie.

Il a été initialement admis que la partie génotoxique des UV était liée aux UVB (83). Aussi,

nombre de produits de protection solaire sont susceptibles de protéger le corps humain contre ces

rayonnements. Or depuis une dizaine d’années, les données scientifiques semblent souligner les effets

génotoxiques des UVA (84-87), qui sont la composante essentielle des rayonnements UV. De plus, le

rayonnement UVA pénètre plus profondément dans l’épiderme que les UVB.

B. OrigineLe soleil est un réacteur nucléaire qui est une source considérable de rayonnements ionisants

et non ionisants.

Més

osph

ère

Stra

tosp

hère

Tro

posp

hère

10 km

50 km

rayons cosmiques

rayons γ

rayons x

couche d'ozone

UV

B

UV

A

UV

C

Epiderme

Derme

Infra

-Rou

ge

Hypoderme

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Action relative du rayonnement UV(normalisée à 254 nm)

1

Action létale

Action mutagène

300 350 400 450

Spectre de l'absorption de l'ADN

Longueur d'onde (nm)

a) b)

Figure 21 : a) Spectre solaire (88), b) Spectre d’action biologique (létale et mutagène) du

rayonnement UV comparé au spectre d’absorption UV de l’ADN (89)Nous avons évoqué dans la première partie de notre exposé la nature des rayonnements

ionisants issus de ces réactions nucléaires. La majeure partie des rayonnements issue de ces réactions,


qui atteint la Terre, est constituée de radiations non ionisantes (Figure 21a). Le spectre des

rayonnements non ionisants peut être divisé en plusieurs sous-groupes. Il comporte une composante

infra-rouge (800-10000 nm), une composante visible (400-800 nm), une composante ultra-violette qui

se divise en 3 parties. On distingue le domaine des ultra-violets de type A (320-400 nm), celui des

ultra-violets de type B (290-320 nm) et des ultra-violets de type C (190-290 nm).

C. Spectre solaireLa couche d’ozone stratosphérique (entre 15 et 25 km d’altitude) filtre les rayonnements UV

de plus courte longueur d'onde, i.e. les UVC et une partie des UVB. L’énergie lumineuse qui atteint le

sol est constituée d’environ 50% de rayonnements appartenant à l’infra-rouge, 40% au spectre visible

et 10% à l’ultra-violet. La proportion d’UVB arrêtée dépend d’une part de l’altitude, de la latitude, de

paramètres météorologiques et de la saison.

Seuls les rayonnements de type UVA (90% du rayonnement ultra-violet) et UVB atteignent la

surface de la Terre (90). Comme le montre la Figure 21b, le spectre d’absorption et le spectre d’action

mutagène et létale du rayonnement UV ne coïncident que dans une gamme de longueurs d’onde

comprises entre 254 nm et 290 nm. Ceci suppose que deux mécanismes soient impliqués dans l’effet

des UV et ceci en fonction de la longueur d’onde.

D. Mode d’action des rayonnements ultra-violets et visibleLes rayonnements UV doivent, pour être actifs biologiquement, être absorbés par la matière

vivante (Figure 22). L’ADN est capable d’absorber les photons de l’UVB et de l’UVA les plus

énergétiques. L’existence dans les cellules de chromophores, encore appelés photosensibilisateurs,

permet l’absorption des longueurs d’onde plus élevées (> 350 nm) (91-93). Il peut s’agir de flavines,

de porphyrines, d’acides aminés, de quinones, de stéroïdes, de protéines à hème, etc.. Après

absorption de l’énergie, le chromophore au préalable à l’état fondamental, passe dans un état excité

singulet. Cette énergie excédentaire peut conduire à plusieurs réactions.

1. Des réactions directes par transfert d’énergie intramoléculaireLe principal chromophore impliqué dans les effets du rayonnement solaire sur le matériel

biologique est constitué par l’ADN. Il présente un pic d’absorption maximal à 260 nm (UVC).

L’absorption peut alors être suivie de réactions entre bases pyrimidiques adjacentes avec formation de

deux liaisons covalentes (dimères de pyrimidines) ou d’une seule (pyrimidine (6-4) pyrimidone) (94-

96). D’autres chromophores cellulaires comme l’acide trans-urocanique sont également impliqués

dans ce type de processus .

2. Des réactions de photosensibilisationLes rayonnements UVA et visible n’étant pas ou très peu absorbés par l’ADN, leur action fait

intervenir des réactions de photosensibilsation impliquant d’autres chromophores que l’ADN. Le

photosensibilisateur peut être de nature endogène (97). Il peut également être de nature exogène


comme des médicaments (anti-bactériens, des anti-inflammatoires, des anti-fongiques), des teintures

(thiazines, bleu de méthylène, rose bengal, acridine orange etc.), etc.. Ces réactions ont lieu entre le

chromophore dans un état excité triplet, et un substrat qui peut être l’ADN lui même, ou d’autres

molécules biologiques (lipides ou protéines) ou l’oxygène. Le temps de vie de l’état triplet est

relativement long (10 à 10-5 s) pour permettre cette réaction. On distingue deux types de réactions

possibles (98).

a) Réactions de type I

Elle font intervenir une réaction entre le photosensibilisateur et le substrat, par arrachement

soit d’un électron, soit d’un atome d’hydrogène. Cette réaction dépend de l’énergie de l’état excité du

photosensibilisateur et du potentiel d’oxydation du substrat à l’état fondamental. La guanine qui

possède le potentiel d’ionisation le plus bas est la plus sensible des 4 bases de l’ADN à ce type de

réaction (99).

La réaction de type I peut également conduire indirectement à la formation d’anion

superoxyde. En effet, suite à une réaction de type I, le photosenbilisateur sous sa forme anionique

radicalaire, peut céder à l’oxygène l’électron non apparié et former ainsi O2°-. Dans une étape

ultérieure, O2°- peut se dismuter en H2O2 (dont la présence dans des cellules exposées au rayonnement

UVA a été démontrée), spontanément ou par voie enzymatique (100). Le radical °OH pourra ensuite

se former par réaction de Fenton impliquant la présence de métaux de transition réduits à proximité de

la double hélice d’ADN.

b) Réactions de type II

Ces réactions se traduisent par la formation de l’oxygène singulet consécutivement à un

processus de transfert d’énergie entre le photosensibilisateur excité et l’oxygène fondamental à l’état

triplet. Au sein de l’ADN, cette espèce réactive de l’oxygène peut réagir ensuite de façon

préférentielle avec la guanine pour produire de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine, une des principales bases

oxydées de l’ADN (101-103). La Figure 22 résume les principaux mécanismes d’action des

rayonnements UV et visible sur l’ADN.


λ (nm)

100

290

320

400

800

UVC

UVB

UVAphotosensibilisateur

endogène excité1O2

type II

type Iarrachement d’e-

visible

absorption directe par l’ADN modifications

..-O2

Fe 2+OHH2O2

cyclobuta-dipyrimidinespyrimidine (6-4) pyrimidone

cation radical

O2

e-

O2

Figure 22 : Mode d’action des rayonnements UV et visible

E. Effets du rayonnement solaire

1. Effets à court termeL’érythème actinique est le principal signe clinique d’un exposition prolongée aux UVB.

C’est le « coup de soleil ». Le mécanisme qui conduit à son apparition n’est pas encore clairement

établi. Il faut ajouter les photodermatoses qui regroupent l’ensemble des affections qui ne sont

présentes que chez certains individus. Elles se caractérisent par une réactivité cutanée anormale à

l’exposition lumineuse. On trouve également les photokératites et photoconjonctivites qui sont des

affections de l’oeil liées à l’absorption du rayonnement UV par les liquides oculaires.

2. Effets à long termeLes effets des UVB à long terme (vieillissement de la peau et cancérogenèse) sont connus

depuis longtemps.

a) Vieillissement cutané

Le vieillissement cutané (104) peut être de deux sortes (actinique ou« chronologique ») selon

qu’il s’agit de zones exposées au soleil ou non.

b) Cancers

Les carcinomes basocellulaires, les carcinomes spinocellulaires et les mélanomes malins

semblent essentiellement dus aux UVB (94, 105). Toutefois, les UVA pourraient potentialiser l’effet

carcinogène des UVB (106). Des études ont montré leur pouvoir tumorigène chez l’animal (107,

108) et génotoxique sur des cellules en culture (109).


3. Effets génotoxiques

a) Effets génotoxiques des UVB et UVC

Les effets génotoxiques des rayonnements UVB et UVC s’expliqueraient essentiellement par

la formation de pontages intra-brin, sous forme de dimères de pyrimidines et d’adduits de type

pyrimidine(6-4)pyrimidone. L’altération de gènes codant pour des protéines ras oncogènes et p53

dans plusieurs cancers cutanés à des sites bi-pyrimidiques semble indiquer l’implication de ces lésions

dans les processus tumoraux. Des mutations de type C→T et CC→TT sont en effet observées aux sites

de dimères de pyrimidines (110, 111) (95). La formation en très faible quantité de 8-oxo-7,8-

dihydroguanine a également été mise en évidence après exposition de kératinocytes de souris aux

UVB (112).

b) Effets génotoxiques des UVA

Bien que le spectre solaire soit principalement constitué d’UVA, ces derniers ont longtemps

été considérés comme n’intervenant pas ou peu dans l’apparition de cancers cutanés. Ceci s’explique

en partie par le fait qu’il faut des doses d’irradiation d’UVA bien supérieures à celles des UVB pour

obtenir un taux de mortalité identique. Nous détaillerons les effets génotoxiques des UVA dans les

chapitres III et IV.

4. Effets cytotoxiquesLe pourcentage de cellules survivantes après exposition à des rayonnements UVA ou UVB

dépend de la longueur d’onde. Une dose d’UVA environ 800 fois plus élevée que la dose d’UVB est

requise pour obtenir un même effet cytotoxique.

5. Autres effets du rayonnement solaireLes UVB sont responsables de l’induction de la cataracte (113) et d’atteintes du système

immunitaire. L’exposition solaire revêt cependant aussi des aspects bénéfiques pour la santé, puisque

les UVB sont responsables de la synthèse de la vitamine D3 hydrolysée ensuite en vitamine D

(connue pour son action antirachitique) (114). Les infra-rouges ont une action calorique et le soleil

possède un rôle fondamental dans la régulation des cycles circadiens.

IV. LA REPONSE DU MATERIEL BIOLOGIQUE FACE AUX RAYONNEMENTS

L’ADN et les différents constituants cellulaires sont en permanence soumis à des agressions

d’origine endogène ou exogène. On estime que 10 000 à 15 000 bases modifiées, en partie d’origine

oxydative, sont produites par jour et par cellule (115). Afin de prévenir ou minimiser l’altération

oxydative de l’ADN et d’autres molécules essentielles à la vie cellulaire, les cellules ont mis en place

des systèmes de défense. Ces derniers comportent des molécules antioxydantes ayant pour fonction

d’éliminer les espèces radicalaires. Il faut ajouter la présence de complexes enzymatiques qui


interviennent, le cas échéant, pour restaurer l’intégrité de la molécule d’ADN. Ce sont les systèmes de

réparation.

A. Les défenses antioxydantes de la celluleDe nombreux ouvrages ou revues traitent des défenses antioxydantes (116-118). Nous n’en

donnerons ici que les principales caractéristiques.

L’oxygène est indispensable à la respiration cellulaire. Il est présent au sein des cellules à une

concentration proche de 10 µM. Il est au cours du métabolisme respiratoire réduit en anion

superoxyde (0,01-0,001 nM). Ce dernier est ensuite réduit en peroxyde d’hydrogène par une

superoxyde dismutase (1-100 nM), et finalement en eau par l’intermédiaire d’une catalase ou d’une

glutathion peroxydase (78, 119). Cette réduction à 4 électrons s’effectue essentiellement par

l’intermédiaire de réducteurs puissants comme le NADPH et le NADH que l’on trouve au niveau de

complexes de cytochrome oxydase localisés dans les membranes mitochondriales. D’autres systèmes

biochimiques peuvent être responsables de réduction à un ou plusieurs électrons. On trouve ces

systèmes au niveau du réticulum endoplasmique ou des membranes plasmiques de certaines cellules.

On peut mentionner qu’en présence de métaux (Fe2+, Cu2+) le peroxyde d’hydrogène peut être réduit

en radical °OH par la réaction de Fenton :

H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + °OH

Fe3+ + O2°- → Fe2+ + O2

soit le produit final de la réaction :

H2O2 + O2°- → OH- + O2 + °OH

Du fait de leur très grande réactivité, les espèces réactives de l’oxygène peuvent réagir avec la

plupart des composés cellulaires. Parmi ces composés, les vitamines E et A, les carotènes au niveau

des membranes jouent un rôle dans la protection contre les peroxydations lipidiques en chaîne. On

trouve des composés hydrophiles comme l’acide ascorbique (O2°-, °OH), le glutathion, l’acide urique

(piégeur de °OH, etc.) etc..

B. Les systèmes de réparation des lésions

1. Cycle cellulaireLes systèmes antioxydants qui assurent la première ligne de défense, par la présence de

molécules capables de piéger les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote, peuvent être dépassés.

Ces espèces peuvent alors réagir avec les phospholipides membranaires, les protéines ou les acides

nucléiques. Pour pouvoir survivre, mais surtout transmettre une information génétique correcte à sa

descendance, la cellule a mis en place des systèmes de reconnaissance et de réparation de ces lésions.

Il existe d’une part des systèmes de réparation fidèles, dirigés de façon préférentielle contre un type

de dommage donné, et d’autre part des systèmes dits fautifs. La radiosensibilité d’une cellule dépend

de la phase du cycle cellulaire dans laquelle elle se trouve. La cellule peut être quiescente (phase G0),


elle peut être engagée dans un cycle cellulaire (phase G1), dupliquer son ADN en phase S, se situer en

phase G2 (avant mitose) ou enfin entrer en mitose (répartition du matériel génétique entre les deux

cellules filles). L’essentiel pour la cellule est de transmettre une information génétique correcte à sa

descendance.

cycD-Cdk4/6

M

G1

S

G2

cycE-Cdk2

cycA-Cdk2

cycB-cdc2

cycA-cdc2

P21

P53

Figure 23 : Contrôle du cycle cellulaire

La progression dans le cycle cellulaire est assurée par la formation de complexes impliquant

des cyclines et des protéines kinase (Figure 23). Le complexe formé peut être ensuite un substrat pour

des protéines kinase. Le complexe le plus connu est celui permettant le passage des cellules en mitose

« Mitosis Promoting Factor » constitué de l’association d’une kinase p34cdc2 et d’une cycline B. Il est

sous le contrôle de kinases (cdk7, wee1) et d’une phosphatase (cdc25). Des protéines comme p53,

p21, p27, pRB sont également impliquées dans la régulation de l’activité de ces complexes.

L’effet d’une exposition de la cellule à plusieurs Gy se traduit par un retard à la mitose. Ce

retard qui peut être d’une durée variable permet essentiellement à la cellule de réparer les lésions

produites, si ces dernières ne sont pas trop importantes. Les principaux arrêts ont lieu en phase G2 et

G1 (120, 121). La durée de l’arrêt en phase G2 dépend de la dose et de la qualité du rayonnement.

Pour les particules de TEL élevé, cet arrêt peut être irréversible. L’arrêt en phase G1 a également été

observé avec les ions très lourds comme l’uranium (122). L’indice mitotique diminue linéairement

avec l’augmentation de la dose délivrée. On peut ajouter que le retard est d’autant plus important que

les cellules sont irradiées à une phase avancée du cycle cellulaire. La radiosensibilité liée au cycle

cellulaire tient au fait que les cellules disposent d’un laps de temps plus ou moins long pour réparer

les dommages. Les conséquences d’une réparation fautive peuvent être des aberrations

chromosomiques ou des mutations chromosomiques létales pour la cellule.

Lors d’une atteinte cellulaire, de nombreux facteurs entrent en jeu (Figure 24). Nous ne

détaillerons pas ici les mécanismes complexes mis en jeu, bien établis ou encore hypothétiques, qui

sont impliqués dans le devenir de la cellule. Néanmoins on peut distinguer tout d’abord une étape de

reconnaissance du dommage (par la Poly (ADP ribose) polymérase (PARP), par des protéines kinase


dépendantes de l’ADN (DNA-PK), par la protéine codée par le gène muté de l’ataxie télangiectasie

(ATM), etc.). Il semblerait qu’à ce niveau, les cassures double brin de l’ADN soient reconnues

comme un élément critique pour la cellule. Il y a ensuite arrêt du cycle cellulaire sous le contrôle de

plusieurs protéines citées précédemment pour permettre la réparation des lésions ou pour engager un

processus apoptotique (pour revue (123)).

p21

p53

ATM DNA-PKSystème de détection des dommages

Lésions de l'ADN

p53 Chk1

ATR

CDC25

CDC2CDK

RB

MDM2

GADD45

PCNAapoptose

arrêt phase G1

inhibition de la réplication

arrêt phase G2

BAX

Radiations ionisantes

Figure 24 : Modulations du cycle cellulaire après irradiation

2. Les systèmes de réparationLa restauration de l’ADN endommagé fait intervenir des systèmes de réparation qui peuvent

être plus ou moins fidèles. Les principaux modes de réparation sont indiqués dans la Figure 25. Nous

n’aborderons que le système de réparation par excision de bases (REB), auquel nous aurons recours

dans la suite de ce travail pour mettre en évidence les dommages de bases de l’ADN.


synt

hèse

synt

hèse

tran

s-lé

sion

tran

s-lé

sion

incorporation d'une base au hasard

recombinaison hom

ologue

recombinaison hom

ologue

exple: réparation des CSB

exple: réparation des 1) CBP et des2) pyrimidines (6-4) pyrimidones

réparation par

réparation par

excision de nucléotides

excision de nucléotides

1)

réparation par réversion

réparation par réversion

réparation desréparation desmésappariementsmésappariements

réparation fidèle

répa

ratio

n par

répar

ation

par

excis

ion de

base

excis

ion de

base

exple: réparation de la 8-oxoGua

exple: réparation des CBP

recombinaison

recombinaison

non homologue

non homologue

exple: réparation des CDB

réparation fautive

HN

N N

NO

O

HH2N

H

HN

N

CH3OH

O

OH

N

N

CH3

HOH2)

H

HN

N

CH3

H

O

OH

NH

N

H3C

H

O

O

G

P PdR dR

PdR

A A

P P P

C

dR dR dR

T G

Figure 25 : Différents systèmes de réparation des lésions de l’ADN

3. La réparation par excision de bases (REB)C’est le système de réparation des bases oxydées, alkylées, fragmentées et des sites abasiques

(124, 125). Il est présent à la fois chez les eucaryotes et les procaryotes en faisant intervenir de

nombreuses enzymes. La réparation s’effectue en quatre étapes. La première correspond à

l’élimination de la base modifiée par coupure de la liaison N-glycosidique qui conduit à la formation

d’un site abasique (AP). Les enzymes qui sont responsables de cette excision sont appelées des ADN

N-glycosylases.

Une fois le site abasique formé, il y a coupure de la liaison phosphodiester en 3’ du site AP, et

éventuellement en 5’, par l’action d’une AP endonucléase. Les dernières étapes de la réparation

impliquent une ADN polymérase et une ligase. Les glycosylases peuvent être classées en plusieurs

catégories. Elles peuvent reconnaître des bases alkylées (AlkA d’E. coli), les cyclobutadipyrimidines

(T4 endo V du phage T4), l’uracile dans l’ADN (Ung d’E. coli), les pyrimidines modifiées (endo III

d’E. coli), les purines modifiées (Fpg d’E. coli), ou les mésappariements (Mut Y d’E. coli).

a) La Formamidopyrimidine glycosylase (Fpg)

Extraite d’Escherichia coli, cette enzyme à doigt de zinc (dans sa partie C terminale) est

composée de 269 acides aminés. Codée par le gène fpg (ou Mut M), elle possède une double activité

de type glycosylase et de type endonucléase en 3’ et 5’ du site abasique formé. L’affinité de l’enzyme


pour ses substrats dépend tout d’abord de leur nature (8-oxoGua, FapyGua, FapyAde, 5-OHcyt, 5-

OHUra, etc.) mais aussi de la base avec laquelle ils sont appariés. Des études quantitatives ont

néanmoins montré que la 8-oxoGua, la FapyGua et la FapyAde étaient d’excellents substrats pour la

protéine Fpg (126, 127).

Des analogues fonctionnels ont été isolés chez la levure (protéine yOgg1) et les mammifères (protéine

Ogg1). yOgg1, bien que différente structurellement, présente une activité relativement proche de celle

de Fpg.

b) L’endonucléase III (endo III)

Extraite d’Eschérichia coli, cette protéine qui comporte 211 acides aminés est codée par le

gène nth (128, 129). Elle possède une activité de type glycosylase mais aussi une activité

endonucléase qui lui permet de rompre la liaison phosphodiester en 3’. Elle a une spécificité de

substrats très large et reconnaît principalement les pyrimidines modifiées. Parmi ces dernières, on

peut citer la 5-hydroxy-5-méthylhydantoïne, la 5-hydroxyuracile, la 5-hydroxycytosine, les diols de

thymine, la 6-hydroxy-5,6-dihydrocytosine, la 6-hydroxy-5,6-dihydrouracile, la 6-hydroxy-5,6-

dihydrocytosine, les diols d’uracile, la 5-hydroxyhydantoïne, la 5,6-dihydrothymine, l’urée, les sites

abasiques, etc.. Toutefois, des études comparatives entre les différents substrats sont nécessaires pour

déterminer la spécificité de l’enzyme. Wang et Essigman ont montré à l’aide d’oligonucléotides

contenant les trois lésions suivantes qu’endo III reconnaissait de façon préférentielle les diols

d’uracile, la 5-hydroxycytosine, et la 5-hydroxyuracile (130). Il a aussi été montré que les diols de

thymine étaient de meilleurs substrats que la 5,6-dihydrothymine pour endo III (131). Des analogues

fonctionnels ont été isolés chez la levure (protéine ntg1 et ntg2) et l’homme (protéine hNth).

c) Mécanismes d’action de Fpg et d’endo III

Les mécanismes d’action de Fpg et endo III sont assez proches (Figure 26). Il y a d’abord

excision de la base modifiée et coupure du brin d’ADN par un mécanisme concerté. L’excision de la

base modifiée repose sur la formation d’une base de Schiff avec un intermédiaire imino entre un acide

aminé de la glycosylase d’une part et le 2-désoxyribose d’autre part. Deux mécanismes conduisent

ensuite à la formation d'une coupure. Une β-élimination pour endo III (cadre A) (suivie d’une

hydrolyse) ou une β-δ-élimination pour Fpg (cadre B).


OB*

NH

HH

enz

HA enz

B enz

OHenz

H

N

OHenz

HN

H B enz

OHenz

H

NOH

enzH

N

P5'

H2O

5'P

OHO

5'P

OHenz

HN

Henz B

OHenz

HN

P5' 5'

P

OHenz

HN

P3' 3'

POH

O

P5'

H2O

A

B

Base de SchiffB*

ββββ-élimination

δδδδ-élimination

Endo III

Fpg

Figure 26 : Mécanismes d’action présumés de Fpg et d’endo III

C. La mort cellulaireLa mort cellulaire est un processus qui intervient dès que les atteintes de molécules cibles sont

trop importantes. Une très forte dose d’irradiation s’accompagne en quelques heures de l’arrêt des

fonctions cellulaires et d’une cytolyse. Pour des doses moins élevées, les lésions ne s’exprimeront, si

la cellule n’a pas eu le temps de les réparer, qu’au moment de la division cellulaire. On considère

qu’une cellule qui a franchi six divisions cellulaires est en vie. La mort cellulaire peut impliquer deux

mécanismes, la nécrose et l’apoptose (ou mort programmée).

La nécrose se produit lorsque la cellule est soumise à des agressions (hypoxie, hyperthermie,

toxines, rayonnements ionisants, etc.). Les traits morphologiques de la cellule impliquent un oedème

cytoplasmique et mitochondrial, une condensation de la chromatine et le phénomène est associé à un

processus inflammatoire.

L’apoptose elle, intervient dans les processus physiologiques des organismes pluricellulaires

tels que l’embryogenèse, la métamorphose ou l’atrophie de tissus, etc.. La morphologie des cellules se

caractérise par une rupture des jonctions intercellulaires et une fragmentation de l’ADN sous l’action

d’endonucléases (132). Elle intervient également lorsque la cellule subit d’importantes altérations de

son patrimoine génétique afin d’éliminer les cellules porteuses de dommages. De nombreux gènes de

contrôle du cycle cellulaire sont impliqués dans le déclenchement de ce phénomène (133).

Objectif de l’étude

Objectifs de l’étude 63

Objectifs de l’étudeLes réactions d’oxydation de l’ADN d’origine endogène (métabolisme cellulaire, processus

inflammatoires) ou d’origine exogène (rayonnements, pollution atmosphérique, tabagisme, etc.)

peuvent être à l’origine de processus cancérigènes ou de vieillissement dans la mesure où les

modifications affectent des gènes indispensables au maintien de l’intégrité de la cellule (78, 134). La

mesure des bases modifiées revêt donc un intérêt tout particulier et certaines modifications peuvent

servir de biomarqueur du stress oxydatif. On distingue deux approches de mesures de dommages de

bases qui impliquent des méthodes directes et des méthodes indirectes (135, 136). Les méthodes

directes regroupent les techniques de postmarquage, l’immunologie et l’ensemble des méthodes

chromatographiques comme la chromatographie liquide haute performance couplée à une détection

électrochimique (CLHP-DE), la chromatographie gazeuse couplée à une détection par spectrométrie

de masse (CG-SM) et enfin la chromatographie liquide haute performance couplée à une détection par

spectrométrie de masse en mode tandem (CLHP-SM/SM). L’approche indirecte implique des

techniques initialement dédiées à la mesure des coupures de brin d’ADN. Il s’agit principalement de

la méthode d’élution alcaline sur filtre et de la méthode des comètes. Ces techniques sont associées à

l’utilisation d’enzymes de réparation (par exemple Fpg ou endo III) qui convertissent les bases

modifiées en coupures. Elles permettent ainsi de façon indirecte la mesure des dommages de bases.

Cette approche sera présentée dans les chapitres IV et V.

Parmi toutes les modifications des bases, la 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) ou son

nucléoside correspondant, la 8-oxo-7,8-dihydroguanine-2’-désoxyguanosine (8-oxodGuo) a fait

l’objet de nombreux travaux. La 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) qui est un des principaux

produits d’oxydation de la guanine a été mise en évidence pour la première fois en 1984 dans l’ADN

exposé aux rayons X (137). Il a été montré qu’elle était formée sous l’action de nombreux agents du

stress oxydant (38, 138-142). Ainsi, l’oxydation de la guanine par ionisation, par le radical °OH ou

par l’oxygène singulet conduit à la formation de 8-oxoGua (38, 143). Si cette lésion n’est pas réparée

par les systèmes dont dispose la cellule (101, 141), elle peut conduire à des mutations de type

G:C→T:A (144-146). Son éventuelle implication dans des processus de carcinogenèse a été émise

dès 1983 par Ames (147, 148). Des niveaux élevés de 8-oxodGuo mesurés dans l’ADN cellulaire ont

par ailleurs été associés avec plusieurs pathologies telles que l’anémie de Fanconi (149) et le diabète

léger (mellitus) (150).

La mesure de la 8-oxoGua peut être effectuée par CG-SM (47, 151-155), CLHP-DE (156),

postmarquage (157, 158), des techniques immunologiques ou des approches indirectes impliquant la

méthode des comètes ou la technique d’élution alcaline sur filtre couplées avec Fpg (159, 160). Le

niveau basal mesuré dans les cellules en absence de tout stress exogène a fait l’objet de nombreux

64 Objectifs de l’étude

débats qui s’expliquent par les écarts importants observés entre les résultats des différentes méthodes

de mesure (161). Sa mesure sera présentée et discutée tout au long de ce mémoire.

Des incohérences similaires ont été mises en évidence lors de la mesure d’autres lésions, et

ont conduit à la remise en question des méthodologies communément utilisées de CG-SM et de

CLHP-DE. Il a en particulier été montré que des possibilités d’oxydation artéfactuelle des bases ou

nucléosides normaux étaient susceptibles de se produire lors de la préparation des échantillons (78,

161-166).

L’objectif de ce travail était de quantifier les dommages radio-induits des bases puriques et

pyrimidiques dans l’ADN cellulaire après irradiation gamma. Pour cela, nous devions disposer de

techniques de mesure fiables qui ne soient pas sujettes aux problèmes d’oxydation artéfactuelle

évoqués ci-dessus. Les seules informations satisfaisantes, relatives à la formation de bases modifiées

dans l’ADN, que nous possédions avant de commencer cette étude, étaient tirés de travaux portant sur

l’irradiation en solution aqueuse aérée, de bases, de nucléosides, ou d’ADN isolé. Ces informations

ont en partie guidé le choix des lésions auxquelles nous nous sommes intéressés dans la suite de ce

mémoire. Ce choix était également tributaire des techniques mais aussi surtout des protocoles que

nous avions à notre disposition. L’extrapolation à l’ADN cellulaire des résultats obtenus sur des

modèles simplifiés n’était évidemment pas possible. En effet, bien que l’ADN isolé constitue le

modèle le plus proche de l’ADN cellulaire, il n’en reste pas moins très différent, car ce dernier est

compacté dans une structure par association avec des protéines. Toutefois, bien que plus simples que

l’ADN cellulaire, ces modèles ont permis de déterminer la nature d’un grand nombre de lésions ainsi

que leur mécanismes de formation. Ils sont de plus très utiles à la mise au point de méthodes

d’analyse fiables. Nous avons, au travers des différents mesures de bases modifiées que nous avons

effectuées, chercher à confirmer, au niveau de l’ADN cellulaire, l’existence de ces lésions ainsi que

leurs mécanismes de formation. Pour cela, il fallait disposer de techniques de mesure des dommages

de bases suffisamment sensibles puisqu’une des principales difficultés rencontrées était de pouvoir

mesurer de faibles taux de formation de bases modifiées. Cette caractéristique s’explique par

l’existence des systèmes de défense au sein de la cellule pour protéger l’ADN (antioxydants,

compactions dans des structures protéiques, enzymes de réparation) et le rendre moins vulnérable à

l’attaque des espèces radicalaires. Il fallait donc disposer de techniques très sensibles, mais aussi de

protocoles d’analyse qui n’entraînent pas l’oxydation artéfactuelle des bases normales. L’ADN isolé

de thymus veau qui est couramment utilisé illustre bien ce dilemme. Les étapes de purification que

subit cet ADN commercial en font un produit relativement pur et adapté à la mise au point de

méthodes chromatographiques ainsi qu’aux études mécanistiques. Toutefois, ces étapes de

purification sont aussi responsables de l’oxydation artéfactuelle des bases normales. Ceci se traduit

par des taux de bases modifiées, dans les échantillons contrôle, nettement supérieurs à ceux

déterminés dans l’ADN cellulaire.

Objectifs de l’étude 65

Nous présentons dans le chapitre II, les améliorations que nous avons apportées à ces

méthodes de mesure en précisant leurs conditions d’utilisation. Parmi ces mises au point, nous nous

sommes efforcés d’améliorer la technique d’extraction de l’ADN cellulaire afin de limiter les artefacts

liés à la manipulation et à la préparation des échantillons avant l’analyse. Nous avons utilisé la mesure

du niveau de 8-oxodGuo dans les cellules contrôle, comme critère de cette optimisation. Nous

présentons également les conditions d’utilisation de la méthode CG-SM et de la technique de CLHP-

SM/SM. L’application des ces méthodes de mesure aux dommages induits par les rayonnements

gamma, UVA, UV LASER de haute intensité ou encore par des photosensibilisateurs exogènes sera

illustrée dans le chapitre III.

Dans le chapitre IV est abordée l’approche indirecte des mesures de dommages de bases de l’ADN

induits par les agents oxydants cités ci-dessus. Cette approche repose sur l’utilisation de la méthode

des comètes couplée à des enzymes de réparation. Les résultats de mesure obtenus par cette technique

sont qualitatifs. Aussi une calibration de la méthode sera-t-elle traitée dans le chapitre V. Elle rendra

possible la « confrontation » des approches directe et indirecte et permettra d’aborder les aspects

mécanistiques conduisant à la formation des dommages étudiés.

Enfin, dans le chapitre VI sont présentés les résultats d’expérimentations conduites avec un

rayonnement de particules chargées de carbone, afin d’étudier l’influence du TEL sur la nature et la

répartition des dommages de bases dans l’ADN.

- Chapitre II -

Mise au point

de méthodes chromatographiques

Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 67

IntroductionL’approche la plus couramment utilisée et la plus ancienne pour mesurer les dommages des

bases de l’ADN repose sur l’utilisation de méthodes directes. Les premiers travaux effectués dans ce

domaine datent des années 70 (167). Ils font appel à des méthodes immunochimiques, à la technique

de postmarquage, aux analyses de chromatographie liquide (CL) ou gazeuse (CG) couplées à une

détection par spectrométrie de masse (SM) ou électrochimique (DE). La quantification des dommages

porte sur la base, le nucléoside ou le nucléotide modifié. La mesure au niveau cellulaire nécessite au

préalable une étape d’extraction de l’ADN cellulaire. L’ADN extrait est ensuite hydrolysé en

monomères, bases, nucléosides ou nucléotides avant que la lésion soit finalement analysée.

Nous allons, avant d’aborder l’optimisation de la méthode d’extraction de l’ADN cellulaire,

présenter le principe de la technique de postmarquage et des méthodes immunologiques. Ces

techniques ne seront néanmoins pas utilisées dans la suite de ce travail.

I. LA TECHNIQUE DE POSTMARQUAGE ET LES METHODESIMMUNOLOGIQUES

La méthode de postmarquage est utilisée depuis une vingtaine d’années (168, 169) pour la

mesure de divers adduits de l’ADN. L’utilisation d’un signal radioactif en fait un outil très sensible (1

adduit pour 108 nucléotides normaux) qui pourrait être très adapté à la mesure des dommages radio-

induits de bases. Un autre atout de la méthode est qu’elle ne nécessite qu’une quantité très faible

d’ADN (quelques µg).

A. La technique de postmarquage

1. PrincipeLa méthodologie consiste en une hydrolyse enzymatique de l’ADN sous forme de nucléosides

3’-monophosphate (à l’aide d’une nucléase micrococcale et d’une phosphodiestérase de rate de veau).

Une (T4 polynucléotide) kinase permet d’introduire, un groupement phosphate radioactif en utilisant

de l’[γ-32P]ATP comme donneur, sur la fonction 5’-OH du nucléoside 3’-monophosphate (Figure 27).

Une séparation par chromatographie sur couche mince de cellulose échangeuse d’anion permettra de

séparer les nucléotides normaux et modifiés avant de les quantifier.

2. Mesure des adduits et des bases oxydées de l’ADNCette approche a rendu possible la mesure d’adduits aromatiques de l’ADN. Elle implique

que les nucléotides modifiés aient un comportement chromatographique suffisamment différent de

celui des nucléotides normaux pour que leur séparation soit possible. Ce n’est pas le cas de la plupart

des bases oxydées de l’ADN. En effet, plusieurs travaux sur la mesure de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine

sous la forme nucléoside 3’-monophosphate (8-oxo-dGMP) dans de l’ADN isolé de thymus de veau

68 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques

(170) ont souligné l’intérêt d’étapes de purification par CLHP afin d’améliorer la sensibilité de la

méthode (171) et de pouvoir ainsi l’étendre à des mesures dans l’ADN cellulaire (172, 173).

L’utilisation de la nucléase P1, après l’étape de phosphorylation du nucléoside 3’-

monophosphate pour obtenir des nucléosides 5’-monophosphate a permis de séparer la 8-oxodGMP

de la dGMP, et d’accroître ainsi la sensibilité de la méthode (174).

Base oxydée

OH

OHO

OPOOH

Base oxydée

OH

O*P

OPOOH

OHO

OH

Base oxydée

OH

OHO

OPOOH

Base

OH

OHO

OPOOH

Base

OH

OHO

OPOOH

Base

OH

O*P

OPOOH

OHO

OH

Purification CLHP

Nucléase P1

[32P*]-ATP T4 kinase

*PO

H

O

OH

OH

Base oxydée

Séparation CLHP

ADNNucléase microccocalePhosphodiestérase II

+

+

+

+

Séparation par chromatographie sur couche mince

Base oxydée*POOH

H

OOH (en faibles quantités)

(en faibles quantités)

(en faibles quantités)

*POOH

H

OOH

Base

Figure 27: Principe du postmarquage au 32P

Toutefois la technique avec une sensibilité de 1 modification pour 104 bases normales est

d’utilisation limitée en raison de l’existence de processus de radiolyse des nucléotides normaux par le

rayonnement β du 32P (174, 175). Une autre difficulté rencontrée lors de la mesure de l’adénine N1-

oxyde et de la 5-hydroxyméthyluracile (176-178) est la faible valeur des rendements de marquage du


nucléotide modifié. Ainsi, il est apparu nécessaire d’utiliser des standards internes pour une meilleure

définition de l’aspect quantitatif des mesures (172, 179-181).

Le dosage des diols de thymine dans l’ADN isolé de thymus de veau, sous forme de

dinucléosides monophosphate, a également été permis par l’utilisation d’une phosphodiestérase de

venin de serpent (182, 183) et d’une T4 polynucléotide kinase (184). Une approche similaire a été

mise en œuvre pour la mesure d’adduits ou de pontages de l’ADN (185-187).

B. Approche immunologique

1. PrincipeElle repose sur l’utilisation d’anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre les modifications

de l’ADN. Une des principales difficultés consiste à obtenir des anticorps spécifiques d’un dommage

oxydatif donné. Pour préparer un système antigénique, une des stratégies est de fixer le nucléoside

modifié sur une protéine qui sera reconnue par les défenses immunitaires d’un système hôte. La

difficulté d’obtention des anticorps est liée à la variabilité des réponses entre les individus, au choix

de l’haptène et aux réactions croisées possibles. Ceci explique l’absence quasi-totale d’anticorps

suffisamment spécifiques pour la mesure des bases oxydées de l’ADN. Une exception concerne

l’anticorps monoclonal dirigé contre les diols de thymidine (188).

2. Exemples d’utilisation

a) Diols de thymine (Tg)

Les premiers anticorps poly et monoclonaux dirigés contre les diols de thymine (Tg) ont été

obtenus par West et al. (189) et Leadon et Hanawalt (190). D’autres anticorps ont été préparés en

utilisant un diol de thymidine (Tg) monophosphate couplé à une protéine, comme haptène. Les limites

de détection ont montré une faible spécificité de 1 Tg pour 104 (191), et de 1 Tg pour 103 paires de

bases qui ont permis de mettre en évidence des résidus Tg dans de l’ADN isolé exposé à 20 (192) et

10 Gy (193). Toutefois cette sensibilité est insuffisante pour mesurer le niveau basal de Tg estimé

entre 1 et 20 pour 106 nucléotides normaux (194). L’utilisation d’un anticorps monoclonal, obtenu par

fixation d’un poly (dT) fixé à une protéine bovine et par réaction d’immunisation chez le lapin ou la

souris (monoclonaux), a permis de détecter 1 Tg pour 2 105 thymines par la méthode ELISA. Il a

toutefois été montré que ces anticorps pouvaient aussi reconnaître des dimères cyclobutyle de thymine

(195, 196).

b) La 8-oxo-7,8-dihydroguanine et la 8-oxo-7,8-dihydroadénine

Le premier anticorps dirigé contre la 8-oxo-7,8-dihydroguanine a été proposé par Kasaï et

Nishimura (138). D’autres anticorps polyclonaux ou monoclonaux, ont depuis été préparés,

respectivement, par Degan et al. et par Park et al. (197, 198). Ils ont été utilisés dans le cadre

d’analyses par chromatographie d’immunoaffinité. La préparation des anticorps était basée sur le


protocole décrit par Erlanger et Beiser (1964) (199). Les premières mesures dans l’ADN cellulaire

ont été effectuées par « ImmunoSlotBlot » sur des cellules traitées avec 10 µM de peroxyde

d’hydrogène (200). Le taux de 8-oxo-7,8-dihydroguanine ainsi mesuré avec des valeurs voisines de 1

lésion pour 15 bases normales est très élevé. Il témoigne, soit du manque de spécificité de l’anticorps,

soit d’artefacts liés à la méthode elle-même. D’autres anticorps, bien que plus spécifiques ne

permettent la mesure que de 1 résidu 8-oxodGuo pour 105 dGuo (201). Les niveaux obtenus sont

toutefois 6 fois supérieurs aux mesures effectuées par CLHP-DE sur les mêmes échantillons.

L’anticorps monoclonal mis au point par Osawa et al., N45.1, a suscité beaucoup d’intérêt car

il apparaît être beaucoup plus spécifique. Sa préparation a impliqué la fixation covalente d’une 8-

oxodGuo sur une protéine (202). Cet anticorps ne donne pas lieu à des réactions croisées avec l’urée,

la créatinine, la guanine ou la 8-oxo-7,8-dihydroguanine. Il est utilisé pour la mesure de la 8-oxodGuo

dans l’urine (203) et pour des études immunohistochimiques (204), bien que l’aspect quantitatif et sa

spécificité n’aient pas été établis.

Des anticorps dirigés contre la 8-oxo-7,8-dihydroadénine ont été mis au point par West et al.

(205) et par Ide et al. (206). Ils n’ont pas montré une spécificité suffisante (40 femtomoles pour

l’anticorps de West et al. ; et 1 8-oxo-7,8-dihydroadénine pour 104 adénines pour Ide et al.) pour

permettre la détermination du niveau basal de 8-oxo-7,8-dihydroadénine dans l’ADN cellulaire.

II. OPTIMISATION DE LA METHODE D’EXTRACTION DE L’ADN CELLULAIRE

A. ProblématiqueLa technique d’extraction de l’ADN cellulaire consiste à isoler ce polymère biologique de

tous les autres constituants cellulaires. Pour cela, l’extraction s’effectue en plusieurs étapes et

commence, quel que soit le protocole, par une lyse des membranes plasmique et nucléaire. L’ADN est

ensuite purifié par précipitation ou passage sur colonne avant d’être hydrolysé et analysé. De

nombreuses techniques d’extraction sont disponibles, soit sous forme de « kits » commerciaux, soit

sous forme de protocoles définis par chaque utilisateur. L’extraction de l’ADN cellulaire étant utilisée

dans de nombreux laboratoires et à de nombreuses fins, les protocoles existants ne prennent pas

toujours en compte les mêmes critères de qualité. Parmi ceux-ci, nous avons surtout retenu la

réduction de l’artefact lié à l’oxydation des bases normales. Ces réactions, si elles concernent les

quatre bases de l’ADN, semblent affecter plus particulièrement la guanine, qui est la plus sensible aux

processus d’oxydation. Les valeurs des taux de 8-oxodGuo mesurés dans l’ADN de cellules non

irradiées montrent, que le niveau de cette lésion, dépend pour beaucoup de la technique d’extraction

utilisée. Cette oxydation artéfactuelle liée à la méthode peut être réduite en prenant un


soin tout particulier à la préparation des échantillons (conservation à + 4°C des échantillons, absence

d’étape d’évaporation à sec, etc.), par l’utilisation de chélateurs de métaux qui inhibent la réaction de

Fenton, par une optimisation des quantités d’enzymes et des temps d’incubation. Des critères ont été

retenus pour pouvoir comparer les différentes techniques d’extraction entre elles. Nous avons ainsi

choisi de considérer le rendement d’extraction ainsi que la pureté de l’ADN obtenu mais surtout le

niveau de 8-oxodGuo mesuré par CLHP-DE. Avant d’aborder les différentes méthode d’extraction,

nous allons donc présenter la méthode permettant le dosage de la 8-oxodGuo par CLHP-DE qui est la

technique la plus adaptée à la mesure de cette modification. Nous comparerons ensuite les différentes

techniques d’extraction entre elles.

B. Technique de CLHP-DE : Application à la mesure de la 8-oxodGuo

La méthode la plus utilisée pour la mesure de la 8-oxodGuo est, en raison de sa sensibilité et

de sa facilité de mise en œuvre, la technique décrite par Floyd et al. en 1986 (Figure 28) (156). Elle

est basée sur une analyse par chromatographie liquide haute performance couplée à une détection

électrochimique (CLHP-DE).

1. Présentation de la technique de CLHP-DELa sensibilité de la méthode tient au mode de détection utilisé que nous allons présenter

maintenant.

a) La détection électrochimique

Elle s’adresse à des composés dits électroactifs, i.e. des composés facilement oxydables qui

peuvent perdre un électron sous l’action d’une différence de potentiel appliqué. Le système de

détection est constitué d’une cellule de détection qui contient deux électrodes de graphite permettant

de travailler à deux potentiels d’oxydation différents. Entre chaque électrode et l’électrode de

référence (à base de palladium) est établie une différence de potentiel modulable. Dans notre système

d’analyse, la première électrode possède un potentiel d’oxydation inférieur à celui du composé à

doser. Elle permet d’oxyder toutes les molécules qui ne présentent pas d’intérêt et qui sont

susceptibles de contaminer l’échantillon. Leur signal n’est donc pas recueilli. La détection est assurée

par la deuxième électrode. Son potentiel est suffisamment élevé pour permettre l’arrachement d’un

électron lors du passage du composé d’intérêt dans la cellule. Les électrons ainsi arrachés produisent

un courant qui est amplifié et dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de produit à doser. Pour

séparer les différents constituants cellulaires, cette étape de détection est précédée d’une étape de

purification par chromatographie liquide haute performance (CLHP).

b) Principe de la CLHP-DE

Un système de chromatographie liquide haute performance permet la séparation des composés

(le plus souvent des nucléosides) sur une colonne de silice à polarité de phase inversée en fonction de


leur polarité. Ils pourront être détectés, en sortie de colonne, selon le principe décrit ci-dessus. La

gamme de potentiels redox utilisables pour les bases modifiées de l’ADN se situe entre 200 et 700

mV. De tels potentiels permettent la mesure des nucléosides modifiés sans détecter les nucléosides

normaux dont le potentiel est plus élevé. Les premières mesures de nucléosides modifiés ont concerné

la 8-oxodGuo, au niveau de l’ADN cellulaire (141, 156, 207-209), bactérien (210), ou

mitochondrial (211). Elles ont ensuite été étendues aux dosages de 8-oxodGuo dans les urines (78,

207, 212) ou dans divers tissus (213). Il est possible de mesurer d’autres nucléosides modifiées

comme la 5-hydroxy-2’-désoxycytidine ou la 5-hydroxy-2’-désoxyuridine (214) ou encore la 8-oxo-

7,8-dihydro-2’-désoxyadénosine. Toutefois, le mode de détection électrochimique, s’il est parmi les

plus sensibles (100 femtomoles pour la 8-oxodGuo) nécessite des échantillons de bonne pureté afin

d’éviter tout interférence de pics parasites avec le signal. Il est par exemple possible de mesurer la 5-

hydroxy-2’-désoxycytidine ou la 5-hydroxy-2’-désoxyuridine dans le foie de rats, alors que la mesure

dans l’ADN de cellules en culture n’a pas pu être effectuée.

2. Mesure de la 8-oxodGuoL’ADN extrait est enzymatiquement hydrolysé sous forme de nucléosides, et le mélange

résultant est injecté sur une colonne chromatographique (Figure 28). En sortie de colonne, un

détecteur UV recueille le signal des nucléosides normaux et un détecteur électrochimique, celui de la

8-oxodGuo (Figures 28 et 29).

injection

colonneanalytique

pompe

!!!! dosage de l’ADN

détecteurélectrochimique

!!!! dosage de la 8-oxodGuo

détecteurUV

nucléosides

Extraction de l'ADN

Figure 28 : Principe du dosage de la 8-oxodGuo par CLHP-UV-DE

Une calibration externe rend possible la quantification des signaux provenant des détecteurs

ultra-violet et électrochimique. Les signaux obtenus par le détecteur ultra-violet comportent 4 pics

correspondant aux quatre nucléosides normaux. Dans l’ordre croissant d’élution, on trouve dCyd >

dGuo > dThd > dAdo. Le signal électrochimique, comporte en général, dans le cas d’échantillons


biologiques, de nombreux pics correspondant à la présence de composés électroactifs qui peuvent

interférer avec la détection de la 8-oxodGuo.

8-oxodGuo

0 18 29141250temps post-injection (min) temps post-injection (min)

dThd

dGuo

dCyd

dAdo

détection électrochimique détection ultra-violette

Figure 29 : Profils d’élution chromatographique correspondant respectivement, à la détection de la8-oxodGuo et des nucléosides normaux (280 nm) dans l’ADN de cellules exposées à une dose de 40

Gy de rayonnement gamma du60Co.

Ceci souligne l’importance de la préparation des échantillons. La méthode d’extraction doit

conduire à l’obtention d’ADN suffisamment pur, tout en minimisant les risques d’oxydation

artéfactuelle. La quantité d’ADN contenue dans l’échantillons est déterminée à partir du signal de

dGuo obtenu. On considère pour cela, que dGuo représente 22% du total des bases de l’ADN. Il est

ainsi possible pour chaque échantillon, d’exprimer le nombre de lésions mesurées par rapport à celui

des bases normales. Les taux de 8-oxodGuo sont généralement exprimés en terme de nombre de 8-

oxodGuo pour 105 dGuo ou pour 106 bases.

C. Méthode d’extraction de l’ADN cellulaire utilisant le « kit Qiagen »

La première méthode d’extraction de l‘ADN que nous avons utilisée est la technique

développée par la société Qiagen sous forme d’un « kit » commercial. La méthode repose sur une lyse

des membranes cellulaires qui a lieu en deux temps. Tout d’abord, on effectue une lyse de la

membrane plasmique qui est suivie par celle de la membrane nucléaire. Le contenu nucléaire est

recueilli par centrifugation avant d’être incubé en présence d’une protéase. Le mélange est ensuite

déposé en tête d’une colonne échangeuse d’anions. Après élution, l’ADN purifié est précipité et


hydrolysé. Le protocole d’extraction est relativement long. Le rendement d’extraction est satisfaisant

et l’ADN obtenu est très pur. On obtient une quantité voisine de 100 µg d’ADN pour 10 millions de

cellules. Toutefois sur une série de colonnes utilisées, des différences de vitesse d’élution sont

observées. Celles-ci peuvent être responsables des variations des taux de modification mesurés sur des

échantillons identiques. Le niveau basal de 8-oxodGuo déterminé par cette méthode est d’environ 1

modification/105 dGuo.

D. Méthodes d’extraction de l’ADN cellulaire en phase homogèneL’intérêt d’utiliser des méthodes d’extraction en phase homogène réside dans le fait qu’elles

sont généralement plus rapides. De plus, l’ADN est maintenu dans un milieu aqueux pendant le

protocole d’extraction. Elles évitent l’utilisation de colonnes susceptibles de favoriser l’oxydation de

l’ADN.

1. Méthode au phénol/chloroformeNous n’avons pas utilisé cette méthode qui est pourtant parmi une des plus anciennes. Ses

principales caractéristiques seront abordées dans la discussion des résultats de ce chapitre.

2. Méthodes au NaCl ou chaotropique au NaI

a) Principe des deux méthodes d’extraction

Nous avons comparé deux techniques d’extraction de l’ADN cellulaire qui sont la méthode au

NaCl et l’approche chaotropique au NaI (Figure 30). Cette dernière, plus récente, se différencie, par

une lyse des cellules en deux étapes, par des quantités d’enzymes réduites, par des temps d’incubation

optimisés, par une précipitation de l’ADN au NaI, et enfin par l’utilisation d’un chélateur du fer, la

déféroxamine, dans tous les tampons utilisés. C’est aussi la plus rapide et elle permet l’extraction de

l’ADN d’une cinquantaine d’échantillons en 4 à 5 h. L’ADN extrait est hydrolysé sous forme de

nucléosides à l’aide du couple d’enzymes, nucléase P1-phosphatase acide ou alcaline.


Lyse de la membrane plasmique

Lyse de la membrane nucléaire

monocyte

Traitements protéase + RNase

Précipitation de l'ADN au NaI

(8-oxodGuo)

nucléase P1 phosphatase alcaline

Lyse des membranesplasmique et nucléaire

ARNADN ARNADN

Traitement à la protéasePrécipitation de l'ADN au NaCl

Traitement RNase

Hydrolyse enzymatique

monocyte

noyau

(8-oxodGMP)

NH

NN

N

O

ONH2O

OH

OPOH

OHO

HNH

NN

N

O

ONH2O

OH

HO

H

Figure 30 : Procédures de la méthode d’extraction au NaCl et au NaI

b) Hydrolyse enzymatique nucléase P1-phosphatase acide

Une hydrolyse enzymatique de l’ADN précipité a été effectuée à l’aide du couple d’enzymes

nucléase P1-phosphatase acide comme une alternative au couple d’enzymes nucléase P1-phosphatase

alcaline, plus classiquement utilisé. Les deux enzymes montrent une activité optimale à la même

valeur de pH. Il était possible de les associer au cours de l’hydrolyse, et de réduire ainsi la durée de

cette étape afin de limiter les sources possibles d’oxydation. Il était cependant nécessaire de s’assurer

au préalable que la 8-oxodGMP était un bon substrat de la phosphatase acide (Figure 31). Les

résultats présentés dans la Figure 31 indiquent qu’une hydrolyse en présence du mélange des deux

enzymes permet une libération totale de la 8-oxodGuo en 90 min. Il est par ailleurs important de

signaler que la présence de 8-oxodGuo dans l’ADN n’inhibe pas l’activité de la nucléase P1.


0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Temps d’incubation (h)

Phosphatase alcaline

8-oxodGuo/105 bases

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30 35 40

8-oxodGuo/105 bases

Nucléase P1- Phosphatase acide


a)

b)

Figure 31 : Cinétiques d’hydrolyse de l’ADN commercial isolé de thymus de veau par a) :Phosphatase alcaline (précédée d’une hydrolyse par la nucléase P1 pendant 90 min) ; b) : Nucléase

P1-phosphatase acide

c) Résultats : Mesure de la 8-oxodGuo dans l’ADN de monocytes

exposés au rayonnement γγγγ du 60Co

Afin de comparer les deux méthodes d’extraction, le niveau de 8-oxodGuo a été mesuré dans

l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma pour des doses comprises entre 0 et 600 Gy ou

0 et 100 Gy, selon l’étude. Les Figures 32 et 33 portent, en ordonnée, le nombre de 8-oxodGuo par

million de bases normales, et en abscisse la dose de rayonnement délivrée (en Gy). Dans le cas de la

méthode au NaCl, un niveau basal de 1,76 8-oxodGuo/106 bases est mesuré. Le taux de formation

déterminé en utilisant une droite de régression linéaire est de 0,022 8-oxodGuo/106 bases/Gy. Pour

mesurer un taux de formation significativement différent du bruit de fond, une dose de 100 Gy est

nécessaire !


8-oxodGuo/10 bases

600

10

15

20

y = 0,022 x + 1,76

0

5

0 200 400

Dose (Gy)

6

Figure 32 : Formation de la 8-oxodGuo déterminée par CLHP-DE dans l’ADN de monocytes exposésau rayonnement gamma du 60Co (méthode au NaCl)

y = 0,011x + 0,20

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80Dose (Gy)

8-oxodGuo/106 bases

Figure 33 : Formation de la 8-oxodGuo déterminée par CLHP-DE dans l’ADN de monocytes exposésau rayonnement gamma du 60Co (méthode au NaI, après soustraction du niveau basal égal à 0,2

lésion/106 bases)

En utilisant la méthode au NaI (Figure 33), le niveau basal n’est plus que de 0,2 8-

oxodGuo/106 bases, soit une réduction par un facteur 9 du taux déterminé par la méthode au NaCl.

Cette valeur basale a été soustraite aux taux mesurés ce qui explique la valeur nulle de l’ordonnée à

l’origine portée dans la Figure 33. Le niveau de formation est établi en utilisant une droite de

régression linéaire de pente 0,011 8-oxodGuo/106 bases/Gy. Une dose de 35 Gy permet d’obtenir un

taux de formation significativement différent du niveau basal. Cette réduction du niveau basal

s’accompagne d’une diminution de la gamme de doses (entre 0 et 80 Gy) pour obtenir une courbe

dose-réponse significative. En utilisant la méthode au NaI sur des cellules exposées à des doses de

rayonnement comprises, cette fois-ci, entre 0 et 600 Gy, le taux de formation est de 0,015 8-


oxodGuo/106 bases/ Gy. Ceci suggère que l’oxydation artéfactuelle est d’autant plus importante que la

dose d’irradiation est élevée. Une des hypothèses pour expliquer la différence de pente observée entre

les deux méthodes pourrait être la libération de fer induite par l’irradiation. Cette libération conduirait

à la formation d'espèces réactives de l’oxygène via la réaction de Fenton.

d) Conclusion

La méthode chaotropique d’extraction au NaI apparaît être particulièrement intéressante.

Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la diminution du niveau de 8-oxodGuo. Il

peut s’agir d’une interférence du NaI avec la détection électrochimique de 8-oxodGuo, ou encore de

l’extraction préférentielle des nucléosides normaux. Toutefois, des expériences contrôle ont été

effectuées de façon à écarter la première hypothèse. Pour cela des échantillons d’ADN cellulaire ont

été enrichis par 100 fmoles de 8-oxodGuo. Une calibration externe a permis de s’assurer que la

quantité ajoutée était bien détectée dans sa totalité. Par ailleurs, l’obtention d’une courbe réponse

similaire à celle obtenue par la méthode au NaCl, suggère que la diminution du niveau de 8-oxodGuo

n’est pas liée à l’extraction préférentielle des nucléosides normaux. L’hypothèse la plus vraisemblable

est que la méthode utilisée réduise les phénomènes artéfactuels d’oxydation (réduction d’un facteur

9). Tout en étant plus rapide, elle permet des analyses dans des gammes de doses plus faibles. Nous

l’avons utilisée, préalablement à toutes les mesures chromatographiques présentées dans la suite de

cet exposé.

III. UTILISATION DE LA TECHNIQUE DE CG-SM

A. Principe de la technique de CG-SML’utilisation de la spectrométrie de masse (SM) a permis dans les quinze dernières années, la

mesure de nombreuses lésions de l’ADN. C’est aujourd’hui la principale technique de détection des

dommages de bases de l’ADN. Couplée à la chromatographie gazeuse, la méthode (CG-SM) est

susceptible après optimisation de permettre la détermination du niveau basal, du taux de formation

ainsi que des cinétiques de réparation des bases modifiées dans un échantillon d’ADN. Plusieurs de

ces lésions ont été produites par irradiation gamma (153, 155, 215-220), ou par des systèmes

biochimiques de type xanthine oxydase/hypoxanthine (221). Nous verrons ultérieurement que

l’application de la version initiale de cette méthode a conduit à l’obtention de résultats dont la plupart

doivent être en fait reconsidérés.

1. Rappel sur la détection par spectrométrie de masseLa spectrométrie de masse (SM) permet la détermination des masses de fragments, après

ionisation de la molécule. Ainsi, des informations sur la nature et la structure de ces molécules sont

recueillies. Elle fait intervenir l’ionisation du composé à analyser afin de soumettre les espèces

chargées ainsi obtenues, à un champ électrique ou magnétique. Chaque ion produit est sélectionné en


fonction de son rapport masse/charge et apparaît dans le spectre de masse. Ce mode de détection est

particulièrement spécifique et permet la détection de nombreuses bases modifiées de l’ADN.

2. Principe de la CG-SM : Conditions opératoiresLa méthode n’est applicable qu’aux bases ou nucléosides thermostables après une étape de

dérivation. Les mesures effectuées dans l’ADN cellulaire nécessitent au préalable une étape

d’extraction de l’ADN cellulaire.

a) Hydrolyse de l’ADN

Une hydrolyse enzymatique (nucléase P1/phosphatase alcaline et/ou acide) est effectuée de

façon à libérer les nucléosides ou les bases. Certains nucléosides peuvent être directement analysés,

après une étape de dérivation (222, 223). Toutefois, une hydrolyse acide qui conduit à la libération

des lésions sous forme de bases est communément utilisée (Figure 34).

extraction de l'ADN

base

hydrolyse acide

quantificationbase silylée

dérivation analyse CG-SM

ADN

Figure 34 : Principe de la préparation des échantillons avant mesure par CG-SM

L’hydrolyse acide induit la rupture de la liaison N-glycosidique. De ce fait, les composés

doivent être stables en milieu acide dans les conditions de l’hydrolyse. C'est le cas de la 8-oxo-7,8-

dihydroguanine et de la 8-oxo-7,8-dihydroadénine (219, 224, 225). Par contre, d’autres bases

modifiées, comme les dérivés Fapy purines, sont instables et se recyclisent (226). Les cytosines

oxydées présentant une liaison 5,6 saturée peuvent subir une désamination qui conduit à la formation

d’analogues de l’uracile (227). L’importance de la dégradation de certains composés dépend de la

nature de l’acide (formique le plus souvent), de la durée d’hydrolyse (30 à 45 min) de la température

(140°C) (224). Une hydrolyse à température ambiante convient à peu près à tous les composés (219,

228). Mais, il reste à établir que la libération de la base modifiée de la chaîne d’ADN est quantitative

dans ces conditions.

b) Etape de dérivation

Une fois l’hydrolyse effectuée, les composés doivent être dérivés afin de les rendre volatils.

C’est une des étapes critiques de la préparation de l’échantillon (Cf. Chapitre III). Les principales

méthodes de dérivation impliquent la silylation des fonctions alcools, amines et énoles des bases par

des groupements triméthylsilyles (Figure 35) (229, 230).


N

N N

N

H2N

O

O

H

HH

8-oxo-7,8-dihydroguanine

N

N N

N

HN

O

O

dérivé silylé de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine

Si(CH3)3

Si(CH3)3Si(CH3)3

Si(CH3)3

Figure 35 : Silylation de la 8-oxoGua en présence de BSTFA

Des agents de dérivation peuvent être utilisés comme le N-tertbutyldiméthylsilyl-N-méthyl-

trifluoroacétamide (MTBDSTFA) ou le N-bis(triméthyl-silyle)trifluoroacétamide (BSTFA) (Figure

35). La dérivation requiert un chauffage pendant une durée de 20 à 30 min à 130°C.

c) Analyses par CG-SM

Les composés rendus volatils sont injectés sur une colonne capillaire de silice (revêtue d’un

film de méthylsiloxane substitué par 5% de phénylméthylsiloxane) parcourue par de l’hélium. Le port

d’injection et l’interface CG-SM sont respectivement maintenus à 250°C et 290°C (Figure 36). Le

décrochage des composés s’effectue par une augmentation de la température de la colonne en utilisant

un gradient. Les composés sont ainsi libérés en fonction du temps et détectés en sortie de colonne par

un spectromètre de masse. L’ionisation est généralement effectuée par impact électronique avec un

mode de détection de type SIM (« Single Ion Monitoring »). Le mode SIM par opposition au mode

SCAN (qui permet de visualiser tous les ions issus de la fragmentation de l’ion parent) est beaucoup

plus sensible.

e-

M(SiCH3)X

M(S

iCH

3) x

gradient de température

température

min

colonne capillaire

[M (SiCH 3 )x

quadripôle

spectromètre de masse

chromatographie gazeuse

source d'ionisation

analyseur

injection

He ]+

Figure 36 : Principe de l’analyse par CG-SM


Les ions majoritaires détectés (pour les dérivés triméthylsilyles) sont d’une part l’ion parent

(M)+° et l’ion (M-15)+° correspondant à la perte d’un groupement méthyle. L’ajout le plus tôt

possible, de standards internes isotopiquement enrichis (Cf. sous-paragraphe III-B-3)-b)) à la solution

à analyser permet de rendre la mesure quantitative. Toutefois de faibles volumes sont injectés (de 1 à

2 µl). Il en résulte que la plus grande partie de l’échantillon (98%) est perdue pour le dosage limitant

la sensibilité de la méthode. Il a été proposé que la méthode CG-SM soit susceptible de mesurer dans

l’ADN de cellules irradiées au 60Co diverses lésions : diols de thymine (Tg), diols de cytosine, 5,6-

dihydrothymine, 5,6-dihydroxy-5,6-dihydrouracile, 5,6-dihydrocytosine, 5-hydroxy-5,6-

dihydrothymine, 5-hydroxy-5,6-dihydrocytosine, 5-hydroxy-5,6-dihydrouracile (5-OHUra), 5-

hydroxy-5,6-dihydrocytosine (5-OHCyt), 5-hydroxy-5-méthylhydantoïne (5-OH-5-Me-Hyd), 5-

hydroxyhdantoïne, 5-hydroxyméthyluracile (5-HmUra), 2,6-diamino-4-hydroxy-5-

formamidopyrimidine (FapyGua), 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine (FapyAde), 8-oxo-7,8-

dihydroadénine (8-oxoAde), 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) et la 2-hydroxyadénine (2-

OHAde) (37, 153, 154, 217-219, 225, 231-239).

B. Mesure des dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine

1. Procédure suivieLa méthode de CG-SM a été appliquée à la mesure de la FapyGua et de la FapyAde. Le

protocole optimisé que nous avons défini est représenté dans la Figure 37.

L’ADN cellulaire est préalablement extrait, selon la méthode chaotropique au NaI, et

hydrolysé sous forme de nucléotides. Des standards internes isotopiquement enrichis [M+3] sont

ajoutés de manière à rendre l’analyse quantitative (méthode de dilution isotopique). Une hydrolyse

acide est ensuite effectuée. Elle est suivie d’une étape de prépurification par CLHP qui permet

d’éliminer les sels présents dans les échantillons qui sont apportés par les tampons enzymatiques. Un

deuxième avantage de la séparation par CLHP est une meilleure pureté de l’échantillon pour l’analyse

ultérieure par CG-SM. Une étape de lyophilisation permet d’éliminer les sels de formiate qui ont été

introduits dans les échantillons lors de l’étape de prépurification. Les échantillons sont ensuite dérivés

à 120°C en présence de BSTFA avant d’être injectés sur le système CG-SM.


prépurification par CLHP

FapyGua et FapyAde

extraction de l’ADN (méthode NaI)

monocyte

ADN

hydrolyse enzymatique (nucléase P1)

hydrolyse acide (acide formique)

ajout de standards internes

Quantification de l’ADN par CLHP-UV

Quantification de FapyGua et FapyAde par CG-SM

Analyse

O

OH

OPOH

OHNH2

H

O

ON

HN N

NH

O

H

FapyGua FapyAde

H

O N

H2N N

N

NH2H

+ nucléotides normauxH

O N

H2N N

NH

O

NH2

H

dérivation

Figure 37 : Principe de la mesure de la FapyGua et de la FapyAde par CLHP/CG-SM


2. Ions caractéristiquesLa silylation de la FapyGua et de la FapyAde à l’aide du BSTFA conduit respectivement à la

fixation de quatre et trois groupements TMS sur la molécule mère (Figure 38).

HN

N

NNH2

NH2

OH

HH

N

N

N

H2N

O

NH2

O

H

N

N

NNH

NH

OH

3)Si(CH 3

)Si(CH 3

)Si(CH 3

HN

N

N

NH

O

NH

OH

3)Si(CH 3

3)Si(CH 3

3)Si(CH 33)Si(CH 3

BSTFA (120°C, 20 min.)

BSTFA (120°C, 20 min.)

FapyGua

FapyAde

Figure 38 : Dérivés silylés de la FapyGua et de la FapyAde

Les ions caractéristiques détectés par spectrométrie de masse, en mode d’ionisation par impact

électronique, correspondent, comme nous l’avons mentionné, aux molécules silylées présentées ci-

dessus, mais aussi aux molécules mères substituées ayant perdu un groupement méthyle (M - 15)

(Tableau VIII).

Tableau VIII: Ions caractéristiques de la FapyGua et de la FapyAde

Molécule mère Molécule dérivée Ions caractéristiques

Masse Masse Masse Masse - 15

FapyGua 169 457 457 442

[M+3] FapyGua 172 460 460 445

FapyAde 153 369 369 354

[M+3] FapyAde 156 372 372 357

3. Standards internes et calibration

a) Standards internes

Il s’agit de molécules identiques aux bases modifiés que l’on veut mesurer, mais possédant

dans leur structure des isotopes lourds, tels que 13C, 15N ou 18O. La molécule ainsi obtenue par

synthèse, possède le même comportement chromatographique et chimique que la base modifiée.

Toutefois, en raison de sa masse légèrement supérieure de 3 ou 4 uma, elle pourra être différenciée de

la molécule normale lors de l’étape de détection par spectrométrie de masse (Tableau IX). Avant

l’analyse, une quantité définie de standard interne est ajoutée à chaque échantillon. Ceci permet de


déterminer le rapport entre le produit et le standard interne lors de l’analyse CG-SM. En utilisant une

courbe de calibration, il est alors possible de calculer la quantité de la lésion étudiée. Le standard de

[M+3] FapyGua a été synthétisé selon le protocole décrit par Douki et al. (226). La [M+3] FapyAde a

été fournie par le Professeur H.E. Poulsen (Université de Copenhague, Copenhague, Danemark).

Tableau IX : Position et nature des isotopes incorporés dans les molécules de standards internes

Lésions Standards isotopiques internes

FapyGua [2,6-diamino,5-formamido-15N3]FapyGua

FapyAde [4,6-diamino-15N2, 5-formamido-13C]FapyAde

b) Droites de calibration

Afin de s’assurer de la linéarité de la réponse du système de détection en fonction de la

quantité de produit, une droite de calibration a été établie. Elle permet de démontrer l’existence d’une

corrélation linéaire entre le rapport des aires du produit normal (A1) à mesurer et du produit enrichi

isotopiquement (A2) et le rapport de leurs concentrations respectives (C1 et C2). Une valeur proche de

1 de la pente de la droite de la calibration, permet de s’assurer qu’à concentration égale, le produit

isotopiquement enrichi et le produit non enrichi donnent le même signal. La valeur nulle de

l’ordonnée à l’origine permet de s’assurer que la contribution isotopique du produit normal dans le

produit isotopiquement enrichi est nulle (Figures 39 et 40).

3,5y = 1,165 x

R2 = 0,9999

0,00,51,01,52,02,53,0

0 0,5 1 1,5 2

Rapport des aires A1/A2

Rapport des concentrations C1/C2

Figure 39 : Courbe de calibration de la FapyGua obtenue par CG-SM


y = 0,8578 x + 0,0086

R2 = 0,9998

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

0 0,5 1 1,5 2



Figure 40 : Courbe de calibration de la FapyAde obtenue par CG-SM

4. Exemples de profils d’élution chromatographiquePour chaque échantillon, quatre profils d’élution chromatographique correspondant aux ions

caractéristiques mentionnés précédemment sont obtenus. On porte en ordonnée l’abondance de l’ion,

et en abscisse le temps d’élution en minutes (Figure 41).

6.60 6.70 6.80 6.90 7.00 7.10 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90

0

Ion 460.30 (460.00 to 461.00): 05049903.D

20000

Abondance

6.60 6.70 6.80 6.90 7.00 7.10 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90

0 Temps (min.)

Ion 457.30 (457.00 to 458.00): 05049903.D500

Abondance

Fapy Gua

[ M+3 ] Fapy Gua

Temps (min.)

Figure 41 : Profil d’élution correspondant à la détection de la FapyGua par CG-SM (monocytesexposés à une dose de 500 Gy)


IV. UTILISATION DE LA TECHNIQUE DE CLHP-SM/SM

A. Principe de la technique de CLHP-SM/SMLa technique de chromatographie liquide haute performance couplée à la détection par

spectrométrie de masse en mode tandem (CLHP-SM/SM) est la méthode d’analyse proposée le plus

récemment. Pratiquement, les échantillons sont séparés sur une colonne chromatographique par une

phase mobile liquide avant d’arriver dans la source d’ionisation. L’ionisation peut s’effectuer à

pression atmosphérique (API) par « électrospray » ou par ionisation chimique à pression

atmosphérique (APCI). Dans le mode « électrospray », les ions sont produits par nébulisation de

l’échantillon au sein d’un champ électrique élevé.

quadripôle 1 cellule de collision quadripôle 3 analyseur

lentilles 1-3 lentilles 4-6 lentilles 7-9

échantillon

sélection de l'ion parent

dissociation de l'ion parent

sélection de l'ion fils

+

- -

+

Figure 42 : Spectrométrie de masse en mode tandem (240)

L’ionisation peut s’effectuer avec création d’ions positifs (+ H+) ou négatifs. La détection est

effectuée en mode SIM ou en mode tandem (« Multiple Reaction Monitoring »). Dans ce dernier cas,

trois quadripôles sont disposés en série (Figure 42). Le premier permet de sélectionner un ion parent

qui sera ensuite fragmenté dans le deuxième quadripôle encore appelé cellule de collision. L’ion

caractéristique issu de cette fragmentation est ensuite sélectionné dans le troisième quadripôle avant

d’être détecté. En raison de l’accessibilité très récente de la technique CLHP-SM/SM, on note une

absence quasi totale d’applications à la mesure des dommages dans l’ADN cellulaire (241).

Toutefois, on note quelques études sur l’action de xénobiotiques sur l’ADN isolé (242, 243). Ce

mode d’analyse est particulièrement adapté à la détection des composés thermolabiles (244) et ouvre

de nouvelles perspectives. Un champ d’application intéressant est celui des études mécanistiques. On

peut ajouter que cette méthode devrait apporter un gain de sensibilité. par rapport aux autres

techniques de mesure.


La méthode de chromatographie liquide associée à un mode de détection par spectrométrie de

masse en mode tandem, a été utilisée dans ce travail pour mesurer plusieurs bases modifiées dans un

même échantillon d’ADN cellulaire. Le mode d’ionisation de notre système CLHP-SM/SM est le

mode « électrospray » qui permet d’ioniser les bases modifiées par protonation (en mode positif) ou

par perte d’un proton (en mode négatif). Les composés ainsi ionisés sont ensuite fragmentés dans une

cellule de collision et donnent des ions fils qui seront filtrés et finalement détectés. La mesure d’un

produit en mode MRM, qui apporte une très grande sensibilité de détection, porte sur une transition

caractéristique. Ainsi, seuls les ions fils possédant une valeur m/z donnée et issus d’un ion

pseudomoléculaire de valeur m/z donnée seront détectés . La quantification de l’ions fils détecté sera

effectuée par calibration interne ou externe. La possession des bases et nucléosides modifiés ainsi que

des dérivés correspondants enrichis isotopiquement facilite la mise au point et l’optimisation des

méthodes d’analyse CLHP-SM/SM.

B. Mesure des dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine parCLHP-SM/SM

1. Spectres de masse et transitions caractéristiques de la FapyGua et dela FapyAde

La technique de CLHP-SM/SM a permis d’accéder à la mesure de la FapyAde et de la

FapyGua dans l’ADN cellulaire exposé au rayonnement du 60Co. L’ion pseudomoléculaire est obtenu

par protonation des dérivés Fapy purines (mode positif [M+H]+) (Figure 43).

a) Spectres de masse

+Product (154) MCA (15 scans) : de FapyAde en mode SM/SM126.2

136.1

154.0

60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160m/z, amu

1.0e6

2.0e6

3.0e6

4.0e6

5.0e6

6.0e6

7.0e6

Inte

nsity

, cps

m/z, amu

+Product (170) MCA (15 scans) : de FapyGua en mode SM/SM142.1

151.9

170.2

70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

Inte

nsity

, cps

- 28

[M]

[M-18]

[M-28][M-28]

[M-18]

[M]

HN

NH2N

CN

NH2O

H*

*

*HNH

NH2N

CN

O

OH

NH2*

*

*

- 28

Figure 43 : Spectres de masse issus de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la FapyGua etde la FapyAde obtenus par CLHP-SM/SM (mode positif)

Les isotopes incorporés sont signalés par une astérisque.

b) Transitions caractéristiques

A partir des spectres de masse établis précédemment (Figure 43), les transitions suivantes ont

été choisies pour mesurer les dérivés Fapy des bases puriques en mode MRM (Tableau X).


Tableau X : Transitions de détection

Bases modifiées Masse molaire Mode d’ionisation Transitions

FapyGua 169 positif 170 → 142

FapyAde 153 positif 154 → 126

[M+3] FapyGua 172 positif 173 → 145

[M+3] FapyAde 156 positif 157 → 128

La transition caractéristique utilisée pour le dosage de la FapyAde est la transition issue de la

fragmentation de l’ion pseudomoléculaire m/z = 154 en l’ion fils m/z = 126. On utilise la transition

m/z = 170 → m/z = 142 pour la FapyGua (Tableau X). Les deux transitions correspondent à la perte,

par l'ion pseudomoléculaire, d’un groupement carbonyle après perte du groupement formyle et

transfert d’un atome d’hydrogène. Les ions de masse 152 et 136 correspondent à la perte d’une

molécule d’eau.

2. Exemples de profils d’élution chromatographiqueLa Figure 44 représente les signaux des dérivés Fapy purines obtenus à partir d’ADN extrait

de monocytes exposés à 500 Gy (60Co). Les pics de standards internes [M+3] correspondent à une

injection de 100 pmoles.

XIC of +MRM (2 pairs): Period 1, for 157.0 / 128.0 amu from 500 GY ECH 3A

0.10 0.88 1.25

2.86

1.0 2.0 3.0Time, min

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

Inte

nsity

, cps

2.96e5 cps

XIC of +MRM (2 pairs): Period 2, for 173.0 / 145.0 amu from 500 GY ECH 3

4 5 6 7 8 9Time, min

10000

12000

14000

Inte

nsity

, cps

5.85

2000

4000

6000

8000

[M+3] FapyGua

FapyGua

[M+3] FapyAde

FapyAde

Figure 44 : Exemple de profils d’élution correspondant à la mesure par CLHP-SM/SM, de dérivésFapy purines dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement γ du 60Co (500 Gy)

3. Niveau basal de FapyGua dans l’ADN cellulaire : Influence de ladéféroxamine

La sensibilité de la technique de CG-SM pour la mesure des dérivés Fapy purines est de

l’ordre de 2 à 3 modifications pour 106 bases. On peut noter que cette sensibilité est trop faible pour

les mesures dans l’ADN de cellules contrôle malgré l’utilisation d’une étape de prépurification par

CLHP. La technique de CLHP-SM/SM s’est avérée être beaucoup plus sensible, et permet en

particulier la mesure de la FapyAde, dans l’ADN cellulaire contrôle. Afin d’accroître la sensibilité de


détection de la FapyGua par cette méthode, nous avons apporté des modifications à la méthodologie.

Les volumes des tampons enzymatiques ont ainsi été réduits, ce qui a permis d’éliminer une partie des

composés ou sels susceptibles d’affecter la détection. De plus, nous avons observé que l’élimination

de la déféroxamine du tampon d’hydrolyse de la nucléase P1 s’accompagnait d’une augmentation

sensible du taux des deux dérivés Fapy purines, aussi bien dans les cellules témoin, que dans les

cellules exposées au rayonnement gamma du 60Co, à des doses comprises entre 250 et 500 Gy (Figure

45).

0

1

2

3

4

0 250 350 500

déf (-)

déf (+)

FapyAde/10 6 bases

Dose (Gy)

Figure 45 : Influence de la déféroxamine (déf) sur le niveau de FapyAde mesuré par CLHP-SM/SM(cellules témoin et irradiées entre 250 et 500 Gy)

Ce résultat suggère que la déféroxamine, en piégeant Fe2+ empêche la formation de °OH et par

là même, la formation du radical neutre réducteur précurseur de la FapyGua et de la 8-oxodGuo.

C. Mesure simultanée des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd , dela 5-FordUrd, de la 5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de la dGuo

Il est apparu intéressant d’étendre la méthode de CLHP-SM/SM à la mesure d’autres lésions.

Nous nous sommes intéressés plus particulièrement à la mesure des diols de thymidine, de la 5-

hydroxyméthyl-2’-désoxyuridine (5-HmdUrd), de la 5-hydroxy-2’-désoxyuridine (5-OHdUrd), de la

5-formyl-2’-désoxyuridine (5-FordUrd), de la 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyadénosine (8-oxodAdo), de

la 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyguanosine (8-oxodGuo) et enfin de la 2’-désoxyguanosine (dGuo).


La mesure de la dGuo devait nous permettre d’estimer la quantité d’ADN présente dans chaque

échantillon.

1. Spectres de masseNous avons déterminé le spectre de masse issu de l’ion pseudomoléculaire de chacun des

nucléosides modifiés ainsi que celui de la dGuo. Il a été observé que le mode positif est plus adapté

aux molécules possédant des amines exocycliques, comme la 8-oxodGuo, la 8-oxodAdo et la dGuo.

Pour les autres nucléosides modifiés, le mode négatif est plus approprié. La comparaison avec les

spectres des produits marqués facilite la détermination des voies de fragmentation (la position des

isotopes incorporés est signalée par une astérisque).

+Product (284) MCA (10 «scans») : de 8-oxodGuo en mode SM/SM

99.1 117.2

168.1

284.0

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

m/z, amu

5e6

Inte

nsity

, cps [M-116]

[M]-116

OH

HOO

O

NH

NN

N

NH2O

H

**

*

**

Figure 46 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 8-oxodGuo

La fragmentation de l’ion parent de la 8-oxodGuo m/z = 284 donne l'ion fils m/z = 168

correspondant à la perte du 2-désoxyribose (Figure 46).

+Product (268) : 0.19 min (10 «scans») de 8-oxodAdo en mode SM/SM

152.1

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z, amu

1.0e5

Inte

nsity

, cps

5.0e4

[M-116]N

NO

HO

OH

N

N

NH2

O

- 116

*

H

*

*

*

*

Figure 47 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 8-oxodAdo


La fragmentation de l’ion parent m/z = 268 de la 8-oxodAdo, donne l’ion fils majoritaire m/z

= 152 correspondant à la perte du 2-désoxyribose (Figure 47).

–Product (274) MCA (25 «scans») : des diols de thymidine en mode SM/SM

m/z, amu

116.0

274.8

2.5e4

5.0e4

Inte

nsity

, cps

60 80 100 120 140 160 200 220 240 260 280180

[M-159]

[M]

OHO

OH

OH

OHH

CH3

O

O N

HN

- 43

- 116

**

*

Figure 48 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire des diols dethymidine

L’ion pseudomoléculaire m/z = 275 des diols de thymidine se fragmente en donnant l’ion fils

majoritaire m/z = 116 correspondant à la perte du groupement NHCO et du 2-désoxyribose (Figure

48).

–Product (243) MCA (10 «scans»): de 5-OHdUrd en mode SM/SM neg

1.21e6 cps

110.0

127.0

152.8

243.0

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240

m/z, amu

5e5

Inte

nsity

, cps O

O

N

N

OH

OHO

OH-90

*

*

*

[M]

[M-90]

[M-116]

Figure 49 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 5-OHdUrd

La fragmentation de l’ion pseudomoléculaire m/z = 243 de la 5-OHdUrd donne l’ion fils

majoritaire m/z = 153 correspondant à la perte d’un fragment de 2-désoxyribose (Figure 49).


m/z, amu

–Product (257) MCA (5 «scans») : de 5HmdUrd en mode SM/SM neg

109.9

124.0

141.1 166.0188.5

214.0

225.4

256.9

120 140 160 180 200 220 240 260 280

5.0e5

1.0e6

Inte

nsity

, cps

**N

N

O

O

HCH2OH

OHO

OH

- 43

- 90

*

[M]

[M-133]

Figure 50 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 5-HmdUrd

La fragmentation de l’ion pseudomoléculaire (m/z = 257) de la 5-HmdUrd donne l’ion fils

majoritaire m/z = 124 correspondant à la perte du fragment du 2-désoxyribose et du groupement

NHCO (Figure 50).

m/z, amu

139.9 166.0

211.9

255.1

120 140 160 180 200 220 240 260 280

5e6

Inte

nsity

, cps

–Product (255) MCA (10 «scans») : de 5-FordUrd en mode SM/SM neg

*NCHO

NO

O

OHO

OH

- 43

**

[M]

[M-43]

Figure 51 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 5-FordUrd

La fragmentation de l’ion parent m/z = 255 de la 5-FordUrd donne l'ion fils majoritaire m/z =

212 correspondant à la perte du groupement NHCO (Figure 51).

+Product (268) MCA (10 «scans») : de dGuo en mode SM/SM

139.0

151.9

188.2246.1

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z, amu

2.0e6

6.0e6

1.0e7

1.4e7

2.2e7

1.8e7

Inte

nsity

, cps

[M]

[M-116]

OH

HOO

O

NH

NN

N

NH2

- 116

Figure 52 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la dGuo

La fragmentation de l’ion pseudomoléculaire m/z = 268 de la dGuo donne l'ion fils m/z = 152

correspondant à la perte du 2-désoxyribose (Figure 52).


2. Transitions caractéristiquesA partir des spectres de masse établis précédemment, les transitions suivantes ont été choisies

pour mesurer les nucléosides modifiés et la dGuo (Tableau XI).

Tableau XI : Transitions de détection

Bases modifiées Masse molaire Mode d’ionisation Transitions

Diols de thymidine 276 négatif 275→116

5-OHdUrd 244 négatif 243→153

5-HmdUrd 258 négatif 257→124

5-FordUrd 256 négatif 255→212

dGuo 267 positif 268→152

8-OxodGuo 283 positif 284→168

8-OxodAdo 267 positif 268→152

3. Hydrolyse enzymatique de l’ADNAvant d’effectuer la mesure de ces lésions dans l’ADN cellulaire, il était nécessaire de

s’assurer que les enzymes d’hydrolyse de l’ADN habituellement utilisées, la nucléase P1 et la

phosphatase acide, permettaient d’obtenir une hydrolyse totale de l’ADN en nucléosides. Pour cela,

de l’ADN isolé de thymus de veau, exposé à une dose de rayonnement de 40 Gy, a été incubé en

présence des deux enzymes pour des périodes de temps croissantes. Les résultats sont rapportés dans

la Figure 53.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 3 6 9 12 15 18 21 24

pmoles/échantillon

5-OHdUrd 5-HmdUrd 5-FordUrd 8-oxodGuo 8-oxodAdo diols de thymidine


Figure 53 : Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par la nucléase P1 associée à la phosphatase acide


Les résultats montrent que les niveaux de 8-oxodGuo, de 5-HmdUrd, de 8-oxodAdo, de 5-

OHdUrd et de 5-FordUrd ainsi libérées tendent vers un plateau. Toutefois, même pour un temps

d’incubation de 24 h, l’hydrolyse des diols de thymidine n’apparaît pas être totale.

Une nouvelle approche basée sur l’utilisation d’exonucléases a été adoptée. Une première

phosphodiestérase extraite de rate de veau (PRV) a été utilisée pour hydrolyser l’ADN en nucléosides

3’-monophosphate. L’efficacité d’une autre phosphodiestérase, extraite de venin de serpent (PVS) à

obtenir des nucléosides 5’-monophosphate a été déterminée. La PRV a été utilisée conjointement à la

nucléase P1 (compatibilité des tampons enzymatiques). Cette dernière en coupant l’ADN en courts

fragments, facilite l’action de la phosphodiestérase. La phosphatase alcaline est associée à la PVS

(compatibilité des tampons enzymatiques) pour achever l’hydrolyse de l’ADN sous forme de

nucléosides. Des expériences ont été effectuées afin de déterminer les temps d’incubation nécessaires

à PRV et PVS pour permettre une libération totale de toutes les bases normales et modifiées de

l’ADN. A cette fin, des échantillons d’ADN isolé de thymus de veau, et exposés à une dose de 40 Gy

de 60Co, ont été incubés à 37°C, en présence de PRV (associée à la nucléase P1), pour des durées

comprises entre 30 min et 24 h. L’enzyme PVS (associée à la phosphatase alcaline) a ensuite été

ajoutée à chaque échantillon, et les solutions ont été incubées à 37 °C pendant 5 h. Les résultats

obtenus sont rapportés dans la Figure 54. Ils montrent qu’une incubation en présence de PRV pendant

2 h, à 37°C des échantillons, est suffisante, quelle que soit la base modifiée étudiée, pour obtenir une

hydrolyse totale.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 5 10 15 20 25

5-OHdUrd 5-HmdUrd 5-FordUrd 8-oxodGuo 8-oxodAdo diols de thymidine


pmoles/échantillon

Figure 54 : Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par l’exonucléase PRV (complétée par une hydrolyse enprésence de l’exonucléase PVS pendant 5 h)


Il était ensuite nécessaire de déterminer la durée d’incubation nécessaire à PVS, pour

hydrolyser totalement l’ADN. Pour cela, tous les échantillons ont été incubés en présence de PRV

(associée à la nucléase P1) à 37°C, pendant 2 h, et ont ensuite été soumis à l’action de PVS (associée

à la phosphatase alcaline) à 37 °C, pour des durées croissantes. Les résultats obtenus sont rapportés

dans la Figure 55. Ils indiquent qu’une incubation de l’ADN, pendant 2 h en présence de PVS,

consécutivement à une digestion pendant 2 h par PRV, permet une libération totale des nucléosides de

l’ADN (Figure 55).

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25

pmoles/échantillon


5-OHdUrd 5-HMdUrd 5-FordUrd 8-oxodGuo 8-oxodAdo diols de thymidine

Figure 55 : Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par l’exonucléase PVS (précédée par une hydrolyse en

présence de l’exonucléase PRV pendant 2 h)

4. Profils d’élution chromatographiqueLes Figures 56-59-60-61-62 montrent les profils d’élution de cinq des sept nucléosides

d’intérêt, mesurés simultanément dans l’ADN de monocytes exposés à une dose de 500 Gy de

rayonnement gamma du 60Co. La Figure 58 donne, à titre indicatif, le profil d’élution

chromatographique obtenu dans le cas de l’exposition d’ADN isolé de thymus de veau à 500 Gy de

rayonnement gamma du 60Co. On rapporte dans la Figure 63 le profil CLHP-SM/SM de la 8-oxodAdo

obtenu dans le cas de monocytes exposés à des impulsions UV LASER correspondant à une dose de

500 mJ. Un gradient de phase mobile et une colonne chromatographique à polarité de phase inverse

permettent de séparer les sept nucléosides au sein d’un même échantillon.


XIC of –MRM (4 pairs): Period 1, for 274.2 / 116.1 amu from 500 Gy

4.214.88

9.63

Time, min

100200300400500600

Inte

nsity

, cps

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

diols (trans)diols (cis)

(5S,6R)

S(5R,6 )

(5R,6R)(5S,6S)

Figure 56 : Profil d’élution CLHP-SM/SM des diols de thymidine

Les diols de thymidine donnent un signal comportant 4 pics correspondant aux 4

diastéréoisomères cis et trans possibles (Figure 56). Les diols de configuration trans, séparés sur une

colonne chromatographique de silice à polarité de phase inversée, sont élués plus rapidement que les

diastéréoisomères cis. On peut ajouter que les diastéréoisomères 5S sont élués plus rapidement que les

diastéréoisomères 5R pour une même configuration relative. Les structures des diastéréoisomères sont

rapportées dans la Figure 57.

HN

N

O

OdR OH

H

CH3OH HN

N

O

OdR H

OH

CH3

OH

cis (5S,6R) trans (5S,6S)

trans (5R,6R) cis (5R ,6S )

HN

N

O

OdR H

OH

OH

CH3HN

N

O

OdR OH

H

OH

CH3

Figure 57 : Structure des 4 diastéréoisomères des diols de thymidine


XIC of –MRM (4 pairs): Period 1, for 243.0 / 153.0 amu from 500 GY

12.46

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time, min

2000

4000

6000

8000

10000

Inte

nsity

, cps

5-OHdUrd

Figure 58 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 5-OHdUrd mesurée dans l’ADN isolé de thymus deveau exposé à 500 Gy de rayonnement gamma du 60Co (pour information)

XIC of –MRM (5 pairs): Period 2, for 257.0 / 124.0 amu from 500 Gy

17.50

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

1000

2000

3000

4000

Inte

nsity

, cps

Time, min

5-HmdUrd

Figure 59 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 5-HmdUrd

XIC of –MRM (5 pairs): Period 2, for 255.0 / 212.0 amu from 500 Gy 22.97

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Time, min

50

100

150

200

Inte

nsity

, cps

5-FordUrd

Figure 60 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 5-FordUrd


XIC of +MRM (5 pairs): Period 3, for 284.1 / 168.0 amu from 500 Gy

27.36

26 28 30 32 34 36 38 40 42 44

1000

Inte

nsity

, cps

2000

8-oxodGuo

Time, min

Figure 61 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 8-oxodGuo

XIC of –MRM (5 pairs): Period 2, for 268.1 / 152.0 amu from 500 Gy23.90

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

1e6

2e6

Inte

nsity

, cps

Time, min

dGuo

Figure 62 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la dGuo

XIC of +MRM (5 pairs): Period 3, for 268.1 / 152.0 amu from 500 Gy

33.33

26 28 30 32 34 36 38 40 42 44

Time, min

0

500

1000

Inte

nsity

, cps

8-oxodAdo

Figure 63 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 8-oxodAdo (irradiation UV LASER)

5. Stabilité des diastéréoisomères cis et trans des diols de thymidineNous n’avons pas été en mesure de séparer, dans les conditions chromatographiques utilisées

pour la technique de CLHP-SM/SM, les 4 diastéréoisomères des diols de thymidine. De ce fait, la


mesure des diols de thymidine que nous présentons dans ce mémoire porte sur l’ensemble des

diastéréoisomères trans et cis, sans essayer de les individualiser. On peut penser que, la mesure des

diols de thymidine trans d’une part et des diastéréoisomères cis des diols de thymidine d’autre part,

suppose que l’équilibre entre les formes trans et cis, dû à un phénomène d’épimérisation par

tautomérie chaîne-cycle, est atteint. Cet équilibre entre les configurations cis et trans de chaque

couple de diastéréoisomère est de 80 : 20 et 70 : 30, respectivement en solution aqueuse neutre (245).

L’équilibre est rapidement atteint en solution aqueuse alcaline. Une comparaison entre des

échantillons trans maintenus à -20°C ou maintenus à 37°C soit dans l’eau, soit dans le tampon de la

nucléase P1 (pH 5,5), a donné les résultats suivants. Les quatre diastéréoisomères ont été séparés sur

colonne de silice à polarité de phase inversée de type Uptisphere (Interchim, Montluçon) et détectés

en sortie de colonne par l’utilisation d’un détecteur UV fixé à 230 nm.

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5diol trans 5R

Figure 64 : Stabilité du diastéréoisomère trans 5R du diol de thymidine conservé à -20°C en milieuaqueux, pendant une nuit

Lorsque les échantillons sont conservés à -20°C en solution aqueuse, seuls les

diastéréoisomères trans sont présents (Figure 64).

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

1

2

3

4

5

6diol cis 5Rdiol trans 5R

Figure 65 : Stabilité du diastéréoisomère trans 5R du diol de thymidine conservé à 37°C en milieuaqueux, pendant une nuit


La conservation à 37 °C en solution aqueuse, des diastéréoisomères trans 5R pendant une nuit,

donne lieu à la formation du diastéréoisomère cis correspondant (Figure 65).

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

2.5

5

7.5

10

12.5

15

17.5

diol trans 5R

diol cis 5R

Figure 66 : Stabilité du diastéréoisomère trans 5R du diol de thymidine conservé à 37°C dans letampon de la nucléase P1, pendant une nuit

Lorsque les diastéréoisomères trans 5R de thymidine sont conservés dans le tampon de la

nucléase P1 (pH 5,5) à 37°C, pendant une nuit, on observe très peu de formation du diastéréoisomère

cis (Figure 66). Le même résultat a été obtenu pour le diastéréoisomère 5S.

La comparaison de ces trois conditions de conservation montrent que les diastéréoisomères

trans s’épimérisent rapidement en diastéréoisomères cis lorsqu’ils sont conservés à 37°C dans l’eau.

Lorsqu’ils sont congelés à -20°C ou maintenus dans le tampon de la nucléase P1, le processus

d’épimérisation ne se produit pas. Ceci s'explique par le fait que l'épimérisation est favorisée en

milieu basique alors qu’elle s’effectue très difficilement à pH acide. L’hydrolyse de l’ADN que nous

proposons dans le paragraphe 3) est effectuée en milieu alcalin. L’équilibre devrait par conséquent

être rapide. Les proportions entre les configurations cis et trans des diols de thymidine citées ci-

dessus, devront être utilisées dans la calibration interne du signal, lorsqu’une mesure séparée des diols

trans et des diols cis sera effectuée.


6. Standards internes et droites de calibration

a) Standards internes

Le principe de l’utilisation de standards internes est le même que celui décrit lors de la

mesure des dérivés Fapy purines par CG-SM. Tous les standards isotopiques internes ont été obtenus

par synthèse chimique (246). Des isotopes tels que, 15N, 13C ou 18O, ont ainsi été incorporés à des

positions spécifiques qui sont rapportées dans le Tableau XII. Leur concentration est ensuite

déterminée par absorption ultra-violette ou par RMN (diols de thymidine).

Tableau XII : Position et nature des isotopes incorporés dans les molécules de standards internes

Lésions Standards isotopiques internes

8-OxodGuo [2-amino-1,3,7,9-15N5]8-oxodGuo

8-OxodAdo [6-amino-1,3,7,9-15N5]8-oxodAdo

5-HmdUrd [5-hydroxyméthyl-13C, 1,3-15N2]5-HmdUrd

5-OHdUrd [1,3-15N2, 2-13C]5-OHdUrd

5-FordUrd [5-formyl-13C, 1,3-15N2]5-FordUrd

Diols de thymidine [1,3-15N2, 2,5-méthyl-13C]diols de thymidine

FapyGua [2,6-diamino, 5-formamido-15N3]FapyGua

FapyAde [4,6-diamino-15N2, 5-formamido-13C]FapyAde

b) Droites de calibration

Pour chaque base modifiée étudiée, une droite de calibration, a été établie selon la stratégie

décrite dans le sous-paragraphe III-B-3)-b. La droite établie pour la 5-HmdUrd est donnée, à titre

d’exemple, dans la Figure 67.

2y = 0,70 x

R = 1

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50



Figure 67 : Exemple de droite de calibration obtenue pour la 5-HmdUrd

Dans le Tableau XIII, on présente les gammes de quantités de produits utilisés pour établir les

courbes de calibration, ainsi que les coordonnées de la droite de régression linéaire obtenue pour


chaque base modifiée. Pour chaque base modifiée, deux picomoles de standard interne ont été

ajoutées.

Tableau XIII: Pente et ordonnée à l’origine des droites de calibration

Lésions Gamme de quantités

injectées (pmoles)

Pente de

la droite

Ordonnée àl’origine

8-OxodGuo 0,01-1000 1,270 0,026

8-OxodAdo 0,01-10 0,755 0,029

5-OHdUrd 0,01-10 1,300 0,000

5-FordUrd 0,01-100 0,780 0,000

5-HmdUrd 0,01-50 0,700 0,000

Diols de thymidine 0,01-50 0,518 0,000

FapyGua 0,1-100 1,628 0,000

FapyAde 0,1-100 0,806 0,095

V. CONCLUSION

Nous avons présenté dans ce chapitre les conditions d’utilisation des techniques

chromatographiques. Nous avons pour cela, au préalable optimisé la technique d’extraction de l’ADN

cellulaire afin de limiter les processus d’oxydation artéfactuelle qui surviennent au cours de cette

étape. Cette amélioration a permis d’améliorer la sensibilité de la technique de CLHP-DE pour la

mesure de la 8-oxodGuo. L’utilisation d’une hydrolyse à froid des nucléotides et le recours à une

étape de prépurification par CLHP a permis d’accéder à la mesure des dérivés Fapy purines dans

l’ADN cellulaire par la technique de CG-SM. Nous avons ensuite défini les conditions de séparation

et de détection de sept nucléosides de l’ADN par la technique de CLHP-SM. Dans tous les cas,

l’hydrolyse totale de l’ADN avant analyse a été vérifiée et les droites de calibration ont été établies

pour chaque composé à doser. La technique de CLHP-SM/SM a ainsi permis d’étendre les mesures au

sein d’un même échantillon aux diols de thymidine, à la 5-OHdUrd , à la 5-FordUrd, à la 5-HmdUrd,

à la 8-oxodAdo, à la 8-oxodGuo et à la dGuo.

Ces techniques ainsi optimisées ont été utilisées, dans le Chapitre III, dans le but d’estimer les

dommages induits dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma du 60Co, à la lumière

UVA, au rayonnement UV LASER, ou encore photosensibilisés par le rose bengal ou l’acridine

orange.

- Chapitre III -

Mesure des dommages radio- et photo-induits

dans l’ADN cellulaire par des méthodes

chromatographiques

Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques

104

IntroductionLa mise au point de techniques d’analyse chromatographiques présentée dans le chapitre II a

permis la mesure de dommages de bases induits dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement γ

du 60Co et au rayonnement UV LASER. Elles ont également été utilisées pour mesurer les taux de

formation de la 8-oxodGuo et des dérivés Fapy purines induits par des réactions de

photosensibilisation ou par la lumière UVA.

I. FORMATION DE DOMMAGES DE BASES DANS L’ADN DE MONOCYTESEXPOSES AU RAYONNEMENT γγγγ DU 60CO

A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuoDes monocytes ont été exposés à une gamme de doses de rayonnement gamma du cobalt 60

comprises entre 0 et 80 Gy. Les résultats des mesures effectuées par CLHP-DE ont été présentés dans

le chapitre II (Figures 33). Ils sont rapportés ici (Figure 68).

y = 0,011x + 0,20

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 20 40 60 80Dose (Gy)

8-oxodGuo/106 bases

Figure 68 : Détermination par CLHP-DE du niveau basal et du taux de formation de la 8-oxodGuodans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement γ du 60Co

B. Détermination par CG-SM du taux de formation des dérivésFapy purines

La mesure de la FapyGua et de la FapyAde dans l’ADN de monocytes exposés au

rayonnement γ du 60Co a été effectuée. Pour cela, les monocytes ont été exposés à des doses de

rayonnement comprises entre 0 et 1000 Gy. Le taux de formation du dérivé Fapy de la guanine est

déterminé en utilisant une droite de régression linéaire de pente 0,027 FapyGua/106 bases /Gy (Figure

69). Le niveau basal dans les cellules contrôle n’a pas été déterminé en raison du manque de

sensibilité de la méthode de détection. Toutefois, une extrapolation de la droite précédemment

105 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques

obtenue signale une valeur de 3,4 FapyGua/106 bases. Ce taux est voisin de la limite de sensibilité de

la méthode de mesure, estimée à environ 2 modifications pour 106 bases. Les mesures de la FapyAde

n’ont pas permis la détection de cette lésion entre 0 et 1000 Gy. La limite de détection est proche de 3

FapyAde/106 bases.

y = 0,027 x + 3,4

0

10

20

30

0 200 400 600 800 1000 Dose (Gy)

FapyGua/ 106 bases

Figure 69 : Formation de la FapyGua déterminée par CG-SM dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement γ du 60Co

C. Mesure par CLHP-SM/SM du taux de formation des dérivésFapy purines

La mesure des dérivés Fapy purines radio-induits a été effectuée par CLHP-SM/SM. Pour

cela, des monocytes ont été exposés à une gamme de doses de rayonnement gamma comprises entre 0

et 500 Gy. Le taux de FapyAde mesuré par la technique de CLHP-SM/SM est de 0,0024 FapyAde/106

bases/Gy. Le niveau basal mesuré est de 0,42/106 bases (Figure 70).

y = 0,0024 x + 0,42R2 = 0,9912

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 100 200 300 400 500

FapyAde /106 bases

Dose (Gy)

Figure 70 : Formation de la FapyAde déterminée par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement γ du 60Co


106

FapyGua/106 bases

y = 0,027 x + 9,2R2 = 0,941

05

10152025

0 100 200 300 400 500

Dose (Gy)

Figure 71 : Formation de la FapyGua par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement γ du 60Co

Le taux de formation de 0,027 FapyGua/106 bases/Gy (Figure 71) est similaire à celui

déterminé par la méthode de CG-SM. Il n’est donné ici qu’à titre indicatif car le signal obtenu pour

cette modification est relativement médiocre, en dépit des efforts d’optimisation de cette détection.

Ceci explique sans doute l’incertitude élevée sur le niveau basal mesuré.

D. Mesure simultanée par CLHP-SM/SM du taux de formationdes diols de thymidine, de la 5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de la dGuo

Les mesures ont été effectuées dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma du

cobalt 60 à des doses comprises entre 0 et 450 Gy. Il n’a pas été possible de mesurer de façon

quantitative la 2’-désoxyguanosine dans les échantillons. En effet le nucléoside normal est présent en

quantités se situant hors du domaine de linéarité de la réponse du système de détection. Il a donc été

nécessaire pour chaque échantillon de quantifier l’ADN en parallèle en utilisant un système CLHP-

UV. Ceci est le cas pour toutes les mesures de dGuo par CLHP-SM/SM présentées dans la suite de ce

mémoire. De façon similaire, le taux de formation de la 5-OHdUrd, induit par une irradiation gamma,

LASER ou par un flux de particules de 12C6+ est inférieur à la limite de détection de la méthode. Il

n’est par conséquent pas rapporté dans la suite de ce chapitre.

1. Bases pyrimidiques modifiéesLa mesure de la 5-HmdUrd par CLHP-SM/SM donne un taux de formation par Gy de 0,029

lésion/106 bases pour un niveau basal proche de 0,9/106 bases (Figure 72).


5-HmdUrd/10 6 bases

R

y = 0,029 x + 0,92 = 0,925

0

10

20

30

0 200 400 500

Dose (Gy)

300100

Figure 72 : Formation de la 5-HmdUrd, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement gamma du 60Co

Le taux de formation des diols de thymidine a été estimé à 0,097 lésion/106 bases/Gy. Cette

valeur correspond à l’ensemble des 4 diastéréoisomères trans et cis. Le niveau basal est de 0,8

diol/106 bases (Figure 73).

Diols de thymidine/10 6 bases

y = 0,097 x + 0,8R2 = 0,9868

0

10

20

30

40

50

0 100 200 300 400 500

Dose (Gy)

Figure 73 : Détermination par CLHP-SM/SM de la formation des diols de thymidine, dans l’ADN demonocytes exposés au rayonnement gamma du 60Co


108

5-FordUrd/10 6 bases

y = 0,022 x + 0,32R = 0,9661

0,0

5,0

10,0

0 200 400

Dose (Gy)

100 300 500

Figure 74 : Mesure de la 5-FordUrd par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement gamma du 60Co

La formation de la 5-FordUrd est de 0,022 lésion/106 bases/Gy, pour un niveau basal de 0,3 5-

FordUrd/106 bases (Figure 74).

2. Bases puriques modifiées

8-oxodGuo/106 bases20 y = 0,020 x + 0,4

R2 = 0,9751

0

5

10

15

0 200 400 500Dose (Gy)

100 300

Figure 75 : Formation de la 8-oxodGuo, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement gamma du 60Co

La formation de la 8-oxodGuo et de la 8-oxodAdo est respectivement de 0,020 et 0,0035

lésion/106 bases/Gy pour des niveaux basaux respectivement de 0,4 et 0,1 lésion/106 bases (Figures 75

et 76). Il faut remarquer que le taux de 8-oxodGuo est sensiblement identique à celui déterminé par

CLHP-DE. Le niveau basal est en revanche environ 3 fois plus élevé.


8-oxodAdo/106 bases

y = 0,0035 x + 0,12R = 0,8493

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 200 400 500Dose (Gy)

300100

Figure 76 : Mesure de la 8-oxodAdo par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement gamma du 60Co

II. IONISATION DE L’ADN CELLULAIRE PAR DES IMPULSIONS UV LASER

Afin d’étudier la contribution des réactions d’ionisation dans la formation radio-induite des

dommages de bases de l’ADN, de monocytes ont été exposés à un rayonnement LASER UV de haute

intensité de longueur d’onde égale à 266 nm. La particularité de ce système d’irradiation tient à la

longueur d’onde des radiations émises et au nombre de photons émis par unité de temps, i.e. à

l’intensité du faisceau. Les photons de 266 nm sont presque exclusivement absorbées par les bases de

l’ADN. De plus, l’intensité de la source est suffisamment élevée pour que deux photons puissent, dans

un laps de temps très court (≈ 5 nanosecondes) interagir avec une même molécule cible. Dans ce cas,

le premier photon émis va amener la molécule dans un état excité singulet d’une durée de vie voisine

d’une picoseconde qui se transforme par une réaction de croisement inter-système en un état excité

triplet de durée de vie plus longue. Si un deuxième photon, interagit alors à nouveau avec la molécule

dans son état excité triplet, un niveau d’excitation global d’au moins 7 eV peut être atteint. Dans ces

conditions, la molécule peut être ionisée.

Les cellules ont été exposées à des doses de rayonnement comprises entre 0 et 500

mJ/échantillon. Chaque échantillon contient environ 20 millions de cellules (≈ 250 µg d’ADN, soit 5

unités densité optique d’ADN) en suspension dans du tampon PBS.


110

A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo

y = 1,2 x + 0,32R = 0,9968

0

200

400

600

0 100 200 300 400 500

8-oxodGuo/106 bases

Dose (mJ)

Figure 77 : Détermination par CLHP-DE, du niveau de 8-oxodGuo, dans l’ADN de monocytes

exposés à des impulsions LASER UV (266 nm) de haute intensité

Le taux de 8-oxodGuo/106 bases induit dans l’ADN cellulaire par mJ d’irradiation LASER est

de 1,2. Le niveau basal est de 0,3 8-oxodGuo/106 bases (Figure 77).

B. Mesure simultanée par CLHP-SM/SM du taux de formationdes diols de thymidine, de la 5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de la dGuo

1. Mesure des bases pyrimidiques modifiées

5-HmdUrd/106 bases

y = 0,060 x + 0,42R = 0,9914

0

10

20

30

40

50

0 200 400 600Dose (mJ)

Figure 78 : Formation de la 5-HmdUrd, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes


Le taux de formation de la 5-HmdUrd mesuré par CLHP-SM/SM est de 0,060 lésion/106

bases/mJ pour un niveau basal de 0,4 5-HmdUrd/106 bases (Figure 78).


5-FordUrd/106 bases

y = 0,017 x

R2 = 0,9882

0

10

20

0 200 400 600Dose (mJ)

Figure 79 : Mesure de la 5-FordUrd par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes exposés à des

impulsions LASER UV (266 nm) de haute intensité

Le taux de formation de la 5-FordUrd mesuré par CLHP-SM/SM est de 0,017 lésion/106

bases/mJ. Le niveau basal est inférieur à la limite de détection proche de 0,1 lésion/106 bases (Figure

79).

Diols de thymidine /10

y = 0,17 x + 0,5R2 = 0,9769

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600

Dose (mJ)

6 bases

Figure 80 : Formation des diols de thymidine, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de

monocytes exposés à des impulsions LASER UV (266 nm) de haute intensité

Le taux de formation de l’ensemble des 4 diols de thymidine mesuré par CLHP-SM/SM est de

0,17 lésion/106 bases/mJ pour un niveau basal de 0,5 lésion/106 bases (Figure 80).

2. Mesures de bases puriques modifiéesLa formation de 8-oxodGuo par mJ de rayonnement reçu est de 1,29 lésions/106 bases. Le

niveau basal est de 0,6 lésion/106 bases (Figure 81).


112

8-oxodGuo/106 bases

y = 1,29 x + 0,6

R 2 = 0,9941

0

200

400

600

800

1000

0 200 400 600

Dose (mJ)

Figure 81 : Formation de la 8-oxodGuo, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes


8-oxodAdo/106 bases

y = 0,017 x + 0,1

R2 = 0,9891

0

5

10

15

0 200 400 600

Dose (mJ)

Figure 82 : Mesure de la 8-oxodAdo, par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement LASER à ionisation bi-photonique (266 nm)

La formation de 8-oxodAdo par mJ de rayonnement reçu est de 0,017 lésion/106 bases. Le

niveau basal obtenue par extrapolation est de 0,1 lésion/106 bases (Figure 82).

C. Expression du rendement quantiqueIl est possible, à partir du nombre de photons absorbés et du taux de modification observé

pour une base donnée de calculer le rendement quantique de formation des lésions.

1. Paramètres d’irradiation

L’énergie délivrée par une impulsion LASER, εp, est comprise entre 18 et 20 mJ.

L’énergie totale d’irradiation, εt s’exprime à l’aide de la relation suivante :

εt = nombre d’impulsions (N) εp

La dose par impulsion est Ep avec Ep étant égale à :


Ep =εp

Sp

où Sp est la surface du faisceau en l’occurrence 0,125 cm2. Ep est donc égal à :

Ep =18

0,125= 0,15 J/cm2

La dose totale est égale au produit N Ep.

L’intensité par impulsion I est égale à :

I =Ep

τp

= 0,15

5 10−9= 30 106 w/cm2

où τp est la durée d’une impulsion (5 nanosecondes)

Le nombre de photons Nph s’exprime selon la relation suivante :

Nph =ε [J](266 nm)

hν= 1,34 1018 ε [J]

Si εt = 0,5 J (pour 250 µg d’ADN), Nphtot = 0,5 1,34 1018 = 6,7 1017 photons. La D.O. étant égale à

5, on peut considérer en première approximation, que tous les photons sont absorbés uniquement par

l’ADN cellulaire.

2. Calcul du rendement quantiqueLe calcul du rendement quantique, Q relatif à la 8-oxodGuo s’exprime à l’aide de la relation

suivante:

=Qnombre de 8-oxodGuo forméesnombre de photons absorbés

Or, N8-oxodGuo = 795/106 bases (pour 500 mJ/échantillon) ce qui représente pour 20 106

cellules/échantillons un nombre de 8-oxodGuo égal à 12000 20 106 cellules (sur la base de 12 109

bases/cellules). On peut alors calculer Q :

Q = 12 000 20 106 795

6,7 1017=

3 10-4


114

III. FORMATION DES DOMMAGES DE BASES DANS L’ADN DE MONOCYTESEXPOSES AU RAYONNEMENT UVA

A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuoLe taux de formation de la 8-oxodGuo a été mesuré dans l’ADN de monocytes exposés au

rayonnement UVA (λmax 372 nm) pour des doses comprises entre 0 et 800 kJ.m-2.

y = 0,00098 x + 0,15

0,0

0,4

0,8

1,2

0 200 400 600 800 1000

-2Dose (kJ.m )

68-oxodGuo/10 bases

Figure 83 : Détermination par CLHP-DE, du niveau de 8-oxodGuo, dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement UVA

Le niveau basal de 8-oxodGuo qui est estimé à 0,15 résidu/106 bases est proche de celui

mesuré précédemment dans le cas de l’irradiation gamma ou UV LASER. Le taux de formation de la

8-oxodGuo est de 9,8 10-4 lésion/106 bases/kJ.m-2 (Figure 83).

B. Mesure par CG-SM du taux de formation des dérivés Fapypurines

Nous n’avons pas été en mesure de mettre en évidence la formation de dérivés Fapy purines

par la technique de CG-SM dans la gamme de doses (0-800 kJ.m-2). Il est vraisemblable que cela est

dû au fait que ces modifications ne se forment pas, où du moins à un taux tel qu’elles ne sont pas

détectées par CG-SM.

IV. FORMATION DES DOMMAGES DE BASES DANS L’ADN DE MONOCYTESPHOTOSENSIBILISES

Deux photosensibilisateurs exogènes ont été utilisés : l’acridine orange et le rose bengal. Les

cellules ont été mises en contact avec ces agents pendant quelques minutes, puis rincées avec du

tampon PBS avant d’être exposées à la lumière visible. La structure ainsi que quelques

caractéristiques de ces photosensibilisateurs sont données ci-après (Figure 84).


N(CH3)2N N(CH3)2+

H

M molaire : 301,8 g.mol-1

λλλλmax : 492 nmεεεε : 28100 l. cm-1. mol -1

Acridine orange

Cl

O OII

-O

I ICOO-

Cl

Cl

Cl

M molaire : 1017,6 g.mol-1

λλλλmax : 548 nmεεεε : 82000 l. cm-1. mol-1

Rose bengal

Figure 84 : Structures de l’acridine orange et du rose bengal

Ces deux agents possèdent un maximum d’absorption dans le domaine visible (λmax = 492 ou

548 nm) et peuvent donner lieu à des réactions de photosensibilisation.

A. Détermination par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo

1. Photosensibilisation par le rose bengal (10-2 D.O.) et par l’acridineorange (5 10-3 D.O.)

L’incubation de monocytes avec des solutions d’acridine orange et de rose bengal, utilisés,respectivement, à une densité optique de 5 10-3 et 10-2 D.O., suivie d’une exposition à la lumièrevisible, entraîne la formation de 8-oxodGuo dans l’ADN de ces cellules. Les taux de formation,linéaires en fonction du temps d’irradiation avec la lumière visible (en min), sont respectivement de0,097 et 0,054 8-oxodGuo/106 bases/min, pour des niveaux basaux de 0,2 et 0,05 lésion/106 bases(Figure 85).

y = 0,097 x + 0,20

y = 0,054 x + 0,05

0

1

2

3

4

0 10 20 30 40Durée d'exposition (min)

rose bengal

acridine orange

68-oxodGuo/10 bases

Figure 85 : Mesure du taux de 8-oxodGuo par CLHP-DE dans l’ADN de monocytes photosensibiliséspar 510-3 D.O. d’acridine orange ou par 10-2 D.O. de rose bengal


116

2. Photosensibilisation par le rose bengal et par l’acridine orange (1D.O.)

Les taux de formation de 8-oxodGuo induits par l’acridine orange et le rose bengal, utilisés à

une concentration, respectivement 200 et 100 fois supérieure à celle des expériences précédentes, sont

de 3,93 et 1,88 8-oxodGuo/106 bases/ min. Le niveau basal est de 0,18 8-oxodGuo/106 bases (Figure

86).

Durée d'exposition (min)

0 10 20 300

40

80

120

160

y = 3,93 x + 0,18

y = 1,88 x + 0,18

acridine orange

rose bengal

68-oxodGuo/10 bases

Figure 86 : Mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE dans l’ADN de monocytes photosensibilisés par 1D.O. de rose bengal ou d’acridine orange

B. Mesure du taux de formation des dérivés Fapy purines par CG-SM

y = 0,90 x + 2,4

6

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30Durée d'exposition (min)

FapyGua/10 basesacridine orange

rose bengaly = 0,66 x + 2,4

Figure 87 : Formation de la FapyGua déterminée par CG-SM dans l’ADN de monocytesphotosensibilisés


La formation de dérivés Fapy purines n’a pas été détectée dans l’ADN de monocytesphotosensibilisés par l’acridine orange ou par le rose bengal, pour des densités optiques,respectivement de 5 10-3 D.O. et 10-2 D.O.. Lorsque les photosensibilisateurs ont été utilisés à unedensité optique de 1, la formation de FapyGua a été mise en évidence avec des taux respectivementpour l’acridine orange et le rose bengal, de 0,90 et de 0,66 FapyGua/106 bases/min (Figure 87). Leniveau basal n’a pas pu être mesuré. Cependant, par extrapolation, une valeur de 2,4 FapyGua/106

bases est obtenue. Elle semble cohérente avec la valeur estimée dans le cas de l’irradiation gamma. Letaux du dérivé Fapy de l’adénine est inférieur à la limite de détection.

V. DISCUSSION DES RESULTATS

Nous avons effectué la mesure de plusieurs bases puriques et pyrimidiques modifiées aprèsirradiation gamma, exposition à la lumière UVA où à des impulsions UV LASER, ou enfin, après desréactions de photosensibilisation par le rose bengal ou l’acridine orange. Parmi les différentesmodifications de bases, nous discuterons plus en détail de la mesure de la 8-oxodGuo qui, comme celaa été mentionné dans la partie introductive à ce mémoire, revêt une importance toute particulière.

A. Mécanismes de formation de la 8-oxodGuoNous rappelons tout d’abord les principaux mécanismes conduisant à la formation de 8-

oxodGuo à partir de dGuo (38).

NH

NN

N

O

H NH2

HN

N N

N°O

OHH

HH2N


HN

N N

N

O

HH2N

+°

+H2O/-H+

(ADN)

(-e-)Guanine


cation radical

°OH

°OH

HN

N NH

N

O

H2NOH

°

N

N NH

N

O°

H2N

radical neutreoxydant

- H+

- H2O

N

NO NH2

H2N

H2O

O2

O

NO

H2N

NH2

NH2 oxazolone

imidazolone

2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine (FapyGua)

HHN

N NH2

N

O

O

HH2N

HHN

N N

N

O

O

HH2N

8-oxo-7,8-dihydroguanine(8-oxoGua)

Figure 88 : Schéma d’oxydation de la guanine


118

Le premier implique l’arrachement d’un électron de la guanine et la formation d’un cation

radical (réaction de type I, ou effet direct du rayonnement ionisant). Le radical ainsi formé peut

s’hydrater dans l’ADN natif pour générer un radical neutre intermédiaire ou peut perdre un proton

pour pour donner naissance à un radical neutre oxydant. Le radical 8-hydroxy-7,8-dihydroguan-7-yle

produit par la réaction d’hydratation pourra être oxydé ou réduit pour conduire respectivement à la

formation de la 8-oxoGua et de FapyGua. D’autre part, le radical oxydant formé par déprotonation du

cation radical de la guanine est le précurseur de l’oxazolone (Figure 88).

La 8-oxoGua peut aussi être formée par addition du radical hydroxyle en position 8 de la

guanine qui se traduit par la formation du radical 8-hydroxy-7,8-dihydroguan-7-yle précédemment cité

(Figure 88). Enfin, le dernier mécanisme de formation commun est celui qui met en jeu l’oxygène

singulet (102, 103). L’oxygène singulet produit au cours de réaction de photosensibilisation peut

conduire à la formation soit de la 4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydroguanine, soit de la 8-oxodGuo. Seule

cette dernière modification a été identifiée dans l’ADN double brin (Figure 89).

NH

NN

N

O

NH2HO O

OH

2'-désoxyguanosine

NH

NN

N

O

ONH2OH

HO O

OH4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (dans le nucléoside seulement)

8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine

NH

NN

HN

O

ONH2HO O

OH

1O2

Figure 89 : Modifications générées par réaction de l’oxygène singulet avec la guanine

B. Discussion des aspects méthodologiques

1. L’extraction de l’ADN cellulaireDans toutes les techniques de mesure directe des dommages, l’expérimentateur se trouve

confronté à deux difficultés. D’une part il doit disposer de méthodes suffisamment sensibles pour

mesurer 1 modification pour 106 ou 107 bases normales. D’autre part il doit s’assurer que le dommage

mesuré n’est pas le reflet de phénomènes d’oxydation parasites susceptibles de se produire au cours

des différentes étapes de préparation des échantillons. En effet, les niveaux de modifications sont très

faibles et de ce fait, peuvent être facilement accrus de façon artificielle.


Ces observations justifient souvent l’utilisation de doses d’irradiation élevées pour mettre en

évidence un taux de formation significatif par rapport au niveau basal présent dans les cellules. Plus

ce niveau ou « bruit de fond » est élevé et plus la dose d’irradiation doit être élevée pour induire une

augmentation significative du niveau de la lésion. La valeur du niveau basal est l’objet de nombreux

débats dans la communauté scientifique puisqu’elle est devenue un des critères de la qualité de la

mesure. Il faut faire la part entre le niveau basal présumé dans l’ADN de la cellule et le niveau mesuré

qui peut être en partie induit par la méthode utilisée. Deux sources d’oxydation ont été mises en

évidence. La première se situe lors de l’étape d’extraction de l’ADN cellulaire. La deuxième est

rencontrée lors des analyses par CG-SM et sera abordée dans le paragraphe suivant. Nous avons

observé en comparant trois techniques d’extraction que le niveau basal de 8-oxodGuo présent dans les

cellules pouvait varier d’un facteur 10 selon la méthode d’extraction utilisée. Un niveau basal de 0,2

8-oxodGuo/106 bases normales a été déterminé par la méthode chaotropique au NaI. Ces résultats sont

en accord avec les travaux d’Helbock et al. (1998). La méthode d’extraction au phénol qui était la

technique la plus couramment utilisée a perdu de son intérêt lorsque plusieurs travaux ont montré

qu’elle pouvait conduire à une oxydation artificielle de l’ADN. Ainsi, on peut citer les résultats de

Claycamp et al., qui ont montré qu’une extraction de l’ADN par le phénol pouvait favoriser

l’oxydation photosensibilisée de l’ADN en présence d’oxygène (247). Même maintenu à -20 °C,

l’ADN extrait peut subir des phénomènes d’oxydation (247). La sensibilisation par le phénol peut

s’expliquer par la présence de composés dans la solution, qui s’intercalent dans la double hélice

d’ADN en jouant le rôle de photosensibilisateurs, ou qui réagissent avec dGuo en présence

d’oxygène. Une dernière possibilité est que le phénol favorise l’apparition de sites de coordination

Fe(II) ou Fe (III). On peut ajouter que la resolubilisation de l’ADN extrait dans des solutions tampons

désaérées s’accompagne d’une réduction du niveau de 8-oxodGuo par un facteur 4, soulignant ainsi

indirectement le rôle de l’oxygène dans l’oxydation artéfactuelle de l’ADN. Toutefois, Harris et al.

ont montré que le niveau de 8-oxodGuo n’était pas accru par l’utilisation de phénol fraîchement

distillé lorsque l’extraction était effectuée en absence d'oxygène (248). Finnegan et al. ont montré que

la technique basée sur l’utilisation de phénol donnait un niveau basal 10 à 20 fois supérieur à celui

déterminé par la méthode à la pronase E (249). Cet effet prooxydant était amplifié lorsque les cellules

étaient irradiées puisqu’aucune augmentation du niveau de 8-oxodGuo à 200 Gy n’était détectée dans

l’ADN extrait par la technique à la pronase alors que la méthode au phénol donnait un taux de 42 8-

oxodGuo/106 bases. Toutefois, au cours de ces travaux, l’ADN a été séché en présence d’air avant

d’être hydrolysé. Les taux obtenus sont bien supérieurs à ceux mesurés habituellement en absence

d’air, si bien qu’il est difficile de tirer des conclusions quant à l’efficacité de l’une ou l’autre des 2

méthodes. De plus les travaux de Nakajima et al. ont montré que ce n’était pas l’air seul qui pouvait

expliquer l’oxydation de l’ADN, mais en fait la présence simultanée d’impuretés (qui peuvent


120

être apportées par exemple par le phénol) et d’oxygène (250). Il semble cependant que les résultats

que nous avons obtenus dans le cas de cellules exposées au rayonnement gamma du 60Co, soient aussi

affectés par une oxydation artificielle plus importante que dans l’ADN cellulaire utilisé comme

contrôle. En effet, la réduction du bruit de fond liée à l’utilisation de la méthode au NaI s’accompagne

d’un changement de pente de la courbe dose-réponse obtenue. De 0,011 8-oxodGuo/106 bases/Gy (par

CLHP-DE), une valeur de 0,015 8-oxodGuo/106 bases/Gy est alors mesurée (par CLHP-DE). Une des

raisons possibles de ce phénomène serait soit une extraction préférentielle de l’ADN endommagé

(249), soit une libération de fer par l’irradiation. Une comparaison a été établie entre six méthodes

d’extraction par Helbock et al. (209). Deux de ces dernières reposaient sur l’utilisation de la pronase,

une sur une extraction au phénol et enfin les trois autres faisaient appel à des variantes de la méthode

chaotropique au NaI. Leurs travaux ont montré que la méthode chaotropique au NaI permettait

d’obtenir le niveau basal de 8-oxodGuo le plus faible. Pour cela, la déféroxamine a été ajoutée dans

toutes les solutions tampons. De plus, les quantités d’enzymes et les temps d’incubation ont été

optimisés. Les auteurs ont aussi montré qu’une étape additionnelle d’extraction au phénol augmentait

le taux de 8-oxodGuo (de 0,1 à 0,6 8-oxodGuo/106 bases). L’effet de la déféroxamine semble indiquer

l’implication des métaux de transition dans les phénomènes d’oxydation de l’ADN. Il faut ajouter que

le niveau basal de 8-oxodGuo est d’autant plus élevé que la quantité d’ADN extraite est faible (< 20

µg).

2. La méthode d’analyse par CG-SMD’importantes différences existent entre les valeurs de niveau basal de 8-oxodGuo mesuré

dans l’ADN extrait de cellules ou de tissus (161) selon les méthodes d’analyse utilisées. Nous avons

rapporté dans le Tableau XIV quelques résultats tirés de la littérature.


Tableau XIV : Niveau basal de 8-oxodGuo mesuré dans l’ADN cellulaire

Techniques 8-OxodGuo /106bases Cellules ou tissus Références

CG-SM 330 cellule de cancer du sein (239)

115 épithéliales bronchiques (251)

20 lymphoblastes (252)

CLHP-DE 8 leucocytes (149)

0,4 lymphocytes (253)

2,5 leucocytes (254)

0,1 foie (209)

0,4 monocytes (**)

0,2 monocytes (*)

Postmarquage 16 leucocytes (172)

66 foie (174)

(*) : étude présente mettant en œuvre la technique de CLHP-DE,

(**) : étude présente mettant en œuvre la technique de CLHP-SM/SM.

La seule technique d’extraction de l’ADN cellulaire ne suffit pas à expliquer les écarts

observés. En effet, des méthodes relativement proches peuvent aboutir à des taux très différents selon

que la méthode de mesure par CG-SM ou par CLHP-DE est utilisée. Cette dernière donne

actuellement les résultats les plus cohérents. En particulier, nous verrons dans le chapitre V qu’elle est

en accord avec les approches indirectes. Ces dernières sont moins sujettes aux artefacts liés à des

phénomènes d’oxydation. Dès 1995, des travaux ont mis en évidence la surestimation des taux de 8-

oxodGuo déterminés par la méthode CG-SM (164, 166). Les valeurs surestimées de 8-oxodGuo

s’expliquent par des phénomènes d’oxydation qui surviennent au cours de l’étape de silylation à

130°C des échantillons. Il a ainsi été montré qu’au cours de cette étape de dérivation, les bases

normales étaient partiellement oxydées. (166). Pour éviter cette oxydation artéfactuelle, deux

approches peuvent être adoptées. La première implique une étape de prépurification par CLHP (163)

ou par chromatographie d’immunoaffinité (38, 255) qui permet d’éliminer les bases normales avant

dérivation. Dans ces conditions, il n’y a plus de possibilités d’oxydation artéfactuelle en raison de

l’élimination du précurseur de la lésion à mesurer. Il est aussi important d’utiliser des standards

internes enrichis isotopiquement pour tenir compte de la perte partielle de matériel au cours des

différentes étapes (prépurification, silylation et analyse par CG-SM). L’utilisation de guanase pour


122

éliminer la guanine a également été décrite (256). Une autre approche consiste à abaisser la

température de dérivation en absence d’oxygène (164) avec l’ajout d’un agent réducteur,

l’éthanethiol (256, 257). Toutefois, la validation des deux dernières méthodes n’a pas encore été

effectuée et les valeurs publiées de 8-oxodGuo, en utilisant ces nouvelles versions sont élevées. La

plupart des travaux reposant sur l’utilisation de la méthode CG-SM sous sa forme originale (258) sont

remis en question (163, 165). On peut remarquer à la lecture du Tableau XV, la grande dispersion

des résultats obtenus pour la mesure d’autres bases modifiées par la méthode CG-SM.

Tableau XV : Niveau basal de différentes lésions mesurées par CG-SM dans l’ADN de cellules (pour

106 bases)

FapyGua FapyAde 8-OxoAde 5-OHdUrd 5-HmdUrd 5-FordUrd Tg Références

109 156 15,6 7 81,7 (218)

55 24 133 12 14 (152)

120,9 16,4 (151)

28,9 65 4,7 36 14,4 (153)

25,6 32,6 29,8 3,8 7,7 16,3 (219)

32 16 30 8 (236)

3,4 0,7 0,1 ≈< 0,5 0,9 0,3 0,8 (*)

(*) : étude présente mettant en œuvre les techniques de CLHP/CG-SM et de CLHP-SM/SM.

Un autre biais méthodologique est lié à l’utilisation d’acide formique à chaud pour hydrolyser

l’ADN. Plusieurs travaux ont montré que son utilisation pouvait altérer la stabilité de certains

composés (224). Il faut s’assurer que les composés sont stables dans les conditions d’hydrolyse. C’est

le cas de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine et de la 8-oxo-7,8-dihydroadénine qui sont stables dans l’acide

formique concentré porté à 140°C pendant 40 min (219, 224, 225). Au contraire, d’autres lésions,

comme la FapyGua et la FapyAde sont instables, donnant lieu à des réactions de recyclisation (226).

Ainsi, un traitement à 150°C pendant 60 min à l’acide formique (88%) entraîne la disparition de 90%

de la FapyGua. On peut ajouter que dans ces conditions, 80% de la 5-OH-5-Me-Hyd, un produit

d’oxydation de la thymine, sont dégradés. Les produits de modification de la cytosine peuvent subir

une désamination qui conduit à la formation des produits correspondants de l’uracile (227).

L’importance de la dégradation de certains composés dépendra de la nature de l’acide (formique le

plus souvent), du temps d’hydrolyse (30 à 45 min) de la température (140°C) (224). Une hydrolyse à

température ambiante est en général compatible avec l’instabilité de la plupart des bases modifiées


(219, 228). Toutefois, dans ces conditions, les bases normales et la plupart des bases modifiées à

l’exception de quelques unes (les dérivés Fapy purines) ne sont pas hydrolysées. La nature et la

proportion des bases affectées par le traitement à chaud à l’acide formique dépendent de sa

concentration et de la température d’hydrolyse. L’instabilité de la liaison N-glycosidique des dérivés

Fapy purines est augmentée après libération de ces composés sous forme de nucléotides. Pour

permettre une hydrolyse plus rapide et plus complète, la méthode d’hydrolyse à froid consécutive à

une digestion de l’ADN en nucléotide par la nucléase P1 a été proposée pour les dérivés Fapy purines

dont la liaison N-glycosidique est particulièrement instable (228). Nous avons, en utilisant cette

nouvelle approche, mesuré un taux de FapyGua dans l’ADN de cellules exposées au rayonnement du60Co de l’ordre de 0,027 FapyGua/106 bases/Gy. La méthode de mesure de la FapyAde par CLHP-

SM/SM a donné un taux de formation de 0,0024 FapyAde/106 bases/ Gy. Cependant, il nous a été

impossible de mesurer par la méthode de CG-SM, le niveau basal de FapyGua et de FapyAde dans

l’ADN de cellules non irradiées. Le niveau basal des dérivés Fapy purines mesuré par CLHP-SM/SM

est, respectivement de 9,6 et de 0,4/106 bases. La formation de la FapyGua est environ deux fois

supérieure à celle de la 8-oxodGuo. Ceci semblerait indiquer, compte tenu du mécanisme de

formation de ces lésions décrit dans la Figure 88, que le milieu cellulaire est plutôt réducteur, ou que

l’accessibilité de l’oxygène à la molécule d’ADN est difficile. Le niveau basal de FapyGua est

supérieur à celui de la 8-oxodGuo. Une des raisons possibles, est que ce taux corresponde au bruit de

fond cellulaire. Toutefois, cette hypothèse est peu probable puisque la 8-oxodGuo et la FapyGua son

des lésions réparées toutes deux par la même ADN N-glycosylase. Une autre possibilité est que le

protocole d’extraction ou d’analyse, optimisé pour réduire l’artefact lié à l’oxydation de la guanine en

8-oxo-7,8-dihydroguanine ne protège pas d’un éventuel artefact conduisant à la formation de dérivé

Fapy de la guanine. Nous avons mis en évidence cet artefact en étudiant l’influence de la

déféroxamine sur le niveau des dérivés Fapy purines mesurés par CLHP-SM/SM.

C. Discussion des taux de formation des lésions

1. Irradiation gamma : 8-OxodGuo, lésion majoritaire ?Les mesures de bases modifiées dans l’ADN de cellules exposées au rayonnement gamma du

cobalt 60 indiquent que les 4 bases de l’ADN sont susceptibles d’être modifiées. Les valeurs des taux

de modification mesurés pour les bases sont comprises entre 0,1 et 10 modifications pour 108 bases

normales, par Gy, données qui concernent la 8-oxodAdo et les diols de thymidine, respectivement.

a) Bases puriques

Les taux de formation des différentes bases puriques modifiées déterminés, respectivement

par CLHP-SM/SM et par CG-SM, sont en désaccord avec la quasi-totalité des résultats des travaux

effectués jusqu’à présent (Tableau XVI) (218, 219, 235). Les nouvelles méthodes qui ont été mises


124

en œuvre permettent, au moins en partie, de s’affranchir des problèmes d’oxydation rencontrés

préalablement au cours de la silylation ou de l’hydrolyse acide inhérents à la technique de CG-SM. Il

est intéressant de constater que la dégradation de l’adénine semble mineure puisque ses deux

principaux produits de dégradation, la FapyAde et la 8-oxodAdo sont formés en quantités très faibles,

comparativement à leurs homologues de la guanine. Des observations similaires ont été effectuées sur

l’ADN isolé, montrant des taux de formation de 8-oxoAde et de FapyAde environ dix fois plus faibles

que ceux de 8-oxoGua et de FapyGua.

Tableau XVI : Formation de bases modifiées dans l’ADN de cellules exposées au rayonnementgamma

Taux de formation/106 bases/Gy

FapyGua FapyAde 8-OxoAde Tg 5-FordUrd 5-HmdUrd 8-OxodGuo Références

0,11 0,04 0,011 0,0095 0,036 (153)

0,8 0,16 0,06 0,2 0,05 0,40 (219)

28S 0,32S

0,32R

1,12

0,48

0,16

0,10

0,32S

0,048R

(236)

0,027 0,0024 0,0035 0,097 0,022 0,029 0,020 (*)

S : lignée radiosensible,

R : lignée radiorésistante,

(*) : étude présente mettant en œuvre les techniques de CG-SM et de CLHP-SM/SM.

La mesure de 8-oxodGuo par CLHP-DE ou par CLHP-SM/SM donne sensiblement le même

taux de formation : respectivement 0,015 et 0,020 8-oxodGuo/106 bases/Gy, dans la même gamme de

doses considérée. Toutefois, le niveau basal de 8-oxodGuo mesuré par CLHP-SM/SM est environ 2 à

3 fois plus élevé que celui déterminé par CLHP-DE. Nous ne sommes pas en mesure actuellement

d’expliquer cet écart.

b) Bases pyrimidiques

Les bases pyrimidiques et en particulier la thymine, semblent particulièrement sensibles à

l’action du rayonnement gamma. En effet, l’ensemble des diols de thymidine, de la 5-FordUrd et de la

5-HmdUrd se forment en quantités environ deux fois supérieures à celle des bases puriques modifiées

(8-oxodGuo, FapyGua, 8-oxodAdo, FapyAde). Il serait cependant très intéressant d’étendre les

mesures à l’oxazolone et à plusieurs produits de réduction des bases pyrimidiques.


c) Conclusion

La 8-oxodGuo n’est donc pas la lésion radio-induite majoritairement formée dans l’ADN

cellulaire, contrairement à ce qui a été observé dans le cas de l’irradiation d’ADN isolé de thymus de

veau en solution aqueuse aérée (226). La seule prise en compte de la formation de la 8-oxodGuo qui

est généralement utilisée comme marqueur biologique du stress oxydant ne peut, dans le cas d’une

irradiation gamma, donner qu’une vision très partielle des effets du rayonnement ionisant sur l’ADN

cellulaire.

2. Irradiation au LASER UV de haute intensitéLe rendement quantique relatif à la formation de 8-oxodGuo est environ inférieur d’un facteur

10 à celui déterminé dans de l’ADN isolé de thymus de veau par Angelov et al. (259). La différence

observée peut s’expliquer pour plusieurs raisons :

a) Perte de lumière par diffusion

Du fait de la densité optique élevée de la suspension cellulaire, une partie de la lumière émise

est perdue par diffusion.

b) Le système d’irradiation

Les irradiation ont été effectuées dans une cuve de quartz de 1 ml. Dans de telles conditions,

une partie du faisceau est atténuée par l’épaisseur de la matière à traverser. Le rendement quantique

est de ce fait d’autant diminué. L’échantillon idéal doit être suffisamment mince pour palier ce

problème. Il doit posséder une densité optique inférieure à 0,1 (260).

c) Absorption par d’autres constituants cellulaires

Des acides aminés comme le tryptophane, des protéines et les ARN peuvent absorber à 266

nm (261).

d) Différence entre ADN isolé et ADN cellulaire

L’ADN cellulaire présente une configuration très différente de l’ADN isolé. Il est en

particulier compacté et associé à des protéines qui peuvent influer sur la nature des réactions

chimiques produites en son sein.

e) Comparaison : Irradiations gamma et UV LASER

Dans le Tableau XVII, on compare les rapports entre les formations des différentes lésions

produites dans l’ADN cellulaire par une exposition au rayonnement gamma ou au rayonnement UV

LASER bi-photonique. Nous ne disposons pas actuellement de résultats relatifs à la mesure du taux de

formation de la FapyGua après irradiation UV LASER.


126

Tableau XVII : Comparaison des rapports des différentes lésions mesurées dans l’ADN cellulaire

induite par une exposition au rayonnement gamma ou au rayonnement UV LASER

Rapports Irradiation gamma Irradiation LASER

8-OxodGuo/ensemble des autres bases modifiées 0,11 4,9

Diols de thymidine/8-oxodAdo 27 10

Bases puriques*/bases pyrimidiques modifiées 0,33 5,3

* : somme des taux de formation de la 8-oxodGuo, de la 8-oxodAdo et des dérivés Fapy purines.

Le Tableau XVII montre que l’irradiation LASER, utilisée pour déterminer la composante

ionisante de l’effet direct du rayonnement gamma, conduit principalement à la formation de 8-

oxodGuo. Si toutes les lésions semblent se former, elles sont produites en quantités bien inférieures et

représentent moins de 15% du taux de 8-oxodGuo. L’irradiation UV LASER induit la formation de 8-

oxodAdo dans des proportions relativement importantes. Le rayonnement gamma est à l’origine d’un

spectre de bases modifiées plus homogène, ce qui corrobore la prédominance de l’effet indirect, via la

radiolyse de l’eau. Il faut cependant ajouter que le taux élevé de 8-oxodGuo peut s’expliquer par deux

processus. Le premier pourrait impliquer les réactions de transfert de trous positifs (cations radicaux)

formés sur les différentes bases vers les bases guanines (262). La guanine qui possède le potentiel

d’ionisation le plus faible apparaît être un piège des trous positifs lorsqu’ils se déplacent le long de la

chaîne d’ADN. Compte tenu du mécanisme de formation de la 8-oxoGua et de FapyGua, on peut

s’attendre à mesurer des taux relativement élevés de cette dernière lésion. La mesure de la FapyGua

permettrait aussi de confirmer que la formation de 8-oxodGuo découle d’un mécanisme d’ionisation

et non d’oxydation par 1O2. En effet, le rayonnement LASER que nous utilisons possède une

composante mono-photonique. Dans ce cas le rayonnement se comporte comme un rayonnement

ultra-violet et des lésions de type dimères cyclobutyles de pyrimidines peuvent se former.

Des réactions de photosensibilisation par les bases de l’ADN elles-mêmes, peuvent également

avoir lieu et être à l’origine d’oxygène singulet.

3. Irradiation UVA et réactions de photosensibilisationLes taux de 8-oxodGuo mesurés dans l’ADN de cellules photosensibilisées par le rose bengal

ou l’acridine orange en présence de lumière sont relativement importants si on les compare à ceux

déterminés après irradiation gamma. Ces agents ont en effet été décrits comme agissant par des

mécanismes de type II (263-265). Comme cela a déjà été abordé, la formation de 8-oxodGuo peut

s’expliquer principalement par une oxydation par l’oxygène singulet (263).


L’existence d’un mécanisme de type II est corroboré par l’absence de détection des dérivés

Fapy purines aux faibles concentrations de photosensibilisateurs. Lorsque ces derniers sont utilisés à

une concentration environ 100 fois plus élevée, le taux de 8-oxodGuo est multiplié par un facteur

compris entre 30 et 40. Les dérivés Fapy purines deviennent alors détectables. Leur taux de formation

représente environ 25 à 30% de celui de la 8-oxodGuo, ce qui tend à confirmer, que même pour ces

fortes concentrations de photosensibilisateurs, la réaction de type II reste prédominante. Bien que

minoritaire, l’implication de mécanismes de type I ou d’oxydation par les radicaux hydroxyle peut

expliquer la formation des dérivés Fapy purines.

Dans le cas de l’irradiation UVA, il n’est pas possible, à partir des présentes données, de tirer

des conclusions définitives concernant les mécanismes d’oxydation mis en jeu. Toutefois les taux

élevés de 8-oxodGuo et l’absence apparente de dérivés Fapy purines semblent indiquer un mécanisme

de type II. Le taux de formation de 8-oxodGuo est, par kJ.m-2, quasiment identique à celui mesuré par

Gy, dans le cas de l’irradiation gamma. Or dans ce dernier cas, aucun dérivé Fapy n’a pu, compte tenu

du manque de sensibilité de notre méthode, être mis en évidence en dessous de 250 Gy. Il aurait pour

cette raison, été intéressant de pouvoir délivrer une dose d’UVA de 250 kJ.m-2. Mais, l’application de

telles doses auraient requis des temps d’irradiation beaucoup trop longs qui auraient

vraisemblablement permis une réparation au moins partielle des lésions.

- Chapitre IV -

Mesure des dommages de l’ADN par la

méthode des comètes

Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 129

IntroductionLes mesures des coupures simple (CSB) et double brin (CDB) ont fait l’objet de nombreux

travaux en raison principalement de la forte implication des CDB dans la létalité radio-induite.

D’autre part, les techniques mises en jeu dans la détermination des CDB ont été adaptées à la mesure

d’autres dommages (266). Plusieurs méthodes ont été proposées au cours des quarante dernières

années. Nous en présenterons brièvement le principe pour nous attarder sur la méthode de

microélectrophorèse de cellules isolées sur gel.

I. METHODES DE MESURE DES COUPURES DE BRINS DE L’ADN

A. Sédimentation sur gradient de sucroseUtilisée initialement pour déterminer la taille des molécules d’ADN, la technique de

sédimentation sur gradient de sucrose a ensuite été utilisée pour déterminer le nombre de coupures

simple brin (267). La méthode a été confrontée à plusieurs problèmes méthodologiques, tels que

l’effet de la vitesse de sédimentation sur les longs fragments d’ADN, l’instabilité du gradient, etc.

(268). De plus, la sensibilité de cette technique, du fait de l’existence d’un bruit de fond généré par la

manipulation des cellules (269), est relativement faible.

B. Méthode basée sur la relaxation de l’ADNLe principe de cette technique repose sur l’observation que la présence de coupures au sein

d’un ADN accélère la migration électrophorétique de la molécule dans un gel d’agarose en milieu

alcalin (26, 270). Les membranes cellulaires sont lysées en milieu basique. La solution est ensuite

neutralisée et une chromatographie sur colonne d’hydroxyapatite permet de séparer CSB et CDB. La

méthode a été utilisée par Rydberg et Johansson en 1978 sur des cellules isolées (271). Une

coloration de l’ADN au bromure d’éthidium permet d’estimer les proportions relatives d’ADN intact

et d’ADN fragmenté.

C. Sédimentation de nucléoïdeL’ADN de phage ou de cellules de mammifère se présente avec une structure plus ou moins

enroulée sur elle même. La formation de CSB entraîne une relaxation de la structure qui se traduit par

une migration plus lente sur un gradient de sucrose (272, 273).

D. Méthode de « Nick translation »Les cellules sont perméabilisées et les extrémités 3’-OH résultant des coupures de brins sont

marquées par des 2-désoxyribonucléosides triphosphate radioactifs à l’aide d’une ADN polymérase I

(274, 275). L’ADN polymérase, qui possède une activité exonucléase 5’-3’ se déplace le long de la

130 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes

double hélice (translation) dans le sens 5’-3’ jusqu’à rencontrer un site avec des contraintes de

structure ou une deuxième coupure simple brin.

E. Electrophorèse en champ pulséLes cellules sont incluses dans des puits d’agarose et leurs membranes plasmique et nucléaire

sont ensuite lysées. Après un traitement adéquat (protéase et RNase), les molécules d’ADN se

déplacent sous l’action d’un champ électrique au sein d’un gel d’agarose et ce, d’autant plus qu’elles

sont de taille réduite. Les molécules d’ADN, ont été préalablement marquées par incubation des

cellules en présence de précurseurs 3H ou 14C. Cette technique est particulièrement utilisée pour la

mesure des CDB et est adaptée aux grandes molécules d’ADN. Plusieurs modifications

méthodologiques ont été apportées telles que l’utilisation de champ inversé ou perpendiculaire (276-

279).

F. La méthode d’élution sur filtreC’est une des techniques les plus faciles à mettre en œuvre. Elle repose sur l’utilisation de

filtre de polycarbonate pour discriminer les fragments d’ADN cellulaire en fonction de leur taille. La

méthode peut être utilisée pour la mesure des pontages ADN-protéines, des CSB des CDB et des sites

alcali-labiles. Les cellules incluses dans une solution de lyse sont déposées sur un filtre. La plupart du

contenu cellulaire hors ADN est éliminé par gravité. Une solution alcaline est ensuite délivrée sous

l’action d’une pompe et l’éluant est recueilli sous forme de diverses fractions. L’élution des fragments

d’ADN qui sont éliminés du filtre montre une relation semi-logarithmique avec la masse (280-282).

Malgré la très grande sensibilité de la méthode, divers travaux ont montré l’influence de facteurs

extrinsèques tels que le pH de lyse (283), la composition des tampons utilisés (280, 284) et la phase

du cycle cellulaire (285). Effectuée en milieu neutre, elle reste néanmoins particulièrement adaptée à

la mesure des CDB aux faibles doses d’irradiation gamma (286). La méthode peut être utilisée pour la

détection de dommages de l’ADN dus à des agents pontants (mitomycine, cis-platine) (287).

G. La méthode des comètes ou méthode de microélectrophorèsesur gel

En 1978, Rydberg et Johanson proposent la méthode des comètes. Pour cela, ils incluent des

cellules dans un gel d’agarose placé sur une lame de microscope. Les membranes plasmique et

nucléaire sont ensuite lysées en milieu alcalin doux, avant que l’ADN soit coloré avec de l’acridine

orange. La fluorescence rouge ou verte observée, selon que l’acridine est liée à de l’ADN simple ou

double brin, permet d’évaluer le rapport des deux classes de coupures. Afin d’augmenter la sensibilité

de la méthode, Ostling et Johanson (1984) (288) ont introduit une étape d’électrophorèse en milieu

neutre. Leur hypothèse était que les fragments d’ADN migrent d’autant plus qu’il sont petits, et qu’ils

sont d’autant plus nombreux que l’ADN est sectionné. En 1988, Singh introduit l’électrophorèse en

milieu alcalin (289). La méthode permet la révélation des coupures des brins de l’ADN et des sites


labiles en milieu basique. En permettant la détection d’une coupure simple brin/ 6 107 bases, la

méthode est beaucoup plus sensible que la plupart des techniques utilisées jusqu’alors (Tableau

XVIII).

Tableau XVIII : Sensibilité de diverses techniques de mesure des coupures simple brin

Méthodes Références Sensibilité

Sédimentation sur gradient de sucrose (290) 1 coupure/ 6-15 105 bases

Relaxation de l’ADN (291) 1 coupure/ 2-3 107 bases

Electrophorèse alcaline sur gel (292) 1 coupure/ 1 107 bases

Elution alcaline (282) 1 coupure/ 0,6-1 107bases

Microélectrophorèse sur gel (293) 1 coupure / 6 107 bases

Un autre intérêt de la méthode est l’analyse des dommages effectuée, cellule par cellule. Il est

ainsi possible au sein d’une population de distinguer des sous-populations, ce qui n’est pas le cas des

analyses globales de modifications de l’ADN. Ne nécessitant qu’un très faible nombre de cellules, elle

est particulièrement adaptée aux études cliniques (294-297).

1. Principe de la méthode des comètes en milieu alcalinLa méthodologie suivie consiste à inclure des cellules dans un gel d’agarose déposé sur une

lame de microscope (Figure 90). Les membranes plasmique et nucléaire sont ensuite lysées. Les lames

sont alors incubées dans un milieu alcalin fortement salin, qui permet la décondensation de l’ADN,

laquelle s’explique en partie par la perte des protéines de type histones. Sous l’action d’un champ

électrique, l’ADN qui est chargé négativement se déplace vers l’anode. Le modèle de migration

d‘ADN au sein d’un gel d’agarose décrit par Deutch (1988) (298) ne peut que partiellement

s’appliquer à la méthode des comètes. En effet la structure superenroulée de l’ADN formée autour des

nucléosomes persiste. Il en résulte que l’ADN est encore maintenu dans une structure appelée

nucléoïde. Le modèle de l’ADN sous forme de nucléoïde a été décrit par Cook et al. (272, 273).

Dans cette structure, l’ADN serait constitué de plusieurs brins qui se comportent comme des

chromosomes uniques (299) et qui seraient reliés à un ou plusieurs sites communs de la membrane

nucléaire (300). Cette fixation se ferait par l’intermédiaire de protéines (299, 301). La migration de

l’ADN n’est pas possible tant que l’ADN est fixé à cette matrice nucléaire. Une rupture de brin,

induite par les rayonnements, suffit à relâcher l’ensemble et à permettre la migration des boucles

d’ADN hors du nucléoïde. Il est alors possible d’observer, après coloration de l’ADN (bromure

d’éthidium, YOYO-1, DAPI) cette migration. L’ADN est réparti entre le nucléoïde (qui représente la


tête de la comète) et la queue de la comète. L’importance des dommages peut être évaluée par une

analyse sous microscope couplée à un traitement d’images.

Cellules Gelsd'agarose

Lame demicroscope

60Co

Marquage de l’ADN au BEt et analyse des lames

Lyse des membranes plasmique et nucléaire

Electrophorèse (pH 13)

Cellule :

peu modifiée

très modifiée

témoin

sens de migration de l’ADN

- +

microscope

Cellules Gelsd'agarose

Lame de

X, γ, γ, γ, γ, UV, etc....

Lyse des membranes plasmique et nucléaire

nucléoïde

Electrophorèse en milieu alcalin

coloration de l'ADN et analyse microscopiquedes lames

nucléoidenucléoïde

Electrophorèse en milieu alcalin

Figure 90 : Principe de la méthode des comètes

Différents paramètres, comme le moment de la queue de la comète, permettent de quantifier

ces dommages. Plusieurs améliorations portant sur la nature du colorant de l’ADN, sur l’utilisation de

protéases et de RNase, sur les conditions de lyse, sur les paramètres de l’électrophorèse et de

l’analyse des lames en font un outil très adapté à la mesure de faibles niveaux de dommages (293,

302-306). La méthode a été utilisée sur des cellules isolées du sang (307), sur des cellules en culture

(308), sur des colonocytes (309), sur les cellules des cryptes intestinales (310), sur les pneumocytes

ou sur les macrophages des alvéoles pulmonaires (311). Les tissus peuvent également être le support

de ces expérimentations (312, 313). Il est possible en fonction de la nature du tampon neutre ou


alcalin de mettre en évidence les cassures simple ou double brin (302, 314). La méthode a également

été utilisée pour étudier les cinétiques de réparation des cassures sans présager de la fidélité de cette

réparation (295, 303, 315, 316). Elle a permis d’estimer l’hétérogénéité des réponses au sein d’une

population cellulaire qu’il s’agisse de population radiosensible ou mal oxygénée (305, 317-320). La

méthode a aussi été employée pour mettre en évidence des adduits du cis-platine et de moutardes

azotées (306, 321) ou des pontages ADN-protéine (dus à l’étoposide) (322).

2. Objectifs de l’étudeDans ce quatrième chapitre, nous proposons d’utiliser la méthode des comètes, pour mesurer

les dommages de bases de l’ADN. La méthode sous sa forme standard, c’est à dire telle qu’elle vient

d’être décrite, permet de mettre en évidence simultanément les coupures simple (CSB) et double brin

(CDB) de l’ADN ainsi que les sites alcali-labiles (SAL). Associée à des enzymes de réparation, telles

que Fpg ou endo III, la méthode permet de révéler des bases modifiées, substrats des enzymes. Les

protéines Fpg et endo III qui possèdent une action endonucléasique produisent des coupures de l’ADN

aux sites des bases modifiées, selon les mécanismes décrits dans le chapitre I et représentés

schématiquement dans la Figure 91.

Fpg

(2)

O

NH

NN

N

NH2O

H

H

Extrémité 3'OH

O

OO

Base 2OHPOOH

Fpg

OO

OPOOH

OO

OPOOH

O

NH

NN

N

NH2

O

H

(1)

Extrémité 3'OHO

OO

Base 2

Cassure simple brin (CSB) 8-oxo-7,8-dihydroguanine

+

Extrémité 5'OHBase 1

(1) coupure de la liaison N-glycosidique

(2) action endonucléasique

Extrémité 5'OH

OHO P

O

OO

OH

Base 1

Figure 91 : Induction d’une coupure de chaîne de l’ADN par l’action de Fpg (Schéma simplifié)

Les premiers travaux mettant en évidence des bases modifiées de l’ADN sous irradiation

gamma ont été décrits dès 1972. Ils utilisaient des extraits bactériens de Micrococcus luteus (323).

Associés à la méthode d’élution alcaline, ils ont fait l’objet de plusieurs études parmi lesquelles

figurent celles de Fornace (324) et de van Loon et al. (325, 326). L’utilisation ultérieure d’enzymes

de réparation est apparue avec les travaux de Collins et al. (159) pour la méthode des comètes, et

ceux de Epe et al. (264) pour la méthode d’élution alcaline sur filtre. L’utilisation de cette nouvelle

approche a permis d’apporter des réponses semi-quantitatives là où des mesures plus spécifiques

avaient échoué. C’est en particulier le cas d’études d’incidences des cancers chez des populations


ayant reçu des régimes alimentaires contenant un apport d’antioxydants (327, 328) ou exposées à de

faibles doses de rayonnement (296, 297). La méthode d’élution alcaline sur filtre associée à des

enzymes de réparation a elle aussi fait l’objet de nombreux travaux (160, 264, 329-335).

Les principales bases modifiées substrats de l’enzyme Fpg sont la 8-oxodGuo, ainsi que la

FapyGua et la FapyAde (101). L’endonucléase III reconnaît, de façon préférentielle, la 5-hydroxy-5-

méthylhydantoïne et les diols de thymine (129). Après l’étape de lyse des membranes cellulaires, les

solutions enzymatiques contenant Fpg ou endo III sont déposées sur les lames et ces dernières sont

incubées à 37°C pendant 45 min. Les lames sont ensuite placées dans le tampon d’électrophorèse

pendant 20 min avant la poursuite du protocole. Dans la première partie de ce chapitre, nous

discuterons de l’optimisation de la méthode des comètes, utilisée d’une part sous sa forme standard et

d’autre part associée à Fpg ou à endo III. La méthode sera ensuite utilisée pour mesurer les

dommages, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma du cobalt 60, au rayonnement

UVA. Elle permettra aussi de mesurer ceux induits par l’acridine orange ou le rose bengal, excités par

la lumière visible.

II. OPTIMISATION DE LA MESURE DES DOMMAGES DE L’ADN PAR LAMETHODE DES COMETES

A. Le « tail moment » ou « moment de la queue de la comète »L’analyse par microscopie à fluorescence des lames portant les gels peut être effectuée

manuellement. Toutefois, une analyse à l’aide des logiciels de traitement d’images est plus

communément utilisée. Dans le premier cas, les cellules sont classées en catégories en fonction de

l’importance des dommages. Dans le deuxième cas, le logiciel permet de quantifier les intensités de

fluorescence des différentes parties de la comète. Il existe de nombreux paramètres, basés sur ces

valeurs d’intensité, pour estimer le nombre de coupures de l’ADN. Nous avons choisi parmi ceux-ci,

d’utiliser le « tail moment » ou « moment de la queue de la comète». Ce paramètre directement

proportionnel au nombre de coupures, est un rapport d’intensités de fluorescence, multiplié par une

longueur. Son unité est donc une distance, le micromètre (Figure 100).

intensité de fluorescence de la queue longueur de la queue«moment de la queue» =intensité de fluorescence de la tête

B. Méthode standard des comètesLa grande sensibilité de la technique de microélectrophorèse sur gel, en fait un outil très

précieux pour la mesure des dommages induits par de faibles doses d’irradiation. La gamme de doses

d’irradiation gamma a été choisie en partie, à la vue du taux de survie de notre modèle cellulaire,

après exposition à ce rayonnement.


A cette fin, un test au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium

(MTT) a été effectué 24 h ou 48 h après irradiation (Tableau XIX).

Tableau XIX: Survie cellulaire de monocytes exposés à différentes doses de rayonnement gamma

(déterminée par un test au MTT)

Dose (Gy) Survie (en %) à 24 h Survie (en %) à 48 h

0 100 982 89 894 76 728 66 7515 52 56

L’analyse des dommages par la méthode des comètes a été effectuée dans une gamme de

doses de rayonnement gamma comprises entre 0 et 8 Gy. Cette gamme de doses, permet d’obtenir un

taux de survie proche de 75% à 48 h. Le choix des doses d’irradiation gamma, devait prendre en

considération, d’une part l’objectif de mieux connaître les dommages oxydatifs de l’ADN produits par

de faibles doses d’irradiation, mais aussi la nécessité de disposer de doses suffisamment élevées pour

permettre la formation significative des lésions étudiées. C’est en particulier le cas des substrats des

enzymes de réparation. Les mesures par CLHP-DE et par CG-SM ont en effet montré que la 8-

oxodGuo et le FapyGua, se formaient en quantités relativement faibles (Chapitre III).

La grande sensibilité de la méthode des comètes est paradoxalement aussi un de ses points

faibles, puisque la méthode est aussi très sujette à des facteurs externes susceptibles de moduler la

réponse de la technique. Parmi ces facteurs, la qualité du gel, la température des tampons utilisés, la

préparation des cellules (conditions de culture, manipulation des cellules, etc.), etc., sont autant de

paramètres susceptibles d’influer sur la qualité des résultats. Le gage d’une bonne expérience est

l’absence de « moment de la queue » mesuré dans les cellules témoin. La méthode repose sur une

analyse statistique, effectuée sur plusieurs cellules au sein du gel d’une lame, et sur plusieurs lames

par classe d’échantillon. L’analyse des dommages d’un nombre élevé de cellules et de lames, permet

de limiter l’influence des variations propres aux conditions expérimentales. Pour ces différentes

raisons, nous proposons ici des conditions qui nous paraissent satisfaisantes pour obtenir une bonne

reproductibilité de la méthode. Une analyse de 50 cellules par lame et d’au moins trois lames par

condition d’irradiation permet de couvrir l’hétérogénéité de la réponse qui peut exister pour une

même dose d’irradiation. De plus, l’établissement de courbe dose-réponse est préférable à l’analyse

effectuée à partir des résultats d’une seule dose d’irradiation. Il est possible d’observer des valeurs de

moment de la queue supérieures, pour des cellules irradiées à des doses plus faibles (5 versus 6 Gy).

La méthode reposant sur une analyse statistique, une reproduction en triple de l’expérience permet

d’atténuer ces variations. Les cellules étant distribuées selon une loi normale en fonction des


différentes classes de dommage, la valeur moyenne du moment de la queue a été utilisée. En

respectant ces conditions, nous avons obtenu une très bonne reproductibilité de la méthode sous sa

forme standard, avec des variations inférieures à 15% sur les pentes dose-réponse établies.

C. Méthode des comètes couplée à l’utilisation de Fpg et d’endo IIIL’utilisation d’enzymes de réparation est nettement plus délicate à mettre en œuvre. Elle

requiert, pour palier les variations obtenues d’une expérimentation à l'autre, la répétition des

expériences en quadruple ou quintuple. Trois lames doivent être analysées par expérimentation. Une

modification a été apportée au niveau de la concentration et du nombre de gels. De nombreux

protocoles impliquent l’inclusion des cellules dans un gel à 0,6% reposant sur un premier gel

d’agarose à 0,6% et recouvert ensuite par un troisième à 0,6%. L’utilisation des enzymes de

réparation nous a conduit à ne pas déposer de troisième gel et à élever la concentration du premier et

deuxième, respectivement à 1 et 1,2%. Ce changement de concentration influe, sur la réticulation du

gel. Il se traduit par une amélioration de la résolution du signal tout en accroissant la résistance

mécanique du gel, face aux différents traitements. Il était par ailleurs, plus approprié à l’application

d’un voltage et d’un ampérage relativement élevés (respectivement 25 Volts et 300 mA).

Il semblait possible que l’hétérogénéité de réponse obtenue en présence d’une enzyme de

réparation, telle que Fpg, pouvait s’expliquer par des différences d’accessibilité de l’enzyme aux sites

substrats. Nous avons donc chercher à améliorer cette accessibilité en effectuant une électrophorèse

de courte durée consécutive à l’étape de lyse des cellules et précédant l’étape d’incubation en

présence de l’enzyme.

1. Etape de « préélectrophorèse »Cette étape supplémentaire en permettant une migration de l’ADN, avait pour objectif de

décondenser l’ADN et le rendre ainsi plus accessible aux enzymes. Pour cela, des lames portant des

cellules irradiées à 8 Gy et préalablement lysées, ont été incubées dans un tampon de

préélectrophorèse (300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA, 2% DMSO) pendant 20 min avant de subir une

première électrophorèse d’une durée de 3, 6 ou 9 min (25 V, 300 mA). Les lames ont ensuite été

rincées et les solutions contenant les enzymes de réparation ont été déposées. Les lames ont alors été

incubées pendant 45 min à 37°C. Elles ont été ensuite placées dans le tampon d’électrophorèse

pendant 20 min avant qu’une électrophorèse soit effectuée (25 V, 300 mA) pendant 20 min.

Nous avons dans ces conditions, constaté une diminution de la dispersion des valeurs

obtenues entre les trois lames analysées (de 37% à 14%) pour les différents temps de

préélectrophorèse. Nous avons également observé une augmentation du moment de la queue de la

comète (Figure 92).


Temps de préélectrophorèse (min)

Moment de la queue (µm)

73,170,660,8

0

50

100

3 6 9

37 % 19,4 % 14 %

Figure 92 : Influence du temps de préélectrophorèse sur la reproductibilité

Ce résultat a montré l’intérêt de cette étape additionnelle. Il était cependant nécessaire de

définir le temps optimal de la durée de la préélectrophorèse. Afin de ne pas être confrontés à des

problèmes de saturation de réponse de la méthode (valeurs supérieures à 120 µm), nous avons répété

la même expérience sur des cellules non irradiées (Figure 93).

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25 30


Temps de préélectrophorèse (min)

Figure 93 : Influence du temps de préélectrophorèse : monocytes contrôle

Dans ces conditions, la valeur maximale de la réponse est atteinte en 10 min. On obtient le

même profil sur des cellules irradiées à 2 Gy et 4 Gy (Figures 94 et 95, respectivement). Dans ce

dernier cas, le moment de la queue de la comète est compris entre 55 µm et 100 µm, respectivement

pour les cellules contrôle et pour les cellules irradiées (valeur moyenne proche de 70 µm). Le moment

de la queue de la comète atteint un plateau au bout de 20 min de préélectrophorèse.


0

20

40

60

80

100

0 5 10 20Temps de préélectrophorèse (min)


Figure 94 : Influence du temps de préélectrophorèse : monocytes exposés à 2 Gy

0

20

40

60

0 5 10 20

Temps (min)


Figure 95 : Influence du temps de préélectrophorèse : monocytes exposés à 4 Gy

La première courbe dose-réponse reliant le moment de la queue de la comète à la dose a

montré une augmentation de 1,7 µm/Gy correspondant aux coupures, et de 2,3 µm/Gy en présence de

Fpg (Figure 96). L’utilisation de la préélectrophorèse s’accompagne d’un « tassement » des valeurs

vers le haut, si bien que même pour des doses comprises entre 2 et 8 Gy, l’augmentation du moment

de la queue de la comète reste faible.


y = 2,3 x + 52,9

R2 = 0,81

y = 1,7 x + 13,7

R2 = 0,980

20

40

60

80

0 2 4 6 8

CSB + CDB + SAL +sites Fpg

CSB + CDB + SAL

Dose (Gy)


Figure 96 : Courbe dose-réponse obtenue en présence d’une préélectrophorèse de 10 min

Toutefois, le rapport entre les deux pentes dose-réponse obtenues ((CSB + CDB +SAL + sites

Fpg)/(CSB + CDB + SAL)) est de 1,3. Il est identique à celui déterminé dans le paragraphe III-A 1).

Une plus grande accessibilité de l’enzyme à ses sites substrats se traduirait par une augmentation du

rapport précédent. Cela veut donc dire que l’utilisation de la préélectrophorèse n’augmente pas

l’accessibilité de l’enzyme à l’ADN. De plus, la pente de la courbe dose-réponse en absence ou en

présence de Fpg est plus faible. La sensibilité de la méthode utilisant la préélectrophorèse est par

conséquent inférieure à celle obtenue en absence de cette étape additionnelle.

2. Composition du tampon d’électrophorèseL’augmentation du moment de la queue de la comète induite par l’étape de préélectrophorèse

peut s’expliquer par une plus grande vulnérabilité de l’ADN aux réactions d’oxydation par les espèces

réactives de l’oxygène. Nous avons, pour palier ce phénomène, utilisé des composés connus pour leur

propriété antioxydante ou anti-radicalaire.

a) Influence de la déféroxamine

L’efficacité de la déféroxamine à réduire l’oxydation de l’ADN cellulaire lors des expériences

d’extraction, nous a naturellement conduit à utiliser ce chélateur du fer dans le tampon

d’électrophorèse (300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA) à raison de 0,1 mM de déféroxamine. Une

préélectrophorèse de 10 min (25V, 300 mA) a été effectuée avant le traitement par Fpg et

l’électrophorèse de 10 min (25 V, 300 mA). La Figure 97 ne montre aucun effet significatif de la

déféroxamine sur le nombre de sites reconnus par Fpg.


0

10

20

30

40

50

déf. (-)Fpg (-)

déf. (-)Fpg (+)

déf. (+)Fpg (-)

déf. (+)Fpg (+)


Figure 97 : Influence de la déféroxamine (déf.) sur le moment de la queue de la comète en présenceou non de Fpg (monocytes contrôle)

b) Influence du DMSO et du Tris

Deux autres composés, le Tris et le DMSO, connus pour leurs propriétés de capteurs de

radicaux ont aussi été ajoutés au tampon d’électrophorèse de composition 300 mM de NaOH, 1 mM

de Na2EDTA, 20 mM de Tris (Figure 98).

10

20

30

40

50

0DMSO (-)Fpg (-)

DMSO (-)Fpg (+)

DMSO (+)Fpg (-)

DMSO (+)Fpg (+)


Figure 98 : Influence du DMSO sur le nombre de sites reconnus par Fpg

La comparaison des différentes expériences permet d’écarter toute influence du Tris sur le

nombre de sites Fpg. Aucun effet significatif de l’apport du DMSO (2%) n’est également montré

(Figures 97 et 98). Ces résultats nous ont permis d’écarter l’utilisation de chélateurs ou de piégeurs de

radicaux dans la méthodologie mise en œuvre.

L'utilisation de la préélectrophorèse, ne permet pas d'améliorer l'accessibilité de l’enzyme à

ses substrats (pas d’augmentation du rapport entre le nombre de sites Fpg et le nombre de coupures)

Au contraire, on observe même une diminution de la sensibilité de la méthode qui s’explique par un


« tassement » des valeurs vers le haut. L’étape de préélectrophorèse ne sera par conséquent pas

utilisée dans toute la suite de ce travail.

III. UTILISATION DE LA METHODE DES COMETES COUPLEE A FPG ET ENDO III

A. Monocytes exposés au rayonnement gamma du 60CoLa méthode a été utilisée sous sa forme standard et associée à Fpg et/ou endo III, pour mettre

en évidence les divers dommages dans l’ADN de cellules exposées à des doses de rayonnement

gamma du 60Co, comprises entre 0 et 8 Gy. Les Figures suivantes montrent des corrélations entre le

moment de la queue de la comète et la dose d’irradiation gamma délivrée.

1. Utilisation de la FpgEn l’absence d’enzyme de réparation, une régression linéaire relie le moment de la queue de

la comète à la dose. La pente obtenue est de 7,8 µm/Gy correspondant à la formation des cassures

simple et double brin (CSB et CDB) et des sites alcali-labiles (SAL). Par la suite, nous désignerons

ces trois catégories de lésions sous le terme CB. En présence de Fpg, la valeur de la pente augmente

jusqu’à 10,6 µm/Gy. Le moment de la queue mesuré dans les cellules contrôle est respectivement de

16,9 et 29,2, en absence ou en présence de Fpg (Figure 99).

0

40

80

120

0 2 4 6 8

Dose (Gy)


y = 7,8 x + 16,92 R = 0.9985

y = 10,6 x + 29,22 R = 0.9947

CSB + CDB + SAL

CSB + CDB + SAL+ sites Fpg

Figure 99 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnus parFpg, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma

La Figure 100 correspond à la visualisation par microscopie à épifluorescence, de cellules

témoin et irradiées à 8 Gy traitées ou non par Fpg.


cellules témoin cellules témoin traitées avec Fpg

cellule irradiée à 8 Gy

tête queue

cellule irradiée à 8 Gy et traitée par Fpg

Figure 100 : Observation par microscopie à épifluorescence de cellules témoin ou irradiées, traitéesou non par Fpg (ADN coloré au bromure d’éthidium)

2. Utilisation de l’endonucléase IIIL’utilisation de l’endonucléase III pour mettre en évidence les bases pyrimidiques modifiées,

permet d’obtenir les résultats présentés dans la Figure 101. On note une augmentation de la pente de

la droite de régression linéaire reliant le moment de la queue de la comète à la dose. Elle passe ainsi

de 7,8 µm/Gy à 11 µm/Gy. Le moment de la queue correspondant aux sites reconnus par endo III dans

les cellule contrôle est de 29,5 µm.


0

40

80

120

0 2 4 6 8

y = 7,88 x + 18,3R2 = 0,9839

y = 11,01 x + 29,5R2 = 0,9581

CSB + CDB +SAL+ sites endo III

CSB + CDB +SAL


Dose (Gy)

Figure 101 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar endo III, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma

3. Utilisation simultanée de l’endonucléase III et de la FpgLorsque les deux enzymes sont utilisées simultanément, une augmentation de 5,2 µm/Gy de la

pente reliant le moment de la queue de la comète à la dose d’irradiation a été observée (Figure 102).

y = 12 x + 26,82

R = 0,9687

y = 6,8 x + 13,8

R2 = 0,9981

Dose (Gy)


0

40

80

120

160

0 2 4 6 8

CSB + CDB + SAL+ sites Fpg + sites endo III

CSB + CDB + SAL

Figure 102 : Augmentation du moment de la queue de la comète mesurée en présence de Fpg etd’endo III par la méthode des comètes, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma

Cette augmentation est de 76% par rapport à la pente obtenue en l’absence des deux enzymes

de réparation. Elle semble indiquer un effet additif des deux enzymes, dans le cas de cellules exposées

au rayonnement gamma et laisse supposer que les enzymes de réparation reconnaissent des substrats

différents. Toutefois une augmentation de 13 µm seulement a été observée dans les cellules contrôle

alors qu’un effet additif aurait donné une valeur de 23,5 µm.


B. Monocytes exposés au rayonnement UVALa méthode modifiée des comètes a également été utilisée pour mesurer les dommages de

l’ADN de monocytes exposés à des doses d’UVA comprises entre 0 et 150 kJ.m-2.

1. Utilisation de la FpgEn absence de Fpg, une pente de 0,056 µm/kJ.m-2 est observée avec un moment de la queue

dans les cellules contrôle de 10,1 µm. La reconnaissance des sites Fpg entraîne une augmentation dela pente qui atteint 0,17 µm/kJ.m-2 (Figure 103).

y = 0,17 x + 17,7

y = 0,056 x + 10,1R

2 = 0,8738

0

20

40

60

0 50 100 150Dose (kJ.m-2)


CSB + CDB + SAL

CSB + CDB + SAL+ sites Fpg

R2 = 0,8795

Figure 103 : Effet de Fpg sur le moment de la queue de la comète mesuré dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement UVA

2. Utilisation de l’endonucléase IIIEn présence d’endo III, une légère augmentation de la pente est observée (0,075 µm/kJ.m-2).

Le moment de la queue mesuré dans les cellules contrôle est de 19,9 µm (Figure 104).


y = 0,075 x + 19,9R2 = 0,9527

y = 0,056 x + 10,62R = 0,8837

CSB + CDB + SAL

CSB + CDB + SAL + sites endo III

1500

20

40

0 50 100Dose (kJ.m-2)

Figure 104 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar endo III, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement UVA


C. Monocytes photosensibilisés par de faibles concentrations derose bengal et d’acridine orange

Une première série d’expériences a été effectuée en utilisant des solutions de rose bengal et

d’acridine orange, à des concentrations correspondant à des densités optiques de 10-2 D.O. et 5 10-3

D.O., respectivement. Les monocytes, mis au contact des photosensibilisateurs, ont ensuite été

exposés à la lumière visible pour des durées comprises entre 0 et 10 min. Deux types de contrôle ont

été effectués. Le premier a consisté à mettre des monocytes au contact du photosensibilisateur en

absence de lumière. Le deuxième a impliqué l’exposition des monocytes à la lumière pendant 10 min,

en absence de photosensibilisateur. Nous n’avons observé aucune différence entre les deux types de

contrôle. Ceci montre que les dommages mesurés sont essentiellement issus de réactions photo-

dynamiques, et non de phénomènes liés à la cytotoxicité de ces agents, ou à l’effet de la lumière seule.

1. Rose bengal

a) Utilisation de la Fpg

Aucune augmentation en fonction du temps d’exposition à la lumière, du niveau basal de

coupures (5,8 µm), n’a été observée dans l’ADN de monocytes photosensibilisés par le rose bengal.

Par contre, pour des périodes d’irradiation comprises entre 0 et 10 min, l’utilisation de l’ADN N-

glycosylase (Fpg) s’est traduite par une augmentation du moment de la queue de la comète

relativement linéaire en fonction de la dose. Elle est estimée à 2,9 µm/min, nombre qui doit être

comparé à la valeur de 13,1 µm du moment de la queue dans les cellules contrôle (Figure 105).

100

20

40

60

0 2 4 6 8Temps d'exposition (min)


y = 2,9 x + 13,1

R2 = 0,8866

CSB + CDB + SAL + sites Fpg

CSB + CDB + SAL

Figure 105 : Augmentation du moment de la queue de la comète produite par Fpg, dans l’ADN demonocytes photosensibilisés par le rose bengal (10-2 D.O.)

b) Utilisation de l’endonucléase III

L’utilisation d’endo III entraîne une augmentation du moment de la queue de la comète dans

les cellules témoin qui est de 10,5 µm. Une augmentation similaire est notée dans les cellules


photosensibilisées sans qu’aucune relation temps d’exposition-augmentation du moment de la queue

de la comète ne puisse être établie (Figure 106). Cela indique l’absence de formation significative de

sites reconnus par endo III.

CSB + CDB + SAL+ sites endo III

CSB + CDB + SAL

0

5

10

15

20

0 3 6 9Temps d'exposition (min)


Figure 106 : Effet d’endo III sur le moment de la queue de la comète mesuré dans l’ADN demonocytes photosensibilisés par le rose bengal (10-2 D.O.)

2. Acridine orange

a) Utilisation de la Fpg

La photosensibilisation de monocytes par l’acridine orange entraîne la formation de coupures

et sites alcali-labiles correspondant à une augmentation du moment de la queue de la comète, valeur

estimée à 1,5 µm par min d’exposition à la lumière visible. Lorsque l’enzyme Fpg est utilisée, cette

augmentation est accrue 5 fois (7,5 µm/min) (Figure 107).


y = 7,5 x + 15,2

R 2 = 0,977

Temps d’exposition (min)

CSB + CDB + SAL + sites Fpg

y = 1,5 x + 5,92R = 0,9463

CSB + CDB + SAL

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8


Figure 107 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar Fpg, dans l’ADN de monocytes photosensibilisés par l’acridine orange (5 10-3 D.O.)

Le moment de la queue correspondant aux coupures et sites alcali-labiles, déterminé dans

l’ADN des cellules contrôle est de 5,9 µm. En, présence de Fpg, il atteint 15,2 µm.

b) Utilisation de l’endonucléase III

0

10

20

30

40

50

0 2 4 8

CSB + CDB + SAL+ sites endo III

CSB + CDB + SAL


Temps d'exposition (min)

Figure 108 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar endo III, dans l’ADN de monocytes photosensibilisés par l’acridine orange (5 10-3 D.O.)

Comme dans le cas de la photosensibilisation par le rose bengal, aucune relation entre le

moment de la queue de la comète, mesuré en présence d’endo III, et le temps d’exposition n’a été

mise en évidence (Figure 108). L’augmentation du moment de la queue de la comète dans les cellules

contrôle qui est de 26 µm, est plus importante que dans l’expérience précédente avec l’acridine

orange.


D. Monocytes photosensibilisés par 1 D.O. de rose bengal etd’acridine orange

Les cellules ont été photosensibilisées par exposition à la lumière visible consécutivement à

une incubation dans des solutions de concentration équivalant à 1 D.O. de rose bengal ou d’acridine

orange.

1. Rose bengalLe moment de la queue de la comète correspondant à la formation des coupures et sites alcali-

labiles, mesuré dans l’ADN de cellules photosensibilisées par le rose bengal, après exposition à la

lumière visible pour des durées comprises entre 0 et 4 min, a été estimé à 24,7 µm/min. Dans ces

mêmes cellules, le moment mesuré dans les cellules contrôle est de 20,4 µm. En présence d’endo III,

le taux de formation des coupures, des sites alcali-labiles et des sites reconnus par l’enzyme atteint la

valeur de 30 µm. Le moment de la queue de la comète mesuré dans l’expérience contrôle est de 26,8

µm (Figure 109).

0

40

80

120

160

0 1 2 3 4Temps d’exposition (min)


y = 24,7 x + 20,4R

2 = 0,888

y = 30,0 x + 26,8R2 = 0,9244


CSB + CDB + SAL

Figure 109 : Moment de la queue de la comète mesuré en présence d’endo III, dans l’ADN demonocytes photosensibilisés par le rose bengal (1 D.O.)

2. Acridine orangeDans le cas des cellules photosensibilisées par l’acridine orange, la formation des coupures et

sites alcali-labiles dans l’ADN correspond à une augmentation du moment de la queue de la comète

de 72 µm/min. Cette valeur est à comparer à celle des expériences contrôle qui est de 15,8 µm. En

présence d’endo III, l’augmentation du moment de la queue de la comète est de 81,8 µm/min (valeur

de 32 µm dans les cellules non exposées) (Figure 110).


0

3060

100

140

180

0 0,5 1 1,5Temps d’exposition (min)


y = 81,8 x + 32,0R2 = 0,9636

y = 72,0 x + 15,8

R2 = 0,9531


CSB + CDB + SAL

Figure 110 :Augmentation du moment de la queue de la comète mesurée en présence d’endo III, dansl’ADN de monocytes photosensibilisés par l’acridine orange (1 D.O.)

IV. METHODE DES COMETES EN MILIEU NEUTRE

Deux protocoles ont été utilisés pour mettre en évidence les coupures double brin. La

première méthode utilisée est celle décrite par Singh et al. (302).

A. Mesure des CDB selon la méthode décrite par Singh et al.Les premières expériences ont porté sur des monocytes exposés à des doses de rayonnement gamma

comprises entre 0 et 8 Gy (Figure 111).

0

5

10

15

20

0 2 4 6 8

Dose (Gy)


y = 0,66 x + 9,8

R2 = 0,8024

CDB

Figure 111 : Moment de la queue de la comète mesuré par la méthode des comètes en milieu neutre,dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma (0-8 Gy) (302)

Un taux de formation de 0,66 µm/Gy est mesuré pour une valeur du moment de la queue dans

les cellules contrôle de 9,8 µm. Dans ces conditions, l’incubation avec la protéine Fpg n’a montré

aucune augmentation significative du moment de la queue de la comète (Figure 112). Une hypothèse

est que les sites Fpg ne sont pas produits dans des zones suffisamment rapprochées de l'ADN, pour

que leur excision par Fpg produise l'apparition d'une coupure double brin.


0

5

10

15

20

0 2 4 8

Dose (Gy)


CDB

CDB + sites Fpg

Figure 112 : Effet de Fpg sur le moment de la queue de la comète mesuré par la méthode des comètesen milieu neutre

Afin de valider la valeur du taux de formation obtenu, nous avons renouvelé l’expérience dans

une gamme de doses de rayonnement gamma comprises entre 0 et 40 Gy. Dans ces conditions, nous

observons l'apparition d'un plateau. Le taux de formation des CDB croît entre 0 et 10 Gy pour ensuite

stagner autour de 17 µm (Figure 113).

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40Dose (Gy)


Figure 113 : Moment de la queue de la comète mesuré par la méthode des comètes en milieu neutre,dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma (0-40 Gy) (302)

Un traitement à la protéase Qiagen a été effectué (100 µg/lame) afin de dégrader les protéines

susceptibles de freiner la migration de l’ADN et d’être à l’origine du plateau observé. Cependant,

comme le montre la Figure 114, ce traitement n’a induit aucune augmentation du moment de la queue

de la comète (Figure 114).


0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40

Dose (Gy)

Protéase (-)

Protéase (+)


Figure 114 : Effet d’un traitement à la protéase sur le moment de la queue de la comètecorrespondant à la formation des CDB

B. Mesure des CDB selon la méthode décrite par Olive et al.Le deuxième protocole que nous avons utilisé est celui décrit par Olive et al. (322). Il diffère

du premier par la préparation des lames et par la nature du tampon d’électrophorèse.

y = 0,075 x + 8,8

R2 = 0,9702

0

5

10

15

20

0 20 40 60 80 100

Dose (Gy)


CDB

Figure 115 : Moment de la queue de la comète déterminée par la méthode des comètes en milieuneutre, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma (0-100 Gy) (322)

La Figure 115 représente la formation des CDB déterminée, par cette approche, dans l’ADN

de monocytes exposés à des doses de rayonnement comprises entre 0 et 100 Gy. Une augmentation du

moment de la queue de 0,075 µm/Gy est obtenue alors que la valeur dans les cellules contrôle est de

8,8 µm. Toutefois, ces résultats ne sont donnés qu’à titre indicatif, car d’importants problèmes de

reproductibilité ont été rencontrés.


V. EXPERIENCES METTANT EN JEU LA REPARATION DES LESIONS

A. Réparation des cassures de brins et sites alcali-labilesDes expériences de réparation ont été effectuées sur des cellules irradiées à 4 Gy. Les cellules

ont été mises en suspension dans 1,2% d’agarose, et le mélange a été déposé sur les lames de

microscope. Les cellules ont été irradiées, en l’état, et les lames ont ensuite été recouvertes de milieu

de culture avant d’être incubées à 37°C, dans une atmosphère enrichie à 5% de CO2. Les membranes

plasmique et nucléaire des cellules ont été lysées après différentes durées avant analyse par la

méthode des comètes. Des cellules témoin maintenues à l’obscurité pendant toute l’irradiation ont été

traitées dans les mêmes conditions. Les résultats obtenus sur ces dernières sont rapportés dans la

Figure 116. Aucune variation significative du moment de la queue de la comète n’a été observée pour

des temps d’incubation compris entre 0 et 5 h.

Temps (min)


0

20

40

60

0 100 200 300

Figure 116 : Réparation des CSB + CDB + SAL (monocytes témoin)

Dans le cas des cellules irradiées, une diminution rapide du moment de la queue de la comète

a été observé dans les 40 premières min.

0

10

20

30

40

0 50 100 150 200 250

Temps (min)


Figure 117 : Réparation des CSB + CDB + SAL (monocytes exposés à 4 Gy)


En moins d’une heure, la totalité des coupures et des sites alcali-labiles induits par le

rayonnement est réparée (Figure 117).

B. Réparation des sites FpgL’enzyme de réparation Fpg a été utilisée sur les mêmes échantillons afin d’étudier la

réparation des sites substrats de l’enzyme. La réparation des sites Fpg a pu être évaluée directement

en soustrayant la valeur du moment de la queue de la comète obtenue en présence de Fpg à la valeur

correspondant aux coupures seules (CB). Les résultats sont présentés dans la Figure 118.

Le moment de la queue de la comète correspondant aux sites Fpg augmente pendant les trente

premières minutes, diminue ensuite pour augmenter à nouveau. Néanmoins l’utilisation de ces

résultats doit être prudente. Une des hypothèses pour expliquer les variations du moment de la queue

observées pourrait être la présence de plusieurs composantes dans la cinétique de réparation, qui

serait due à la l’existence de lésions très diverses.

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 60 120 180 240

sites Fpg

Temps (min)


Figure 118: Réparation des sites Fpg (monocytes exposés à 4 Gy)

VI. DISCUSSION DES RESULTATS

A. La méthode des comètes sous ses formes standard et modifiéeBien que plusieurs travaux aient fait appel à la méthode des comètes en milieu neutre afin de

mesurer les coupures double brin (302, 314, 315), nos travaux ayant impliqué l’un ou l’autre des

protocoles ont conduit à l’obtention de résultats peu reproductibles. Il aurait été intéressant de

mesurer les CDB, afin de comparer les effets produits par l’irradiation gamma et ceux générés par

l’irradiation au 12C6+ (influence du TEL, Cf. Chapitre VI). La mise en évidence des sites Fpg en milieu

neutre aurait permis d’aborder la répartition de ces lésions le long de la chaîne d’ADN et en

particulier leur implication dans les sites multi-lésés (14, 336). Les expériences de réparation

conduites en milieu alcalin ont montré que la réparation des CB était totale en moins d’une heure, ce

qui est en accord avec les résultats de plusieurs travaux (295, 315, 316, 337, 338). Toutefois, nous

n’avons pas réussi à mettre en évidence la réparation des sites Fpg, du moins sur une période courte.


Ceci peut s’expliquer par un biais méthodologique, mais nous avons cependant observé dans les

mêmes conditions la réparation des coupures de brins. Une autre explication possible serait une

réparation plus tardive d’autres lésions comme les lésions complexes. Ce phénomène n’a cependant

pas été observé dans des travaux antérieurs.

Nous avons utilisé la méthode sous sa forme standard en milieu alcalin afin de mettre en

évidence les coupures correspondant à la somme CSB + CDB + SAL (CB). Nous avons défini les

conditions d’utilisation de la méthode qui associe des enzymes de réparation Fpg et endo III, dans le

but de mettre en évidence, respectivement les purines et les pyrimidines modifiées.

Une des principales difficultés rencontrées lors de l’utilisation de la méthode des comètes

associant les enzymes de réparation est la définition d’une gamme de dose ou de temps d’irradiation

qui soit compatible avec l’approche expérimentale. En effet diverses expériences effectuées, en

particulier avec des photosensibilisateurs, tels que le bleu de méthylène, se sont traduites par

l’absence de courbe dose-réponse (339). Il s’est avéré par la suite que ce composé avait, au cours des

expériences préliminaires, été utilisé à des concentrations trop élevées. Il faut en effet tenir compte de

la capacité de l’agent oxydatif utilisé à produire des coupures mais aussi des sites Fpg ou endo III. En

nombre trop élevé, la méthode peut rapidement être confrontée à des problèmes de saturation de

réponse. Les mesures de 8-oxodGuo, effectuées aux fortes doses d’irradiation, ont permis de définir

les domaines d’utilisation de la méthode modifiée des comètes.

B. Aspects mécanistiques

1. Rappel sur les mécanismes de formation des lésionsLa méthode des comètes associant les enzymes de réparation nous a permis d’établir le

spectre des dommages produits par le rayonnement gamma, la lumière UVA ou par les

photosensibilisateurs exogènes excités par la lumière visible. Dans le Tableau XX figurent les

rapports entre les différents taux de formation des lésions mesurées soit par les méthodes

chromatographiques (décrites dans le chapitre II) soit par la technique modifiée des comètes.


Tableau XX: Rapport de formation de différentes lésions dans l’ADN de monocytes exposés au

rayonnement γ du 60Co, à la lumière UVA ou à des photosensibilisateurs excités

RAPPORTSγγγγ UVA

RB

(10-2 DO)

AO

(5 10-3 D.O.)

RB

(1 D.O.)

AO

(1 D.O.)

CB/ sites (endo III+ Fpg) 1,4 0,04 ND1 ND1 4,6 7,4

CB/ sites endo III 2,4 3 ND1 ND1 4,6 7,4

CB/ sites Fpg 2,7 0,4 ND1 ND1 ND1 ND1

8-oxodGuo/FapyGua 0,4 ND2 ND2 ND2 2,6 4,5

ND1 : taux de formation de CB et/ou d’endo III inférieurs à la limite de détection,

ND2 : taux de formation de la FapyGua non déterminé.

Dans le chapitre III, nous avons présenté les mécanismes possibles de formation de la 8-

oxodGuo et des dérivés Fapy purines. Trois mécanismes de formation de la 8-oxodGuo pour l’ADN

sont connus à ce jour. Un fait intervenir l’oxygène singulet (102, 103) qui conduit exclusivement à la

formation de la 8-oxodGuo. Les deux autres mécanismes peuvent aussi générer de la FapyGua. Il

s’agit du mécanisme d’ionisation par arrachement d’un électron de la guanine et de l’addition du

radical °OH en position 8 de la guanine. Ces deux mécanismes se traduisent par la formation d’un

radical neutre intermédiaire qui peut être oxydé ou réduit pour donner, respectivement, la 8-oxodGuo

ou la FapyGua (38). Les coupures des chaînes de l’ADN peuvent principalement être générées par

action du radical °OH sur le 2-désoxyribose. Un mécanisme de coupure de l’ADN faisant intervenir

l’oxygène singulet a été proposé (340, 341). Il fait intervenir une deuxième molécule de 1O2. Cela

suppose en effet, que la 8-oxodGuo soit produite en quantités suffisamment importantes pour être à

son tour substrat de l’oxygène singulet. Or, ceci est peu probable dans l’ADN cellulaire puisque les

taux de formation de cette modification sont, quel que soit l’agent oxydant considéré, de l’ordre de 1

modification/106-108 bases (Cf. Chapitre III). Les principaux substrats d’endo III sont les diols de

thymine, la 5-hydroxy-5-méthylhydantoïne et la 5-hydroxycytosine (129). La formation de ces bases

modifiées résulte de l’attaque des pyrimidines par le radical hydroxyle (41, 342). Enfin, les sites Fpg,

constitués de 8-oxodGuo ou de dérivés Fapy purines, peuvent être produits selon les mécanismes

précédemment décrits.

2. Niveau basal des lésionsLe niveau basal des coupures (CB) varie entre 6 et 20,4 µm. La valeur la plus forte est

obtenue dans le cas des photosensibilisateurs utilisés à de fortes concentrations. On peut supposer que


le photosensibilisateur a un effet légèrement génotoxique par lui-même, ou que les échantillons en

dépit des précautions prises, aient été exposés à une source de lumière parasite. Dans le cas du

rayonnement gamma, un niveau basal de 16,9 µm est mesuré. Il est relativement plus important que

celui observé dans le cas de photosensibilisateurs utilisés aux faibles concentrations. Il peut

s’expliquer en partie par les contraintes matérielles imposées lors de ces expérimentations. Les

cellules étaient conservées, dans du tampon PBS, pendant un délai plus ou moins long avant

l’irradiation. En présence d’endo III, l’augmentation du moment de la queue de la comète la plus

importante est observée dans le cas de cellules traitées par 5 10-3 D.O. d’acridine orange. La plus

faible augmentation est mesurée dans le cas de l’utilisation du rose bengal à 10-2 D.O.. L’utilisation de

Fpg s’est accompagnée d’une augmentation de la valeur du moment de la queue comprise entre 5 et

12 µm, selon le modèle déterminé.

3. Irradiation gammaUn rapport de 1,4 entre les taux de formation des coupures (CB) et des sites reconnus par les

enzymes de réparation a été déterminé (Tableau XX). Cette valeur montre la contribution importante,

sur le plan quantitatif, des coupures et sites alcali-labiles dans les effets du rayonnement gamma. Ces

résultats sont assez proches de ceux de Banath qui s’est intéressé à la formation des sites Fpg et endo

III dans l’ADN de cellules exposées au rayonnement X (316). Il observe un rapport de deux en faveur

des coupures. La valeur du taux de formation des sites Fpg et des sites endo III que nous avons

déterminée est identique pour les deux enzymes. Elle est environ 2,5 fois plus faible que celle des

coupures et sites alcali-labiles. Un rapport de 1 entre bases modifiées et coupures avait été proposé

(16). Il faut ajouter que la mesure des sites reconnus par endo III ou par Fpg ne suffit à estimer

l’ensemble des dommages de bases induits par l’irradiation gamma. En effet, dans des travaux

antérieurs (343) il avait été supposé que l’utilisation des deux enzymes permettait de couvrir près de

95% du total des dommages de bases. Or, nous avons observé que le taux de formation de la 5-

HmdUrd déterminé dans le chapitre III, lésion qui n’est reconnue par aucune de ces deux enzymes et

qui de ce fait n’est pas prise en compte dans les présentes analyses, se forme en quantités importantes.

L’analyse des taux de formation des différents substrats d’endo III (Chapitre III) révèle qu’un nombre

supérieur de sites endo III était attendu. En effet le taux de formation des diols de thymidine (principal

substrat d’endo III) est de 0,097/106 bases/Gy. La somme des taux de formation de la 8-oxodGuo et de

la FapyGua, qui sont les principaux substrats de Fpg formés sous irradiation gamma, représente 0,047

lésion/106 bases/Gy. Il existe donc, d’après les données obtenues par la méthode modifiée des comètes

(qui mesurait un nombre de sites endo III et Fpg sensiblement équivalent) un déficit d’environ 0,05

substrat de Fpg/106 bases. Cette différence pourrait être encore accentuée par la mesure du taux de

formation de la 5-hydroxy-5-méthylhydantoïne et de la 5-hydroxycytosine, qui sont aussi substrats

d’endo III.


4. Réactions de photosensibilisationUn tout autre profil se dessine avec les photosensibilisateurs exogènes utilisés, puisque dans

ce cas, la lésion majoritairement formée est la 8-oxodGuo. Aux faibles concentrations en

photosensibilisateur, aucune formation de sites endo III n’est observée et les coupures ne sont

générées qu’en faibles quantités, lorsque l’acridine est utilisée. L’acridine orange et le rose bengal

sont connus pour générer de l’oxygène singulet (264, 265) qui explique la formation importante de 8-

oxodGuo (102, 103). Utilisés à plus forte concentration, les photosensibilisateurs produisent des

coupures de chaînes, et le rapport CB/endo III est compris entre 4,6 et 7,4. Le taux de 8-oxodGuo

mesuré par CLHP-DE est augmenté d’un facteur 40, par rapport à celui mesuré aux faibles

concentrations en photosensibilisateurs. Les dérivés Fapy purines sont mesurables mais représentent

moins de 30% du taux de 8-oxodGuo. Les sites Fpg n’ont pas pu être déterminés car on observe une

saturation de la valeur en raison du grand nombre de sites produits. Dans ces conditions très

oxydantes, les coupures peuvent provenir de l’attaque du radical hydroxyle sur le 2-désoxyribose.

Ceci peut s’expliquer par le transfert d’un électron du radical anion (réaction de type I) du

photosensibilisateur vers l’oxygène. L’anion superoxyde produit peut se dismuter en H2O2, pour

générer, via la réaction de Fenton, le radical °OH. Cependant l’implication de ce radical suggérerait

d’observer un rapport CB/endo III proche de celui observé dans le cas de l’irradiation gamma, ce qui

n’est pas le cas. Une deuxième possibilité pour expliquer la formation de coupures de brins de l’ADN

et de dérivés Fapy purines, est l’existence du mécanisme de type I qui conduirait à une ionisation de la

guanine. Le cation radical formé peut s’hydrater ou perdre un proton pour donner un radical

précurseur de la 8-oxodGuo et de la FapyGua d’une part, et de l’oxazolone d’autre part. Ce dernier

composé est alcali labile et pourrait être à l’origine de coupures des chaînes d’ADN, révélées par

l’étape d’électrophorèse en milieu alcalin.

Dans une étude de Epe et al. (264), l’induction des dommages dans l’ADN isolé ou cellulaire

par des photosensibilisateurs exogènes tels que le bleu de méthylène et l’acridine orange a été

estimée. Les résultats montrent la forte capacité de l’acridine orange à former des sites Fpg en

présence de lumière visible. Le rapport sites Fpg/coupures est de 2,6. Nous avons dans notre étude,

déterminé un rapport de 4. L’induction des sites endo III, mesurés dans l’ADN de bactéries ou dans de

l’ADN isolé est dans tous les modèles très faible, et négligeable devant l’importance des sites Fpg

(264). La mesure des dommages induits dans l’ADN isolé par les rayons X a également été effectuée.

Il a été observé que le taux de formation des sites Fpg est similaire à celui des coupures, avec une

valeur qui est environ 1,5 fois supérieure à celle des sites endo III. Toutefois l’extrapolation de ces

résultats à l’ADN cellulaire n’est pas possible.


5. Irradiation UVADans le cas d’exposition des cellules au rayonnement UVA, le profil de formation des lésions

induites apparaît être un compromis entre celui généré d’une part par le radical hydroxyle (irradiation

gamma), et celui produit par l’oxygène singulet (photosensibilisateurs exogènes). La présence de sites

endo III suggère l’implication du radical hydroxyle. Ceci est conforté par l’observation d’un rapport

CB/sites endo III de 3, proche de celui déterminé pour le rayonnement gamma. Le fait que plusieurs

travaux aient mis en évidence la présence du peroxyde d’hydrogène dans des cellules exposées au

rayonnement UVA (100) suggère que le radical hydroxyle est impliqué dans la formation des CB.

Des mécanismes de type I peuvent être à l’origine indirecte du radical hydroxyle selon le processus

décrit précédemment. Il faut souligner que les dérivés Fapy purines n’ont pas été mis en évidence par

la méthode de CG-SM. Toutefois, le manque de sensibilité de la technique empêche d’en exclure la

formation, qui au mieux serait relativement faible.

Le rapport CB/sites Fpg de 0,4 (Tableau XX) souligne l’importante formation des sites Fpg par

rapport aux coupures de chaînes de l’ADN. Cette forte contribution des sites Fpg impliquerait

l’oxygène singulet, ce qui est en accord avec d’autres études (86, 160, 329).

- Chapitre V -

Calibration de la méthode des comètes :

aspects mécanistiques

Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 160

IntroductionL’utilisation comparative de la méthode des comètes sous sa forme standard et celle associée

à des enzymes de réparation telles que Fpg ou endo III permet d’estimer le taux de formation des

coupures de brins (simples ou doubles et sites alcali-labiles) par rapport aux modifications de bases

reconnues par les enzymes. Le logiciel de traitement d’images met à la disposition de l’utilisateur de

nombreux paramètres pour quantifier les dommages de l’ADN, tels que la longueur de la queue ou le

moment de la queue de la comète. L’unité du moment de la queue de la comète que nous avons

choisie dans ce travail pour estimer les dommages de l’ADN, est le µm. Or, il est intéressant de

pouvoir exprimer l’atteinte de l’ADN non pas en terme de µm, mais en la rapportant au nombre de

modifications par million de bases normales. Pour cela il est nécessaire de calibrer la méthode. Nous

allons dans ce chapitre aborder les deux façons possibles de conforter l’aspect quantitatif de ces

mesures.

Nous aurons recours aux différents systèmes oxydants présentés dans les chapitres

précédents : rayonnements gamma et UVA, photosensibilisation par le rose bengal et l’acridine

orange en présence de lumière visible.

L’utilisation de rayonnement UVA ou de photosensibilisateurs exogènes pour compléter

l’étude des effets du rayonnement gamma se justifie par le fait que ces agents, comme le montrent les

résultats obtenus dans les chapitres III et IV, agissent principalement par l’intermédiaire de l’oxygène

singulet. De ce fait, ils produisent un spectre de lésions plus restreint que celui obtenu dans le cas de

l’irradiation gamma.

I. PRINCIPE DE LA CALIBRATION DE LA METHODE DES COMETES

A. IntroductionLa méthode des comètes associée à l’utilisation de Fpg a été utilisée dès 1996, pour estimer le

niveau basal de 8-oxodGuo dans l’ADN cellulaire (159, 344). Pour être quantitative, la méthode sous

sa forme standard devait être calibrée. Les auteurs ont eu recours à la valeur du nombre de coupures

(CB) radio-induite, qui avaient été déterminées par d’autres techniques. L’exposition de cellules au

rayonnement gamma du 60Co permettait d’établir une courbe dose-réponse, Y(µm), entre la dose

d’irradiation gamma et le moment de la queue de la comète exprimé en micromètres.

Y(µm) = tan α dose (Gy)

où tan α, représentait la pente de la courbe dose-réponse.

Cette courbe dose réponse était établie pour des conditions expérimentales définies telles que

la densité du gel et le temps d’électrophorèse. Afin de corréler 1 µm à un nombre de coupures

produites par cellule, les auteurs utilisaient la valeur de référence qui est de 1000 coupures produites

par Gy de rayonnement de faible TEL et par cellule (16, 270). Basée sur une simple extrapolation

161 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques

linéaire, la calibration de la méthode était établie en reliant l’augmentation du moment de la queue de

la comète obtenue pour un Gy, Y1Gy(µm), à la valeur de 1000 CSB/cellule (Figure 119) :

Y1Gy(µm) = tan α1 1 (Gy) = 1000 CSB/cellule

Cette approche négligeait cependant la formation des CDB + SAL. Elle assimilait en effet la

pente correspondant à la formation des CSB + CDB + SAL à celle correspondant à la formation des

CSB seules. Cette approximation est justifiée dans la mesure où le nombre de CDB, compris entre 40

et 100 par cellule/Gy, est négligeable, et que peu de sites alcali-labiles, comparativement aux CSB,

sont formés par irradiation gamma de l’ADN. Une fois la méthode calibrée, la correspondance établie

permettait de déterminer le taux de formation et le niveau basal des lésions par simple extrapolation

linéaire. Il était possible en utilisant les enzymes de réparation, Fpg ou endo III de quantifier le taux

de formation et le niveau basal des bases modifiées substrats des enzymes. Pour cela, la différence ye-

y0 donnait le niveau basal de ces lésions et la différence de pente tan (αe-α1) permettait d’accéder au

taux de formation à partir de la relation suivante :

nombre de lésions substrats de l’enzyme/cellule = Yenz.(µm) 1000/Y1Gy(µm)

Cette approche a été en particulier utilisée pour mesurer le niveau basal de 8-oxodGuo dans

l’ADN cellulaire. Dans ce cas, il était supposé qu’un site reconnu par Fpg correspondait à une 8-

oxodGuo et le calcul ne prenait pas en compte les autres substrats de l’enzymes comme les dérivés

Fapy purines.

X, dose d'irradiation (Gy)

Y, moment de la queue (µm)

α1

CSB +DSB +SAL

CSB +CDB +SAL + sites

recon

nus

par l'e

nzyme

0

αe

ye

y0

1000 CSB/cellule/Gytan α α α α1111 = = = =

Y1Gy (µm) = tan α 1 1 Gy

Yenz. (µm) = tan (αe −α 1) X

Figure 119 : Principe de la calibration de la méthode des comètes à partir du taux de formation desCSB sous irradiation gamma

Le système de calibration que nous avons utilisé repose sur une approche différente (Figure

120). Il ne se base pas sur le taux de formation des coupures simple brin produites sous irradiation

gamma mais sur le taux de formation des sites Fpg. L’augmentation du moment de la queue de la

comète due à l’utilisation de Fpg est corrélée à la valeur de formation, sous irradiation, des principaux


substrats de l’enzyme. La mesure du taux de formation de la 8-oxoGua, de la FapyGua et de la

FapyAde a été déterminée dans le chapitre III par CLHP-DE, par CG-SM ou par CLHP-SM/SM, dans

des gammes de doses comprises entre 0 et 80 Gy pour la 8-oxoGua et 0 et 1000 Gy pour les dérivés

Fapy purines. Dans notre approche, l’augmentation de moment de la queue de la comète par Gy en

présence de Fpg, YFpg(µm), correspondant à une augmentation de la pente tan(αe−α1) est due, d’une

part à la 8-oxoGua (augmentations de pente tan α8-oxod.) et d’autre part aux dérivés Fapy de la guanine

et de l’adénine (augmentation de pente tan αFG et tan αFA, respectivement). Si l’approche est

satisfaisante, la calibration ainsi obtenue doit permettre de déterminer, à partir de la mesure de tan α1,

un nombre de coupures (CSB) produites par Gy proche de 1000/cellule, qui est la valeur de référence

utilisée précédemment.

X, dose d'irradiation (Gy)

Y, moment de la queue (µm)

CSB +DSB +SALCSB +C

DB +SAL + si

tes re

conn

us

par F

pg

0

αe

yey0

Substrats d

e Fpg

FapyGua

dosed'irradiation

CG-SMαFG

8-oxoGua

dosed'irradiation

CLHP/DEα8-oxod.

FapyAde

dosed'irradiation

CLHP-SM/SMαFA

α1

α e Y enz.(µm) = tan X = (tan α8-oxod. + tan αFA + tan αFG ) X

Figure 120 : Principe de la calibration de la méthodes des comètes à partir du taux de formation dessites Fpg

B. Hypothèses de la calibrationLa méthode de calibration que nous proposons de mettre en œuvre repose sur plusieurs

hypothèses :

- Hypothèse de spécificité de substrat : un site reconnu par Fpg correspond à une 8-oxoGua, à

une FapyGua où à une FapyAde ;


- Hypothèse d’accessibilité : l’enzyme a accès à tous ses substrats ;

- Hypothèse basée sur l’extrapolation : il est possible d’extrapoler les taux de formation de 8-

oxoGua, FapyGua et de FapyAde, déterminés au delà de 30 Gy au domaine de dose utilisé

dans la méthode des comètes (< 8 Gy) ;

- Hypothèse de stabilité des substrats de l’enzyme en milieu alcalin.

C. Stabilité des substrats de la protéine Fpg en milieu alcalinToutes les études faisant appel à la méthode des comètes modifiée ou à la technique d’élution

alcaline, pour estimer le niveau basal de 8-oxoGua dans l’ADN cellulaire, reposent sur l’hypothèse de

travail, quel que soit le système de calibration, qu’un site Fpg correspond à une 8-oxoGua. En effet,

jusqu’à de récents travaux (228), aucune méthode décrite ne permettait d’effectuer un dosage correct

des dérivés Fapy purines. Lorsque l’on utilise la méthode modifiée des comètes, une des conditions

pour que les dérivés Fapy purines soient effectivement reconnus par l’enzyme Fpg, est que les

différents traitement alcalins utilisés lors de l’analyse, n’altèrent pas leur stabilité au sein de la

molécule d’ADN. Nous avons étudié la stabilité des dérivés Fapy purines dans le tampon de lyse (2,5

M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% sodium sarcosinate, 1% Triton X-100, 10%

DMSO) et dans le tampon d’électrophorèse (300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA).

1. Stabilité de la 8-oxodGuoPlusieurs travaux ont montré la stabilité de la 8-oxoGua en milieu alcalin (345, 346). La

stabilité de la 8-oxodGuo dans les conditions plus spécifiques de la méthode modifiée des comètes a

été démontrée dans la plupart des études impliquant des photosensibilisateurs de type II.

2. Stabilité des dérivés Fapy purines

a) Stabilité des dérivés Fapy purines dans les conditions de lyse (pH

10)

L’ADN isolé de thymus de veau irradié à 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co, a été

dissous dans le tampon de lyse des cellules pour une durée comprise entre 30 min et 24 h. Le mélange

a ensuite été élué sur colonne d’exclusion. Le principe de ces colonnes est basé sur une élution plus

rapide des molécules de grande taille, comparativement aux molécules de faible taille. Il a été

possible, dans ces conditions, de séparer physiquement l’ADN des éventuelles molécules de dérivés

Fapy purines libérées par le traitement alcalin. A chaque échantillon élué, ont été ajoutées 100 pmoles

de standard interne [M+3] avant séchage sous vide. Une hydrolyse par la nucléase P1 et par l’acide

formique a ensuite été effectuée avant dérivation des échantillons et analyse par CG-SM. Le rapport

entre l’aire du pic obtenu pour le dérivé Fapy [M] de l’ADN et pour son standard interne [M+3], a été

déterminé pour les différentes durées d’incubation dans le tampon de lyse (Figure 121).


0

2

4

6

8

10

0 0,5 1 2 24

pH 7

pH 10

Rapport des aires [M]/[M+3]

Durée de l'incubation (h)

Figure 121 : Rapport [M]/[M+3], pour les dérivés FapyGua mesurés dans les échantillons d’ADNmaintenus à pH 7 ou 10

Aucune différence significative n’a été observée pour les valeurs de la FapyGua et de

FapyAde, dans les deux catégories d’échantillons maintenues à pH 7 et à 10 respectivement. La

mesure de l’ADN dans chaque échantillon a permis de s’assurer que la quantité d’ADN élué sur des

colonnes d’exclusion, était bien indépendante du traitement subi.

b) Stabilité des dérivés Fapy dans les conditions d’électrophorèse

L’ADN isolé de thymus de veau exposé à une dose de 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co

a été incubé dans le tampon d’électrophorèse pour différentes durées. Le protocole suivi est le même

que celui décrit précédemment. Le rapport des aires entre le produit et son standard interne a été

calculé. Aucune différence notable n’a été observée entre les échantillons contrôle et ceux maintenus

à pH 13 (Figures 122-123).


0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 24

pH 7

pH13

Durée de l’incubation (h)

Figure 122 : Rapport [M]/[M+3], pour les dérivés FapyGua dosés dans les échantillons d’ADNmaintenus à pH 7 ou 13


0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

0 1 2 24

pH 7

pH 13


Durée de l'incubation (h)

Figure 123 : Rapport [M]/[M+3], pour les dérivés FapyAde dosés dans les échantillons d’ADNmaintenus à pH 7 ou 13

c) Contrôle de l’efficacité des colonnes d’exclusion

Afin de conforter les résultats précédents, il était nécessaire de s’assurer de l’efficacité

d’exclusion des dérivés Fapy purines par les colonnes Nap 25, utilisées pour purifier l’ADN. Une

expérience a consisté à enrichir les échantillons d’ADN isolé de thymus de veau avec 100 pmoles de

FapyGua. Le niveau basal de FapyGua présent « spontanément » dans l’ADN est d’environ 15 à 20

pmoles de FapyGua par échantillon. L’ADN a été mis en présence ou non du tampon

d’électrophorèse, pendant 12 h. Comme précédemment, le mélange contenant l’ADN a été déposé sur

une colonne d’exclusion, et différentes fractions ont été recueillies. La fraction 1 correspond au

volume mort de la colonne. La fraction 2 correspond à l’élution de l’ADN proprement dite. Enfin, la

fraction 3 correspond à l’ajout d’un volume important (3,5 ml) d’eau désionisée en tête de colonne.

Comme dans les expériences précédentes, chaque fraction recueillie est soumise au traitement adéquat

avant analyse des rapports [M]/[M+3] par CG-SM. 100 pmoles de standard interne [M+3] ayant été

ajoutées à chaque échantillon, un rapport [M]/[M+3] supérieur à 1, suggérerait l’élution des dérivés

Fapy purines dans la fraction contenant l’ADN (Figure 124).

Fraction 2Rapport [M]/[M+3]

0,0

0,5

7 S 7 13 S 13

Echantillons

Figure 124 : Contrôle de l’efficacité d’exclusion des colonnes


Il est confirmé qu’aucun dérivé Fapy n’est détecté dans la fraction 1. L’ADN est élué dans la

fraction 2. Le rapport [M]/[M +3] montre qu’il n’existe pas de différences entre les échantillons

enrichis en dérivés Fapy purines (7 S ou 13 S) et les échantillons contrôle (7 ou 13) (Fraction 2). Ceci

confirme bien les capacités d’exclusion des colonnes utilisées pour les dérivés Fapy purines. On ne

constate à nouveau aucune différence entre les échantillons maintenus à pH 7 ou 13. Les résultats

obtenus sur la fraction 3 ont confirmé que la plus grande partie de l’ADN était éluée dans la fraction

2, et que les dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine correspondant au dopage des échantillons sont

présents dans la fraction 3.

d) Conclusion

Ces travaux montrent l’efficacité des colonnes d’exclusion Nap 25 pour séparer les dérivés

Fapy purines des molécules d’ADN. Les dérivés Fapy purines présents dans une molécule d’ADN

ayant été soumis aux traitements alcalins, analogues à ceux employés lors de l’analyse par

microélectrophorèse sur gel, restent présents dans la structure de l’ADN. Ils peuvent ainsi être ensuite

substrats de l’enzyme Fpg.

II. CALIBRATION

Nous avons pour les quatre systèmes d’oxydation présentés dans les chapitres III et IV,

exprimé le niveau basal et le taux de formation des différentes lésions en terme de migration de

l’ADN en µm. La méthode standard des comètes en milieu alcalin permet de déterminer le taux de

formation des CB. Associée à des enzymes de réparation, telles que Fpg ou endo III, elle permet

d’estimer, simultanément, la formation des coupures et de sites reconnus par les ADN N-glycosylases

(CB + sites substrats de l’enzyme). Afin d’obtenir uniquement le taux de formation des sites substrats

de l’enzyme, il suffit de faire la différence entre les deux taux de formation de ces deux classes de

lésions. Ceci revient à évaluer la différence des pentes des droites de régression linéaire reliant le

moment de la queue de la comète à la dose ou au temps d’exposition, obtenue en présence ou non de

Fpg et d’endo III : pente (CB + sites substrats de l’enzyme) - (CB). Le taux de formation des sites

reconnus par l’enzyme peut ensuite être corrélé aux valeurs de formation de 8-oxoGua, FapyGua et

FapyAde, mesurés après exposition à de fortes doses par les méthodes chromatographiques.

A. Modèle I : Irradiation gammaLe taux de formation des coupures et des sites reconnus par les enzymes Fpg et endo III, en

fonction de la dose appliquée est présenté dans la Figure 125. Une dose de 1 Gy se traduit par une

augmentation du moment de la queue de la comète de 7,8 µm, correspondant aux coupures (CB). On

note une augmentation de 2,8 µm et 3,1 µm du moment de la queue de la comète correspondant,

respectivement, à l’induction des sites Fpg et endo III.


y = 7,8 x + 16,9

y = 3,1 x + 12,3

y = 2,8 x + 12,3

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10Dose (Gy)

Moment de la queue

CSB +CDB + SAL

sites Fpg

sites endo III

Figure 125 : Augmentation du moment de la queue de la comète, correspondant à trois classes delésions oxydatives en fonction de la dose d’irradiation gamma

L’augmentation du moment de la queue de la comète de 2,8 µm/Gy correspondant à la mesure

des sites Fpg a été corrélée aux taux formation de 8-oxoGua et des dérivés Fapy purines, mesurés

respectivement par CLHP-DE ou par CG-SM et CLHP-SM/SM, soit, au total, 0,040 modification/106

bases/Gy.

Tableau XXI : Calibration de la méthode des comètes (irradiation gamma)

Méthode des comètes(µm/Gy)

Taux de formation des lésions par approchechromatographique (/106 bases/Gy)

Sites Fpg 8-oxodGuo FapyGua FapyAde

2,8 0,011 0,027 0,0024

CALIBRATION 1 modification pour 106 bases normales correspond à 70 µm

Une calibration de 1 modification par 106 bases correspondant à 70 µm peut ainsi être

déterminée.

B. Modèle II : Irradiation de type UVALa formation des coupures après irradiation UVA se traduit par une augmentation du moment

de la queue de la comète de 0,54 µm par kJ.m-2. Une augmentation de 1,14 µm et 0,2 µm par kJ.m-2

est mesurée en présence, respectivement, de Fpg et d’endo III (Figure 126).


y = 1,14 x + 6,9 sites Fpg

y = 0,54 x + 10,1 CSB + CDB + SAL

y = 0,20 x + 9,8 sites endo III

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15

Dose (kJ.m -2 )


Figure 126 : Augmentation du moment de la queue de la comète, correspondant à trois classes delésions oxydatives en fonction de la dose de rayonnement UVA

La corrélation entre l’augmentation du moment de la queue de la comète due à l’excision des

sites Fpg, et le taux de 8-oxoGua (0,00098 8-oxoGua/kJ.m-2), mesuré par CLHP-DE, permet d’obtenir

la calibration suivante : 1 modification/106 bases correspond à 116 µm. Le taux de formation des

dérivés Fapy purines qui n’a pas pu être déterminé par CG-SM a été estimé négligeable.

Tableau XXII : Calibration de la méthode des comètes (irradiation UVA)

Méthode des comètes(µm/kJ.m-2)

Taux de formation des lésions par approchechromatographique (/106 bases/kJ.m-2)


1,14 0,00098 (< 2*) (< 3*)


* : limite de sensibilité de détection des dérivés Fapy purines par la méthode de CG-SM (exprimée

pour 106 bases).

C. Modèle III : Réactions de photosensibilisationPour la calibration de la méthode des comètes, seuls les résultats des expériences mettant en

jeu de faibles concentrations de photosensibilisateurs (10-2 D.O. de rose bengal et 5 10-3 D.O.

d’acridine orange) ont été pris en compte. En effet, dans les conditions où les photosensibilisateurs

ont été utilisés à une densité optique de 1, la formation de sites Fpg était trop importante, pour qu’une

courbe dose-réponse soit établie.


1. Acridine orangeAvec le modèle représenté par l’acridine orange en présence de lumière visible, un taux de

formation des CB correspondant à un moment de la queue de la comète de 1,5 µm/min a été mesuré.

Un moment de la queue de la comète de 6 µm/min correspond à l’excision des sites reconnus par Fpg.

Aucune formation de sites endo III n’a été mise en évidence (Figure 127).

CSB + CDB + SAL

0

20

40

60

0 2 4 6 8

sites Fpgy = 6 x + 9,3

y = 1,5 x + 5,9

Temps d’exposition (min)


Figure 127 : Augmentation du moment de la queue de la comète, correspondant à deux classes delésions oxydatives en fonction du temps d’exposition à la lumière visible (photosensibilisation par

l’acridine orange)

Tableau XXIII : Calibration de la méthode des comètes (photosensibilisation par l’acridine orange)


Taux de formation des lésions par approchechromatographique (/106 bases/min)


6 0,097 (< 2*) (< 3*)



pour 106 bases).

La corrélation entre l’augmentation du moment de la queue de la comète due à l’excision des

sites Fpg et le taux de 0,097 8-oxodGuo/min, mesuré par CLHP-DE, permet d’obtenir une calibration

de 1 modification/106 bases. Cette valeur correspond à un moment de la queue de la comète de 62 µm.

Le taux de formation des dérivés Fapy purines n’a pas pu être déterminé par la méthode de CG-SM. Il

a été estimé, au mieux à une valeur inférieure à 2 dérivés/106 bases.


2. Rose bengalDans le cas du modèle représenté par le rose bengal, aucune formation de coupures ni de sites

endo III, n’a été mise en évidence pour des temps d’exposition compris entre 0 et 10 min (Figure 128).

y = 2,96 x + 5

0

10

20

30

0 5 10

Temps d'exposition (min)


Figure 128 : Augmentation du moment de la queue de la comète, correspondant aux sites Fpg enfonction du temps d’exposition à la lumière visible (photosensibilisation par le rose bengal)

L’augmentation du « moment de la queue de la comète" due à la reconnaissance des sites Fpg

est de 2,9 µm/min. Corrélée au taux de 8-oxodGuo mesuré par CLHP-DE, on conclut que 1

modification/106 bases correspond à un moment de la queue de la comète de 55 µm.

Tableau XXIV : Calibration de la méthode des comètes (photosensibilisation par le rose bengal)


Taux de formation des lésions par approchechromatographique (/106 bases/min)


2,96 0,054 (< 2*) (< 3*)



pour 106 bases).

III. EXPRESSION DES DOMMAGES

Le système représenté par les photosensibilisateurs exogènes est sans doute le modèle le plus

approprié pour établir une corrélation entre le nombre de sites Fpg et le taux de 8-oxodGuo mesuré

par CLHP-DE. De tels agents de photosensibilisation, sont en effet supposés agir préférentiellement

selon un mécanisme de type II, ce qui semble conforté par les résultats que nous avons obtenus. Le

mécanisme de type II conduit comme nous l'avons mentionné, à la formation d'oxygène singulet qui

réagit de façon préférentielle avec la dGuo pour produire la 8-oxodGuo. De tels systèmes photo-

oxydants permettent de s’affranchir de la mesure des dérivés Fapy purines qui bien souvent n’est pas


possible par manque de sensibilité de la méthode CG-SM. De plus l'oxygène singulet a une action

spécifique sur la dGuo. En effet, il n’oxyde pas d'autres constituants de l'ADN. Or, un des problèmes

soulevés par l'utilisation d'enzymes de réparation est leur manque de spécificité. Plusieurs travaux font

état de reconnaissance par la protéine Fpg d'autres substrats que la 8-oxoGua, FapyGua ou FapyAde

(128, 347). L'utilisation d'un agent oxydatif comme le radical hydroxyle rend discutable l’hypothèse

selon laquelle un site Fpg correspond exclusivement à une des trois lésions précédemment citées. Le

radical °OH qui est très réactif peut produire d'autres substrats, connus ou non, de la protéine Fpg. Les

deux modèles représentés par les photosensibilisateurs donnent des calibrations très proches. Ainsi,

une valeur moyenne de 1 modification/106 bases correspondant à 58,5 µm a été retenue pour calibrer

la méthode modifiée des comètes.

A. Niveau basal de 8-oxodGuo (assimilée aux sites Fpg)Le niveau basal de 8-oxodGuo dans l’ADN cellulaire peut être déterminé à partir du niveau

mesuré des sites Fpg. Ceci suppose qu’un site reconnu par la protéine Fpg corresponde à une 8-

oxodGuo. Nous avons constaté que ceci n’était pas toujours vrai. Toutefois, cette approximation sera

faite afin de pouvoir estimer le niveau basal de 8-oxodGuo dans l’ADN cellulaire par cette approche.

La valeur obtenue surestimera, par conséquent le taux réel de 8-oxodGuo. Ce niveau basal est

rapporté dans le Tableau suivant. La quantité des dérivés Fapy purines (70%) déterminée dans le

modèle de l’irradiation gamma n’est par conséquent pas extrapolé au niveau basal. Pour les autres

agents d’oxydation, la contribution n’est également pas prise en compte. Le taux de 8-oxodGuo, sur la

base de la calibration précédemment définie, est compris entre 0,08 et 0,21 8-oxodGuo/106 bases

selon le système oxydant étudié (Tableau XXV).

Tableau XXV : Niveau basal des sites Fpg (assimilés ici à la 8-oxodGuo)

Méthode des comètes

Sites Fpg (µm) Nombre de 8-oxodGuo /106

bases

Irradiation gamma 12,3 0,21

Irradiation UVA 6,9 0,11

Rose bengal + lumière visible 5 0,08

Acridine orange + lumière visible 9,3 0,15


B. Niveau basal des sites endo III

Tableau XXVI : Niveau basal des sites endo III


Sites endo III(µm)

Nombre de sites endoIII/106 bases



Rose bengal + lumière visible 3,0 0,05

Acridine orange + lumière visible 20 0,34

Rose bengal + lumière visible (1 D.O.) 6,4 0,10

Acridine orange + lumière visible (1 D.O.) 16,2 0,27

Le niveau basal des sites endo III varie fortement entre 0,05 et 0,34 sites/106 bases. La plus

forte valeur obtenue avec l’acridine orange est due à la seule présence du photosensibilisateur. Le

niveau basal est sensiblement du même ordre de grandeur que le celui des sites Fpg (Tableau XXVI).

C. Niveau basal des coupures (CSB + CDB + SAL)

Tableau XXVII : Niveau basal des coupures


CSB +CDB +SAL (µm)

Nombre de coupures/106 bases



Rose bengal + lumière visible (10-2 D.O.) 7,5 0,13

Acridine orange + lumière visible (5.10-3 D.O.) 6 0,10

Rose bengal + lumière visible (1 D.O.) 20,4 0,34

Acridine orange + lumière visible (1 D.O.) 15,8 0,27

Le niveau basal des coupures de chaîne de l’ADN et des sites alcali-labiles varie entre 0,10 et

0,34 coupures/106 bases (Tableau XXVII).

D. Taux de formation des différentes lésionsLes Figures 125-126-127-128 permettent à partir de la calibration précédemment définie,

d’estimer le taux de formation et le niveau basal des coupures (CSB +CDB +SAL), des sites Fpg et


endo III. Les mesures effectuées par l’approche chromatographique donnent les taux de formation de

la 8-oxodGuo, de FapyGua et de FapyAde. Ces valeurs sont rapportées dans le Tableau ci-dessous.

Tableau XXVIII : Taux de formation des différentes lésions (exprimés en nombre de modifications/106

bases normales)

Irradiationgamma

Irradiation UVA Rose Bengal

(0,01 D.O.)

Acridine orange

(0,005 D.O.)

Formation/Gy Formation/ kJ.m-2 Formation/min Formation/min

8-OxodGuo (CLHP-DE) 0,011/106 bases 0,00098/106 bases 0,054/106 bases 0,097/106 bases

FapyGua (CG-SM) 0,027/106 bases N D N D N D

Sites Fpg 2,8 µm

0,049/106 bases *

0,114 µm

0,0020/106 bases*

2,96 µm

0,054/106 bases*

6 µm

0,097/106 bases *

Sites endo III 3,1 µm

0,054/106 bases *

0,019 µm

0,0003/106 bases *

< 0,5 µm

< 0,01/106 bases *

< 0,5 µm

< 0,01/106 bases *

CSB + CDB + SAL 7,8 µm

0,13/106 bases *

0,056 µm

0,0009/106 bases *

< 0,5 µm

< 0,01/106 bases *

1,5 µm

0,026/106 bases *

ND : formation en dessous de la limite de détection,

* : formation exprimée en nombre de lésions /106 bases en utilisant la valeur de la calibration selon

laquelle 1 modification/106 bases correspond à 58,5 µm.

IV. DISCUSSION DES RESULTATS

A. Niveau basal de la 8-oxodGuoUn des principaux intérêts de la calibration de la méthode des comètes a été de mesurer le

niveau basal de 8-oxodGuo. Comme rapporté dans le chapitre III, des écarts, parfois d’un facteur

1000, avaient été précédemment observés selon l’approche expérimentale utilisée.

Le niveau basal de 8-oxodGuo mesuré par la méthode des comètes couplée à l’utilisation de

Fpg indique des valeurs comprises entre 0,08 et 0,21 8-oxodGuo/106 bases. Ces valeurs bien

inférieures à celles déterminées par CG-SM (152, 234, 239, 251, 252) sont en accord avec les

récentes mesures effectuées par CLHP-DE (209), ou avec d’autres travaux faisant appel à la méthode

des comètes, ou la technique d’élution alcaline couplée à Fpg (161, 329, 344, 348). Ces travaux

montrent que les efforts pour limiter les artefacts liés à l’oxydation des bases normales

s’accompagnent d’une réduction du niveau basal d’un facteur 100 à 1000. La méthode des comètes

ainsi calibrée permet de mesurer le taux de 8-oxodGuo (assimilé aux sites Fpg) dans l’ADN de

cellules exposées à des doses aussi faibles que 2 Gy de rayonnement gamma, contre 35 Gy pour


l’analyse par CLHP-DE (349, 350). La méthode est particulièrement adaptée à la mesure de faibles

niveaux de dommages. La calibration permet également d’estimer le taux de formation des coupures

et des sites endo III. Par exemple, dans le cas de l’irradiation gamma, un taux de formation de 0,13

CB/106 bases par Gy a été déterminé. Rapporté à la cellule, cette valeur correspond à 1600 CB. Ce

nombre est relativement proche des 1000 CSB qui avaient été suggérées.

B. Aspects mécanistiquesA partir de la méthode des comètes ainsi calibrée, il a été possible de comparer les taux de

formation des coupures et des sites endo III avec les mesures chromatographiques de 8-oxodGuo,

FapyGua et FapyAde, et ceci pour chaque système oxydant étudié. Ceci nous a permis de discuter des

mécanismes conduisant à la formation de ces lésions (349).

Un récapitulatif des résultats de mesure de plusieurs lésions induites par des

photosensibilisateurs à forte concentration est présenté dans le Tableau XXIX. L’intérêt d’utiliser ces

agents à plus forte concentration, se justifie par les informations qu’ils apportent en terme de

mécanismes de production des lésions. L’extrapolation aux domaines de concentrations cent fois plus

faibles demande néanmoins certaines précautions, car les mécanismes mis en jeu peuvent être

sensiblement différents.

Tableau XXIX : Taux de formation des lésions produites par les photosensibilisateurs, utilisés à une

densité optique de 1 et excités par la lumière visible (exprimés en nombre de modifications/106 bases

normales)

Rose bengal

(1 D.O.)

Acridine orange

(1 D.O.)Formation/min Formation/min

8-OxodGuo (CLHP-DE) 1,88/106 bases 3,93/106 bases

FapyGua (CG-SM) 0,66/106 bases 0,90/106 bases

Sites endo III 5,3 µm

0,09/106 bases *

9,8 µm

0,17/106 bases *

CSB + CDB + SAL 24,7 µm

0,42/106 bases *

72 µm

1,23/106 bases *

* : formation exprimée en nombre de lésions /106 bases en utilisant la valeur de la calibration selon

laquelle 1 modification/106 bases correspond à 58,5 µm.


1. Niveau basal des différentes lésionsLes rapports entre les différentes lésions mesurées dans les cellules contrôle sont rapportés

dans le Tableau XXX. Ce niveau basal est le reflet du nombre de lésions correspondant au «bruit de

fond » cellulaire. Il peut aussi donner des indications sur la qualité des conditions expérimentales.

Tableau XXX : Rapports entre les différentes lésions mesurées dans l’ADN de cellules contrôle

RAPPORTSγγγγ UVA

R.B.

(10-2 D. O.)

A.O.

(5 10-3 D. O.)

R.B.

(1 D. O.)

A.O.

(1 D. O.)

Sites endo III/CB 0,72 0,92 0,40 3,33* 0,31 1,02

Sites Fpg/CB 0,72 0,65 0,66 1,55*

Sites endo III/ Fpg 1,00 0,70 1,66 0,46

CB : correspond à la somme CSB + CDB + SAL,

* : valeur élevée du nombre de sites endo III ou Fpg traduisant un possible effet oxydant du

photosensibilisateur en absence de lumière.

S’agissant du même type cellulaire utilisé dans tous les modèles, nous devrions obtenir des

valeurs de rapports similaires. En effet, même si des écarts peuvent être observés, des tendances

semblent se dessiner. Ainsi, la comparaison du rapport entre sites endo III et CB indique des valeurs

globalement comprises entre 0,3 et 1 (à l’exception de la valeur identifiée par l’astérisque). La valeur

moyenne est de 1,06. Le rapport entre sites Fpg et CB est proche de 0,7 (à l’exception de la valeur

identifiée par par l’astérisque). La valeur moyenne est de 0,89. Le rapport entre sites endo III et CB

est compris entre 0,5 et 1,66. La valeur moyenne est de 0,95.

2. Taux de formation des différentes lésions

a) Irradiation gamma

La somme des taux de formation des bases modifiées déterminés par les méthodes

chromatographiques est de 0,19 lésion/106 bases. Celui des coupures est de 0,13 lésion/106 bases. Le

rapport entre ces deux valeurs est de 1,5. Il est donc relativement proche de la valeur de 2 décrite dans

la littérature d’autant plus que plusieurs bases modifiées de l’ADN n’ont pas encore pu être

quantifiées (diols de cytosine, oxazolone, etc. ).

Le Tableau suivant montre les rapports des taux de formation des mêmes lésions après

irradiation ou réaction de photosensibilisation. Les sites endo III, FapyGua, et les coupures CB

n’ayant pas été mis en évidence lorsque les photosensibilisateurs ont été utilisés à de faibles

concentrations, ces aspects ne seront pas abordés dans la discussion.


Tableau XXXI : Rapport entre les taux de formation des différentes lésions produites dans l’ADN de

cellules exposées à divers agents oxydants

RAPPORTS Irradiation

γγγγ

Irradiation

UVA

R.B.

(1 D.O.)

A.O.

(1 D.O.)CB/endo III 2,4 3 4,6 7,4

FapyGua/CB 0,2 ? 1,7 0,7

FapyGua/endo III 0,5 ? 7,9 5,0

8-OxodGuo/FapyGua 0,4 ? 2,6 4,5

8-OxodGuo/endo III 0,2 3,2 20 23

8-OxodGuo/CB 0,08 1,08 4,4 3,10

CB : correspond à la somme CSB + CDB + SAL.

La comparaison de ces valeurs (Tableau XXXI) montre une différence très nette entre

l’importance relative des différents dommages produits par l’irradiation gamma, et ceux générés par

l’action d’autres agents oxydants. En effet, parmi les lésions que nous avons mesurées, le

rayonnement gamma du 60Co génère au sein de l’ADN, de façon majoritaire, des coupures (CSB +

CDB + SAL), des sites endo III (diols de thymidine), de la FapyGua, de la 5-HmdUrd, de la 8-

oxodGuo. Ceci conforte les résultats présentés dans le chapitre III en soulignant le rôle primordial du

radical hydroxyle. En effet, la formation de ces trois grandes catégories de lésions peut s’expliquer

par l’action de ce radical (25, 38, 41, 42, 53, 342).

b) Réactions de photosensibilisation

Dans le cas des photosensibilisateurs que sont le rose bengal et l’acridine orange,

l’importance relative des divers dommages est très différente puisque la lésion majoritaire est la 8-

oxodGuo. Le rapport entre les taux de formation de la 8-oxodGuo et des sites endo III est voisin de

20. Dans le cas des rayonnements gamma et UVA, cette valeur est respectivement de 0,2 et 3. Si on

regarde le rapport entre 8-oxodGuo et CB obtenu pour A.O. et R.B., il est compris entre 3 et 4. Ceci

indique que la formation des coupures de chaîne de l’ADN reste minoritaire devant la formation des

bases modifiées. Ces résultats sont concordants avec l’implication de l’oxygène singulet dans le

mécanisme d’action des photosensibilisateurs.

L’examen des valeurs des rapports entre FapyGua et CB, d’une part, ou entre FapyGua et

sites endo III d’autre part, indique que le dérivé Fapy de la guanine est formé en plus grande quantité

que les coupures ou les sites endo III. Il peut être formé, soit à partir du radical hydroxyle, soit par

ionisation directe de la guanine. La première voie est dans les cas présents en partie exclue. Il reste

donc un mécanisme de type I pour expliquer la formation de la FapyGua. Ce mécanisme pourrait aussi


expliquer la formation des coupures produites en quantités relativement importantes. Ainsi, entre 0,4

et 1,2 CB/106 bases sont produits par photosensibilisation contre 0,13 CB/106 bases dans le cas du

rayonnement gamma. En particulier, elles pourraient faire intervenir un mécanisme de type I (38),

conduisant à la formation d’oxazolone. Cette modification est alcali-labile et par là même peut être

convertie en coupure de chaîne dans les conditions d’analyse de la méthode des comètes. Ceci est

conforté par la valeur comprise entre 0,7 et 1,7 du rapport entre FapyGua et CB (contre 0,2 dans le cas

du rayonnement gamma). La valeur proche de 1 de ce rapport suggère que les deux types de lésions

sont générées par un même mécanisme.

c) Irradiation UVA

Les rapports entre 8-oxodGuo et endo III, d’une part, et entre 8-oxodGuo et CB d’autre part

sont respectivement de 3,2 et 1,08 contre 0,2 et 0,08 pour le rayonnement gamma. La formation

d’oxygène singulet explique la formation préférentielle de 8-oxodGuo. La présence de sites endo III,

suggère l’implication du radical hydroxyle via un mécanisme de type I, dans la formation des CB

observées. Il est raisonnable de suggérer que la FapyGua puisse être formée soit par action de °OH,

soit par ionisation directe de la guanine. Le taux doit être intermédiaire entre celui des CB (rapport

FapyGua/CB de 0,7 et 1,7 pour les photosensibilisateurs exogènes) et 20% des CB (rapport

FapyGua/CB de 0,2 dans le cas du rayonnement gamma).


°OH sites endo IIIcassures de brins

2O °-

Fe 3+

oxydation1O2

Type II

2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine

Type I- e-

ιιιιrradiationγγγγ

effet direct

effet indirect

P .- 2 O

UVA, lumière visibleP

FapyGua

1P 3P

réduction

Photosensibilisateu

r (P)

pyrimidines

8-oxo-7,8 dihydroguanine

8-oxoGua

H2NH

NH2O O

NN

oxazolone

HN

N NH

N

O

OH2N

HN

N NH2

N

O

O

HH2N

HN

N NH

N

O

H2N

HN

N NH

NO

H2N

+°

HN

N NH

N°O

OHH

H2N

HN

N NH

NO

H2N

HN

N NH

NO

H2N

Figure 129 : Mécanismes de formation proposés des principales lésions mesurées par la méthode descomètes modifiée

La Figure 129 propose, à partir des informations apportées par la méthode des comètes ou par

les techniques d’analyse chromatographique, un schéma des mécanismes conduisant aux lésions

produites par les différents agents utilisés dans cette étude.

- Chapitre VI -

Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur

l’ADN cellulaire

Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire 180

IntroductionNous allons aborder dans ce chapitre, l’étude de l’influence du TEL sur la nature et la

quantité des dommages radio-induits de l’ADN, en nous intéressant plus particulièrement aux

dommages de bases. En effet, si les mécanismes mettant en jeu les cassures des chaînes de l’ADN

sont en partie connus, peu de travaux portent sur les dommages de bases de l’ADN induits par les ions

lourds. Dans ce but, des cellules ont été exposées au rayonnement particulaire constitué d’ions

carbone, d’une énergie de 95 MeV/u et possédant un TEL moyen de 28 keV/µm. Les doses délivrées

ont été comprises entre 0 et 1000 Gy d’une part et 0 et 4 Gy d’autre part, pour les échantillons

destinés à être analysés respectivement, par les techniques d’analyse chromatographique et par la

méthode des comètes. Nous allons tout d’abord effectuer un bref rappel sur les principales

caractéristiques des rayonnements de TEL élevé.

I. BREFS RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES SUR LES IONS LOURDS

Les différences que l’on peut attendre concernant la nature des dommages de l’ADN induits

par un rayonnement à TEL élevé tient à la nature des interactions de ce rayonnement avec la matière.

La trace des ions lourds comme le 12C6+ est très différente de celle des rayonnements à ionisation

diffuse comme le rayonnement gamma du 60Co. La trajectoire des particules est rectiligne et les

ionisations sont regroupées autour de cette trajectoire. Il est alors possible de distinguer deux zones

différentes de densités d’ionisation (351). La première caractérisée par une forte densité d’ionisation

s’appelle le coeur de la trace. La deuxième située à la périphérie de la précédente s’appelle la

pénombre et correspond à une zone de plus faible densité d’ionisation (Figure 130). Le coeur est la

zone centrale de la trace constituée de particules lourdes excitées ou ionisées par le premier ion

accéléré (ion de recul). Les électrons δ secondaires sont éjectés hors de la région centrale et

constituent la pénombre. La dose varie ainsi en 1/r2 où r est la distance à l’axe de la trace. Lorsque

l’ion lourd pénètre dans la matière, la dose qu’il délivre le long de sa trajectoire est maximale au

terme de celle-ci, i.e. quand les interactions avec le milieu sont les plus importantes (pic de Bragg).

12C6+

12C6+

coeur

pénombre

Figure 130 : Schéma de la trace d’un ion lourd (14)

181 Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire

Du fait de la nature de la trace, une irradiation par les ions lourds se caractérise par son

hétérogénéité. Dans le cas de l’irradiation de cellules, seules les molécules suffisamment proches du

coeur de la trace pourront être ionisées. Le nombre d’impacts par noyau dépend du nombre de

particules émises par cm2 (fluence de particules) (Tableau XXXII). La probabilité pour qu’un noyau

soit touché par n impacts est calculée par la formule de Poisson :

P(n) =e-λ.λn

n!où λ est le nombre moyen de collisions par noyau

λ, est donc le rapport entre la fluence et la surface équatoriale du noyau cellulaire.

Tableau XXXII : Répartition des impacts dans des noyaux de lymphocytes humains (25 µm2 de

surface équatoriale) d’après la distribution de Poisson

Nombre d’impacts réels par noyau

Fluence

(part./cm2)

λλλλ 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1,6 106 0,4 67 27 5,3 0,7

2 106 0,5 61 30 7,5 1,5

4 106 1, 37 37 18 6,1 1,9

8,4 106 2,1 12 26 27 19 10 4,1 1,4 0,5

107 2,5 9 21 26 21 13 6,8 2,8 10,4

2 107 5 0,7 3,4 8,4 14 18 17 15 10 6,5 3,6

Tableau XXXII : Répartition des impacts dans des noyaux de lymphocytes humains (25 µm2 de

surface équatoriale) d’après la distribution de Poisson (suite)

Nombre d’impacts réels par noyau

Fluence (part./cm2) λλλλ 0000 40404040 50505050 60606060 75757575 100100100100

2 108 50 ≈ 10−20 2,1 5,5 2 0,02 ≈ 10−8

Parmi les principaux dommages de l’ADN induits par des rayonnements de TEL élevé, lescoupures de brins ont fait l’objet d’un intérêt tout particulier. L’efficacité des rayonnements de TEL

élevé à produire des coupures a été mise en évidence dans plusieurs travaux (352-354). On peutrappeler que dans le cas de rayonnements à fort TEL, si le nombre de cassures simple brin estrelativement similaire à celui induit par les rayonnements de faible TEL, celui des cassures doublebrin ainsi que la complexité qui y est associée augmente de façon exponentielle avec la fluence des

particules (355). De même, la réparation des cassures simple et double brin est plus longue voire

inachevée (355, 356). Par ailleurs, les aberrations chromosomiques produites par les ions lourds sont


beaucoup plus complexes. En particulier, les aberrations de type cassure sont beaucoup plusnombreuses que les aberrations de type échange, alors que ces deux types d’aberrations sont induits

dans les mêmes proportions dans le cas du rayonnement X (352). On peut ajouter que les échanges

entre chromatides soeurs sont aussi plus nombreux (357).

II. MESURE DE LA 5-HMDURD, DE LA 5-FORDURD, DES DIOLS DETHYMIDINE, DE LA 8-OXODGUO ET DE LA 8-OXODADO PAR CLHP-SM/SM

Dans le cadre des mesures des bases modifiées par CLHP-SM/SM, des monocytes ont étéexposés à des doses de 12C6+ comprises entre 100 et 1000 Gy. Ils ont ainsi été soumis à une fluencecomprise entre 2,4 109 et 2,4 1010 particules/cm2. Le flux utilisé était de 5 108particules/cm2.s-1.

5-HmdUrd/106 bases

y = 0,012 x + 0,3

R 2 = 0,9881

05

1015

2025

0 500 1000Dose (Gy)

Figure 131 : Formation de la 5-HmdUrd par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés au12C6+

La formation de la 5-HmdUrd est de 0,012 lésion/106 bases/Gy avec un niveau basal de 0,3lésion/106 bases (Figure 131).

Dose (Gy)

5-FordUrd/106 bases

y = 0,011 x + 0,1

R 2 = 0,9717

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

0 500 1000

Figure 132 : Formation de la 5-FordUrd par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés au12C6+


La formation de 5-FordUrd est de 0,011 lésion/106 bases/Gy avec un niveau basal de 0,1

lésion/106 bases (Figure 132).

y = 0,062 x + 1,96

2R = 0,9734

0

20

40

60

80

0 500 1000

Diols de thymidine/106 bases

Dose (Gy)

Figure 133 : Formation des diols de thymidine par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés

au 12C6+

L’ensemble des diols de thymidine se forme à raison de 0,062 lésion/106 bases/Gy avec un

niveau basal de 1,96 diols/106 bases (Figure 133).

8-oxodGuo/106 bases

y = 0,0097 x + 0,8

R2 = 0,9851

0

5

10

15

20

0 500 1000

Figure 134 : Formation de la 8-oxodGuo par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés au12C6+

La formation de 8-oxodGuo est estimée à 0,0097 lésion/106 bases/Gy (Figure 134). Le niveau

basal est de 0,9 lésion/106 bases.


8-oxodAdo/106 bases

y = 0,002 x + 0,1R

2 = 0,9605

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 200 400 600 800 1000

Dose (Gy)

Figure 135 : Formation de la 8-oxodAdo par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés au12C6+

Le taux de 8-oxodAdo mesuré est de 0,002 lésion/106 bases/Gy pour un niveau basal de 0,1

lésion/106 bases (Figure 135).

III. UTILISATION DE LA METHODE MODIFIEE DES COMETES

Nous avons utilisé la méthode des comètes en milieu alcalin, associée ou non aux enzymes de

réparation afin de mesurer, d’une part, les coupures de chaîne de l’ADN induites par le 12C6+ et

d’autre part les bases modifiées, substrats de Fpg et d’endo III. Il ne s’agit que de résultats

préliminaires qui devront être confirmés par de nouvelles expériences. Les cellules ont été exposées à

des doses de rayonnement comprises entre 2 et 4 Gy, i.e. à une fluence comprise entre 4,8 107 et 9,6

107 particules/cm2. Le flux utilisé est de 3 106 particules/cm2.s-1.

A. Utilisation de la Fpg

y = 6,9 x + 63,9R2 = 0,6598

y = 5,6 x + 25,6R2 = 0,8214

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4

CSB + CDB + SAL +sites Fpg

CSB + CDB + SAL


Dose (Gy)

Figure 136 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar Fpg, dans l’ADN de monocytes exposés au 12C6+


La mesure de la formation des coupures (CB) est estimée à l’aide d’une droite de régression

linéaire de pente 5,6 µm/Gy. Le niveau basal de ces lésions est de 25,6 µm. Lorsque l’enzyme Fpg est

utilisée, on constate une augmentation de la pente précédente avec une valeur de 6,9 µm/Gy. La

valeur du moment de la queue de la comète mesurée dans les cellules contrôle est de 63,9 µm (Figure

136). L’augmentation du niveau basal, due à l’utilisation de la protéine Fpg est élevée. Une des

raisons possibles pour expliquer cette forte valeur est le stress que peuvent subir les cellules avant

leur lyse. En effet, du fait de contraintes techniques imposées par l’irradiation au 12C6+, les cellules

sont maintenues pendant une période variable dans une solution de PBS avant que leur lyse ne soit

effectuée. On peut ajouter, à l’appui de cette hypothèse, que la valeur du moment de la queue de la

comète mesurée dans les cellules contrôle en absence de Fpg est également élevée.

On peut noter que, si nous calibrons la méthode des comètes, en utilisant l’approche décrite

dans le Chapitre V, nous obtenons une valeur de 1 8-oxodGuo/106 bases correspondant à 130 µm du

moment de la queue de la comète. Cette valeur est élevée car elle ne prend pas en compte le taux de

formation des dérivés Fapy purines, qui n’a pas été pour l’instant mesuré.

B. Utilisation de l’endonucléase III

y = 12,6 x + 40,5

R2 = 0,9132

y = 5,6 x + 25,6

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4

CSB + CDB + SAL +sites endo III

CSB + CDB + SAL

2R = 0,9452

Dose (Gy)


Figure 137 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar endo III, dans l’ADN de monocytes exposés au 12C6+

En présence d’endo III, l’augmentation du moment de la queue de la comète est de 12,6

µm/Gy et le moment de la queue atteint 40,5 µm dans les cellules contrôle (Figure137).

IV. DISCUSSION DES RESULTATS

Si nous comparons les taux de formation des lésions induites par le rayonnement gamma du

cobalt 60, par le 12C6+, ou par des impulsions UV LASER, il apparaît que les deux premiers types de

rayonnements produisent sensiblement le même spectre de bases modifiées (Tableau XXXIII). Les

diols de thymidine constituent la lésion majoritairement formée, suivie dans un ordre décroissant de la


5-HmdUrd et de la FapyGua (même ordre de grandeur), de la 5-FordUrd, de la 8-oxodGuo et enfin de

la 8-oxodAdo. Il faut ajouter qu’aussi bien dans le cas de l’irradiation gamma que dans le cas de

l’irradiation au 12C6+, très peu de 8-oxodAdo est générée. L’utilisation de particules possédant un TEL

plus élevé que celui des ions 12C6+ serait très intéressante. Elle permettrait de mettre en évidence de

façon plus claire l’existence ou non d’un effet de TEL sur la distribution des différents produits de

modification des bases.

Tableau XXXIII : Comparaison entre les taux de formation des lésions induites par le rayonnement

gamma, les particules chargées 12C6+ ou le rayonnement UV LASER

Irradiation gamma Irradiation au 12C6+ Irradiation UV LASER

/106 bases/Gy /106 bases/Gy /106 bases/mJ

8-OxodGuo 0,020 0,0097 1,29

8-OxodAdo 0,0035 0,0026 0,017

Diols de thymidine 0,048 0,029 0,085

5-FordUrd 0,022 0,011 0,017

5-HmdUrd 0,029 0,012 0,06

La lecture du Tableau suivant montre que le rapport entre le taux de formation de la 8-

oxodGuo et celui de l’ensemble des autres bases modifiées est à peu près identique dans le cas de

l’irradiation gamma et de l’exposition au 12C6+. Il semble cependant que le rayonnement de faible TEL

produise entre 1,5 et 2 fois plus de bases modifiées. Une des hypothèses pour expliquer cette

différence peut être la formation par les ions lourds de sites multi-lésés. De telles lésions pourraient

inhiber en partie l’hydrolyse enzymatique de l’ADN et empêcher ainsi la libération des bases

modifiées. Le Tableau XXXIV montre que la distribution des lésions est similaire dans les deux types

d’irradiation.

Tableau XXXIV : Comparaison des rapports entre les taux de formation des diverses catégories de

lésions pour le rayonnement gamma et pour l’exposition au 12C6+

Rapports Irradiation gamma Exposition au 12C6+

8-OxodGuo/ensemble des autres bases modifiées* 0,11 0,11

8-OxodGuo/sites endo III** 0,38 0,08

8-OxodGuo/diols de thymidine 0,20 0,16

* : mesures par CLPH-SM/SM,

** : nombre de sites endo III obtenu à partir de la calibration de la méthode des comètesprécédemment utilisée dans le Chapitre V.


Le rapport 8-oxodGuo/sites endo III est différent, mais la mesure des sites endo III par la

méthode des comètes dans le cas de l’irradiation au 12C6+ doit être confirmée.

Nous avons noté dans le chapitre III que l’effet d’ionisation (abordé par l’irradiation UV

LASER) se traduisait par des taux élevés de 8-oxodGuo, comparativement aux niveaux de formation

des autres lésions. Or, une irradiation à l’aide d’un rayonnement de TEL plus élevé, devrait se traduire

par une contribution plus importante de l’effet direct comparativement à l’effet indirect. De même, il

ressort à l’examen des rapports 8-oxodGuo/sites endo III et 8-oxodGuo/diols de thymidine, que le

taux de formation des diols de thymidine ne suffit pas, à lui seul, à expliquer la forte augmentation du

moment de la queue de la comète mesurée en présence d’endo III. Le taux de formation des CB est

par Gy légèrement plus faible que celui déterminé dans le cas de l’irradiation gamma. La mesure des

coupures double brin permettrait sans doute, comme cela a déjà été mentionné dans la partie

introductive de ce chapitre, de mettre en évidence un taux de formation supérieur à celui déterminé

avec les rayonnements de faible TEL.

Nous n’avons pas constaté, lors de l’analyse des lames, d’hétérogénéité morphologique entre

les différentes cellules soumises à une même fluence de particules. Ceci est surprenant au regard du

parcours rectiligne de ces particules dans la matière.

Conclusion et Perspectives

Conclusion et Perspectives 189

Conclusion et PerspectivesUne meilleure connaissance des effets des rayonnements ionisants sur l’organisme implique la

possibilité de mesurer les lésions radio-induites dans l’ADN cellulaire. Ces lésions peuvent être de

plusieurs sortes : cassures de brin, modifications de bases, pontages ADN-protéines, sites abasiques,

etc.. L’objectif de l’étude que nous avons présentée dans ce mémoire était de mesurer les principales

bases modifiées de l’ADN cellulaire exposé au rayonnement gamma du 60Co. Il s’agissait de

déterminer les taux de formation ainsi que les niveaux basaux des lésions radio-induites et de mieux

comprendre leurs mécanismes de formation au niveau cellulaire. La mesure de ces modifications a été

effectuée à l’aide de méthodes chromatographiques comme la CLHP-DE pour la mesure de la 8-

oxodGuo, la CG-SM pour la mesure des dérivés Fapy purines ou la technique de CLHP-SM/SM. La

première étape de notre travail a comporté une phase de mise au point de ces méthodes. Il a ainsi été

possible de mesurer le niveau basal ainsi que le taux de formation de sept bases modifiées dans

l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma (0-1000 Gy) ou à la lumière UV LASER (0-

500 mJ). Cinq modifications de bases ont également été mesurées dans l’ADN de monocytes exposés

à un flux de particules de 12C6+ (0-500 Gy).

Il ressort de ces expériences que les modifications de bases se forment en quantités

relativement faibles. La meilleure sensibilité de détection obtenue est de l’ordre de 50 femtomoles

pour la 8-oxodGuo par la technique de CLHP-DE et de CLHP-SM/SM. La plus mauvaise est observée

dans le cas de la technique de CG-SM avec une limite de sensibilité de l’ordre de 1 pmole pour les

dérivés Fapy purines. Pour mettre en évidence de façon significative la formation des lésions étudiées,

il a été nécessaire d’exposer les échantillons à de fortes doses d’irradiation, i.e. supérieures à 40 Gy

pour la mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE ainsi que pour la mesure des diols de thymidine par

CLHP-SM/SM et supérieures à 100 Gy pour la mesure des autres bases modifiées. Il faut ajouter que

pour accroître la sensibilité de détection, les mesures ont été effectuées sur des quantités d’ADN

relativement élevées (> 100 µg).

De toutes les bases de l’ADN, il est apparu que la thymine est particulièrement dégradée sous

irradiation gamma. En effet, les diols de thymidine constituent la lésion majoritaire avec un taux de

formation proche de 1 modification/107 bases/Gy. Ils sont suivis de la 5-HmdUrd, du dérivé Fapy de

la guanine et de la 5-FordUrd. Ces données semblent en accord avec les études effectuées sur les

nucléosides isolés qui montraient que les radicaux °OH, très électrophiles, réagissaient de façon

préférentielle avec les liaisons insaturées des bases pyrimidiques. Toutefois, les taux que nous avons

mesurés sont bien inférieurs à ceux déterminés dans de nombreuses études utilisant la technique de

CG-SM. Ils sont compris entre 0,003 et 0,1 modification/106 bases par Gy (données correspondant à

la 8-oxodAdo et aux diols de thymidine, respectivement). La mesure des principales modifications de

l’adénine (FapyAde et 8-oxodAdo) semble indiquer que cette base est peu modifiée. Toutefois, ces

190 Conclusion et Perspectives

conclusions doivent être nuancées. En effet, d’autres lésions, que nous ne sommes pas à l’heure

actuelle en mesure de quantifier, peuvent se former dans des proportions importantes. Il serait par

exemple intéressant de déterminer le taux de formation des diols de cytosine, des produits de

réduction des bases pyrimidiques ou de l’oxazolone. Nous avons en effet observé qu’un autre produit

de réduction, la FapyGua se formait en quantités importantes. Ces résultats montrent aussi que la 8-

oxodGuo généralement utilisée comme marqueur biologique du stress oxydant se forme en quantité 5

à 7 fois inférieure à celle des diols de thymidine (dans le cas de l’irradiation gamma). Cette dernière

lésion pourrait, par conséquent, constituer un marqueur plus sensible de l’altération de la molécule

d’ADN par le rayonnement gamma.

Afin d’étudier l’influence du TEL du rayonnement, des mesures de dommages induits par un

flux de particules de 12C6+ ont été effectuées. Nous n’avons pas observé de différences significatives

avec l’effet du rayonnement gamma. Les taux de formation de cinq lésions déterminés par CLHP-

SM/SM sont sensiblement équivalents à ceux obtenus dans le cas du rayonnement de faible TEL. Une

des explications à ceci est peut-être que l’ion 12C6+ ne possède pas un TEL suffisamment élevé pour

que des différences notables soient observables. Il serait par conséquent envisageable dans le futur

d’utiliser des particules possédant un TEL supérieur comme l’40Ar, l’17O, le 40Ca, etc.. Dans ces

dernières conditions, une contribution plus importante de l’effet direct au dépens de l’effet indirect du

rayonnement est attendue.

Pour déterminer la nature des lésions formées par ionisation directe de l’ADN, nous avons eu

recours à un rayonnement UV LASER de haute intensité. L’utilisation d’une telle source d’ionisation

permet d’étudier certains aspects de l’effet direct du rayonnement gamma. Les mesures de bases

modifiées que nous avons effectuées ont montré que la 8-oxodGuo était la lésion induite dans les

proportions les plus importantes, suivie des diols de thymidine. Un rayonnement de TEL

suffisamment élevé devrait produire le même spectre de dommages. Il faut noter que la 8-oxodAdo se

forme dans des proportions notables. La comparaison des taux de formation de la 8-oxodGuo produite

par irradiation gamma et UV LASER suggère que l’effet direct n’est pas dans le cas du rayonnement

gamma prédominant. La radiolyse de l’eau qui est à l’origine du radical °OH apparaît être le principal

processus responsable des altérations observées. Il sera néanmoins très intéressant de déterminer le

taux de formation des dérivés Fapy purines induits par des impulsions UV LASER. Ceci permettra de

déterminer la contribution de la composante mono-photonique de ce rayonnement dans la formation

de 8-oxodGuo (réactions de photosensibilisation).

Parallèlement à l’utilisation de méthodes chromatographiques, nous avons développé une

approche indirecte de mesure des dommages de bases de l’ADN, faisant appel à la méthode des

comètes associée à des enzymes de réparation (Fpg et endo III).

Nous avons défini les conditions d’utilisation de la méthode. La formation relative ainsi que

le niveau basal des CB (coupures + sites alcali-labiles) et des sites reconnus par Fpg ou endo III ont

Conclusion et Perspectives 191

été déterminés dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma du 60Co (0-8 Gy), à la

lumière UVA (0-150 kJ.m-2) ou à des photosensibilisateurs exogènes (acridine orange et rose bengal

excités par la lumière visible).

Il a été observé dans le cas de l’irradiation gamma que les coupures de brin (CB) sont

produites en quantités sensiblement équivalentes à la somme des coupures induites par les deux

enzymes de réparation associées. De plus le nombre de sites Fpg mesuré est proche de celui des sites

endo III. Lorsque les photosensibilisateurs ont été utilisés à faible concentration, nous avons observé

une formation très faible voire nulle des coupures. Les sites révélés par l’endonucléase III se sont

avérés être formés en des quantités inférieures à la limite de détection de la méthode. En revanche, un

niveau important de sites Fpg a été mesuré.

Utilisés à une concentration correspondant à une unité densité optique de 1, les

photosensibilisateurs ont induit des coupures de brin de l’ADN et des sites endo III. Les sites Fpg

produits en trop grandes quantités n’ont pas pu être mesurés dans ces conditions.

Enfin, il a été montré que la lumière UVA produisait principalement des sites Fpg mais aussi

en plus faibles quantités des coupures et des sites alcali-labiles (CB). Des sites endo III ont également

été mesurés en faibles quantités.

Les modèles oxydatifs représentés par les radiations gamma, le rayonnement UVA et par les

photosensibilisateurs exogènes ont permis de calibrer la méthode des comètes. Pour cela,

l’augmentation du moment de la queue de la comète observée en présence de Fpg, a été corrélée aux

taux de formation, de la 8-oxodGuo et des dérivés Fapy purines, déterminés respectivement par

CLHP-DE, et par CG/SM ou CLHP-SM/SM. Une modification/106 bases normales a été corrélée avec

58,5 µm de moment de la queue de la comète. Cette calibration a permis de mesurer le niveau basal et

le taux de formation, des CB, des sites endo III et ceux des sites Fpg. Elle a rendu possible la

confrontation des deux approches et a conduit à la détermination des taux de 8-oxodGuo (assimilée

aux sites Fpg) dans l’ADN cellulaire pour des doses d’irradiation gamma aussi faibles que 2 Gy. Ce

niveau est voisin de 0,2 lésion/106 bases. Or de nombreuses études utilisant la technique de CG-SM

indiquaient des taux 100 à 1000 fois plus élevés. Nos résultats confirment les résultats d’autres études

qui ont souligné les problèmes d’oxydation artéfactuelle associés à l’utilisation des méthodes

chromatographiques. Parmi ceux-ci, on peut citer l’oxydation des bases normales qui se produit au

cours de l’extraction de l’ADN cellulaire, mais aussi au cours de l’étape de silylation des échantillons

avant l’analyse par CG-SM. La méthode des comètes, en s’affranchissant de ces contraintes

techniques semble, par conséquent moins sujette à ces artefacts.

La confrontation des deux approches a permis d’étudier les mécanismes de formation des

lésions. Les résultats obtenus ont montré que dans le cas du rayonnement gamma, le radical hydroxyle

était la principale espèce produite et conduisait à un spectre très large de lésions, incluant les coupures

de brin et les atteintes des bases dans des proportions sensiblement équivalentes. En revanche, le

192 Conclusion et Perspectives

modèle représenté par les photosensibilisateurs excités par la lumière visible indique que la lésion

majoritaire est la 8-oxodGuo via la formation d’oxygène singulet. Cela explique le spectre restreint de

lésions observé (pas de sites endo III, très peu de coupures et de dérivés Fapy purines). La lumière

UVA produit de faibles taux de formation des coupures et sites alcali-labiles ainsi que des sites endo

III. En contrepartie, la proportion des sites Fpg est importante, suggérant l’implication de l’oxygène

singulet.

Il ressort de cette étude que la plupart des travaux portant sur la mesure des dommages de

bases de l’ADN par la méthode CG-SM doivent être reconsidérés. Il serait par ailleurs intéressant de

déterminer le temps nécessaire à la cellule pour réparer chaque type de base modifiée ainsi mesurée.

Les études de cinétique de réparation des modifications de bases ont en effet, pour la plupart, été

effectuées en utilisant la méthode CG-SM. C’est par exemple le cas d’une étude de Jaruga et al.(252).

Dans cette dernière étude, le délai permettant la réparation de 50% des lésions est compris entre 8,5

min pour la 5-OH-Ura et, 62,2 min pour la FapyAde. Le rapport entre les bases modifiées et les

coupures de chaînes et sites alcali-labiles de 1,5 signifie que les bases modifiées se forment en

quantités relativement importantes. Par conséquent, il est indispensable pour la cellule d’assurer une

réparation complète de ces dommages.

Les études de réparation pourraient être également abordées par la méthode modifiée des

comètes. Enfin, il serait intéressant d’aborder l’étude des sites multi-lésés. Pour cela, l’association de

techniques de mesure de CDB aux enzymes de réparation pourrait fournir des indications.

- Chapitre VII -

Partie expérimentale

Chapitre VII : Partie expérimentale 194

I. PRODUITS CHIMIQUES

L’agarose et l’agarose « low melting point» sont des produits Promega (Madison, WI, USA).

Le Tris, le Na2EDTA et le BSTFA ont été obtenus chez Interbiotech (Interchim, Montluçon), alors

que KCl et NaOH proviennent de chez Carlo Erba (Milan, Italie). Tous les produits ou enzymes

suivants : nucléase P1, phosphatase acide, phosphatase alcaline, RNase A, RNase T1, DMSO, triton

X-100, BSA, sodium sarcosinate, NaI, MgCl2, bromure d’éthidium, déféroxamine, SDS, FapyAde, et

l’ADN isolé de thymus de veau ont été obtenus chez Sigma Co (St Louis, MO, USA). La PRV et la

PVS sont des produits de Boehringer (Mannheim, Allemagne). La protéase provient de chez Qiagen

Genomic (Hilden, Allemagne). Les enzymes de réparation surexprimées chez Escherichia coli, Fpg et

endo III, ont été gracieusement fournies par le Dr. Serge Boiteux (CEA, Fontenay-aux-Roses). Le

RPMI-1640, le FCS, le PBS Dulbecco's sont des produits de Life Technologies (Paisley, Royaume

Uni). Les lames et les lamelles de microscope proviennent respectivement de Touzart & Matignon

(Vitry-sur-Seine) et de Marienfeld (Allemagne). Les colonnes Nap 25 ont été obtenues chez

Pharmacia Biotech (Uppsala, Suède). Les dérivés enrichis [M+3] FapyGua et FapyGua ont été

synthétisés comme décrit dans (226). Le dérivé [M+3] FapyAde a été fourni par H. E. Poulsen

(Université de Copenhague, Copenhague, Danemark). Les composés [M+3] 5-OHdUrd, [M+3] 5-

FordUrd, [M+3] 5-HmdUrd, [M+3] diols de thymine, et les dérivés [M+5] 8-oxodGuo, [M+5] 8-

oxodAdo ont été synthétisés selon les méthodes décrites dans (246). La 5-OHdUrd, la 5-FordUrd, la

5-HmdUrd ont été préparées selon le protocole décrit dans (358). La 8-oxodGuo et la 8-oxodAdo ont

été synthétisées selon la méthode rapportée dans (359). Les diols de thymidine ont été obtenus

comme décrit dans (360).

II. LIGNEE ET CULTURE CELLULAIRE

Un lignée monocytaire tumorale THP-1 isolée du sang périphérique d’un jeune donneur

atteint de leucémie (ATCC, Rockville, MD, USA) a été cultivée dans une atmosphère enrichie en CO2

à 5% et maintenue à 37°C. Le milieu de culture comprenait du RPMI-1640 auquel 10% de sérum de

veau décomplémenté et 5% de glutamine à 200 mM ont été ajoutés.

III. COURBE DE SURVIE CELLULAIRE

La survie cellulaire de cellules exposées au rayonnement gamma du cobalt 60 a été mesurée à

l’aide d’une méthode colorimétrique au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-

tétrazolium (MTT). Cette molécule de couleur jaune est réduite par les enzymes déshydrogénases

mitochondriales en sel de couleur bleu. Pour cela, 1,5 ml de suspension cellulaire irradiée ou témoin

ont été déposés dans des puits avant ajout de 200 µl de solution MTT préparée dans le tampon PBS (5

mg/ml). Les préparations ont ensuite été incubées pendant 24 ou 48 h dans une atmosphère enrichie

195 Chapitre VII : Partie expérimentale

en CO2 à 5% et maintenues à 37°C. La coloration bleue des cristaux formés par les cellules vivantes a

ensuite été dissoute dans 100 µl de DMSO et l’absorbance a été mesurée à 570 nm en utilisant un

spectrophotomètre (Titertek Multiskan, Labsystems Group, Les Ullis) relié à un système

informatique. L’absorbance mesurée est alors directement proportionnelle au nombre de cellules

vivantes. Les résultats sont ensuit exprimés en % de survie.

(M-B)(T-B)

% survie = 100

T : moyenne des densités optiques des cellules non traitées ;

M : moyenne des densités optiques des cellules traitées ;

B : moyenne des densités optiques des cristaux bleus.

IV. IRRADIATIONS ET REACTIONS DE PHOTOSENSIBILISATION

A. Irradiations γγγγ et UVALes irradiations UVA ont été effectuées en utilisant une lampe à haute pression Tecimex

(Dixwell, St Symphorien d’Ozon). Le spectre délivré par la lampe indique un maximum d’émission à

373 nm. Le débit de dose (45 mW.cm-2) a été mesuré par un radiomètre (Dixwell, St Symphorien

d’Ozon). Les irradiations gamma des échantillons pour les dosages des dérivés Fapy purines par CG-

SM ont été effectuées à l’aide d’une source de 60Co avec un débit de dose de 50 Gy. min-1. Les

échantillons destinés aux autres mesures de dommages de bases de l’ADN par l’approche

chromatographique, ont été irradiés à l’aide d’une source de 60Co d’un débit de dose de 20 Gy. min-1.

Dans ces deux cas, la dosimétrie a été effectuée à l'aide de poly-méthacrylate de vinyle.

Enfin, les irradiations des échantillons pour les mesures par la méthode des comètes ont été

effectuées avec une source de 60Co (service de Radiothérapie du C.H.U. Michallon, Grenoble). Le

faisceau était vertical et le débit de dose était de 0,8 Gy min-1. Les suspensions cellulaires ont été

transférées dans des boîtes cylindriques de 9 ml placées en « sandwich » entre des plaques de

polystyrène condensé, équivalent tissu (Figure 138). Ces dernières permettent d’atteindre les

conditions d'équilibre électronique. Le champ d’irradiation avait une dimension de 16 cm × 16 cm. La

distance entre la source et la plaque de polystyrène était de 80 cm (DSP). Le calcul du temps

d’irradiation a été effectué à l’aide du logiciel de calcul inclus dans le serveur TIGR du service.


×

60Co

hν matériel équivalent tissu

échantillon

champ 16 cm 16 cm ( γ )

DSP = 80 cm ( γ )

Figure 138 : Dispositif d’irradiation aux faibles doses de 60Co

Avant irradiation UVA ou γ, les cellules ont été centrifugées à 240 g pendant 4 min, afin

d’éliminer le milieu de culture. Le culot a été rincé une fois dans du tampon PBS avant d’y être repris

afin d’obtenir une suspension cellulaire de 2 106 cellules/ml et de 20 106 cellules/ml pour les

échantillons destinés, respectivement à l’analyse par la méthode des comètes et aux analyses

chromatographiques. Toutes les irradiations ont pour des raisons pratiques été effectuées à

température ambiante. Les cellules contrôle ont été maintenues à l’obscurité à 4°C. Immédiatement

après l’irradiation, les cellules destinées à l’analyse par la méthode des comètes ont été mélangées

avec de l’agarose « low-melting point ». Le mélange a été déposé sur les lames de microscope et les

cellules ont ensuite été lysées. Les cellules destinées aux mesures chromatographiques ont été

centrifugées à 240 g pendant 4 min. Puis, les culots obtenus ont été repris dans le tampon de lyse

(320 mM sucrose, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, 0,1 mM déféroxamine, 1% TritonX-100) pour

l’extraction de l’ADN.

B. Irradiation par des particules de 12C6+

L’irradiation des échantillons au 12C6+ a été effectuée au GANIL (Grand Accélérateur

National d’Ions Lourds) à Caen en collaboration avec une équipe du CIRIL (Centre Interdisciplinaire

de Recherche sur les Ions Lourds).

Les suspensions cellulaires de monocytes, destinées aux mesures chromatographiques et à

l’analyse par la méthode des comètes ont été irradiées dans des tubes « Eppendorfs », d’un volume de

2 ml et de 200 µl, respectivement. Pour cela, les cellules ont été disposées face au faisceau horizontal

de particules d’une section diamétrale de 2,5 cm. Les conditions de préparation et de traitement des

échantillons avant et après irradiation étaient identiques à celles utilisées dans le cas de l’irradiation

gamma ou UVA.


C. Irradiation par des impulsions UV LASERL’irradiation au LASER UV des suspensions de monocytes a été effectuée dans des cellules

de quartz de volume 1 ml. Les monocytes ont été préparés et concentrés dans du tampon PBS, à raison

de 20 millions de cellules/ml irradié, ce qui représente environ 5 D.O. d’ADN (250 µg d’ADN). La

source LASER de modèle Surelite II (Continuum) était constituée d’un cristal Nd YAG émettant à

1064 nm. L’énergie maximale que le système peut fournir à 1064 nm était de 0,7 J par impulsion. La

durée d’une impulsion était de 5 ns. La conversion de la lumière infra-rouge en lumière UV était

effectuée par deux doublements de fréquence consécutives (générateurs de seconde harmonique) à

l’aide de cristaux de kalium dihydro-phosphate deutéré (1064→538→266 nm). Seule la lumière à λ =

266 nm était conservée après passage au travers d’un filtre constitué par un miroir dichroïque et par

un prisme Pelin-Brocca. L‘énergie maximale que l’on pouvait délivrer à 266 nm était de 60 mJ par

impulsion. Le dispositif est représenté dans la Figure 139.

Nd : YAG laserλλλλλ λ λ λ = 1064 nm

GH GH λλλλ2

λλλλ4

MD PPB

CMM

DC

MEPPC

PC OEM

λλλλ4266 nm

GH λ2

λ4( (: générateur de 2 ème (4ème) harmonique

MD : miroir dichroïque

PPB : prisme en quartz de Pelin-Brocca

DC : diaphragme circulaire

DF : déviateur de faisceau R = 8%

MPE : système de mesure d’énergie pyroélectrique

OEM: obturateur électromagnétique

C : cuve en quartz

MM: mélangeur magnétique

PC

PC : système informatique

Figure 139 : Dispositif d’irradiation au LASER à ionisation bi-photonique

La source LASER, le système de mesure d’énergie pyroélectrique (MPE) Nova (Ophir,

Israël) et l’obturateur électromagnétique (OEM) étaient reliés à un système informatique. La

procédure d’irradiation (acquisition de l’énergie, fermeture-ouverture du faisceau, introduction de

l’énergie d’irradiation, etc.) était contrôlée par informatique, à l’aide d’une carte universelle

ADC/DAC/TTL. Avant l’irradiation, la densité optique de la suspension cellulaire, préalablement

lysée par ajout de 0,3% de SDS, était déterminée sur une fraction aliquote par absorption UV à 260

nm. Les suspensions cellulaires ont été exposées à des doses comprises entre 10 et 100 mJ/D.O.,


correspondant à une gamme de doses comprises entre 50 et 500 mJ par ml de suspension cellulaire.

Immédiatement après irradiation, les échantillons ont été traités de manière conventionnelle pour les

mesures chromatographiques.

D. Réactions de photosensibilisationL’acridine orange et le rose bengal ont été utilisés à des concentrations de 5 10-3 D.O. et 10-2

D.O., respectivement. Les expériences ont été également effectuées à une concentration de 1 D.O.

pour les deux photosensibilisateurs. Avant exposition à la lumière, les cellules ont été centrifugées à

240 g pendant 4 min, afin d’éliminer le milieu de culture. Les culots ont été rincés une fois et repris

dans un volume de tampon PBS de manière à obtenir les concentrations en cellules décrites ci-dessus.

Le rose bengal ou l’acridine orange ont ensuite été ajoutés. Après 5 min, les cellules ont été

centrifugées deux fois à 240 g pendant 4 min, et rincées dans du tampon PBS afin d’éliminer toute

trace du photosensibilisateur. Les irradiations ont été effectuées à température ambiante en utilisant

une lampe (Philips) émettant dans le visible (puissance 100 watts), maintenue à 18 cm de

l’échantillon. Les cellules contrôle ont été maintenues à l’obscurité en présence de

photosensibilisateur ou exposées à la lumière seule. Immédiatement après l’irradiation visible, les

cellules destinées à l’analyse par la méthode des comètes ont été mélangées à de l’agarose « low-

melting point » avant d’être déposées sur les lames de microscope et lysées. Les cellules destinées aux

mesures chromatographiques ont été centrifugées à 240 g pendant 4 min et les culots obtenus ont

été repris dans le tampon de lyse (320 mM sucrose, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, 0,1 mM

déféroxamine, 1% TritonX-100) pour l’extraction de l’ADN.

V. METHODE DE MICROELECTROPHORESE SUR GEL

A. Méthode des comètes en milieu alcalin150 µl d’agarose standard 1% ont été déposés sur une lame de microscope puis ont été

recouverts d’une lamelle. Les lames ont été maintenues à température ambiante pendant 5 min.

Immédiatement après irradiation (UVA, gamma) ou réaction de photosensibilisation en présence de

lumière visible, 10 µl de la suspension cellulaire ont été mélangés à 100 µl d’agarose « low-melting

point » à une concentration de 1,2%. Les lamelles ont été retirées et le mélange a été déposé sur le

premier gel avant d’être recouvert par une lamelle. Les lames ont été ensuite déposées sur de la glace

pour solidification. Les lamelles ont été ensuite retirées et les lames ont été recouvertes d’un tampon

de lyse (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% sodium sarcosinate, 1% Triton X-

100 et 10% de DMSO). Puis l’ensemble a été laissé en contact pendant 1 h à 4°C.

Afin de convertir les bases modifiées en coupures de chaîne d’ADN, des enzymes de

réparation dont les gènes ont été surexprimés dans E. coli, à savoir Fpg et endo III ont été utilisées

séparément. Pour cela, les lames ont été rincées trois fois avec du tampon Tris/HCl (0,4 M, pH 7,4)

afin d’éliminer le tampon de lyse restant. Puis, elles l’ont été encore deux fois avec le tampon de la


protéine Fpg (20 mM Tris, 0,2 mg/ml d’albumine de sérum de veau, 0,5 mM Na2EDTA, 0,1 M KCl,

pH 8). Dans l’étape suivante, 100 µl de la Fpg glycosylase (1 µg/ml) ou de l’endonucléase III

(1µg/ml) ont été déposés sur les lames. Des lamelles ont été ajoutées et les lames ont été incubées à

37°C pendant 45 min, avant d’être immergées dans le tampon d’électrophorèse (300 mM NaOH, 1

mM Na2EDTA) pendant 20 min. L’électrophorèse a été effectuée à 25 V et 300 mA pendant 45 min.

Les lames ont été ensuite rincées avec du Tris/HCl (0,4 M, pH 7,4) avant que l’ADN nucléaire soit

visualisé par l’ajout de 60 µl de bromure d’éthidium (0,5 mg/ml) par lame et l’observation avec un

microscope à épifluorescence.

B. Méthode des comètes en milieu neutreLes protocoles utilisés ont été ceux décrits pour la technique en milieu alcalin jusqu’à l’étape

de lyse.

1. Protocole décrit par Singh et al.Le protocole décrit par Singh et al. comprend les étapes suivantes (302) : après une lyse de 1

h (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% sodium sarcosinate, 1% Triton X-100),

les lames ont été incubées, pendant 1 h à 37°C, dans la solution de lyse à laquelle de la protéase de la

société Qiagen (1 mg/ml) a été ajoutée. Les lames ont été ensuite immergées dans le tampon

d’électrophorèse (300 mM NaOH, 0,1% 8-hydroxyquinoline, 2% DMSO, 10 mM Na2EDTA). Après

20 min d’attente, période qui permet la décondensation de l’ADN, l’électrophorèse a été effectuée à

un voltage de 25 volts pendant 1 h.

2. Protocole décrit par Olive et al.Le protocole décrit par Olive et al. a été utilisé (314, 315) : les lames ont été immergées

pendant 4 h à 50°C dans le tampon de lyse (1% sarkosyl, 2 M NaCl, et 30 mM Na2EDTA, pH 8,3).

Les lames ont été ensuite rincées dans un tampon (90 mM Tris, 90 mM acide borique, 2 mM

Na2EDTA) pendant une nuit. Une électrophorèse a alors été effectuée dans le tampon Tris-borate-

Na2EDTA à 0,6 V.cm-1 pendant 25 min.

C. Analyse des lames de microscopeL’analyse des lames a été effectuée en utilisant un microscope à épifluorescence (Carl Zeiss,

Microscope Division, OberKochen, Allemagne) muni d’une lampe à mercure HBO (50 W, 516-560

nm) de la société Zeiss (OberKochen, Alllemagne). Le logiciel de traitement d’image utilisé a été le

système Komet 3.1 (Kinetic Imaging, Liverpool, Royaume Uni) qui a permis la mesure du moment de

la queue de la comète de 50 cellules par lame. Pour chaque dose d’irradiation, le moment de la queue

de la comète moyen a été calculé à partir de trois lames.


VI. METHODE D’EXTRACTION DE L’ADN CELLULAIRE

A. Méthode chaotropique au NaILe protocole décrit par Helbock et al. a été utilisé (209). Immédiatement après l’irradiation,

les cellules ont été centrifugées à 240 g pendant 4 min. Le culot obtenu (15 106

cellules/échantillon) a été repris deux fois dans 2 ml de tampon de lyse A (320 mM sucrose, 5 mM

MgCl2, 10 mM Tris/HCl, 0,1 mM déféroxamine, 1% TritonX-100) et centrifugé à 1500 g pendant

10 min. Les culots obtenus ont été repris dans 0,6 ml de tampon de lyse B (5 mM Na2EDTA, 10 mM

Tris/HCl, 0,15 mM déféroxamine). Du SDS (35 µl, 10%) a été ajouté et le mélange agité

vigoureusement avant addition de 30 unités de ribonucléase A (1 mg/ml) et de 8 unités de

ribonucléase T1. Les échantillons ont été incubés à 50°C pendant 15 min. Ensuite, 30 µl de protéase

Qiagen (20 mg/ml) ont été ajoutés et les échantillons ont été incubés pendant 1 h à 37°C.

L’ADN a été précipité par l’ajout de 0,8 ml de solution NaI (20 mM Na2EDTA, 7,6 M NaI, 40

mM Tris/HCl, 0,3 mM déféroxamine) et de 2 ml de propan-2-ol. L’ADN obtenu a été centrifugé à

5000 g pendant 10 min, et rincé successivement avec 1 ml de propan-2-ol à 40% et 1 ml d’éthanol

à 70%. Le culot a ensuite été dissous dans 100 µl d’une solution de déféroxamine à 0,1 mM.

B. Méthode au NaClLes culots cellulaires (106 cellules) ont été repris dans 1,5 ml de tampon de lyse (20 mM

NaCl, 20 mM Na2EDTA, 20 mM Tris, 5 mM déféroxamine, 10% SDS) auxquels 100 µl de protéase

(1mg/ml) ont été ajoutés. La solution obtenue a été incubée à 37°C pendant 1 h. Pour permettre la

précipitation des acides nucléiques, 300 µl d’une solution de NaCl 4 M ont été ajoutés ainsi que 7,5

ml d’éthanol froid. Les acides nucléiques ont été recueillis après centrifugation à 4500 g pendant

10 min. Les culots d’ADN ont été dissous dans 1 ml de tampon RNase (10 mM Tris, 2,5 mM

déféroxamine, 1 mM Na2EDTA, pH 7,4) et incubés pendant 1 h à 37°C en présence de 100 µl de

ribonucléase A (1 mg/ml ) et de 10 unités de ribonucléase T1. L’ADN a été ensuite précipité par

addition d’éthanol 100% froid, et rincé avec de l’éthanol 70%. Les échantillons ont été ensuite

dissous dans 100 µl d’eau désionisée.

C. Hydrolyse enzymatique de l’ADN sous forme de nucléosides

1. Hydrolyse de l’ADN préalable à la mesure de la 8-oxodGuo parCLHP-DE

L’hydrolyse de l’ADN sous forme de nucléosides par le couple d’enzymes nucléase P1-

phosphatase acide/ou phosphatase alcaline a permis la mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE.

L’ADN extrait selon la méthode au NaCl ou au NaI, est incubé à 37°C pendant 90 min en

présence de 10 µl de tampon 10X de la nucléase P1 (300 mM acétate de sodium, 1 mM ZnSO4, pH

5,3), de 10 unités de nucléase P1 et de 0,5 unité de phosphatase acide. Les protéines ont été ensuite


précipitées par addition de 50 µl de chloroforme. Une centrifugation à 5000 g pendant 15 min a

permis de recueillir la phase aqueuse avant analyse par CLHP-DE-UV.

2. Hydrolyse de l’ADN préalable à la mesure simultanée de septnucléosides par CLHP-SM/SM

Afin de mesurer par CLHP-SM/SM, au sein d’un même échantillon, la 8-oxodGuo les diols de

thymidine, la 5-FordUrd, la 5-OHdUrd, la 5-HmdUrd, la 8-oxodAdo et la dGuo, une hydrolyse

enzymatique de l’ADN par la nucléase P1 et la phosphatase alacaline associées à des exonucléases a

été effectuée.

Pour cela, l’ADN extrait selon la méthode chaotropique au NaI a été repris dans une solution

à 0,1 mM de déféroxamine. Il a alors été incubé en présence de 0,008 unité de phosphodiestérase de

rate de veau (PRV) diluée dans 10 µl de tampon 10 X (200 mM d’acide succinique, 100 mM CaCl2,

pH 6) et de 10 unités de nucléase P1. Les échantillons ont été incubés pendant 150 min à 37 °C. 0,003

unité de phosphodiestérase de venin de serpent (PVS) diluée dans 10 µl du tampon de la phosphatase

alcaline, et 10 unités de phosphatase alcaline ont été ajoutées aux échantillons avant incubation

pendant 150 min à 37°C.

VII. ANALYSES CHROMATOGRAPHIQUES

A. Courbes de calibrationAfin de rendre les mesures par CLHP-DE, CG-SM et CLHP-SM/SM quantitatives, des

courbes de calibration ont été établies pour chaque base modifiée. Pour la technique de CLHP-DE,

des quantités croissantes de 8-oxodGuo ont été injectées et le signal mesuré. Pour les techniques

faisant appel à la détection par spectrométrie de masse, la valeur du rapport des signaux entre le

produit recherché et l’étalon marqué a été déterminée. Pour cela des échantillons contenant une

quantité fixe de standard interne marqué isotopiquement ([M+3] ou [M+5]) et des quantités

croissantes de la base modifiée ont été préparés et analysés. Les Tableaux suivant donnent pour

chaque base modifiée, les concentrations des différents produits utilisés. On peut ajouter que 10 µl de

chaque solution préparée ont été injectés sur les colonnes chromatographiques.

1. Mesure par CLHP-DE

Tableau XXXVa : Concentrations des solutions utilisées pour établir la courbe de calibration de la 8-

oxodGuo mesurée par CLHP-DE

8-oxodGuo

Solution I II III IV V8-oxodGuo (µM) 0,01 0,05 0,1 1 10


2. Mesures par CG-SM et par CLHP-SM/SM

Tableau XXXVb : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la

FapyGua mesurée par CLHP-SM/SM

FapyGua

Solutions I II III IV VFapyGua (µM) 0,01 0,05 0,1 1 10

[M+3] FapyGua (µM) 0,5

Tableau XXXVc : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la

FapyAde mesurée par CLHP-SM/SM

FapyAde

Solutions I II III IV VFapyAde (µM) 0,01 0,05 0,1 1 10

[M+3] FapyAde (µM) 0,5

Tableau XXXVd : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la

5-OHdUrd mesurée par CLHP-SM/SM

5-OHdUrd

Solutions I II III IV V5-OHdUrd (µM) 0,001 0,01 0,1 0,5 1

[M+3] 5-OHdUrd (µM) 0,2

Tableau XXXVe : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la

5-HmdUrd mesurée par CLHP-SM/SM

5-HmdUrd

Solutions I II III IV V VI VII VIII IX5-HmdUrd (µM) 0,001 0,01 0,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10

[M+3] 5-HmdUrd (µM) 0,2


Tableau XXXVf : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la

5-FordUrd mesurée par CLHP-SM/SM

5-FordUrd

Solutions I II III IV V VI VII VIII IX5-FordUrd (µM) 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,2 1 5 10

[M+3] 5-FordUrd (µM) 0,2

Tableau XXXVg : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la

8-oxodAdo mesurée par CLHP-SM/SM

8-oxodAdo

Solutions I II III IV V VI VII VIII8-oxodAdo (µM) 0,0005 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 1

[M+3] 8-oxodAdo (µM) 0,2

Tableau XXXVh : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la

8-oxodGuo mesurée par CLHP-SM/SM

8-oxodGuo

Solutions I II III IV V VI VII VIII IX X8-oxodGuo (µM) 0,001 0,003 0,006 0,01 0,1 0,5 1 10 50 100

[M+5] 8-oxodGuo (µM) 0,2

Tableau XXXVi : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la

8-oxodGuo mesurée par CLHP-SM/SM

diols de thymidine (Tg)

Solutions I II III IV V VI VII VIII IXTg (µM) 0,001 0,01 0,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10

[M+3] Tg (µM) 0,2


B. Mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DELe système de CLHP comprenait une pompe MERCK-Hitachi HPLC, modèle L-6200,

associée à un injecteur automatique SIL 9A (Shimadzu, Kyoto, Japon). La phase mobile isocratique

était constituée de 50 mM KH2PO4 et de 8% de méthanol. Le débit de l’éluant était de 1 ml.min-1. La

séparation des nucléosides a été effectuée sur une colonne chromatographique C18 de silice à polarité

de phase inversée Uptisphere (5 µm, 4,6 mm 250 mm) d’Interchim (Montluçon) maintenue à 30°C.

Dans ces conditions, le temps de rétention de la 8-oxodGuo et de la dGuo ont été respectivement de

18,6 et 13 min. Un détecteur électrochimique Coulochem II, modèle 5200A (ESA, Chelmsford, MA,

USA) a été utilisé pour mesurer la 8-oxodGuo. Les potentiels d’oxydation des électrodes de la cellule

de détection électrochimique (modèle 5011, ESA) reliée à la colonne ont été fixés respectivement à

200 mV et 450 mV. Le potentiel de la cellule de garde placée en sortie de pompe a été fixé à 500 mV.

L’élution des nucléosides normaux a été suivie avec un détecteur UV (modèle 2151, LKB Bromma) à

une longueur d’onde de 280 nm. L’ADN cellulaire a été extrait selon la méthode chaotropique au

NaCl où au NaI. Il a été hydrolysé sous forme de nucléosides et injecté sur le système CLHP-DE-UV.

Pour chaque échantillon, la quantité d’ADN a été a estimée à partir du signal UV de la dGuo après

calibration externe.

C. Mesures par CG-SM des dérivés Fapy purines

1. Système CG-SML’analyse par CG-SM a été effectuée sur un appareil de chromatographie gazeuse de type HP

5890 Series II (Hewlett-Packard, les Ulis) muni d’une colonne capillaire (0,25 mm, 15 m) revêtue

d’un film de 0,1 µm d’épaisseur de méthylsiloxane substitué par 5% de phénylsiloxane (HP5-MS,

Hewlett Packard). L’injection de 2 µl de l’échantillon a été effectuée dans le mode « splitless » à une

température du port d’injection fixée à 250°C. Le gradient de température a été le suivant :

température initiale de 110°C, avec une élévation de 15°C/min pour atteindre la température finale de

280 °C. La détection des ions positifs a été effectuée avec un détecteur de type HP 5972 en mode

d’ionisation par impact électronique. Les chromatogrammes ont été recueillis en mode « SIM ». Les

temps de rétention de la FapyGua et de la FapyAde silylées ont été respectivement de 7 min et de 5,4

min.

2. Préparation des échantillonsPour les mesures par CG-SM, 35 106 cellules ont été utilisés. L’extraction de l’ADN a été

effectuée selon la méthode chaotropique au NaI précédemment décrite. L’ADN a été hydrolysé par

ajout de 20 unités de nucléase P1 dissoute dans 20 µl de tampon (300 mM acétate de sodium, pH 5,3,

1 mM ZnSO4). Deux standards internes isotopiquement enrichis, à savoir la [M+3] FapyGua (100

pmoles) et la [M+3] FapyAde (100 pmoles) ont été ajoutés. Une fraction aliquote (100 µl) des

échantillons a été séchée sous vide avant l’étape d’hydrolyse acide. Le reste de la solution (10 µl) a


été utilisé pour déterminer, par CLHP-UV, la quantité d’ADN présente dans chaque échantillon. Pour

cela, le système CLHP-DE-UV décrit précédemment a été utilisé (sans recueil du signal

électrochimique) pour mesurer la dGMP et estimer ainsi la quantité d’ADN, après calibration. La

phase mobile utilisée était constituée de 50 mM de KH2PO4 et de 1% de méthanol. Le débit d’élution

était de 1 ml.min-1. Dans ces conditions, le temps de rétention de la dGMP était de 18,0 min.

Parallèlement, une hydrolyse acide a été effectuée à température ambiante pendant 10 min,

dans 100 µl d’acide formique à 88%. Les échantillons ont ensuite été rincés 2 fois avec 50 µl d’eau

distillée et les solutions résultantes, séchées sous vide. Les résidus secs ont été repris dans une phase

contenant 25 mM de formiate d’ammonium pour prépurification.

Le système de prépurification était composé d’une pompe modèle 2150 LKB (Pharmacia

LKB Biotechnology, Uppsala, Suède) reliée à un injecteur automatique SIL-9A (Shimadzu, Kyoto,

Japon). La séparation a été effectuée sur une colonne de type C18 à polarité de phase inversée

Uptisphere (5 µm, 4,6 mm 250 mm) d’Interchim (Montluçon). Le gradient suivant a été utilisé pour

l’élution : 100% de formiate d’ammonium à 25 mM pendant les 10 premières minutes, puis la

proportion de méthanol a été augmentée linéairement de 20% à 100% en 25 min. Les conditions

finales ont été maintenues pendant 5 min avant retour à 100% de formiate d’ammonium à 25 mM. Le

débit était de 1 ml.min-1. Cinq fractions ont été collectées entre 2 et 7 min, après l’injection de 100 µl

de l’échantillon, en utilisant un collecteur de fraction (FC 204, Gilson, France). Les temps de

rétention de la FapyGua et de la FapyAde étaient respectivement de 3,5 min et 4,5 min, ( fractions 2 et

3 respectivement). Les fractions recueillies ont été lyophilisées afin d’éliminer le formiate

d’ammonium avant la dérivation des échantillons. Pour cela, les échantillons ont été dissous dans une

solution de 25 µl de BSTFA et de 25 µl d’acétonitrile. La silylation des bases modifiées a ensuite été

effectuée par chauffage à 120°C pendant 20 min, en présence de BSTFA. Les échantillons ont été

injectés en tête de colonne capillaire pour l’analyse CG-SM.

D. Mesures par CLHP-SM/SM

1. Système CLHP-SM/SMLe système chromatographique était constitué d’une pompe, modèle 2150 LKB (Pharmacia

LKB Biotechnology, Uppsala, Suède) reliée à un injecteur automatique SIL-9A (Shimadzu, Kyoto,

Japon). Le spectre de masse des composés a été obtenu sur un appareil type API 3000 (SCIEX,

Thornill, Canada) équipé d’une source « turboionspray » (SCIEX). Le gaz de nébulisation permettant

l’ionisation en mode « électrospray » était de l’azote circulant avec un débit de 1,23 l.min-1. Un

courant auxiliaire d’azote, possédant un débit de 8 l.min-1, et chauffé à 400°C, a été utilisé pour

accroître la sensibilité de l’analyse en favorisant l’évaporation des solvants. L’optimisation des

conditions de détection des nucléosides a été effectuée par infusion des composés utilisés à l’état pur.

Pour cela, ils ont été dissous dans de la phase mobile mise en mouvement à un débit de 5 µl min-1, par

un pousse seringue modèle 11 Harvard (Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA). L’optimisation


a porté sur les paramètres suivants : mode d’ionisation (positif ou négatif), tension d’ionisation (5000

Volts), tension de l’orifice et des différentes lentilles.

2. Mesures de la FapyGua et de la FapyAde

a) Préparation des échantillons

Comme dans le cas des mesures par CG-SM, 35 106 cellules ont été utilisés. L’ADN a été

extrait selon la méthode chaotropique au NaI et hydrolysé sous forme de nucléotides. Les standards

internes de [M+3)] FapyGua (100 pmoles) et de [M+3] FapyAde (100 pmoles) ont été ensuite ajoutés.

Comme décrit ci-dessus, une fraction aliquote (100 µl) des échantillons a été séchée sous vide avant

l’hydrolyse acide de l’ADN. Le restant de la solution (20 µl) a été utilisé pour déterminer par CLHP-

UV, la quantité d’ADN présente dans chaque échantillon. Un traitement à l’acide formique 88%, à

température ambiante a permis de libérer les bases FapyGua et FapyAde. Les échantillons ont été

ensuite rincés 2 fois avec 50 µl d’eau distillée et les solutions résultantes séchées sous vide. Les

résidus secs ont été repris dans 50 µl de phase mobile avant d’être injectés sur le système CLHP-

SM/SM.

b) Mesure des dérivés Fapy purines

Une colonne chromatographique de type NH2 (5 µm, 2 mm 150 mm) d’Interchim

(Montluçon) a permis de séparer les divers constituants du mélange. La phase mobile isocratique était

constituée de 10 mM de formiate d’ammonium en présence de 90% d’acétonitrile. Le débit était de

0,2 ml.min-1. Dans ces conditions, la FapyAde a été éluée en 2,9 min et la FapyGua en 5,8 min.

3. Cinétiques d’hydrolyse de l’ADNLa détermination des cinétiques d’hydrolyse a consisté à incuber en présences d’enzymes de

l’ADN isolé de thymus de veau après exposition à 40 Gy de rayonnement gamma. Le protocole

suivant a été utilisé:

a) Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par la nucléase P1 et la

phosphatase acide

Cent µl d’une solution d’ADN (0,5 mg/ml) ont été incubés en présence de 10 unités de

nucléase P1 diluée dans son tampon 10 X (300 mM acétate de sodium, 1 mM ZnSO4, pH 5,3) et de

0,5 unité de phosphatase acide pendant différentes durées. Les échantillons ont été ensuite analysés

par CLHP-SM/SM.

b) Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par la nucléase P1 et la

phosphatase alcaline associées à des exonucléases

Une première expérience a consisté à incuber 100 µl d’une solution d’ADN (0,5 mg/ml),

préalablement exposée à 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co, en présence de 0,004 unité de

phosphodiestérase de rate de veau (PRV) diluée dans 10 µl de tampon 10 X ( 200 mM d’acide


succinique, 100 mM CaCl2, pH 6) et de 10 unités de nucléase P1. Les solutions ont été maintenues à

37°C, pour des périodes comprises entre 30 min et 24 h. Puis, 0,003 unité de phosphodiestérase de

venin de serpent (PVS) diluée dans 10 µl du tampon 10 X de la phosphatase alcaline (500 mM Tris, 1

mM Na2EDTA, pH 8) et 10 unités de phosphatase alcaline ont été ajoutées aux échantillons avant une

incubation additionnelle de 5 h à 37°C. Dans une deuxième expérience, on a étudié plus

particulièrement l’influence du temps d’incubation en présence de PVS sur la cinétique d’hydrolyse

de l’ADN. Le temps d’incubation en présence de PRV a été fixé à 120 min. Les échantillons ont été

ainsi incubés en présence de PVS pour des périodes comprises entre 30 min et 24 h avant d’être

analysés par CLHP-SM/SM.

4. Mesure des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd, de la 5-HmdUrd, dela 5-FordUrd, de la 8-oxodGuo, de la 8-oxodAdo et de la dGuo

a) Préparation des échantillons

L’ADN a été extrait de 25 106 cellules selon la méthode chaotropique au NaI avant d’être

hydrolysé sous forme de nucléosides à l’aide de la nuléase P1 et de la phosphatase alcaline associées

aux exonucléases PRV et PVS. Une fraction de 10 µl de l’échantillon a été utilisée pour quantifier

l’ADN par CLHP-UV alors que le restant a été analysé par CLHP-SM/SM. Deux picomoles de

standards [M+3] de 5-OHdUrd, de 5-HmdUrd, de 5-FordUrd, et des diols de thymidine ainsi que des

étalons [M + 5] de la 8-oxodGuo et de la 8-oxodAdo ont été ajoutés à chaque échantillon avant

analyse.

b) Mesure des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd, de la 5-HmdUrd,

de la 5-FordUrd, de la 8-oxodGuo, de la 8-oxodAdo et de la dGuo

La colonne qui a permis de séparer les 7 nucléosides était de type C18 Uptisphere (5 µm, 2

mm 150 mm) d’Interchim (Montluçon). La phase mobile était le gradient suivant. Au cours des 10

premières min, la composition de l’éluant a été modifiée linéairement de 100% à 75% d’une solution

A de formiate d’ammonium (2 mM) et de 0 à 25% d’une solution B (2 mM formiate d’ammonium,

10% d’acétonitrile). La composition du mélange a été maintenue pendant 5 min avant d’être

constituée en 15 min de 100% de la solution B. Après 10 min dans ces conditions, l’élution était

effectuée avec le solvant initial. Le débit de la phase mobile était de 0,2 ml.min-1. Les temps de

rétention des nucléosides oxydés étaient les suivant : diols de thymidine trans et cis (4,2-4,9 min et

9,6 min ) ; 5-OHdUrd (12,4 min) ; 5-HmdUrd (17,5 min) ; 5-FordUrd (23 min ) ; 8-oxodGuo (27,3

min) ; dGuo (23,9 min) ; 8-oxodAdo (33,3 min).


E. Epimérisation des diols de thymidineLes diols de thymidine ont été synthétisés selon le protocole décrit dans (360). Afin d’étudier

la stabilité des diastéréoisomères trans et cis des diols dans différentes conditions de pH et de

température, deux solutions ont été préparées dans de l’eau désionisée. Ainsi, les solutions des deux

diastéréoisomères trans (5R, 6R) et (5S, 6S) ont été maintenues à 37°C ou à -20°C, pendant une nuit.

Une troisième solution contenant également les diols de configuration trans (5R, 6R) et (5S, 6S) a été

maintenue à température ambiante, pendant une nuit, dans le tampon de la nucléase P1 (pH 5,5). Une

fraction aliquote de chaque solution a été analysée sur un système CLHP composé d’une pompe

modèle 2150 LKB (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suède). La séparation a été effectuée

sur une colonne de type C18 Uptisphere (5 µm, 4,6 mm 150 mm) d’Interchim (Montluçon). La

phase mobile qui a permis la séparation des diastéréoisomères trans et cis des diols de thymidine était

constituée d’une solution de 5 mM de formiate d’ammonium. Le débit d’élution était de 1 ml.min-1.

Dans ces conditions, les diols possédant la configuration trans ont été élués en 4,5-5,5 min et ceux

possédant la configuration cis en 11,4 min.

VIII. STABILITE DES DERIVES FAPY PURINES EN MILIEU ALCALIN

A. Stabilité à pH 10Des échantillons de 500 µl d’une solution aqueuse d’ADN isolé de thymus de veau (0,5

mg/ml) ont été exposés à une dose de 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co. La moitié des

échantillons a été incubée en présence de tampon de lyse à 4°C, pour différentes durées. Les

échantillons contrôle maintenus à pH 7 ont été conservés à 4°C. L’ADN a ensuite été précipité avec

0,8 ml de solution NaI (20 mM Na2EDTA, 7,6 M NaI, 40 mM Tris/HCl, 0,3 mM déféroxamine) et 2

ml de propan-2-ol à 100%. L’ADN obtenu a été centrifugé à 5000 g pendant 10 min et rincé avec 1

ml de propan-2-ol à 40% et 1 ml d’éthanol à 70%. Le culot dissous dans 100 µl d’une solution de

déféroxamine à 0,1 mM a été soumis, après ajout de 100 pmoles de standards internes ([M+3]

FapyGua et [M+3] FapyAde), à une digestion enzymatique et à une hydrolyse acide afin de libérer les

dérivés Fapy purines selon la procédure précédemment décrite.

B. Stabilité à pH 13Des échantillons de 500 µl d’une solution aqueuse d’ADN isolé de thymus de veau (0,5

mg/ml) ont été exposés à une dose de 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co. La moitié des

échantillons a été incubée en présence de 300 mM de NaOH, pendant différentes durées à une

température de 4°C. Un volume de HCl a été ajouté de façon à obtenir une concentration finale de 300

mM en acide afin de neutraliser la solution. Les échantillons contrôle maintenus à pH 7 ont été

conservés à 4°C. Un volume de 1 ml de chaque échantillon a été ensuite déposé en tête d’une colonne

d’exclusion de type Nap 25. L’ADN a été élué par 2,5 ml d’eau désionisée. La solution recueillie a été

séchée sous vide et le résidu obtenu repris dans une solution de déféroxamine (0,1 mM). Après ajout


de 100 pmoles de standards internes ([M+3] FapyGua et [M+3] FapyAde), une digestion enzymatique

et une hydrolyse acide ont été effectuées avant le dosage des dérivés Fapy purines par CG-SM.

C. Efficacité d’exclusion des colonnes Nap 25L’efficacité des colonnes Nap 25 à séparer l’ADN des dérivés Fapy purines a été déterminée.

Pour cela, des échantillons de 500 µl d’ADN de thymus de veau (0,5 mg/ml) ont été enrichis avec 100

pmoles de FapyGua et de FapyAde. Le pH des solutions correspondantes a été porté à 13 puis a été

neutralisé par l’ajout de HCl comme décrit ci-dessus. Les échantillons ont été déposés sur une

colonne d’exclusion de type Nap 25 et ont été élués en trois fractions, correspondant à trois volumes

d’eau désionisée. La première fraction de 1 ml, correspond au volume mort de la colonne. La

deuxième fraction de 2,5 ml correspond à l’élution supposée de l’ADN. Enfin la troisième, de 3,5 ml,

correspond à un volume de rinçage. Chaque fraction recueillie a été séchée et le résidu a été repris

dans 100 µl d’une solution de 0,1 mM de déféroxamine. Puis, 100 pmoles de standards internes

[M+3] FapyGua et [M+3] FapyAde ont été ajoutés avant l’étape de digestion enzymatique et

d’hydrolyse acide, et la mesure des dérivés Fapy purines par CG-SM.

Références bibliographiques

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Table des matières

- Table des matières -

CHAPITRE I : Etude bibliographiqueI. Rayonnements ionisants et Société __________________________________________ 10

A. Introduction ________________________________________________________________10

B. Rayonnements ionisants_______________________________________________________111. Définition d’un rayonnement ionisant ___________________________________________________122. Quelques notions de base de physique nucléaire ___________________________________________12

C. Le cobalt 60 _________________________________________________________________161. Schéma de désintégration du 60Co ______________________________________________________162. Désintégration β- ___________________________________________________________________163. Emission gamma____________________________________________________________________17

D. Coefficients d’interaction _____________________________________________________171. Pouvoir massique total de ralentissement_________________________________________________172. Coefficient massique de transfert d’énergie µtr/ρ ___________________________________________18

E. Nature des interactions _______________________________________________________181. Interaction des particules chargées ______________________________________________________182. Interaction du rayonnement γ avec la matière______________________________________________20

F. Notions de radiométrie________________________________________________________221. Les unités de radiométrie _____________________________________________________________222. Energie transférée et énergie absorbée localement__________________________________________253. Variation de la dose en fonction de la profondeur __________________________________________26

G. La qualité du rayonnement et la radiosensibilité des tissus__________________________261. Le Transfert d’Energie Linéique (TEL) __________________________________________________272. L’Efficacité Biologique Relative (EBR)__________________________________________________273. La dose équivalente _________________________________________________________________284. La dose efficace ____________________________________________________________________285. Les grandeurs opérationnelles _________________________________________________________29

H. Sources d’exposition _________________________________________________________291. Sources d’irradiation industrielles ______________________________________________________302. Sources d’irradiation médicales ________________________________________________________313. Sources d’irradiation naturelles ________________________________________________________32

II. Effets des rayonnements ionisants __________________________________________ 33A. Effets direct et indirect du rayonnement gamma du 60Co ___________________________33

1. Effet direct ________________________________________________________________________332. Effet indirect_______________________________________________________________________333. Trace d’un rayonnement de faible TEL __________________________________________________35

B. Effets sur les membranes______________________________________________________35

C. Effets sur l’ADN _____________________________________________________________351. Structure de l’ADN__________________________________________________________________352. Fonctions de l’ADN _________________________________________________________________373. Lésions radio-induites de l’ADN _______________________________________________________374. Lésions spontanées de l’ADN _________________________________________________________44

D. Effets d’une irradiation sur les chromosomes : Aberrations chromosomiques__________451. Nature des aberrations _______________________________________________________________452. Transmission des aberrations à la descendance ____________________________________________453. Dosimétrie biologique _______________________________________________________________45

E. Effets d’une irradiation sur le corps humain______________________________________461. Effets déterministes _________________________________________________________________462. Effets aléatoires ____________________________________________________________________46

F. Radioprotection : Les trois principes ____________________________________________491. Les effets déterministes ______________________________________________________________492. Les effets aléatoires _________________________________________________________________493. Justification _______________________________________________________________________504. Limitation _________________________________________________________________________505. Optimisation _______________________________________________________________________506. Limites d’exposition des travailleurs ____________________________________________________50

III. Rayonnements ultra-violets et visible _______________________________________ 51A. Introduction ________________________________________________________________51

B. Origine_____________________________________________________________________51

C. Spectre solaire_______________________________________________________________52

D. Mode d’action des rayonnements ultra-violets et visible ____________________________521. Des réactions directes par transfert d’énergie intramoléculaire ________________________________522. Des réactions de photosensibilisation____________________________________________________52

E. Effets du rayonnement solaire__________________________________________________541. Effets à court terme _________________________________________________________________542. Effets à long terme __________________________________________________________________543. Effets génotoxiques _________________________________________________________________554. Effets cytotoxiques __________________________________________________________________555. Autres effets du rayonnement solaire ____________________________________________________55

IV. La réponse du matériel biologique face aux rayonnements______________________ 55A. Les défenses antioxydantes de la cellule__________________________________________56

B. Les systèmes de réparation des lésions___________________________________________561. Cycle cellulaire_____________________________________________________________________562. Les systèmes de réparation ____________________________________________________________583. La réparation par excision de bases (REB) _______________________________________________59

C. La mort cellulaire____________________________________________________________61

OBJECTIFS DE L’ÉTUDE ___________________________________________ 63

CHAPITRE II : Mise au point de méthodes chromatographiques

I. La technique de postmarquage et les méthodes immunologiques __________________ 67A. La technique de postmarquage _________________________________________________67

1. Principe __________________________________________________________________________672. Mesure des adduits et des bases oxydées de l’ADN_________________________________________67

B. Approche immunologique _____________________________________________________691. Principe __________________________________________________________________________692. Exemples d’utilisation _______________________________________________________________69

II. Optimisation de la méthode d’extraction de l’ADN cellulaire ____________________ 70A. Problématique_______________________________________________________________70

B. Technique de CLHP-DE : Application à la mesure de la 8-oxodGuo __________________711. Présentation de la technique de CLHP-DE________________________________________________712. Mesure de la 8-oxodGuo _____________________________________________________________72

Table des matières

C. Méthode d’extraction de l’ADN cellulaire utilisant le « kit Qiagen » _________________73

D. Méthodes d’extraction de l’ADN cellulaire en phase homogène ______________________741. Méthode au phénol/chloroforme _______________________________________________________742. Méthodes au NaCl ou chaotropique au NaI _______________________________________________74

III. Utilisation de la technique de CG-SM ______________________________________ 78A. Principe de la technique de CG-SM _____________________________________________78

1. Rappel sur la détection par spectrométrie de masse _________________________________________782. Principe de la CG-SM : Conditions opératoires ____________________________________________79

B. Mesure des dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine _____________________________811. Procédure suivie ____________________________________________________________________812. Ions caractéristiques _________________________________________________________________833. Standards internes et calibration________________________________________________________834. Exemples de profils d’élution chromatographique __________________________________________85

IV. Utilisation de la technique de CLHP-SM/SM_________________________________ 86A. Principe de la technique de CLHP-SM/SM_______________________________________86

B. Mesure des dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine par CLHP-SM/SM ____________871. Spectres de masse et transitions caractéristiques de la FapyGua et de la FapyAde _________________872. Exemples de profils d’élution chromatographique __________________________________________883. Niveau basal de FapyGua dans l’ADN cellulaire : Influence de la déféroxamine __________________88

C. Mesure simultanée des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la 5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de la dGuo ____________________________89

1. Spectres de masse___________________________________________________________________902. Transitions caractéristiques ___________________________________________________________933. Hydrolyse enzymatique de l’ADN ______________________________________________________934. Profils d’élution chromatographique ____________________________________________________955. Stabilité des diastéréoisomères cis et trans des diols de thymidine _____________________________986. Standards internes et droites de calibration ______________________________________________101

V. Conclusion ____________________________________________________________ 102

CHAPITRE III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulairepar des méthodes chromatographiques

I. Formation de dommages de bases dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement γγγγdu 60Co _________________________________________________________________ 104

A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo______________________104

B. Détermination par CG-SM du taux de formation des dérivés Fapy purines ___________104

C. Mesure par CLHP-SM/SM du taux de formation des dérivés Fapy purines___________105

D. Mesure simultanée par CLHP-SM/SM du taux de formation des diols de thymidine, de la5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la 5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de ladGuo ________________________________________________________________________106

1. Bases pyrimidiques modifiées ________________________________________________________1062. Bases puriques modifiées ____________________________________________________________108

II. Ionisation de l’ADN cellulaire par des impulsions UV LASER __________________ 109A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo______________________110

B. Mesure simultanée par CLHP-SM/SM du taux de formation des diols de thymidine, de la5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la 5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de ladGuo ________________________________________________________________________110

1. Mesure des bases pyrimidiques modifiées _______________________________________________110

2. Mesures de bases puriques modifiées___________________________________________________111

C. Expression du rendement quantique ___________________________________________1121. Paramètres d’irradiation _____________________________________________________________1122. Calcul du rendement quantique _______________________________________________________113

III. Formation des dommages de bases dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnementUVA____________________________________________________________________ 114

A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo______________________114

B. Mesure par CG-SM du taux de formation des dérivés Fapy purines _________________114

IV. Formation des dommages de bases dans l’ADN de monocytes photosensibilisés____ 114A. Détermination par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo________________115

1. Photosensibilisation par le rose bengal (10-2 D.O.) et par l’acridine orange (5 10-3 D.O.)___________1152. Photosensibilisation par le rose bengal et par l’acridine orange (1 D.O.) _______________________116

B. Mesure du taux de formation des dérivés Fapy purines par CG-SM _________________116

V. Discussion des résultats__________________________________________________ 117A. Mécanismes de formation de la 8-oxodGuo______________________________________117

B. Discussion des aspects méthodologiques ________________________________________1181. L’extraction de l’ADN cellulaire ______________________________________________________1182. La méthode d’analyse par CG-SM _____________________________________________________120

C. Discussion des taux de formation des lésions_____________________________________1231. Irradiation gamma : 8-OxodGuo, lésion majoritaire ? ______________________________________1232. Irradiation au LASER UV de haute intensité _____________________________________________1253. Irradiation UVA et réactions de photosensibilisation ______________________________________126

CHAPITRE IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes

I. Méthodes de mesure des coupures de brins de l’ADN __________________________ 129A. Sédimentation sur gradient de sucrose _________________________________________129

B. Méthode basée sur la relaxation de l’ADN_______________________________________129

C. Sédimentation de nucléoïde___________________________________________________129

D. Méthode de « Nick translation » _______________________________________________129

E. Electrophorèse en champ pulsé________________________________________________130

F. La méthode d’élution sur filtre ________________________________________________130

G. La méthode des comètes ou méthode de microélectrophorèse sur gel ________________1301. Principe de la méthode des comètes en milieu alcalin ______________________________________1312. Objectifs de l’étude ________________________________________________________________133

II. Optimisation de la mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes____ 134A. Le « tail moment » ou « moment de la queue de la comète » ________________________134

B. Méthode standard des comètes ________________________________________________134

C. Méthode des comètes couplée à l’utilisation de Fpg et d’endo III____________________1361. Etape de « préélectrophorèse »________________________________________________________1362. Composition du tampon d’électrophorèse _______________________________________________139

III. Utilisation de la méthode des comètes couplée à Fpg et endo III ________________ 141A. Monocytes exposés au rayonnement gamma du 60Co ______________________________141

Table des matières

1. Utilisation de la Fpg ________________________________________________________________1412. Utilisation de l’endonucléase III_______________________________________________________1423. Utilisation simultanée de l’endonucléase III et de la Fpg____________________________________143

B. Monocytes exposés au rayonnement UVA _______________________________________1441. Utilisation de la Fpg ________________________________________________________________1442. Utilisation de l’endonucléase III_______________________________________________________144

C. Monocytes photosensibilisés par de faibles concentrations de rose bengal et d’acridineorange _______________________________________________________________________145

1. Rose bengal ______________________________________________________________________1452. Acridine orange ___________________________________________________________________146

D. Monocytes photosensibilisés par 1 D.O. de rose bengal et d’acridine orange __________1481. Rose bengal ______________________________________________________________________1482. Acridine orange ___________________________________________________________________148

IV. Méthode des comètes en milieu neutre _____________________________________ 149A. Mesure des CDB selon la méthode décrite par Singh et al. _________________________149

B. Mesure des CDB selon la méthode décrite par Olive et al.__________________________151

V. Expériences mettant en jeu la réparation des lesions __________________________ 152A. Réparation des cassures de brins et sites alcali-labiles_____________________________152

B. Réparation des sites Fpg _____________________________________________________153

VI. Discussion des résultats _________________________________________________ 153A. La méthode des comètes sous ses formes standard et modifiée ______________________153

B. Aspects mécanistiques _______________________________________________________1541. Rappel sur les mécanismes de formation des lésions _______________________________________1542. Niveau basal des lésions_____________________________________________________________1553. Irradiation gamma _________________________________________________________________1564. Réactions de photosensibilisation______________________________________________________1575. Irradiation UVA __________________________________________________________________158

CHAPITRE V : Calibration de la méthode des comètes et aspects mécanistiques

I. Principe de la calibration de la méthode des comètes ___________________________ 160A. Introduction _______________________________________________________________160

B. Hypothèses de la calibration __________________________________________________162

C. Stabilité des substrats de la protéine Fpg en milieu alcalin _________________________1631. Stabilité de la 8-oxodGuo____________________________________________________________1632. Stabilité des dérivés Fapy purines _____________________________________________________163

II. Calibration____________________________________________________________ 166A. Modèle I : Irradiation gamma ________________________________________________166

B. Modèle II : Irradiation de type UVA ___________________________________________167

C. Modèle III : Réactions de photosensibilisation ___________________________________1681. Acridine orange ___________________________________________________________________1692. Rose bengal ______________________________________________________________________170

III. Expression des dommages_______________________________________________ 170A. Niveau basal de 8-oxodGuo (assimilée aux sites Fpg)______________________________171

B. Niveau basal des sites endo III ________________________________________________172

C. Niveau basal des coupures (CSB + CDB + SAL)__________________________________172

D. Taux de formation des différentes lésions _______________________________________172

IV. Discussion des résultats _________________________________________________ 173A. Niveau basal de la 8-oxodGuo _________________________________________________173

B. Aspects mécanistiques _______________________________________________________1741. Niveau basal des différentes lésions ____________________________________________________1752. Taux de formation des différentes lésions_______________________________________________175

CHAPITRE VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire

I. Brefs rappels bibliographiques sur les ions lourds _____________________________ 180II. Mesure de la 5-HmdUrd, de la 5-FordUrd, des diols de thymidine, de la 8-oxodGuo et dela 8-oxodAdo par CLHP-SM/SM ____________________________________________ 182III. Utilisation de la méthode modifiée des comètes ______________________________ 184

A. Utilisation de la Fpg _________________________________________________________184

B. Utilisation de l’endonucléase III _______________________________________________185

IV. Discussion des résultats ________________________________________________ 185

CONCLUSION ET PERSPECTIVES __________________________________ 188

CHAPITRE VII : Partie expérimentale

I. Produits chimiques ______________________________________________________ 194II. Lignée et culture cellulaire _______________________________________________ 194III. Courbe de survie cellulaire ______________________________________________ 194IV. Irradiations et réactions de photosensibilisation _____________________________ 195

A. Irradiations γγγγ et UVA________________________________________________________195

B. Irradiation par des particules de 12C6+ __________________________________________196

C. Irradiation par des impulsions UV LASER______________________________________197

D. Réactions de photosensibilisation ______________________________________________198

V. Méthode de Microélectrophorèse sur gel ____________________________________ 198A. Méthode des comètes en milieu alcalin__________________________________________198

B. Méthode des comètes en milieu neutre__________________________________________1991. Protocole décrit par Singh et al. _______________________________________________________1992. Protocole décrit par Olive et al. _______________________________________________________199

C. Analyse des lames de microscope ______________________________________________199

VI. Méthode d’extraction de l’ADN cellulaire __________________________________ 200A. Méthode chaotropique au NaI ________________________________________________200

B. Méthode au NaCl ___________________________________________________________200

Table des matières

C. Hydrolyse enzymatique de l’ADN sous forme de nucléosides _______________________2001. Hydrolyse de l’ADN préalable à la mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE_____________________2002. Hydrolyse de l’ADN préalable à la mesure simultanée de sept nucléosides par CLHP-SM/SM ______201

VII. Analyses chromatographiques ___________________________________________ 201A. Courbes de calibration_______________________________________________________201

1. Mesure par CLHP-DE ______________________________________________________________2012. Mesures par CG-SM et par CLHP-SM/SM ______________________________________________202

B. Mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE ________________________________________204

C. Mesures par CG-SM des dérivés Fapy purines___________________________________2041. Système CG-SM___________________________________________________________________2042. Préparation des échantillons__________________________________________________________204

D. Mesures par CLHP-SM/SM __________________________________________________2051. Système CLHP-SM/SM _____________________________________________________________2052. Mesures de la FapyGua et de la FapyAde _______________________________________________2063. Cinétiques d’hydrolyse de l’ADN _____________________________________________________2064. Mesure des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd, de la 5-HmdUrd, de la 5-FordUrd, de la 8-oxodGuo, dela 8-oxodAdo et de la dGuo ____________________________________________________________207

E. Epimérisation des diols de thymidine___________________________________________208

VIII. Stabilité des dérivés Fapy purines en milieu alcalin _________________________ 208A. Stabilité à pH 10 ____________________________________________________________208

B. Stabilité à pH 13 ____________________________________________________________208

C. Efficacité d’exclusion des colonnes Nap 25 ______________________________________209

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ________________________________ 211

TABLE DES MATIÈRES_______________________________________________ 234

RésuméNous avons mesuré plusieurs modifications de bases dans l’ADN de monocytes, exposés au

rayonnement γ du 60Co, à la lumière UV LASER de haute intensité, ou soumis à un flux de particulesde 12C6+. Nous avons eu recours à deux approches complémentaires. La première a impliqué lesméthodes de chromatographie liquide haute performance ou gazeuse couplées à une détection parspectrométrie de masse (CLHP-SM/SM ou CG-SM) ou par électrochimie (CLHP-DE). Ces différentestechniques ont permis la mesure du niveau basal et du taux de formation de 7 lésions.

La deuxième approche était basée sur l’utilisation de la méthode des comètes associée auxenzymes de réparation Fpg et endo III. La méthode, sous sa forme standard, permet de mettre enévidence les cassures simple et double brin ainsi que les sites alcali-labiles de l’ADN. Associée à Fpget à endo III, elle a permis de quantifier respectivement des purines et des pyrimidines modifiées. Laconfrontation des deux approches et le recours à d’autres agents oxydants comme le rayonnementUVA ou des photosensibilisateurs exogènes, a permis de calibrer la méthode afin d’estimer le niveaudes différentes classes de lésions. Il ressort de ces travaux que l’approche indirecte, bien que moinsspécifique est moins sujette aux problèmes d’oxydation des bases normales rencontrés lors de lapréparation et de l’analyse des échantillons par les méthodes chromatographiques d’analyse.Toutefois, lorsque ces problèmes d’oxydation sont pris en considération dans les mesures analytiques,les deux approches donnent approximativement les mêmes valeurs. Dans le cas contraire, desvariations d’un facteur 100 à 1000 peuvent être observées. Ainsi, il apparaît aujourd’hui que laplupart des travaux antérieurs concernant la mesure des bases modifiées de l’ADN par la méthodeCG-SM doivent être reconsidérés.

Mots clés : 8-oxoGua, FapyGua, diols de thymidine, dommages de bases, CLHP-SM/SM, CLHP-DE,CG-SM, méthodes des comètes, Fpg, ions lourds, rayonnement gamma, oxydation.

AbstractThe main objective of the current project was to measure DNA base damage in the DNA of a

monocytic cell line exposed to γ-ray, UV LASER pulses or to 12C6+ particles. For this purpose, twoapproaches were developed. The first one consisted of chromatographic methods including highperformance liquid or gas chromatography assay coupled with either an electrochemical (HPLC-EC)or a mass spectrometry detection (HPLC-MS/MS, GC-MS). After optimisation, the latter methodsallowed the measurement of the level of 7 base lesions.

An indirect approach based on the comet assay associated to DNA N-glycosylases was alsoapplied. The latter method, under its standard form, allowed the detection of single and double strandbreaks together with alkali-labile sites. Associated to DNA repair enzymes such as Fpg and endo III, itallowed the measurement of modified purines and pyrimidines, respectively. It was possible tocalibrate the modified comet assay in order to evaluate the level of the previous classes of lesions. Forthis purpose, cells were also exposed to UVA and exogenous photosensitisers. Although the cometassay associated to Fpg and endo III can suffer from a lack of specificity, it was shown to be lesssubject to the artefactual oxidation of the normal bases which occurs during the preparation of thesamples prior to their analysis by HPLC-EC or GC-MS. However, when much attention is devoted toreduce these drawbacks, indirect and direct approaches give approximately the same values. Theselevels are at least 100 fold lower than those reported by many previous studies involving the use ofGC-MS assay. Therefore, many results inferred from the latter method have today to be reconsidered.

Nous avons mesuré plusieurs modifications de bases dans l’ADN de monocytes, exposés aurayonnement γ du 60Co, à la lumière UV LASER de haute intensité, ou soumis à un flux de particulesde 12C6+. Nous avons eu recours à deux approches complémentaires. La première a impliqué lesméthodes de chromatographie liquide haute performance ou gazeuse couplées à une détection parspectrométrie de masse (CLHP-SM/SM ou CG-SM) ou par électrochimie (CLHP-DE). Ces différentestechniques ont permis la mesure du niveau basal et du taux de formation de 7 lésions.

La deuxième approche était basée sur l’utilisation de la méthode des comètes associée auxenzymes de réparation Fpg et endo III. La méthode, sous sa forme standard, permet de mettre enévidence les cassures simple et double brin ainsi que les sites alcali-labiles de l’ADN. Associée à Fpget à endo III, elle a permis de quantifier respectivement des purines et des pyrimidines modifiées. Laconfrontation des deux approches et le recours à d’autres agents oxydants comme le rayonnementUVA ou des photosensibilisateurs exogènes, a permis de calibrer la méthode afin d’estimer le niveaudes différentes classes de lésions. Il ressort de ces travaux que l’approche indirecte, bien que moinsspécifique est moins sujette aux problèmes d’oxydation des bases normales rencontrés lors de lapréparation et de l’analyse des échantillons par les méthodes chromatographiques d’analyse.Toutefois, lorsque ces problèmes d’oxydation sont pris en considération dans les mesures analytiques,les deux approches donnent approximativement les mêmes valeurs. Dans le cas contraire, desvariations d’un facteur 100 à 1000 peuvent être observées. Ainsi, il apparaît aujourd’hui que laplupart des travaux antérieurs concernant la mesure des bases modifiées de l’ADN par la méthodeCG-SM doivent être reconsidérés.

The main objective of the current project was to measure DNA base damage in the DNA of amonocytic cell line exposed to γ-ray, UV LASER pulses or to 12C6+ particles. For this purpose, twoapproaches were developed. The first one consisted of chromatographic methods including highperformance liquid or gas chromatography assay coupled with either an electrochemical (HPLC-EC)or a mass spectrometry detection (HPLC-MS/MS, GC-MS). After optimisation, the latter methodsallowed the measurement of the level of 7 base lesions.

An indirect approach based on the comet assay associated to DNA N-glycosylases was alsoapplied. The latter method, under its standard form, allowed the detection of single and double strandbreaks together with alkali-labile sites. Associated to DNA repair enzymes such as Fpg and endo III, itallowed the measurement of modified purines and pyrimidines, respectively. It was possible tocalibrate the modified comet assay in order to evaluate the level of the previous classes of lesions. Forthis purpose, cells were also exposed to UVA and exogenous photosensitisers. Although the cometassay associated to Fpg and endo III can suffer from a lack of specificity, it was shown to be lesssubject to the artefactual oxidation of the normal bases which occurs during the preparation of thesamples prior to their analysis by HPLC-EC or GC-MS. However, when much attention is devoted toreduce these drawbacks, indirect and direct approaches give approximately the same values. Theselevels are at least 100 fold lower than those reported by many previous studies involving the use ofGC-MS assay. Therefore, many results inferred from the latter method have today to be reconsidered.

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Effet du rayonnement ionisant sur l’ADN cellulaire ...inac.cea.fr/Phocea/file.php?file=Seminaires/233/t233_1.pdf · CHAPITRE VII : Partie expérimentale ... FapydAdo : 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine