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MACTAR SECK
EFFETS DES FACTEURS ALIMENTAIRES SUR LA
SYNTHÈSE RUMINALE DE VITAMINES B CHEZ LA
VACHE LAITIÈRE
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Sciences animales pour l’obtention du grade de Maître ès Sciences (M. Sc.)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES ANIMALES
FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
2012
© Mactar Seck, 2012
RÉSUMÉ
Deux études ont été initiées dans le but d’évaluer les effets du type de fourrages et du
rapport fourrage : concentrés sur la synthèse ruminale de vitamines B. Dans un premier essai, huit
vaches Holstein ont été alimentées avec une ration contenant de l’ensilage de luzerne ou de
l’ensilage de dactyle comme unique fourrage. Dans un deuxième essai, quatorze vaches Holstein
ont été alimentées avec une ration à faible taux de fourrages (44.8%) ou à fort taux de fourrages
(64.1%).
Utiliser le dactyle comme unique fourrage a augmenté les synthèses ruminales de thiamine,
riboflavine, niacine et vitamine B6, mais n’a eu aucun effet sur celle de vitamine B12. Utiliser une
ration à bas taux de fourrages a augmenté la synthèse ruminale de thiamine et de niacine, mais a
réduit celle de la vitamine B12 tout en diminuant la dégradation ruminale de la vitamine B6. Cette
étude est une étape vers l’identification de rations qui nécessiteront une éventuelle supplémentation
afin d’optimiser la production laitière.
iv
ABSTRACT
B-vitamins are synthesized by rumen microflora but knowledge on factors affecting this
synthesis is very scarce. Two studies were conducted to determine the effects of dietary factors such
as family forage or forage-to-concentrate ratio on B-vitamin ruminal syntheses. In study 1, eight
Holstein cows were fed with diets containing either alfalfa or orchardgrass silages as sole forage. In
study 2, fourteen Holstein cows were fed low-forage (44.8% forage) or high-forage (64.1% forage)
diets.
Apparent ruminal synthesis of thiamin, riboflavin, niacin and vitamin B6 were greater with
orchardgrass silage than with alfalfa silage. Using a low-forage diet increased ruminal syntheses of
thiamin, riboflavin and niacin, reduced vitamin B6 degradation, but decreased ruminal synthesis of
vitamin B12. These studies are a step towards identification of diets that may require B-vitamin
supplementation to optimize milk production of dairy cows.
AVANT-PROPOS
Mes remerciements vont tout d’abord à mon co-directeur de recherche, madame Christiane
Girard, chercheure à Agriculture et Agro-alimentaire Canada pour m’avoir mis le pied à l’étrier et
facilité mon travail par sa gentillesse, sa disponibilité et son humanisme. Les mots ne pourront
jamais exprimer la profondeur de ma gratitude.
J’associe à ces remerciements mon directeur de recherche, le professeur Yvan Chouinard,
enseignant à l’Université Laval, dont les conseils avisés et la pertinence des corrections ont été d’un
grand apport dans la rédaction des articles et du mémoire.
Je remercie également mesdames Véronique Roy et Christiane Plante, techniciennes de
laboratoire à Agriculture et Agro-alimentaire Canada, et sans le support desquelles ce travail
n’aurait pas abouti. Merci enfin aux autres membres de l’équipe du «218» qui ont contribué à
instaurer une ambiance de travail à nulle autre pareille : Jacques Matte, Michelle Guillette, Isabelle
Audet.
Ce projet n’aurait pas vu le jour sans la contribution substantielle de Mike S. Allen et J. A.
Voelker Linton, de l’université du Michigan, aux États-Unis. Il a été mené en collaboration avec ces
chercheurs qui ont fourni les échantillons de digesta et d’aliments provenant d’études menées sur
les effets de différents facteurs alimentaires sur la fermentation ruminale.
Le financement de nos travaux a été assuré par la Coop fédérée (Québec) et les Producteurs
laitiers du Canada que nous remercions pour leur contribution à la réalisation de nos travaux.
Les études ont fait l’objet de 2 articles dont je suis l’auteur principal. Ces articles sont en voie
de soumission pour publication au Journal of Dairy Science. Les co-auteurs sont J. A. Voelker
Linton et Mike S. Allen (Université du Michigan), Yvan Chouinard (Université Laval) et
Christiane Girard (Agriculture Canada).
À Léna, Mariama, Aïssatou; À ma défunte mère
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ.....................................................................................................................................i ABSTRACT .............................................................................................................................. iii AVANT-PROPOS...................................................................................................................... iv TABLE DES MATIÈRES............................................................................................................v LISTE DES FIGURES................................................................................................................ vi LISTE DES TABLEAUX .......................................................................................................... vii
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1
CHAPITRE 1. REVUE DE LA LITTÉRATURE ......................................................................3
1.1. Définitions et fonctions .........................................................................................................3 1.2. Biochimie des vitamines B ....................................................................................................4
1.2.1. Thiamine (B1) ......................................................................................................4 1.2.2. Riboflavine (B2)...................................................................................................5 1.2.3. Niacine (B3) ........................................................................................................6 1.2.4. Vitamine (B6) ......................................................................................................7 1.2.5. Biotine (B8) .........................................................................................................8 1.2.6. Acide folique (B9) ................................................................................................8 1.2.7. Vitamine B12........................................................................................................9
1.3. Peu de travaux sur les vitamines B ....................................................................................... 10 1.4. Objectifs de l’étude ............................................................................................................. 12 1.5. Synthèse ruminale de vitamines B chez la vache laitière........................................................ 12
1.5.1. Apports vitaminiques des rations ........................................................................ 13 1.5.2. Quantification de la synthèse ruminale ................................................................ 15 1.5.3. Influence des caractéristiques de la ration sur la synthèse ruminale........................ 17
1.5.3.1. Le rapport fourrage : concentrés ................................................................ 18 1.5.3.2. Le niveau d’ingestion................................................................................ 22 1.5.3.3. Le traitement physique des aliments ........................................................... 24 1.5.3.4. La composition nutritionnelle .................................................................... 25 1.5.3.5. Les additifs .............................................................................................. 27
1.6. Conclusions....................................................................................................................... 28 1.7. Bibliographie..................................................................................................................... 30
CHAPITRE 2........................................................................................................................... 35
Effects of Forage Family on Apparent Ruminal Synthesis of B-vitamins
in Lactating Dairy Cows
2.1. ABSTRACT ....................................................................................................................... 36 2.2. RÉSUMÉ ........................................................................................................................... 36 2.3. INTRODUCTION .............................................................................................................. 37 2.4. MATERIALS AND METHODS.......................................................................................... 38
2.4.1. Animals and treatments ........................................................................................ 38 2.4.2. Data and sample collection ................................................................................... 36 2.4.3. Laboratory analyses ............................................................................................. 39 2.4.4. Calculations and statistical analyses ...................................................................... 41
2.5. RESULTS AND DISCUSSION ........................................................................................... 42
vi
2.5.1. Thiamin ............................................................................................................ 42 2.5.2. Riboflavin ............................................................................................................ 42 2.5.3. Niacin .................................................................................................................. 44 2.5.4. Vitamin B6 ........................................................................................................... 45 2.5.5. Vitamin B12 .......................................................................................................... 46
2.6. CONCLUSIONS................................................................................................................. 47 2.7. ACKNOWLEDGEMENTS ................................................................................................. 47 2.8. REFERENCES ................................................................................................................... 48
CHAPITRE 3........................................................................................................................... 60
Effects of Forage-to-Concentrate Ratio on Apparent Ruminal Synthesis of B-vitamins in
Lactating Dairy Cows
3.1. ABSTRACT ....................................................................................................................... 61 3.2. RÉSUMÉ ........................................................................................................................... 61 3.3. INTRODUCTION .............................................................................................................. 62 3.4. MATERIALS AND METHODS.......................................................................................... 63
3.4.1. Animals and treatments ......................................................................................... 63 3.4.2. Sample and data collection .................................................................................... 64 3.4.3. Laboratory analyses .............................................................................................. 64 3.4.4. Calculations and statistical analyses ....................................................................... 65
3.5. RESULTS AND DISCUSSION ........................................................................................... 65 3.5.1. Thiamin ............................................................................................................... 66 3.5.2. Riboflavin ............................................................................................................ 67 3.5.3. Niacin .................................................................................................................. 68 3.5.4. Vitamin B6 ........................................................................................................... 69 3.5.5. Vitamin B12 .......................................................................................................... 70
3.6. CONCLUSIONS................................................................................................................. 71 3.7. ACKNOWLEDGEMENTS ................................................................................................. 71 3.8. REFERENCES ................................................................................................................... 72
CHAPITRE 4. Conclusion générale ......................................................................................... 83
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1.1 Teneurs en vitamines B d’ingrédients utilisés dans des rations pour vache Laitière .................................................................................................................................... 13
Tableau 1.2 Concentrations en vitamines B de rations et consommations moyennes de vaches laitières .................................................................................................................... 14
Tableau 1.3 Concentrations en vitamines B des types de grains utilisés dans l’alimentation des vaches laitières .............................................................................................. 14
Tableau 1.4 Synthèse ruminale de vitamines B chez les vaches laitières ....................................... 16
Tableau 1.5 Effets du niveau d’ingestion sur la production journalière de vitamine B12 duodénale et de vitamine B12 sérique.......................................................................................... 23 Tableau 1.6 Niveaux moyens de vitamines B dans le rumen de bouvillons alimentés avec 6 rations différentes........................................................................................................... 25 Tableau 1.7 Effets du type de grains sur la synthèse ruminale de thiamine .................................... 26 Tableau 2.1 Ingredients, nutrient composition and B-vitamin concentrations of the two treatment diets containing alfalfa silage (AL) or orchargrass silage (OG) as sole forage................. 52 Tableau 2.2 B-vitamin concentrations (mg/kg DM) of ingredients used in the experimental diets..................................................................................................................... 54 Tableau 2.3 Intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis of B-vitamins (expressed as mg/d) in responses to diets based on alfalfa (AL) or orchardgrass (OG) silages (LSMeans) .................................................................................................................... 55 Tableau 2.4 Intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis of B-vitamins (expressed as mg/kg DMI) in responses to diets based on alfalfa (AL) or orchardgrass (OG) silages (LSMeans) ................................................................................................................................ 57 Tableau 2.5 Pearson correlations coefficients between apparent ruminal synthesis and ruminal fermentation parameters ............................................................................................................. 59 Tableau 3.1 Ingredients, nutrient composition and B-vitamin concentrations of a low-forage (LF) and a high-forage (HF) diets ....................................................................................................... 76 Tableau 3.2 B-vitamin concentrations (mg/kg DM) of ingredients used in the experimental Diets ........................................................................................................................................ 77
viii
Tableau 3.3 Intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis of B-vitamins expressed as milligram per day in responses to low-forage (LF) and high-forage (HF) diets (LSMeans) ............. 78 Tableau 3.4 Intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis of B-vitamins (expressed as milligram per kilogram of DMI) in responses to low-forage (LF) and high-forage (HF) diets (LSMeans ................................................................................................................................. 80
Tableau 3.5 Pearson correlations coefficients between apparent ruminal synthesis and dry matter intake or ruminal fermentation parameters................................................................................... 82
LISTE DES FIGURES
Figure 1.1 Structure chimique de la thiamine ................................................................................ 4
Figure 1.2 Structure chimique de la riboflavine............................................................................ 5
Figure 1.3 Structure chimique de la niacine ................................................................................ 6
Figure 1.4 Structure chimique de la vitamine B6 ........................................................................... 7
Figure 1.5 Structure chimique de la biotine................................................................................... 8 Figure 1.6 Structure chimique de l’acide folique .......................................................................... 9
Figure 1.7 Structure chimique de la vitamine B12 ......................................................................... 10
Figure 1.8 Influence du rapport fourrages : concentrés sur les concentrations de thiamine et de riboflavine dans le rumen de veaux alimentés avec du foin de mil comme unique source de fourrages .......................................................................................... 19 Figure 1.9 Concentrations ruminales de riboflavine, de niacine et d’acide pantothénique de moutons alimentés avec diverses rations ..................................................................... 20 Figure 1.10 Effets du rapport fourrage : concentrés sur les consommations ruminales de vitamine B12........................................................................................................... 21 Figure 1.11 Influence du niveau de prise alimentaire sur la synthèse ruminale de vitamines B.............................................................................................................................. 24
INTRODUCTION
La recherche sur la synthèse ruminale des vitamines B chez les vaches laitières connaît un
regain d’intérêt depuis quelques années. Cela n’a pas toujours été le cas car la communauté
scientifique a longtemps considéré que les besoins des bovins laitiers pouvaient être comblés par
les apports de la ration et la synthèse par les bactéries du rumen (NRC, 2001).
Dans la seconde moitié du vingtième siècle, les innovations technologiques en agriculture
(génétique et sélection, insémination artificielle, raffinement des méthodes de rationnement et
amélioration de la régie) ont engendré un fulgurant développement des niveaux de rendement
laitier, et conduit à la probabilité que les besoins en vitamines B des vaches laitières ne soient pas
couverts de manière optimale sans une supplémentation (Weiss et Ferreira, 2006).
Bien que des études mirent en évidence les effets bénéfiques d’une supplémentation en
vitamines B pour les vaches laitières (Midla et al., 1998; Girard et Matte, 1998; Zimmerly et Weiss,
2001; Majee et al, 2003), il apparut que la compréhension des facteurs régulant la synthèse naturelle
par les bactéries du rumen constituait un pré requis important. Les premières investigations menées
en ce sens, chez les petits ruminants et les bovins de boucherie notamment, ont fait apparaître le
rôle déterminant des caractéristiques de la diète. La nature et le traitement des ingrédients, le niveau
de consommation et le rapport fourrages: concentrés sont réputés affecter la physiologie digestive
des ruminants en modifiant le temps de transit des aliments dans le tractus digestif, les quantités de
salive produites, les temps de mastication et de rumination et par conséquent la fermentation
ruminale. Cette fermentation détermine dans une large mesure la synthèse et /ou l’utilisation des
vitamines B par les bactéries du rumen. Le niveau de connaissances des effets de la ration sur la
synthèse ruminale des vitamines B chez la vache laitière est toutefois peu important
comparativement aux petits ruminants et bovins de boucherie car relativement peu d’études y ont
été consacrées.
Ce projet est une contribution à une meilleure connaissance des facteurs alimentaires
influençant la synthèse ruminale des vitamines B chez la vache laitière. L’identification de ces
facteurs, en plus de pallier un manque d’informations, sera une étape primordiale dans la confection
de régimes adaptés à différents états physiologiques et demandes métaboliques de la vache laitière,
ainsi que l’identification de rations susceptibles de nécessiter une supplémentation. Ce travail a été
mené en collaboration avec des chercheurs de l’Université du Michigan qui ont fourni des
2
échantillons provenant de deux études menées sur les effets de différents facteurs alimentaires sur la
fermentation ruminale.
Nous avons émis l’hypothèse que les facteurs alimentaires influencent la synthèse ruminale
des vitamines B chez la vache laitière. L’objectif spécifique de ces études est d’évaluer les effets du
type de fourrage et du rapport fourrage : concentrés sur la synthèse ruminale des vitamines B
suivantes : thiamine, riboflavine, niacine, vitamine B6 et vitamine B12.
3
CHAPITRE 1 : REVUE DE LA LITTÉRATURE
1.1. Définitions et fonctions
Les vitamines sont des composés organiques sans valeur énergétique propre, qui ne peuvent
être synthétisées par l’organisme, qui sont requises en quantités minimes et qui sont essentielles à la
vie. Le terme vitamines désigne généralement des composantes organiques des aliments naturels
différents des glucides, lipides et protéines. Leur découverte est attribuée à un biochimiste polonais,
en 1911, Casimir Funk, travaillait à l’isolation d’un facteur anti béribéri. Étymologiquement le
terme «vitamine» dérive de la contraction du mot latin vita (vie) et du terme chimique amine qui
témoignait de l’ancienne croyance selon laquelle toutes les vitamines contenaient de l’azote.
Les besoins en vitamines B sont définis comme la quantité minimale devant être présente
dans l’alimentation afin d’éviter les symptômes de carences. Chaque vitamine B agit comme une
coenzyme. Une coenzyme se combine à une autre substance pour former une enzyme (protéine
produite par les cellules vivantes qui active les réactions chimiques). La principale fonction des
vitamines B est d’agir soit comme cofacteur pour les enzymes qui sont impliquées dans le
métabolisme des acides aminés, des acides gras, de l’énergie et des acides nucléiques, soit comme
intervenant dans le métabolisme intermédiaire de la glande mammaire. Par exemple, chez les
ruminants, près de 50% du propionate qui atteint le foie est transformé en glucose grâce à une série
de réactions enzymatiques dans lesquelles la niacine, la riboflavine , l’acide pantothénique et la
biotine jouent des rôles fondamentaux (Brockman, 1993).
Ainsi, les carences, mais aussi l’absorption en excès de vitamines peuvent entraîner des
dysfonctionnements métaboliques. Les cas de carences sévères avec des manifestations cliniques
sont relativement rares dans le contexte de l’élevage Nord Américain où la problématique est
surtout centrée sur la nécessité de fournir aux animaux des quantités adéquates de vitamines afin
d’optimiser la fertilité, le taux de croissance et la production laitière. Les vitamines sont apportées
par la ration ou synthétisées par des microorganismes dans le système digestif de l’animal. À
l’exception de la vitamine B12 et contrairement aux vitamines A, D, E et K qui sont liposolubles, les
vitamines B ne sont pas stockées très longtemps dans l’organisme, soit juste quelques semaines et
rarement plus d’un mois. Les huit vitamines B reconnues sont la thiamine (B1), la riboflavine (B2),
4
la niacine (B3), l’acide pantothénique (B5), le complexe B6 (pyridoxal, pyridoxamine, pyridoxine),
la biotine (B8), l’acide folique (B9) et la cobalamine (vitamine B12).
1.2. Biochimie des vitamines B
1.2.1. Thiamine (B1)
La thiamine fut la première vitamine B isolée et sa structure fut définie en 1934. Sa première
dénomination fut aneurin, à cause des effets désastreux de la carence en thiamine sur le système
neurologique. Elle est composée d’une molécule de pyrimidine et d’une molécule de thiazole reliées
par un pont méthylène (fig.1.1). La thiamine existe dans l’organisme sous une forme libre ou sous
des formes phosphorylées : thiamine monophosphate, thiamine pyrophosphate (forme la plus
répandue dans l’organisme) et thiamine triphosphate. Ces trois formes sont intra mitochondriales et
sont respectivement à l’origine de la formation de l’acylcoenzyme A, l’acétylcoenzyme A et de la
succinylcoenzyme A. Elles sont aussi impliquées dans le catabolisme des acides aminés à chaîne
ramifiée (about.com).
Figure 1.1: Structure chimique de la thiamine (Scientific Psychic, 2010)
La thiamine intervient dans la biochimie de tous les organismes vivants mais n’est synthétisée
que par les bactéries, les champignons et les plantes. Une carence entraîne la polyencéphalomacie
chez les ruminants, la polynévrite chez les oiseaux et le béribéri chez les humains. La carence en
thiamine chez les ruminants serait due à la présence d’une enzyme, la thiaminase, qui détruit ou
altère la thiamine. Le mécanisme par lequel la carence en thiamine entraîne ces symptômes n’est
pas encore élucidé. De nouveaux dérivés de thiamine phosphate ont été récemment découverts par
Bettendorf et al. (2007), mettant ainsi l’accent sur la complexité du métabolisme de la thiamine et la
nécessité de poursuivre les recherches sur cette vitamine. La thiamine est trouvée naturellement
5
dans une grande variété de végétaux (tiges, feuilles, racines, fruits), mais aussi dans les produis
d’origine animale : poissons et fruits de mer, lait, œufs et viandes (about.com).
1.2.2. Riboflavine (B2)
La riboflavine est la seconde vitamine B découverte et sa structure chimique a été définie peu
après celle de la thiamine. La forme libre de B2 est composée de la combinaison d’un noyau
diméthyl-isoalloxazine, d’alcool, de ribose et d’une chaîne latérale de ribityl (fig.1.2)
Figure 1.2: Structure chimique de la riboflavine (Scientific Psychic, 2010)
La flavine mono nucléotide (FMN) et la flavine adénine dinucléotide (FAD) sont les formes
de B2 physiologiquement actives. Elles agissent comme coenzymes et sont séquentiellement
formées à partir de la riboflavine libre dans une série de réactions nécessitant de l’ATP et catalysées
respectivement par la flavokinase et la FAD synthétase.
Entre autres fonctions, la riboflavine (dans ses formes coenzymes) est impliquée dans la
conversion du succinate en fumarate par la succinate déshydrogénase, étape irréversible dans la
néoglucogenèse, ainsi que dans la conversion du tryptophane en niacine (B3). La riboflavine est
trouvée naturellement dans les végétaux comme les asperges, les bananes et haricots verts et les
produits d’origine animale comme le lait, les fromages, le poisson, la viande et les œufs
(about.com).
6
1.2.3. Niacine (B3)
La niacine a été décrite pour la première fois en 1873 par Weidel. Elle fut extraite à partir du
foie par Elvehjem qui en a identifié plus tard le principe actif alors connu comme facteur anti-
pellagre et anti-langue noire vers 1938. Il existe deux formes de la vitamine: l’acide nicotinique
comprenant le groupe carboxyle (COOH) et le nicotinamide ayant un groupe carboxamide
(CONH2) (fig.1.3).
Nicotinamide
Acide nicotinique
Figure 1.3: Structure chimique de la niacine (Scientific Psychic, 2010)
La niacine est active dans les formes coenzymes du nicotinamide (NAD et NADP) qui
permettent son action comme accepteur d’électron et donneur d’hydrogène dans de multiples
réactions d’oxydoréductions. Ces coenzymes sont importantes dans des centaines de réactions
métaboliques (McDowell, 2000) et interviennent dans le cycle de Krebs, la glycolyse, l’oxydation et
la synthèse des acides gras, la biosynthèse des stéroïdes, la dégradation et la synthèse de certains
acides aminés et la synthèse des désoxyribonucléotides. La niacine est aussi impliquée dans
l’arrangement et la réplication de l’ADN et la production d’hormones stéroïdiennes par la glande
surrénale. Les sources végétales de niacine sont diverses et variées. Elle est présente dans les fruits
et légumes tels la patate, la carotte, les tomates, le brocoli ainsi que dans des grains entiers de
céréales (about.com).
7
1.2.4. Vitamine B6
La vitamine B6 fut découverte dans les années 1930 lors de recherches de nutrition chez le rat.
En 1934, un médecin hongrois, Paul Gyorgy découvrit une substance capable de soigner une
dermatite chez le rat et la nomma vitamine B6. Lepkovsky isola la vitamine B6 à partir du son de riz
en 1938 et Harris et Folkers en déterminèrent la structure en 1939. Le terme vitamine B6 fait
référence principalement à un groupe de trois composés organiques différant légèrement sur le
carbone en position Quatre (fig.1.4): un alcool (pyridoxine), un aldéhyde (pyridoxal) ou une amine
(pyridoxamine). Ces trois formes ont une activité similaire mais la principale forme
métaboliquement active est la pyridoxal phosphate (PLP).
Pyridoxamine
Pyridoxal
Pyridoxine
Figure 1.4: Structures chimiques de la vitamine B6 (Scientific Psychic, 2010)
La PLP est impliquée dans plusieurs processus métaboliques des macronutriments :
- métabolisme des acides aminés : la PLP est un cofacteur dans les transaminases qui
interviennent dans le catabolisme des acides aminés et dans la conversion de la
méthionine en cystéine et du tryptophane en niacine.
- néoglucogenèse: la vitamine B6 est aussi une coenzyme du glycogène phosphorylase.
- métabolisme lipidique: la vitamine B6 est une composante essentielle des enzymes
facilitant la biosynthèse des sphingolipides.
Les sources alimentaires de vitamine B6 sont essentiellement les aliments d’origine animale :
viande, volaille, abats, lait et œufs. On en trouve aussi en quantités moins importantes dans les
végétaux tels les céréales, les légumineuses, les fruits et certains légumes (about.com).
8
1.2.5. Biotine (B8)
La biotine, aussi connue sous le nom de vitamine H, fut découverte en 1940. La structure
chimique de la vitamine B8 comprend un noyau de 2-imidazolinone fusionné à un noyau thiolane,
auquel est rattaché un groupe acide propénoïque (fig.1.5).
Figure 1.5: Structure chimique de la biotine (Scientific Psychic, 2010)
Chez les mammifères, la biotine est un cofacteur pour quatre carboxylases catabolisant des
étapes essentielles du métabolisme intermédiaire. Elle joue ainsi un rôle dans le cycle de Krebs et
est nécessaire à la production des acides gras et au métabolisme des acides aminés.
La biotine est présente dans une grande variété d’aliments d’origine animale (foie, œufs) et
d’origine végétale (légumineuses, oléagineuses, avoine, tomates,..). La quantité de vitamine B8
contenue dans la diète est variable et peut être influencée par les variétés végétales, la saison, et le
rendement (about.com).
1.2.6. Acide folique (B9)
La vitamine B9 (acide folique) fut découverte en 1943 et sa structure chimique déterminée en
1945. La forme synthétique de la vitamine B9 est composée de trois parties : un noyau ptéridine,
une molécule d’acide para-amino-benzoïque et une molécule d’acide glutamique (fig.1.6). Les
formes biologiquement actives sont les plus nombreuses connues à ce jour pour une vitamine
(McDowell, 2000). Cette diversité serait due à des variations dans le nombre de molécules d’acide
glutamique (1 à 7 molécules) et du niveau de réduction du noyau ptéridine (Girard et Matte, 1998).
9
Figure 1.6: Structure chimique de l’acide folique (Scientific Psychic, 2010)
L’acide folique est un transporteur d’unités mono carbonées et intervient dans la synthèse
de la purine et de la pyrimidine, dans la synthèse de la méthionine à partir de l’homocystéine et
dans la dégradation de la glycine et de l’histidine. Les légumes feuilles sont les principales sources
d’acide folique mais on en trouve aussi dans certaines céréales enrichies (about.com).
1.2.7. Vitamine B12
La vitamine B12 est la dernière vitamine hydrosoluble découverte, en 1948. La molécule de
vitamine B12 est la plus grosse et la plus complexe de toutes les vitamines B. Le terme «vitamine
B12» dans un sens large fait référence à un groupe de composés organiques appelés «corrinoïdes» à
cause de la présence d’un noyau corrine. Ce noyau comporte en son centre un atome de cobalt lié
à un nucléotide, le 5,6-diméthylbenzimidazole (fig.1.7).
L’activité biologique de la vitamine B12 est essentiellement due aux formes suivantes : la
cyanocobalamine, l’adénosylcobalamine, la méthylcobalamine et la nitrocobalamine qui
contiennent respectivement des unités CN, 5’-désoxyadenosine, CH3 et NO2 reliée à l’atome de
cobalt. La méthylcobalamine et l’adénosylcobalamine sont indispensables à deux réactions
enzymatiques chez les mammifères: la conversion de l’homocystéine en méthionine par la
méthionine synthétase et la conversion de la méthylmalonyl-CoA en succinyl-CoA par la
méthylmalonyl-CoA mutase qui constitue une étape importante dans le métabolisme du propionate.
La vitamine B12 intervient en principe dans le métabolisme de chaque cellule, et plus
spécialement dans la régulation et la synthèse de l’ADN, mais aussi dans le catabolisme des acides
10
gras à nombre impair de carbones et de certains acides aminés, ainsi que dans la production
d’énergie (Christensen, 2007).
La synthèse de la vitamine B12 est une propriété exclusive de certaines bactéries qui disposent
des enzymes nécessaires, contrairement aux animaux et végétaux. Cette synthèse n’est toutefois
possible qu’en présence de cobalt. Il existe plusieurs analogues qui partagent une structure similaire
à la B12, mais avec des activités biologiques différentes. Ces analogues sont présents dans le
fumier, les eaux d’égout, le contenu ruminal et les résidus de fermentation et sont possiblement des
intermédiaires dans la chaîne de production des vitamines (about.com).
Figure 1.7 : Structure chimique de la vitamine B12 (Scientific Psychic, 2010)
1.3. Peu de travaux sur les vitamines B
Il y a plusieurs décennies, Bechdel et al. (1928) mirent en évidence la production de
vitamines B par les bactéries présentes dans le rumen d’une vache. Dans les années qui suivirent, il
apparut que les carences réelles en vitamines B étaient très rares chez les animaux avec un rumen
fonctionnel. En conséquence, les chercheurs ont longtemps accepté le dogme selon lequel la
synthèse ruminale et l’apport de la ration suffisaient à satisfaire les besoins en vitamines B des
11
animaux (NRC, 2001), ce qui s’est traduit par un manque de soutien et d’investissement pour les
recherches sur les exigences des vaches laitières pour les vitamines B.
Durant les 50 dernières années cependant, la production de lait et de ses composantes s’est
considérablement accrue, faisant logiquement penser que les besoins en vitamines B ont suivi la
même courbe ascendante, et que la synthèse ruminale seule ne suffisait plus à rencontrer ces
nouveaux besoins et assurer une optimisation de la production laitière. En effet, la principale
fonction des vitamines B est d’agir comme cofacteur pour des enzymes impliquées dans le
métabolisme des acides aminés, des acides gras et des acides nucléiques. Plusieurs de ces enzymes
interviennent directement dans la production du lait et de ses composantes. Ainsi, l’augmentation de
la production laitière implique logiquement une augmentation des besoins en enzymes (et
cofacteurs associés).
En assumant (pour une vache Holstein) que la composition moyenne du lait n’ait pas varié
durant ce temps, une vache moyenne en 2005 devait synthétiser approximativement 0.18 kg
d’acides gras, 0.27 kg de protéines et 0.41 kg de lactose en plus, sur une base journalière, qu’une
vache moyenne de 1990 (Weiss et Ferreira, 2006). Ces auteurs ont calculé, sur une période de
quinze ans, une hausse de la production laitière moyenne de 33% chez des vaches Holstein tandis
que la consommation volontaire de matière sèche augmentait de seulement 15%. Or, les vitamines
B n’étant pas ajoutées en supplément, l’apport extérieur pour les vaches laitières ne peut être assuré
que par la ration alimentaire. Ce potentiel déséquilibre entre les besoins et l’apport chez les vaches
laitières hautes productrices peut laisser supposer qu’une réponse positive pourrait être observée
suite à une supplémentation en vitamines B. Cela a été confirmé par des études mettant en évidence
les effets bénéfiques de la supplémentation de thiamine (Shaver et Bal, 2000), de niacine (Kung et
al., 1980 ; Ridell et al., 1981;), de biotine (Majee et al., 2003), d’acide folique et de vitamine B12
(Girard et Matte, 1998; Girard et Matte, 1999; Girard et Matte, 2005; Girard et Matte, 2006).
Cependant, comme mentionné dans le NRC (2001), il manque des données pour quantifier la
biodisponibilité, la synthèse ruminale et les besoins des vaches laitières pour la plupart des
vitamines B.
12
1.4. Objectifs de l’étude
Les supplémentations en vitamines B, bien qu’intéressantes d’un strict point de vue de
production laitière, se heurtent à des obstacles d’ordre pratique et économique dans leur mise en
œuvre :
- la destruction des suppléments dans le rumen de 99% de la riboflavine, 68% de la
thiamine, 80% de la vitamine B12 et 70% de l’acide folique (Santschi et al., 2005b).
Cela nécessite l’utilisation de suppléments enrobés pour une meilleure efficacité, et
donc un renchérissement des coûts.
- les injections intramusculaires ne sont pas pratiques à cause d’une augmentation des
besoins en main d’œuvre pour la manipulation des animaux.
Une meilleure connaissance des facteurs intervenant dans la synthèse ruminale des vitamines
B pourrait donc contribuer à constituer une alternative et/ou un complément à la supplémentation.
1.5. Synthèse ruminale des vitamines B chez la vache laitière
L’apport de vitamines pour la vache laitière dépend des facteurs suivants : la consommation
de vitamines (la teneur en vitamines de la ration multipliée par la consommation de matière sèche),
la synthèse et la dégradation de la vitamine dans le rumen et sa biodisponibilité (sa capacité à être
absorbée, principalement dans l’intestin grêle).
La synthèse ruminale apparente des vitamines B est la différence entre la quantité de
vitamines apportées par la ration et le flux de vitamines mesuré au duodénum. On parle de synthèse
apparente en référence au fait que les mesures ne tiennent pas compte des quantités de vitamines
utilisées par les microorganismes pour leur métabolisme ou détruites dans le rumen, ainsi que d’une
éventuelle absorption à travers les parois du rumen.
13
1.5.1. Apport vitaminique des rations
La teneur en vitamines des rations utilisées chez la vache laitière n’a pas fait l’objet de
plusieurs publications, à cause principalement de la difficulté de tels dosages. Dans une étude en
2006, Schwab et al. ont déterminé la teneur en vitamines B de neuf ingrédients courants dans les
rations de la vache laitière (tableau 1.1).
La niacine (somme de l’acide nicotinique et du nicotinamide) est la vitamine ayant les plus
fortes teneurs dans les divers ingrédients. À l’opposé, les folates, mais surtout la vitamine B12 sont
présentes en très faibles quantités. Il ne semble pas y avoir de fortes variations de la teneur en
vitamines entre les ingrédients, à l’exception de la coque de soja, de la pulpe de betterave et du
tourteau de soja qui se démarquent du fait notamment de leur forte teneur en niacine et en thiamine
(tourteau de soja).
Tableau 1.1: Teneur en vitamines B d’ingrédients utilisés dans les rations pour vaches laitières.
Vitamine
(mg/kg de
MS)
Ensilage
de maïs
Foin de
graminées
Foin
de
luzerne
Maïs
moulu
Orge
moulue
Coque
de
soja
Pulpe de
betterave
Tourteau
de soja
Farine
de
sang
Thiamine 0,57 0,89 1,9 2,7 3,9 1,8 0,62 7,1 0,38
Riboflavine 3,5 9,9 17,5 1,2 1,1 2,4 2,0 4,3 0,62
Acide
nicotinique
22,5 11,8 26,4 7,0 18,9 34,2 59,8 16,0 10,1
Nicotinamide 1,5 0,34 7,6 0,0 18,0 194,7 1,1 26.1 35,1
Pyridoxamine 0,24 0,25 0,82 1,6 0,73 0,27 0,0 2,0 0,0
Pyridoxal 0,44 0,15 0,61 1,8 0,28 0,48 5,8 0,84 0,0
Pyridoxine 1,9 1,8 4,5 0,21 0,69 1,2 0,61 1,1 0,0
Biotine 7,3 7,6 7,4 6,4 6,2 7,2 5,7 8,1 6,9
(Schwab et al, 2006)
Weiss et Ferreira (2006) ont fait une synthèse des études menées sur des rations totales
mélangées (RTM). Il en ressort que comme pour les ingrédients, les variations des teneurs en
vitamines B des différentes rations sont relativement modérées. La forte variation des teneurs en
niacine est attribuable à la présence ou l’absence de coques de soja dans les rations (Tableau 1.2).
14
On peut aussi remarquer que la teneur moyenne en biotine des rations utilisées dans les expériences
de Santschi et al. (2005a et 2005b), puis Schwab et al. en 2006 (6,3 à 7,8 mg/kg MS) est sans
commune mesure (presque 20 fois plus haute) avec celles obtenues dans trois autres études (Zinn et
al., 1987; Frigg et al., 1993; Midla et al.,1998). Les méthodes analytiques utilisées sont à l’origine
de ces différences.
Ces données sont obtenues par des méthodes d’analyses plus récentes à savoir le HPLC pour
toutes les vitamines à l’exception de la biotine (ELISA), de la vitamine B12 et des folates (méthode
radioactive). Les études plus anciennes faisant recours aux méthodes microbiologiques révèlent de
grandes disparités sur les niveaux de vitamine B8 (biotine).
Tableau 1.2: Concentrations en vitamines B dans des rations et consommations moyennes des
vaches laitières1.
Vitamine Moyenne (mg/kg de
MS)
Intervalle (mg/kg de
MS)
Consommation
moyenne (mg/jour)2
Thiamine 2,0 1,5 à 2,6 45
Riboflavine 5,4 4,3 à 6,7 123
Niacine totale 46,0 22,6 à 94,8 1045
Vitamine B6 5,2 3,2 à 8,5 118
Folates 0,5 0,4 à 0,7 11
Biotine 6,9 6,3 à 7,8 157
Biotine3 0,37 0,33 à 0,41 8
1Les données proviennent de 7 différentes rations dans 3 expériences (Santschi et al., 2005a; Sants chi et al.,
2005b; Schwab et al., 2006)
2Basée sur une consommation journalière moyenne de matière sèche de 22.7 kg
3Les données de cette rangée proviennent de trois différentes rations (Zinn et al., 1987; Frigg et al.,1998;
Milda et al.,1998) et les méthodes de dosage utilisées (méthode microbiologique) sont différentes des autres
expériences (ELISA)
Des études encore plus anciennes (Miller et al., 1989a) confirment une certaine cohérence
dans les concentrations des vitamines B des ingrédients mais aussi sur l’effet de la méthode
d’analyse (ici la méthode microbiologique) sur la concentration de biotine (tableau 1.3).
15
Tableau 1.3 : Concentrations en vitamines B de types de grains utilisées dans l’alimentation des
vaches laitières.
Vitamines,
mg/kg
Maïs Blé Avoine Orge Sorgho
Thiamine 1,90 3,33 2,67 2,03 1,47
Niacine 30,34 50,06 22,41 74,79 40,10
Riboflavine 4,79 4,12 4,16 5,69 3,48
Biotine 0,08 0,10 0,16 0,13 0,28
(Miller et al., 1989a)
Les études mentionnées ci-dessus donnent aussi une indication des niveaux d’apports en
vitamines B de diverses rations. En toute logique, la forte concentration relative de la niacine dans
les aliments se traduit par une consommation journalière moyenne élevée (1045 mg/jour), en
opposition à la thiamine (45 mg/jour) et aux folates (11 mg/jour), par exemple.
1.5.2. Quantification de la synthèse ruminale
Les études sur la synthèse ruminale des vitamines B chez la vache laitière (quantification et
facteurs de variation) sont relativement récentes et peu nombreuses. Historiquement, de telles
recherches étaient plutôt menées sur les races de bovins de boucherie ou les petits ruminants,
notamment à cause des maladies neurodégénératives reliées au manque de thiamine. De plus, ces
études ne concernaient qu’un nombre réduit de vitamines B et les méthodes d’analyse utilisées
étaient moins spécifiques. Il en est ainsi des recherches menées par Hollis et al. en 1954 sur la
synthèse ruminale de riboflavine, d’acide nicotinique et d’acide pantothénique chez le mouton; par
Conrad et Hibbs en 1953 (thiamine et riboflavine) chez des veaux d’élevage, et par Miller et al. en
1989 (thiamine, niacine, riboflavine et biotine) chez des bouvillons.
Les études spécifiques aux vaches laitières débutèrent dans les années quatre-vingts, lorsque
Breves et al. (1981) déterminèrent par la méthode fluorimètrique un flux duodénal de thiamine
moyen de 51,7 mg/jour en utilisant des vaches Frisonnes. Des études récentes utilisant des
technologies plus modernes (HPLC) permettent de quantifier la synthèse ruminale des vitamines B
16
chez des vaches Holstein (Santschi et al., 2005b; Schwab et al.,2006). Weiss et Ferreira (2006)
firent la synthèse des valeurs moyennes pour différents traitements alimentaires (tableau 1.4).
Tableau 1.4 : Synthèse ruminale de vitamines B chez la vache laitière1
Synthèse ruminale Flux total2,3
(mg/j) Synthèse ruminale,
% du flux total
Vitamine mg/kg de
matière sèche
ingérée
mg/jour
Thiamine 2,3 51 96 53,1
Riboflavine 12,1 274 397 69,0
Niacine 62,8 1425 2470 57,7
Vitamine B6 0,9 21 139 15,1
Folates 0,9 19 30 63,3
Biotine 0 0 157(8)4 0
Vitamine B12 3,9 88 88 100
1(Traduit de Weiss et Ferreira (2006), à partir des données de Santschi et al., 2005a.)
2Basée sur une consommation de matière sèche de 22,7 kg/jour
3Flux mesuré au duodénum, soit la somme de la consommation de vitamines et de la synthèse nette
4Le nombre entre parenthèses est la concentration basée sur une méthode analytique différente (voir tableau
1.2)
La synthèse ruminale apparente constitue, pour chaque vitamine, la différence entre l’apport
de la ration et le flux duodénal. Cette formule, cependant, ne rend pas compte de la dégradation
ruminale et de l’utilisation microbienne, ainsi que d’une éventuelle absorption à travers les parois
du rumen. Pour la plupart des vitamines étudiées le flux au niveau du duodénum excède la
consommation, ce qui traduit une synthèse nette. À l’exception de la biotine et de la vitamine B6,
du moins pour les rations étudiées, il semble que la majorité des vitamines B qui atteignent
l’intestin proviennent de la synthèse ruminale.
Dans les études sur les vaches laitières en référence (Santschi et al., 2005a; Schwab et al.,
2006), on note une apparente absence de synthèse ruminale de biotine, à moins que cela ne signifie
que la dégradation soit égale ou plus importante que la synthèse. En opposition, des études menées
sur des bovins de boucherie (Miller et al., 1989a; Zinn et al., 1987) révèlent une synthèse nette de
17
biotine. Dans le cas des vaches laitières, les analyses révèlent des teneurs relativement élevées de
biotine dans les rations utilisées (tableau 1.2). Or, une surestimation à ce niveau se traduit par une
sous-estimation de la synthèse ruminale. Le phénomène inverse est noté dans le cas des études sur
les races à viande.
Les anciennes techniques d’extraction utilisées par Miller et al. (1989a) et Zinn et al. (1987)
ne permettraient pas de détecter la biotine totale, à la différence des techniques plus récentes. La
méthode de préparation des échantillons et d’extraction a donc un grand impact sur le niveau de
biotine détectée, et par conséquent sur le calcul de la synthèse ruminale et l’absorption intestinale de
biotine. Cette nouvelle méthode d’extraction combinée au dosage par ELISA permet de conclure
que la synthèse et l’utilisation de la biotine sont égales, ou que les bactéries du rumen ne possèdent
pas la capacité de synthétiser la biotine, ni de dégrader la forme liée de cette vitamine présente dans
les aliments.
Cela montre aussi que la synthèse ruminale de biotine telle que relatée dans des études
antérieures (Miller et al., 1989a) n’est qu’un artéfact dû au fait que dans ces analyses, seule la
forme libre de la biotine était mesurée. En utilisant une méthode qui détecte la biotine totale,
certains auteurs (Santschi et al., 2005a; Schwab et al., 2006) ont conclu qu’il n’y avait pas de
synthèse nette de biotine ou que la dégradation ruminale était légèrement supérieure à la synthèse
(ex. flux duodénal de biotine statistiquement inférieur à l’apport de la ration).
1.5.3. Influence des caractéristiques de la ration sur la synthèse ruminale
Comme mentionné précédemment, la plupart des études sur les effets de la ration sur la
synthèse ruminale des vitamines B ont été menées chez les races de bovins de boucherie et les petits
ruminants il y a plusieurs décennies. Une des rares études impliquant des vaches laitières fut menée
vers les années 50 à l’université du New Hampshire par N.F.Colovos. L’intérêt des chercheurs pour
cette problématique chez la vache laitière est donc relativement récente, d’où la modicité des
publications qui y sont consacrées.
Il faut dire que les méthodes de préparation des échantillons et de dosage utilisées dans ces
années étaient moins précises. Le plus souvent, on ne mesurait que les excrétions urinaires et
fécales des vitamines. Cependant, la mise en lumière du rôle du gros intestin dans une probable
18
synthèse des vitamines B par le biais de sa population microbienne et celui de l’intestin grêle
comme principal site d’absorption (Miller et al., 1989a; Zinn et al., 1987) remirent en question la
précision des excrétions urinaire et fécale comme instrument de mesure des synthèses ruminales de
vitamines B. Par ailleurs, la plupart des études mesuraient les concentrations de vitamines dans
différentes fractions du contenu ruminal. Or, les concentrations ruminales ne représenteraient pas la
synthèse totale car le remplissage du rumen et les taux de passage des digesta pourraient être
influencés par certains aspects de la ration tels le rapport fourrage : concentrés, le niveau
d’ingestion, les ingrédients, la texture et les additifs.
1.5.3.1. Le rapport fourrage/concentrés
Il est depuis longtemps admis que des variations dans le rapport fourrage/concentrés sont
susceptibles d’affecter l’activité microbienne du rumen, modifiant ainsi la quantité de vitamines B
produites par la microflore ruminale. Hunt et al. (1941), dans une expérience avec des bouvillons,
conclurent que la concentration de riboflavine dans le contenu ruminal était plus haute lorsqu’ils
étaient nourris avec une ration composée de foin de luzerne, de maïs et de complément protéique,
plutôt qu’avec une ration composée exclusivement de foin.
Conrad et Hibbs (1954) ont comparé 8 rations comprenant divers ratios de foin de mil et d’un
mélange de grains chez des veaux. La thiamine et la riboflavine furent analysées dans le liquide
ruminal. Ils en conclurent que lorsque la proportion de concentrés dans la ration augmente, la
concentration ruminale de riboflavine augmente pour atteindre un plateau au ratio
fourrage/concentrés de 2:1. La concentration ruminale de thiamine était maximale au ratio 4:1 et
diminuait aux ratios plus haut ou plus bas (fig.1.8). L’augmentation des proportions de concentrés
dans la ration jusqu’à un certain niveau semble donc favoriser la synthèse ruminale de thiamine et
de riboflavine.
19
Fig.1.8 : Influence du rapport fourrage : concentré sur les concentrations de thiamine et de
riboflavine dans le rumen de veaux alimentés avec du foin de mil comme unique source de
fourrage. (Adaptée de Conrad et Hibbs, 1954)
Hayes et al. (1966) ont évalué les effets de diverses rations sur la synthèse ruminale des
vitamines B chez des bouvillons de race Angus. À l’exception de la riboflavine et de la biotine, les
concentrations des autres vitamines (thiamine, niacine, acide pantothénique, acide folique et
vitamine B12) dans le liquide ruminal étaient plus élevées avec une ration composée exclusivement
de concentrés en comparaison avec une ration composée de maïs et de foin.
Hollis et al. (1954) ont étudié les effets de 3 rations (ration 1:100% foin de prairie : ration
2 : 45% foin de prairie 53% maïs et 2% urée; ration 3 : 45% foin de prairie, 40% maïs et 15%
tourteau de soja) sur la synthèse ruminale de riboflavine, de niacine et d’acide pantothénique chez
16 moutons âgés d’un an. L’augmentation de la proportion de concentrés a entraîné une
augmentation de la concentration ruminale des 3 vitamines, probablement à cause de l’amélioration
de la croissance microbienne (fig.1.9).
Kon et Porter (1953) travaillant sur des bouvillons ont rapporté une plus grande concentration
de la vitamine B12 totale dans le contenu ruminal lorsque la ration était composée de foin et de
concentrés, plutôt que de foin exclusivement.
20
Fig.1.9. Concentrations ruminales de riboflavine, d’acide nicotinique et d’acide pantothénique de
moutons alimentés avec diverses rations. (Adaptée de Hollis et al., 1954)
Sutton et Elliott (1972) ont évalué l’effet de 3 rations composées de foin de mil et de maïs
dans des ratios respectifs de 100:0; 70:30 et 40:60 sur la synthèse ruminale de vitamine B12 chez des
moutons. La vitamine B12 totale était mesurée par dosage radio-isotopique alors que la vitamine B12
biologiquement active était mesurée microbiologiquement en utilisant Ochromonas malhamensis.
La synthèse ruminale de B12, exprimée en proportion de la consommation journalière de matière
sèche digestible diminuait numériquement au fur et à mesure que le ratio foin/maïs diminuait.
(fig.10). Cependant, la synthèse ruminale de la B12 biologiquement active diminuait de 36% quand
le ratio foin/maïs passait de 70:30 à 40:60. La diète 40:60, riche en concentrés, a réduit la
production de vitamine B12 sans toutefois affecter celle de ses analogues.
21
Fig.1.10. Effets du rapport fourrage/concentrés sur les concentrations ruminales de vitamine B12
totale (dosage radio-isotopique) et de vitamine B12 vraie (dosage par Ochromonas). (Adaptée de
Sutton et Elliott ,1972)
Cet effet réducteur du haut niveau de concentrés sur la production de vitamine B12, tout en
n’affectant pas celle des analogues a été similairement observé par Walker et al. (1972) puis par
Rickard et al. (1975). Girard et al. (1994) ont étudié l’influence du rapport fourrage/concentré sur la
concentration ruminale de folates chez 8 bouvillons pesant en moyenne 352 kg. Deux rations étaient
servies, une à haute teneur en concentrés (70% d’orge floconnée, 30% foin de mil) et une à haute
teneur en fourrage (30% d’orge floconnée, 70% foin de mil). Les concentrations ruminales
moyennes de folates étaient de 40,9 ng/ml pour la ration à haute teneur en fourrage et de 53,0 ng/ml
pour la ration à haute teneur en concentrés.
Santschi et al. (2005b) ont comparé les effets de 2 rations, à 40 ou 60% de fourrages (herbe et
ensilage de maïs) sur les concentrations de vitamine B dans diverses fractions du contenu ruminal
de vaches laitières. La ration à faible teneur en fourrage (40%) avait comme effets notables une
hausse de la riboflavine et une diminution de la vitamine B12 dans les bactéries associées aux
particules solides, ainsi qu’une diminution des concentrations de biotine dans le fluide sans
particules.
22
Abel et al. (2001) ont procédé à une expérimentation in vitro sur l’effet du rapport fourrage :
concentrés sur la synthèse ruminale de biotine, avec le système de culture continue RUSITEC. Cinq
rations avec divers rapports de foin et de grains d’orge (83:17; 67:33; 50:50; 33:67; 17:83) étaient
incubées de manière séquentielle pendant 9 jours. La synthèse apparente de biotine diminuait
numériquement au fur et à mesure que le ratio foin: grains d’orge baissait. Cependant, seuls les
rapports 83:17 et 17:83 étaient statistiquement différents, avec des concentrations de biotine
respectives de 0,34 et 1,53 µg/jour.
Schwab et al. (2006) ont évalué les effets de rations à 35 ou 60% de fourrages (ensilage de
maïs, foin de luzerne et foin de graminées) sur la synthèse ruminale apparente des vitamines B chez
des vaches nourries ad libitum. La synthèse ruminale était rapportée soit en proportion de la matière
organique ingérée (MOI) pour tenir compte des différences de consommation entre les traitements,
ou en proportion de la matière organique réellement digérée dans le rumen (MORDR) comme
mesure de l’efficacité de la synthèse ruminale. L’augmentation de la proportion de fourrage de 35 à
60% entraînait une diminution de la synthèse ruminale de B12 en proportion de la matière organique
ingérée mais était sans effet sur la synthèse ruminale de B12 rapportée en proportion de la matière
organique réellement digérée dans le rumen.
1.5.3.2. Le niveau d’ingestion
L’étude menée par Sutton et Elliott (1972) a fourni une première indication sur la relation
entre le niveau d’ingestion et la synthèse ruminale de vitamine B12, en utilisant 3 moutons pesant en
moyenne 40 kg et pourvus de canules ruminales et intestinales. La consommation moyenne de
matière sèche digestible était de 527, 698 et 894 (écart-type±14) g/jour pour les niveaux faible,
moyen et haut, respectivement.
La production de vitamine B12 mesurée par un essai avec Ochromonas était augmentée de
manière significative par l’augmentation de la matière sèche ingérée digestible (MSDI, tableau 1.5).
La production de vitamine B12 mesurée par radio essai n’était pas influencée par le niveau
d’ingestion. Par conséquent, le rapport duodénal O/R (traduisant le rapport entre la vitamine B12
biologiquement active et la vitamine B12 totale) augmentait avec le niveau d’ingestion, indiquant
une relative réduction dans la synthèse des analogues de la B12. Contrairement aux analogues, la
23
production de la «vraie» vitamine B12 augmentait avec le niveau de la matière sèche digestible. Le
niveau d’ingestion n’a pas eu d’effet sur les concentrations sériques de vitamine B12.
Tableau 1.5. Effets du niveau d’ingestion sur la production journalière de vitamine B12 duodénal et
de B12 sérique.
Production
journalière (µg)
Production (µg/g
MSDI)
B12 duodénal B12 sérique
Niveau
d’ingestion
Ochromonas Radio-
isotope
Ochromonas Radio-
isotope
Ochr/radio×1004
(%)
Concentration
(radio)
(µg/ml)
Ochr/radio*100
(%)
Faible1 579a 3076 1.1 5,9 19
a 5,2 96
Moyen2 868
ab 3401 1.2 4,8 26
a 6,1 98
Haut3 1176
b 3174 1.3 3,6 36
b 5,2 91
Écart-type 98 475 0.1 0,8 2 0,5 3
(Adapté de Sutton et Elliott, 1972)
1527 g de MS/jour
2698 g de MS/jour
3894 g de MS/jour
4Ochr/radio*100 traduit le rapport entre la B12 biologiquement active et la B12 totale
Les valeurs (a, b) à l’intérieur d’une colonne n’ayant pas la même lettre en exposant sont significativement
différentes (p < 0,05)
Zinn et al. (1987) ont aussi évalué l’effet du niveau d’ingestion sur la synthèse ruminale de
thiamine, riboflavine, niacine, pyridoxine et vitamine B12 chez des bouvillons (250 kg de poids vif).
Les animaux étaient alimentés avec une ration composée de 80% de concentrés à 1,2; 1,5; 1,8 et
2,1% du poids vif. La synthèse ruminale (mg/jour) des vitamines augmentait en même temps que le
niveau d’ingestion exprimé en pourcentage du poids vif, à l’exception de la riboflavine dont la
synthèse culminait quand les bouvillons étaient alimentés à 1,6% avant de décliner légèrement
(fig.1.11). En considérant la moyenne entre les différents niveaux de prise alimentaire, la synthèse
ruminale de thiamine, de riboflavine, de niacine, de pyridoxine et de vitamine B12 était de 19, 22,
317, 29 et 11mg/jour soit 331, 108, 308, 244 et 438% de l’apport de la ration, respectivement.
24
0
10
20
30
40
50
60
1,2 1,6 1,8 2,2
consommation,%poids vif
syn
thès
e d
e vi
tam
ines
,mg
/jthiamine
riboflavine
pyridoxine
vitamine B12
niacine(1/10)
Fig.1.11. Influence du niveau de prise alimentaire sur la synthèse ruminale de vitamines B.
(Adaptée de Zinn et al., 1987)
1.5.3.3. Traitement physique des aliments
La méthode de traitement des grains et des fourrages semble avoir une influence sur la
production de vitamines B dans le rumen. Dans l’étude de Hayes et al. (1966), 8 bouvillons de race
Angus pesant approximativement 340 kg étaient assignés à chacun des 6 traitements suivants : maïs
floconné (1); maïs moulu (2); maïs floconné et foin long (3); maïs moulu et foin long (4); maïs
floconné et foin moulu (5) et maïs moulu et foin moulu (6). Les concentrations de thiamine, de
riboflavine, de niacine, d’acide pantothénique, d’acide folique, de biotine et de vitamine B12 ont
ensuite été déterminées dans le liquide ruminal par méthode microbiologique. À l’exception de la
riboflavine et de la biotine, les vitamines B étudiées dans cette expérience furent trouvées en plus
grande concentration dans le liquide ruminal des bouvillons alimentés avec les rations tous
concentrés, en particulier la ration avec le maïs moulu (traitement 2). Les concentrations de
riboflavine étaient plus élevées avec les rations à base de foin moulu et de maïs en comparaison
aux rations à base de foin long et de maïs.
25
Tableau 1.6. Niveaux moyens1 de vitamines B dans le rumen de bouvillons alimentés avec 6
rations différentes.
Maïs Foin long Foin moulu
Concentration
initiale de
vitamines2
En
flocons
moulu Flocons
de maïs
Maïs
moulu
Flocons
de maïs
Maïs
moulu
Thiamine 2,0 5,5b 16,8
c 1,2
b 0,3
b 0,8
b 5,5
b
Riboflavine 56 40d 74
c 29
d 54
c,d 106
b 108
b
Biotine 4,0 4,8 3,7 2.9 3,3 3,2 3,1
Acide
pantothénique
71 242d 354
c 65
b 77
b 115
b 112
b
Acide folique 7,6 18,6c 18
c 8
b 8,3
b 9,1
b 14,4
d
Niacine 146 649c 850
b 222
d,e 375
d 141
e 324
d
Vitamine B12 3,0 6,4b,d
8,8b 4,6
c,d,e
5,6b,d
2,2c,e
2,1c,e
(Traduit de Hayes et al. ,1966)
1Microgrammes par 100 ml de fluide ruminal
b, c, d, e En excluant les concentrations initiales, les moyennes dans la même ligne avec un exposant différent
sont significativement différentes (p < 0,05)
2Teneur en vitamines du
fluide ruminal durant la phase préliminaire (15 jours) en prélude au début des
traitements
Le traitement physique des aliments semble donc influencer la synthèse ruminale des
vitamines B. Une autre expérience, menée par Hunt et al. (1941), corrobore cette hypothèse. Chez
des veaux alimentés avec du foin et du maïs, la concentration ruminale de riboflavine était plus
élevée avec du maïs moulu comparé au grain entier.
1.5.3.4. Ingrédients et composition nutritionnelle
Miller et al. (1989a) ont testé, chez des bouvillons Hereford, des rations différant par les types
de grains : maïs, blé, avoine, orge et sorgho. La synthèse ruminale de thiamine était supérieure pour
le sorgho comparativement aux autres céréales (tableau.1.7). Le type de grains de la ration n’a pas
affecté la synthèse ruminale de niacine, de riboflavine et de biotine.
26
Tableau 1.7. Effets du type de grains sur la synthèse ruminale de thiamine.
Ration
Maïs Blé Avoine Orge Sorgho ET1
Quantités de thiamine, mg/jour
Aliments
duodénum
12,5b
12,0bc
23,2c
14,9bc
19,2c
13,9bc
14,1b
10,1b
10,3b
18,4c
1,38
2,74
(Adapté de Miller et al., 1989a)
1ET= écart-type de la moyenne
bcvaleurs dans une rangée sans exposant commun diffèrent (p<0,05)
La composition nutritionnelle des rations est aussi évoquée par Breves et al. (1981), en
conclusion d’une étude sur 4 vaches laitières Frisonnes. La ration était composée de 43% d’ensilage
de maïs, 21% de foin, 36% de concentrés en différentes proportions de blé, de maïs, de tourteau de
soja et d’orge. La synthèse ruminale moyenne de thiamine était 116% de l’apport de la diète et était
fortement corrélée avec le flot de protéines microbiennes (r = + 0.92) et la matière organique
digérée dans le tube digestif. Ces auteurs suggèrent qu’une faible teneur de la ration en protéines se
traduit par une diminution de la synthèse de thiamine.
Hollis et al (1954) ont mesuré l’effet de la variation du type de fourrages, de glucides
rapidement fermentescibles et des constituants minéraux de la ration sur la synthèse de riboflavine,
d’acide nicotinique et d’acide pantothénique. L’addition de sources d’azote sous forme d’urée ou de
tourteau de soja entraînait une augmentation de la synthèse des vitamines chez les moutons
alimentés avec une ration à base de foin de prairie. L’addition de cendres de luzerne à une ration
contenant des épis de maïs comme fourrage principal augmentait la synthèse de toutes les vitamines
B en comparaison aux rations non supplémentées.
Les effets de la composition nutritionnelle des rations sur la synthèse ruminale de vitamines B
ont aussi été évoqués dans l’étude de Schwab et al. (2006). La synthèse ruminale de thiamine
rapportée en proportion de la MOI ou en proportion de la MORDR tendait à être diminuée par une
augmentation des glucides non structuraux chez des vaches nourries à 35% de fourrages alors que la
tendance inverse était notée à 60% de fourrages. Le passage du niveau de glucides non structuraux
de 30% à 40% a entraîné une augmentation de la synthèse ruminale, rapportée en proportion de
matière organique ingérée ou de matière organique réellement digérée dans le rumen de la niacine
et de la vitamine B6, mais une diminution de celle de la vitamine B12.
27
1.5.3.5. Additifs et minéraux
L’ajout de monensin dans la ration de bouvillons diminuait le flot duodénal de niacine,
augmentait la riboflavine et était sans effet sur la thiamine et la biotine, selon Miller et al. (1989b),
tandis que l’incorporation de chlorotétracycline était sans effet.
Hayes et al. (1966) n’ont pas observé d’effet de l’incorporation d’un mélange d’antibiotiques
sur les concentrations ruminales de thiamine, de riboflavine, de biotine, de niacine, d’acide folique,
d’acide pantothénique et de vitamine B12 chez des bouvillons de race Angus. Kon et Porter (1953)
ont aussi constaté la même absence d’effet de l’addition de pénicilline-procaïne dans la ration de
bouvillons sur les concentrations ruminales de riboflavine, de vitamine B6, de biotine et de vitamine
B12.
Différents auteurs ont rapporté le rôle essentiel du cobalt (Co) sur la synthèse ruminale de
vitamine B12. Kawashima et al. (1997) ont testé les effets de diverses sources et taux
d’incorporation de Co dans la production in vitro de vitamine B12 et de ses analogues. La production
de vitamine B12 et de ses analogues était supérieure dans les cultures supplémentées avec du sulfate
de Co, du carbonate de Co, du glucoheptonate de Co et de l’oxyde de Co comparées aux cultures
non supplémentées. L’augmentation de la teneur de Co de 1 à 40 ppm a entraîné une augmentation
de la vitamine B12 et de ses analogues. Judson et al. (2008) ont évalué l’efficacité de comprimés de
cobalt donnés en suppléments à des bovins s’alimentant dans des pâturages déficients en cobalt.
Les animaux recevaient une seule dose orale de 0, 1, 2 ou 4 comprimés de 30 g contenant 30%
d’oxyde de cobalt. Un seul comprimé de Co augmentait les concentrations de vitamine B12 dans le
foie comparativement aux animaux non traités pendant au moins 28 semaines. Avec 2 ou 4
comprimés ce temps passait à 57 semaines. Ils ont ainsi conclu que l’utilisation de comprimés de
Co permettait de prévenir la carence en vitamine B12.
Stangl et al. (2000) ont utilisé chez des taurillons de 236 kg de poids moyen une ration à base
d’ensilage de maïs supplémentée avec 70, 90, 109, 147, 184, 257, 327, 421, 589 et 689 µg de Co
par kg de matière sèche afin d’estimer la teneur optimale. Les concentrations de vitamine B12
biologiquement active dans le plasma et le foie ont atteint un pic puis ont plafonné à 257 et 236
µg/kg de matière sèche respectivement.
28
Al Habsi et al. (2007) ont étudié l’effet d’une faible teneur en Co de la ration chez 73 chèvres
en lactation de race Omani (38 dans le groupe témoin et 35 dans le groupe de traitement) âgés en
moyenne de 10 semaines. Tous les animaux recevaient une ration composée de concentrés et de
foin contenant respectivement 0,12 et 0,10 mg de Co/kg de MS. Les animaux dans le groupe de
traitement recevaient en plus des injections sous-cutanées de 2000 µg d’hydroxycobalamine tous les
15 jours. Contrairement aux animaux traités, les animaux du groupe témoin ont connu une sévère
baisse des concentrations de vitamine B12 dans le sérum et le lait.
Kincaid et Socha (2007) ont étudié, chez 36 vaches multipares, les effets de la
supplémentation en Co durant la fin de gestation et le début de lactation sur les concentrations de
vitamine B12 dans le sérum et le lait. Les vaches gestantes ont reçu des diètes contenant 0,15; 0,89
ou 0,71 mg/kg de MS à partir de 55 jours avant la parturition et les vaches en lactation des diètes
contenant 0,19; 0,57 ou 0,93 mg/kg de MS les 120 jours après la parturition. Les auteurs ont
rapporté qu’il y avait une réduction des concentrations sériques de vitamine B12 lors du tarissement
et que la supplémentation de la ration en Co pouvait augmenter la synthèse ruminale de vitamine
B12, tel qu’indiqué par une tendance à l’augmentation des concentrations de vitamine B12 dans le
colostrum et le lait chez les vaches supplémentées. Le cobalt joue donc un rôle essentiel dans la
synthèse de vitamine B12, rôle que lui confère selon toute vraisemblance sa position centrale dans le
noyau corrine (fig.1.7).
1.6. Conclusions
Les études relatées dans cette revue de littérature indiquent que les caractéristiques des
rations telles le ratio fourrage/concentrés, le traitement physique des aliments, le niveau de prise
alimentaire, la nature des ingrédients et les additifs alimentaires peuvent avoir une influence sur la
synthèse ruminale des vitamines B. Les résultats sont toutefois souvent contradictoires : au gré des
études et des auteurs, ces facteurs peuvent entraîner une augmentation ou une diminution de la
synthèse ruminale d’une ou de plusieurs vitamines B, ce qui rend plus complexe l’interprétation de
leur action.
Les flux duodénaux de vitamines B sont le plus souvent supérieurs aux quantités apportées
par la diète. L’estimation des quantités de vitamines synthétisées par la différence entre le flux
duodénal et la consommation est biaisée par une potentielle dégradation et/ou utilisation des
29
vitamines par les micro-organismes du rumen, ou par une absorption à travers les parois du rumen.
En effet, les microorganismes du rumen synthétisent des vitamines, mais en consomment aussi
pour leur propre métabolisme. Par ailleurs, Erickson et al. (1991) ont démontré que la niacine,
particulièrement le nicotinamide, peut être absorbée à travers les parois du rumen. Girard et al.
(2001), dans une étude chez des vaches laitières, ont toutefois calculé que des quantités
infinitésimales d’acide folique (0,015%) et de vitamine B12 (0,0004%) perfusées traversaient la
paroi ruminale. Cette constatation sera corroborée par une étude de Girard et Rémond (2003) menée
avec des moutons.
La presque totalité des études citées en référence ont utilisé comme modèle animal des
moutons, des veaux et des bouvillons. L’extrapolation des résultats chez des vaches laitières n’est
pas sans risques. En effet, les niveaux de prise alimentaire et par conséquent les quantités de
vitamines synthétisées sont beaucoup plus élevés chez ces dernières. De plus, les ingrédients
utilisés, ainsi que les proportions dans les rations des veaux, des bouvillons et des moutons ne sont
généralement pas typiques des rations de vaches laitières. Par ailleurs la plupart des études
comparaient les concentrations ruminales de vitamines B en réponses à des traitements, au contraire
de quelques unes plus récentes qui mettaient l’emphase sur les flux duodénaux et le calcul de la
synthèse ruminale apparente. Tout cela met en exergue la nécessité d’entreprendre des études
spécifiques sur les effets des caractéristiques de la diète sur la synthèse ruminale des vitamines B
chez la vache laitière.
Notre étude est une contribution à l’avancée de ces connaissances. Notre hypothèse de travail
est que les caractéristiques de la diète influencent la synthèse ruminale apparente par la microflore
du rumen, modifiant les quantités de vitamines B disponibles pour la vache.
Les objectifs spécifiques sont :
- De déterminer les effets du type de fourrage (légumineuse ou graminée) et du ratio
fourrage/concentrés sur la synthèse ruminale des vitamines B.
- D’utiliser des données sur les caractéristiques de la fermentation ruminale recueillies
par les chercheurs de l’université du Michigan par la mise en évidence des corrélations
qui existent avec la synthèse ruminale de chaque vitamine B.
30
1.7. Bibliographie
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35
Chapitre 2
Effects of Family Forage on Apparent Ruminal Synthesis
of B-vitamins in Lactating Dairy Cows
Ce chapitre sera soumis pour publication dans le Journal of Dairy Science sous la référence de M. Seck, J. A. Voelker Linton, M. S. Allen, P. Y. Chouinard, and C. L. Girard. 2012.
Effects of family forage on Apparent Ruminal Synthesis of B-vitamins in Lactating Dairy Cows
36
2.1. Abstract
Effects of forage family on apparent ruminal synthesis and post-ruminal supply of B-vitamins
were evaluated using 8 lactating Holstein cows (DIM ± 83) fitted with ruminal and duodenal
cannulas. The experiment was a cross-over design with a 14-d preliminary period when cows were
fed a diet intermediate in composition with the treatment diets and two 15-d treatment periods. The
two treatment diets were formulated for 23% NDF and contained either alfalfa (AL, 43% NDF) or
orchardgrass (OG, 48% NDF) silage as the sole forage. B-vitamins analyzed were thiamin,
riboflavin, niacin, vitamin B6 and vitamin B12. Apparent ruminal synthesis was calculated as the
duodenal flow of each vitamin minus intake. Forages were the main sources of niacin and riboflavin
whereas cereals were the main sources of thiamin. Vitamin B6 was equally present in forages and
cereals whereas there was no vitamin B12 in the diets. Intakes of thiamin and riboflavin were greater
for OG than AL whereas the opposite was observed for niacin and vitamin B6 intakes. When
averaged across diets, the greatest amounts of B-vitamins synthesized in rumen were, in decreasing
order, niacin, riboflavin, thiamin, vitamin B12, and vitamin B6. Compared with AL, OG diet
increased ruminal syntheses of all the studied B-vitamins except vitamin B12 which was not
affected. Moreover apparent ruminal syntheses of thiamin, niacin and vitamin B6 were negative
with AL diet whereas they were positive with OG diet. In dairy cows, B-vitamin supply was greater
with OG silage-based diet than with AL silage-based diet.
2.2. Résumé
Les effets du type de fourrage sur la synthèse ruminale apparente de vitamines B ont été
évalués en utilisant 8 vaches Holstein (JEL 139±83) équipées de canules ruminale et duodénale. Le
plan expérimental était un chassé-croisé avec une période préliminaire de 14 jours pendant laquelle
les vaches étaient nourries avec une ration dont la composition était intermédiaire entre les 2 rations
à être utilisées dans les 2 périodes de traitements de 15 jours chacune. Les 2 traitements étaient des
rations formulées pour contenir 23% de fibres au détergent neutre (NDF) et à base soit de luzerne
(AL, 43% NDF) soit de dactyle (OG, 48%) comme unique fourrage. Les vitamines B analysées
étaient la thiamine, la riboflavine, la niacine, la vitamine B6 et la vitamine B12. La synthèse ruminale
apparente était calculée en soustrayant la consommation journalière de vitamines du flux duodénal.
Les fourrages étaient les principales sources de niacine et de riboflavine tandis que les céréales
37
étaient les principales sources de thiamine. La teneur en vitamine B6 était similaire entre fourrages
et céréales, alors que la vitamine B12 était indétectable dans les ingrédients.
Les consommations de thiamine et de riboflavine étaient supérieures pour OG en comparaison
de AL, alors que l’effet inverse était noté pour les consommations de niacine et de vitamine B6. En
considérant la moyenne de toutes les rations, les plus grandes quantités de vitamines synthétisées
sont respectivement la niacine, la riboflavine, la thiamine, la vitamine B12 et la vitamine B6. La
ration OG, en comparaison de la ration AL, augmentait les synthèses ruminales de toutes les
vitamines B étudiées, à l’exception de la vitamine B12 qui n’était pas affectée par les traitements.
Par ailleurs, les synthèses ruminales de thiamine, niacine et vitamine B6 étaient négatives pour la
ration AL et positives pour la ration OG. Chez la vache laitière, la synthèse ruminale de vitamines B
était meilleure pour une ration à base d’ensilage de dactyle qu’avec une ration à base de luzerne.
2.3. Introduction
In the last years, there was a renewed interest for research on B-vitamin requirements of dairy
cows. Indeed, most studies in this field, conducted more than half a century ago, concluded that
mature ruminants with a functional rumen did not require B-vitamin supplements because the
amounts of vitamins provided by the diet or synthesized by rumen microorganisms were sufficient
to avoid deficiency (Kon and Porter, 1954). Nevertheless, Weiss and Ferreira (2006) reported that
during a 15 year period, from 1990 to 2005, yields of milk and milk components (and consequently
nutrient demand) increased by about 33% while DMI increased only by approximately 15%.
Because B-vitamin supplements are not commonly used for dairy cows, B-vitamin supply is mostly
a function of intake from specific feed ingredients and their effects on ruminal fermentation which
affect microbial synthesis; whereas the cow needs is mostly related to milk production and
gestation. The potential imbalance between supply and need in today’s high-producing cows
increases the likelihood that responses will be observed when cows are supplemented with B-
vitamins. This was supported by studies reporting beneficial effects of dietary supplementations of
thiamin (Shaver and Bal, 2000), niacin (Schwab et al., 2005), biotin (Chen et al., 2011; Lean and
Rabiee, 2011) and folic acid (Girard and Matte, 1998), although some studies observed no effect of
vitamin supplements (Girard et al., 2005; Rosendo, 2004). Moreover, B-vitamin supplementation
faces two disadvantages: extensive intraruminal degradation of dietary supplements (68% for
thiamin, 99% for riboflavin, 70% for folic acid and 80% for vitamin B12; Santschi et al., 2005b),
38
and the cost related to a surplus of workmanship in a case of intramuscular injections. A better
understanding of dietary factors involved in ruminal synthesis of B-vitamins in dairy cows could help
to provide an alternative and/or a complement to supplementation. Various authors have studied the
effects of dietary factors such as forage-to-concentrate ratio or grain processing on B-vitamin
ruminal synthesis (Conrad and Hibbs, 1954; Hayes et al., 1966; Breves et al., 1981; Abel et al.,
2001), but to our knowledge no data is available on the effects of forage species. The objective of
the present study was to evaluate the effect of forage family (legume or grass) on B-vitamin supply
and apparent ruminal synthesis in dairy cows.
2.4. Materials and methods
2.4.1. Animals and treatments
In summary, the study was conducted at Michigan State University following approval by the
All University Committee on Animal Use and Care. Prior to calving, 8 multiparous Holstein cows
were equipped with rumen and duodenal cannulas, and housed in tie-stalls. Cows were assigned
randomly to treatment sequence in a crossover design with a 14-d preliminary period followed by
two 15-d treatment periods. At the beginning of the preliminary period, the cows were 139 ± 83
(mean ± SD) DIM, and DMI was 18.6 ± 2.8 kg/d.
The two treatments were diets containing either alfalfa (Medicago sativa L.) silage harvested
at early bud stage (AL) or orchardgrass (Dactylis glomerata L.) silage harvested at early boot stage
(OG) as sole forage (Table 2.1). The forage-to-concentrate ratios were 53:47 and 48:52 for AL and
OG, respectively. Except for silages, the same ingredients were used in preliminary and treatments
diets. The diet served during the preliminary period was formulated so that AL and OG each
provided 50% of forage NDF. Cows were fed ad libitum a TMR served once daily (11h00).
2.4.2. Sample and data collection
Individual feed intake was recorded daily. From d 11 to d 13 of each period, samples of each
dietary ingredient and orts were collected daily and mixed into a sample per period. Duodenal
samples (1000 g each) were collected every 9 h during these 3 d. All samples were stored at –20°C.
39
2.4.3. Laboratory Analyses
Frozen duodenal samples were chopped finely using a commercial food processor and a
representative subsample was lyophilized. Dietary ingredients and orts samples were dried in a 55
°C forced-air oven for 72 h. All samples were ground with a Wiley mill (1-mm screen, Arthur H.
Thomas, Philadelphia, PA). Samples were analyzed for DM, ash, NDF, indigestible NDF and starch
as described by Voelker Linton and Allen (2008).
Concentration of B-vitamins in feed, orts and duodenal digesta were analyzed at the Dairy
and Swine Research and Development Centre (Sherbrooke, Québec, Canada). Thiamin, riboflavin,
niacin and vitamin B6 were analyzed on HPLC (Varian Prostar, Lake Forest, CA) with a solvent
delivery system (model 210), an autosampler (model 410) and a fluorescence detection system
(model 363).
2.4.3.1. Thiamin
Samples were analyzed according to a method adapted from Bötticher and Bötticher (1986),
and described by Santschi et al. (2005b). Standard curves were prepared as followed: a standard
solution was prepared by dissolving 0.0337 g of thiamin (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) in
1 mL of H2SO4 (0.01 M; Fischer Scientific, Ottawa, ON, Canada) and the volume was completed to
100 mL with ultrapure water. Then, 400 µL of the solution was diluted in 1600 µL of sulphuric acid
0.1 M to obtain an initial concentration of 200 µM of thiamin which was used to obtain a 7-levels
standard curve (0.3 to 7.5 µM). All samples were analyzed in duplicates, and a coefficient of
variation of less than 10% was accepted between duplicates.
2.4.3.2. Riboflavin
Riboflavin concentrations were determined according to a method developed by Giguère et al.
(2002). Initial solutions (2656.75 µM) of riboflavin and flavin-adenine dinucleotide (Sigma-
Aldrich) were used to obtain 6 concentrations (5.31 to 53.13 µM) in the standard curves. A sample
of 200 mg was acidified with 20 mL of HCl 0.1 M (Fischer Scientific) in borosilicate tubes then
autoclaved (20 min, Iso mode, 121 oC). After cooling, the volume was completed to 40 mL with
ultrapure water, and 2 mL were transferred in borosilicate tubes for centrifugation at 704 x g for 5
40
min. A volume of 500 µL of supernatant was then combined with 200 µL of 15% perchloric acid
(Fischer Scientific) to precipitate the protein and the mixture was boiled for 10 min. After
centrifugation at 704 x g for 10 min, 400 µL of supernatant was combined with 200 µL of sodium
acetate 4.0 M and 25 µL of 2% acid phosphatase (Sigma-Aldrich, 20 mg per mL of ammonium
acetate buffer at pH 4.0) in 1.5 mL eppendorf tubes. Following incubation in water bath for 18 h at
37 °C to convert flavin-adenine dinucleotide into riboflavin, samples were centrifuged at 13226 x g
for 10 min, then injected into HPLC as described by Santschi et al. (2005b). A coefficient of
variation of less than 10% was accepted between duplicates.
2.4.3.3. Niacin
The two forms of niacin, nicotinic acid (NA) and nicotinamide (NAM), were analyzed.
Concentrations in samples were determined by HPLC with fluorometric detection based on
adaptation of methods of Mawatari et al. (1991), Lahély et al. (1999) and Ndaw et al. (2002)
described by Santschi et al. (2005b). Standard solutions were prepared by dissolving 0.01 g of NA
and NAM (Sigma-Aldrich) in 100 mL of ultrapure water. Six concentrations of NA (20.30 to
203.70 µM) and NAM (5.16 to 100.00 µM) were then used in the standard curves. All samples
were analyzed in duplicates and a coefficient of variation of less than 10% was accepted.
2.4.3.4. Vitamin B6
The three forms of vitamin B6, pyridoxamine (PAM), pyridoxal (PAL) and pyridoxine
(PYR) were determined by adaptation of methods described by Srivastava and Beutler (1973) and
Matte et al. (1997), and reported by Santschi et al. (2005b). Four stock solutions (Sigma-Aldrich) of
PAM, PAL, PYR and pyridoxal-5-phosphate (P5P), the latter being converted to PAL for analysis,
were diluted to one-tenth to obtain standard solutions with concentrations of 210.50, 247.33, 248.80
and 203.10 µM respectively. These solutions were used to prepare standard curves with 5
concentrations of each form of the vitamin (0.25 to 3.00 µg/mL). All samples were analyzed in
duplicates. Although concentrations of some forms of the vitamin were close to the level of
detection, only a coefficient of variation of 10% or less was accepted.
41
2.4.3.5. Vitamin B12
The method of extraction was adapted from AOAC (1990; method 952.20) using the
following extractive solution: 13 g of Na2HPO4, 12 g of citric acid (Sigma-Aldrich) and 10 g of
sodium metabisulfite (Fischer Scientific) in 1 L of ultrapure water. A sample of 100 mg was
hydrolyzed with 24 mL of extractive solution and 150 µL of NaCN 1M (Baker Chemical, Mumbai,
India) was added before autoclaving at 100°C for 10 min. Following cooling at room temperature,
NaOH 3.3 N (Fischer Scientific) was added to bring the pH to approximately 6.2 to 6.5 and the final
volume was completed to 30 mL with ultrapure water. After centrifugation at 1509 x g during 10
min, 200 µL of supernatant were used to determine the concentration of the biologically active form
of vitamin B12 using a commercial kit (Simultrac B12/Folates-S, MP Biomedicals, Solon, OH). All
samples were analyzed in duplicates and a coefficient of variation of less than 10% was accepted.
2.4.4. Calculations and Statistical Analyses
B-vitamin concentrations in the TMR were the summation of B-vitamin concentration of each
ingredient multiplied by the proportion of this ingredient in the TMR, on a DM basis. Daily intakes
(DI) of each vitamin were calculated as the concentration of each vitamin in the TMR multiplied by
the amount of TMR served, on a DM basis minus the concentration of each vitamin in orts
multiplied by the quantity of orts, on a DM basis. Calculations of dry matter duodenal flow were
described by Voelker Linton and Allen (2008). Duodenal flow (DF) of vitamins was calculated as
B-vitamin concentrations in duodenal sample multiplied by the daily dry matter flowing through the
duodenum. Apparent ruminal synthesis (ARS) was calculated as duodenal flow minus the daily
intake. Total niacin DI, DF and ARS were calculated as the sum of nicotinic acid and nicotinamide
for these variables. Total vitamin B6 DI, DF and ARS were calculated as the sum of pyridoxamine,
pyridoxal and pyridoxine for these variables.
Daily intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis for each vitamin, expressed in
milligram per day or milligram per kg of DMI, were analyzed using SAS (1999) mixed model in
which periods and treatments were analyzed as fixed effects and cows as random effect. Differences
were declared significant at P < 0.05 and as a tendency at 0.05 ≤ P ≤ 0.1.
42
2.5. Results and discussion
Animal performance was presented and discussed previously (Voelker Linton and Allen,
2008). In particular, DMI was 20.9 and 20.0 (SE 1.2) kg/d for AL and OG, respectively (P = 0.25).
Concentrations of B-vitamins in ingredients used in the experimental diets are presented in Table
2.2. Daily intakes, DF and ARS of B-vitamins expressed in milligram per day are presented in
Table 2.3. In Table 2.4 the variables are expressed in milligram per kg of DMI to allow
comparisons between treatments independently from DMI differences. Consequently, in the latter,
daily intakes of B-vitamins depend mostly on the vitamin concentrations in the ingredients, and
their relative proportions in the experimental diets. Differences between intakes and B-vitamin
dietary concentrations were due to B-vitamin concentrations in orts.
The calculation of ARS of B-vitamins does not allow evaluating the confounded effects of
microbial use, ruminal degradation and potential absorption of B-vitamins across the rumen wall.
There is a lack of information on the extent of microbial use and degradation of B-vitamins in
rumen but some studies have shown that ruminal absorption is negligible. According to Girard et al.
(2001), only 0.015% of folic acid and 4×10-6
% of vitamin B12 were absorbed across the rumen wall
during the hour following ruminal infusion of a vitamin solution. Hoeller et al. (1977) demonstrated
impermeability of the rumen wall to thiamin under in vitro conditions. Moreover, according to
Rérat et al. (1959), B-vitamins are mostly sequestered within bacteria and consequently not
available for absorption across the rumen wall. This observation is supported by findings from
Santschi et al. (2005a) reporting that B-vitamin concentrations are up to 5000-fold higher in
bacteria than in particle-free supernatant. Apparent ruminal synthesis probably underestimates the
amounts of vitamin synthesized by ruminal microflora. Nevertheless this calculated parameter
allows comparisons among treatments and estimation of the relative importance of ruminal
microflora for vitamin supply.
2.5.1. Thiamin
Among the ingredients used in the two studied diets, dry corn grain, soybean meal and
SoyPlus®, a heat-processed soybean meal, showed the highest concentrations of thiamin. Thiamin
concentration in SoyPlus® represented only 60% of the concentration in soybean meal.
Orchardgrass silage had very low levels of the vitamin whereas the level in alfalfa silage was under
43
the detection limit. Similarly, Schwab et al. (2006) also observed that soybean meal, corn and
barley had high concentrations of thiamin but in contrast to alfalfa silage, alfalfa hay provided 1.9
mg of thiamin per kg of DM. Average thiamin concentration for the studied diets was 1.24 mg/kg
DM, which is lower than concentrations reported by Santschi et al. (2005a, b) and Schwab et al.
(2006), ranging from 1.50 to 2.64 mg/kg of DM.
Using orchardgrass silage as main forage instead of alfalfa silage increased (P < 0.01)
thiamin intake (Tables 2.3 and 2.4). This difference reflects the fact that orchardgrass silage used in
a proportion of 48% in the OG diet provided 0.32 mg of thiamin/kg of DM while alfalfa silage used
in a proportion of 53% in AL diet did not provide a significant amount of the vitamin. Duodenal
flow of thiamin was increased by 137 and 146% with OG diet as compared to AL when reported in
g/d or g/kg of DMI, respectively (Tables 2.3 and 2.4). For AL diet, the amount of thiamin flowing
to the duodenum was less than the daily intake, suggesting that the ruminal microflora synthesized
less or degraded more thiamin when AL was used as main forage rather than OG. Apparent ruminal
synthesis of thiamin varied from -0.07 to 1.07 mg/kg DMI for AL and OG, respectively. The latter
is similar to the value calculated from Santschi et al. (2005b; 1.3 mg/kg DMI) but both values were
much lower than the averages calculated from Schwab et al. (2006; 2.5 mg/kg DMI) and Breves et
al. (1981; 3.6 mg/kg DMI).
Thiamin ARS (mg/d) tended to be correlated negatively (r = -0.46, P = 0.07; Table 2.5)
with OM digestibility (kg/d), in opposition with the positive correlation reported by Schwab et al.
(2006). Unlike the present study, these authors also reported a positive correlation between thiamin
ARS and microbial flow of N.
2.5.2. Riboflavin
Riboflavin concentration in OG diet was slightly higher than in AL diet (Table 2.1),
reflecting mainly the differences between OG (18.1 mg/kg DM) and AL silages (14.3 mg /kg DM).
In contrast to thiamin, forages were the main sources of riboflavin in the present study (Table 2).
Schwab et al. (2006) reported that riboflavin concentrations were high in alfalfa and grass hays but
rather low in corn silage. Dietary concentrations of riboflavin in our study varied from 8.7 to 9.9
mg/kg DM and were higher than the values reported by Santschi et al. (2005a, b) and Schwab et al.
(2006), ranging from 4.3 to 6.7 mg/kg of DM using diets in which hay and grass provided between
17.5 to 43.6% of the diets, on a DM basis. Proportionally, the same difference was observed
44
between the average daily riboflavin intake reported by these authors (123.0 mg/d) and ours (202.7
± 11.2 mg/d).
Diet based on OG tended (P = 0.06) to increase riboflavin intake expressed in mg/d (Table
2.3) and increased (P < 0.0001) that variable when expressed as mg/kg DMI (Table 4). Compared
with AL diet, OG diet increased (P = 0.03) both duodenal flow and ruminal synthesis expressed as
mg/d or mg/kg DMI (Tables 2.3 and 2.4). Reported in g/d or mg/kg of DMI, duodenal flow of
riboflavin with AL was lower whereas with OG, it was similar to values reported by Santschi et al.
(2005b; 361 mg/d or 18.2 mg/kg DMI) and Schwab et al. (2006; ranging from 317 to 363 mg/d, or
from 15.8 to 18.3 mg/kg DMI). On the other hand, ARS of riboflavin, even with OG (136 mg/d or
7.1 mg/kg DMI), was quite lower than the values reported by Schwab et al. (2006; from 206 to 246
mg/d or 11.4 to 12.4 mg/kg DMI) and Santschi et al. (2005b; 267 mg/d or 13.5 mg/kg DMI).
There was no significant correlation with fermentation parameters, except for OM digested,
expressed in kg/d, which tended (r = - 0.47, P = 0.07) to be correlated negatively with riboflavin
ARS. In opposition, Schwab et al. (2006) reported positive correlations with OM digested, starch
ruminally digested and microbial flow of N.
2.5.3. Niacin
Niacin is by far the B-vitamin with the highest concentration in the diets. Nevertheless,
huge differences among diets exist as reported by Santschi et al., (2005a, b; 23 to 26 mg/kg DM)
and Schwab et al. (2006; 30 to 95 mg/kg DM). In the present study daily intake of niacin with AL
diet was 3-fold greater compared to OG diet (P < 0.01; Table 2.3). This difference was mainly due
to the use of AL silage, which had the highest niacin concentration (201 mg/kg DM) among the
ingredients used in the studied diets (Table 2.2). By contrast, Schwab et al. (2006) reported much
lower niacin concentration in alfalfa hay (34 mg/kg DM). Similarly, daily intake of niacin reported
in the literature varied widely from 471 to 2019 mg/d (Santschi et al., 2005b; Schwab et al., 2006).
Based on values reported in Schwab et al. (2006) and the present study, NA concentrations are
higher than NAM in most ingredients, except for soybean hulls and soybean meal in which NAM
was the major form (Schwab et al. 2006). Total niacin concentration was higher for SoyPlus® than
soybean meal and the ratio NAM: NA was 2:1 for soybean meal but 1:5 in SoyPlus® (Table 2.2).
However, the relative proportions of the two forms should be interpreted with caution because
conversion of a portion of NAM into NA under acidic conditions during extraction procedures
45
before HPLC determination has been reported (Ndaw et al., 2002). Lower values for NAM
compared to NA were also observed for duodenal flow and ruminal synthesis in the present study.
However, interconversion of the two forms under the action of ruminal microflora has also been
reported (Harmeyer and Kollenkirchen, 1989; Erickson et al., 1991).
As for intake, DF and ARS of niacin were much greater than for any other B-vitamins and
highly variable among diets. Indeed in the present study, DF and ARS, reported per d or kg of DMI,
were respectively 50 and 300% higher with OG than AL diets (Tables 2.3 and 2.4). When AL silage
was used rather than OG, niacin DF was decreased (P < 0.01) by 806 mg/d while the niacin ARS
value was negative (-760 vs. 1627 ± 142 mg/d, P < 0.0001), reflecting less synthesis or more
degradation or both in the rumen. Using grass-legume and corn silages as forages, Santschi et al.
(2005b) reported niacin DF and ARS of 2777 mg/d or 140 mg/kg DM and 2213 mg/d or 112 mg/kg
DM, respectively. Such values are similar to those observed when feeding OG diets. Nevertheless,
with diets using corn silage, alfalfa and grass hays, Schwab et al. (2006) observed niacin DF
varying from 1908 to 2874 mg/d (99 to 1129 mg/kg DMI) and ARS, from 446 to 1386 mg/d (21 to
70 mg/kg DMI).
Mean ruminal pH was correlated negatively (P < 0.01) with niacin ARS (Table 2.5). That
was consistent with the effects of experimental diets on ruminal pH reported by Voelker Linton and
Allen (2009): pH was lower for OG diet (6.00 vs. 6.27) while niacin ARS was higher (1627 vs. –
760 ± 142 mg/d). In contrast Schwab et al. (2006) observed no correlation between ruminal pH and
ARS of niacin. Moreover, unlike the present study, these authors reported positive correlations with
starch ruminally digested and microbial flow of N.
2.5.4. Vitamin B6
In our study, PYR was the predominant form in the diets and constituted in average 50% of
the dietary vitamin B6 concentration. This was consistent with the relative proportions of 51% and
68% reported by Schwab et al. (2006) and Sanschi et al. (2005a), respectively. The comparison with
the dietary ingredients used in the study of Schwab et al. (2006) confirmed that PYR was the
predominant form in hays and silages while PAM was the predominant form in corn and soy
products (Table 2.2). As observed with thiamin, vitamin B6 concentration was 60% lower in
SoyPlus® than in soybean meal. Contrary to what was observed with the other studied B-vitamins,
there was no net difference between forages and cereals in vitamin B6 concentrations. Vitamin B6
46
was higher in AL diet, reflecting higher concentration in AL silage compared to OG (Tables 2.1 and
2.2). The average dietary concentration of vitamin B6 (3.2 mg/kg DM) was equal to the level
reported by Schwab et al. (2006) but at least twice lower than the values reported in the studies of
Santschi et al. (2005a, b), ranging from 6.7 to 8.5 mg/kg DM). Similarly, the vitamin B6 intake (68
± 3.8 mg/d) was almost equal or much lower than the 64.5 and 171.5 mg/d reported by these
authors, respectively.
As for niacin, AL diet compared to OG diet increased (P < 0.0001) vitamin B6 intake, due
to greater vitamin B6 concentration in AL compared to OG silage (Table 2.2). With AL diet,
whereas PYR represented 58% of total vitamin B6 daily intake, it was only 20% of the total vitamin
B6 in duodenal flow; PAL duodenal flow was also proportionally less than the intake. So there was
no apparent ruminal synthesis of these forms, unlike PAM, which represented 20% of the intake but
60% of the total duodenal flow. In cows fed AL diet, total vitamin B6 ARS was however negative,
similar to the results of Sanschi and al. (2005a) who reported positive values of PAM (51 ± 4 mg/d)
and PAL (24 ± 6 mg/d) ARS while PYR (-94 ± 6 mg/d) and total B6 (-14 ± 6mg/d) ARS were
negative. With OG diet, ARS of the 3 forms as well as total vitamin B6 were positive, in accordance
with Zinn et al. (1987) and Schwab et al. (2006) who reported positive values of total vitamin B6
ARS. The latter observed that, like for AL diet, PYR was the major form of vitamin B6 intake while
PAM constituted the major form recovered at the duodenal level. This led to the hypothesis that
PYR may have been converted into PAM in rumen (Schwab et al., 2006), as supported by the
observation that although representing 60% of total vitamin B6 in the diets, PYR account for less
than 5% in the ruminal bacterial fractions (Santschi et al., 2005a).
Orchardgrass silage used as main forage rather than AL increased (P = 0.03) vitamin B6
DF. The effects on ruminal synthesis were so different between the two diets that vitamin B6 ARS
was negative (-32.3 ± 8.8 mg/d) for AL diet and positive (24.9 ± 8.8 mg/d) for OG (P = 0.006).
Vitamin B6 ARS tended to be correlated positively (P = 0.06) with microbial flow of N and intake.
In opposition, Schwab et al. (2006) reported no correlation with microbial flow of N but a positive
tendency (P < 0.1) of vitamin B6 ARS with starch ruminally digested.
2.5.5. Vitamin B12
Vitamin B12 dietary concentrations were under the level of detection of the method used.
This was consistent with the findings of Santschi et (2005b) and Schwab et al. (2006) who reported
47
average B12 dietary concentrations of 0.01 and 0.02 mg/kg DM, respectively. As a result, vitamin
B12 intake was null, and ARS equal to DF. Daily ARS averaged 10.4 ± 0.8 mg, much less than the
79.8 and 73 mg reported by the authors cited above. Family forage did not affect (P = 0.7) vitamin
B12 apparent ruminal synthesis.
2.6. Conclusions
Legume-based and grass-based diets affected B-vitamin intakes, DF and ARS. Globally, B-
vitamin dietary concentrations and intakes were higher for niacin, followed by riboflavin, vitamin
B6 and thiamin. Vitamin B12 was not detected in diets. Intakes of thiamin and riboflavin were higher
with OG diet while intakes of niacin and vitamin B6 were higher with AL diet.
When averaged across diets, amounts of B-vitamins ruminally synthesized are, in
descending order, niacin, riboflavin, vitamin B12, thiamin and vitamin B6. However the average
ARS masked the fact that there was no apparent ruminal synthesis of thiamin, niacin and vitamin B6
when alfalfa silage was used as sole forage. Duodenal flows and ruminal synthesis of all the studied
B-vitamins at the exception of vitamin B12 which was not affected by the type of forage, increased
with OG diet compared to AL diet. The main differences in ruminal functions between those two
diets were a higher digestibility of NDF (Voelker Linton et al., 2008), and lower rumen pH and N
digestion (Voelker Linton et al., 2009) with OG as compared with AL. However, none of those
parameters was highly correlated with ARS of B-vitamins, except for the negative correlation
between ruminal pH and ARS of niacin.
Forages from different families altered rumen fermentation in different ways, especially
ruminal pH and N digestion, affecting probably microbial population and, as a consequence, B-
vitamin ruminal synthesis and supply to dairy cows.
2.7. Acknowledgements
The authors thank Véronique Roy and Chrystiane Plante (AAFC, Sherbrooke, QC, Canada)
for their technical support. This study was financially supported by the Coop Fédérée (Montréal,
QC, Canada) and the Dairy Farmers of Canada (Ottawa, ON, Canada).
48
2.8. References
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52
Table 2.1. Ingredients, nutrient composition and B-vitamins concentrations of the two treatment diets containing alfalfa silage (AL) or orchargrass silage (OG) as sole forage
AL OG Ingredient, % DM
Alfalfa silage1
53.0 Orchardgrass silage
2 47.9
Dry ground corn 36.3 40.3 Soybean meal (48% CP) 6.5 7.0 Vitamin mineral mix
3 4.2 4.2
SoyPlus4 1.3 1.3
Bloodmeal 0.3 0.9 Limestome 0.4 Urea 0.2
Nutrient DM,% as fed 43.6 50.6 OM,% of DM 91.5 91.5 NDF,% of DM 26.7 27.5 Forage NDF,% of DM 22.5 23.0 Indigestible NDF,% of DM 14.8 7.9 Potentially digestible NDF,% of DM
11.9 19.7
Starch,% of DM 30.2 32.1 CP,% of DM 18.3 18.8
Rumen-undegraded CP
5,% of
DM 5.6 6.3
Co6, mg/kg of DM 0.93 0.93
B-vitamin concentrations, mg/kg of DM Thiamin, mg/kg of DM 1.11 1.37 Riboflavin, mg/kg of DM 8.70 9.88 Total niacin, mg/kg of DM 111.62 42.36
Nicotinic acid, mg/kg of DM 102.1 35.95 Nicotinamide, mg/kg of DM 9.53 6.41
Total vitamin B6, mg/kg of DM 3.57 2.75 Pyridoxamine, mg/kg of DM 0.73 0.66 Pyridoxal, mg/kg of DM 0.78 0.98 Pyridoxine, mg/kg of DM 2.05 1.11
Vitamin B12, mg/kg of DM 0.00 0.00 1DM, as fed 30.6%; OM 88.7% DM; NDF, 42.6% DM; iNDF, 25.2% DM; potentially digestible
NDF, 17.4%; starch, 4.0% DM, CP, 20.5% DM. 2DM, as fed 35.3%; OM 89.2% DM; NDF, 48.0% DM; iNDF, 13.1% DM; potentially digestible
NDF, 34.9%; starch, 2.3% DM, CP, 20.4% DM. 3Vitamin mineral mix contained, on a DM basis, 11.7% dicalcium phosphate, 11.1% trace-mineral
premix, 8.8% sodium bicarbonate, 2.3% magnesium oxide, 134.3 IU/kg of vitamin A, 35.53 kIU/kg of vitamin D, 895.5 kIU/kg of vitamin E, and 65.2% ground corn grain as a carrier. 4West Central Soy, Ralston, IA. Nutrient composition: 85% DM, 7% ash, 16% NDF, 5% starch,
49% CP. 5Calculated according to NRC (2001) model.
6Provided by the vitamin mineral premix
53
Table 2.2. B-vitamin concentrations (mg/kg DM) of ingredients used in the experimental diets Orchardgrass
silage Alfalfa silage
Corn, dry ground
Soybean meal
SoyPlus®, Blood
meal Thiamin 0.32 0 2.73 2.13 1.27 0
Riboflavin 18.10 14.31 2.30 4.70 4.61 2.51
Niacin
1
NA 67.21 186.19 6.40 8.80 40.21 18.01 NAM 10.11 14.60 1.81 19.80 8.09 11.40 Total 77.40 200.81 8.19 28.71 48.30 29.41
Vitamin B6
2
PAM 0.19 0.39 1.13 2.10 0.87 0 PAL 0.28 0.03 1.91 1.31 0.41 0.23 PYR 2.27 3.81 0.02 0.11 0.21 0 Total 2.70 4.29 3.10 3.50 1.50 0.23
Vitamin B12 0 0 0 0 0 0 1NA: nicotinic acid; NAM: nicotinamide; total: summation NA and NAM.
2PAM: pyridoxamine; PAL: pyridoxal; PYR: pyridoxine; total: summation PAM, PAL and PYR.
54
Table 2.3. Intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis of B-vitamins (expressed as mg/d) in responses to diets based on alfalfa (AL) or orchardgrass (OG) silages (LSMeans)
Treatment1
AL OG SEM
2 P Values
Thiamin Intake 21.9 26.8 1.67 0.005 Duodenal flow 19.7 46.7 3.80 0.004 ARS
3 -2.2 19.9 4.54 0.01
Riboflavin
Intake 193.2 212.2 11.27 0.06 Duodenal flow 242.7 347.9 22.93 0.02 ARS 49.4 135.7 24.66 0.03
Niacin
4
NA
Intake 2257.6 757.0 73.40 <0.0001 Duodenal flow 1072.3 1583.8 169.29 0.0007 ARS -1184.9 826.8 143.13 <0.0001
NAM Intake 193.2 212.2 11.27 0.06 Duodenal flow 629.5 924.1 74.33 0.007 ARS 425.7 800.0 73.43 0.002
Total Intake 2461.5 881.0 81.19 <0.0001 Duodenal flow 1701.8 2507.9 175.04 0.0003 ARS -759.7 1626.9 142.07 <0.0001
Vitamin B6
5
PAM Intake 16.0 13.6 0.83 0.0005 Duodenal flow 28.0 34.2 4.25 0.20 ARS 12.0 20.6 3.66 0.10
PAL Intake 17.3 21.3 1.06 0.005 Duodenal flow 9.1 23.9 3.67 0.01 ARS -8.2 2.5 2.92 0.04
PYR Intake 45.4 22.4 2.01 <0.0001 Duodenal flow 9.3 24.2 3.71 0.01 AS -36.1 1.7 2.85 <0.0001
Total Intake 78.7 57.4 3.80 <0.0001 Duodenal flow 46.4 82.3 11.34 0.03 ARS -32.3 24.9 8.84 0.006
Vitamin B12
Intake 0 0 0 Duodenal flow 10.1 10.6 0.82 0.7
55
ARS 10.1 10.6 0.82 0.7 1Treatments: AL = alfalfa silage; OG = orchardgrass silage.
2SEM = standard error of the mean.
3ARS = apparent ruminal synthesis.
4NA: nicotinic acid; NAM: nicotinamide; total: summation NA and NAM.
5PAM: pyridoxamine; PAL: pyridoxal; PYR: pyridoxine; total: summation PAM, PAL and PYR.
56
Table 2.4. Intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis of B-vitamins (expressed as mg/kg DMI) in responses to diets based on alfalfa (AL) or orchardgrass (OG) silages (LSMeans)
Treatment1
AL OG SEM2
P Values
Thiamin Intake 1.05 1.34 0.016 <0.0001 Duodenal flow 0.98 2.41 0.240 0.003 ARS
3 -0.07 1.07 0.240 0.009
Riboflavin
Intake 9.27 10.64 0.095 <0.0001 Duodenal flow 11.87 17.74 1.367 0.009 ARS 2.61 7.11 1.344 0.03
Niacin
4
NA Intake 114.29 43.16 1.535 <0.0001 Duodenal flow 51.06 79.14 7.186 0.01 ARS -63.22 35.98 7.689 <0.0001
NAM Intake 9.73 6.23 0.154 <0.0001 Duodenal flow 30.71 47.68 4.776 0.01 ARS 20.98 41.45 4.772 0.005
Total Intake 124.02 49.39 1.545 <0.0001 Duodenal flow 81.77 126.82 7.645 0.004 ARS -42.25 77.25 8.145 <0.0001
Vitamin B6
5
PAM Intake 0.76 0.68 0.007 <0.0001 Duodenal flow 1.33 1.69 0.135 0.08 ARS 0.57 1.01 0.133 0.04
PAL Intake 0.83 1.071 0.013 <0.0001 Duodenal flow 0.43 1.16 0.132 0.003 ARS -0.40 0.086 0.138 0.02
PYR Intake 2.16 1.12 0.019 <0.0001 Duodenal flow 0.43 1.17 0.133 0.003 ARS -1.73 0.05 0.136 <0.0001
Total Intake 3.75 2.87 0.020 <0.0001 Duodenal flow 2.19 4.02 0.381 0.008 ARS -1.56 1.15 0.385 0.001
Vitamin B12
Intake ND ND Duodenal flow 0.47 0.54 0.043 0.35
57
ARS 0.47 0.54 0.043 0.35 1Treatments: AL = alfalfa silage; OG = orchardgrass silage.
2SEM = standard error of the mean.
3ARS = apparent ruminal synthesis.
4NA = nicotinic acid; NAM = nicotinamide; Total = summation of nicotinic acid and nicotinamide.
5PAM = pyridoxamine; PAL = pyridoxal; PYR = pyridoxine; Total = summation of pyridoxamine,
pyridoxal and pyridoxine.
58
Table 2.5. Pearson correlations coefficients between apparent ruminal synthesis, dry matter intake and ruminal fermentation parameters
Thiamin Riboflavin Niacin Vitamin B6 r P r P r P r P
Intake 0.03 0.9 0.06 0.82 -0.89 <0.0001 -0.48 0.06 Mean pH -0.34 0.2 -0.34 0.19 -0.76 0.0006 - 0.11 0.69 MN flow
1, g/d -0.09 0.73 0.14 0.61 0.17 0.53 0.48 0.06
TRDOM2,% -0.08 0.78 -0.17 0.52 - 0.14 0.6 - 0.26 0.33
TRDOM, kg/d -0.46 0.07 -0.47 0.07 - 0.24 0.38 0.14 0.6 TRDS
3, % -0.12 0.66 -0.15 0.57 - 0.24 0.38 - 0.23 0.39
TRDS, kg/d -0.31 0.25 -0.36 0.17 - 0.17 0.52 - 0.01 0.95 1MN
= microbial nitrogen.
2TRDOM
= true rumen degraded organic matter.
3TRDS
= true rumen degraded starch.
59
Chapitre 3
Effects of Forage-to-Concentrate Ratio on Apparent Ruminal Synthesis of B-vitamins
in Lactating Dairy Cows
Ce chapitre sera soumis pour publication dans le Journal of Dairy Science sous la référence de M. Seck, J. A. Voelker Linton, M. S. Allen, P. Y. Chouinard, and C. L. Girard. 2012.
Effects of Forage-to-Concentrate Ratio on Apparent Ruminal Synthesis of B-vitamins in Lactating Dairy Cows
60
3.1. Abstract
Effects of forage-to-concentrate ratio on apparent ruminal synthesis of thiamin, riboflavin,
niacin, vitamin B6 and vitamin B12 were evaluated in an experiment using 14 ruminally and
duodenally cannulated Holstein cows. The experiment was a cross-over design with two 15-d
treatment periods and a 14-d preliminary period in which cows were fed a diet intermediate in
composition between the treatment diets. Treatments were diets containing low-forage (LF; 44.8%
forage, 32.8% starch, 24.4% NDF) or high-forage (HF; 64.1% forage, 22.5% starch, 30.7% NDF)
concentrations. Apparent ruminal synthesis of each B-vitamin was calculated as the duodenal flow
minus the intake.
The high-forage diet had the highest concentrations of riboflavin, niacin and vitamin B6 while
the low-forage diet had the highest concentration of thiamin. There was no vitamin B12 in the diets.
Consequently, increasing dietary forage concentration increased intakes of riboflavin, niacin and
vitamin B6 but reduced thiamin intake.
Increasing dietary forage concentration reduced duodenal flows and apparent ruminal
synthesis of thiamin, and niacin, increased vitamin B6 ruminal degradation, but increased ruminal
synthesis of vitamin B12. Apparent ruminal syntheses of all the studied B-vitamins were correlated
positively with the starch digested, and in a lesser extent with the microbial N flow.
Dietary forage concentration affected B-vitamin intake, and possibly through an effect on
ruminal digestion of dietary starch, duodenal flows and ruminal syntheses of B-vitamins. In dairy
cows, thiamin, niacin and vitamin B6 ruminal syntheses are greater with a low-forage diet as
compared to a high-forage diet, contrary to vitamin B12.
3.2. Résumé
Les effets du rapport fourrage: concentrés sur la synthèse ruminale de thiamine, riboflavine,
niacine, vitamine B6 et vitamine B12 ont été évalués en utilisant 14 vaches Holstein équipées de
canules ruminale et duodénale. Le plan expérimental était un chassé-croisé avec une période
préliminaire de 14 jours pendant laquelle les vaches ont été nourries avec une ration dont la
61
composition était intermédiaire entre les rations à être utilisées dans les 2 périodes de traitements
de 15 jours chacune. Les 2 traitements étaient des rations à faible taux de fourrages (LF; 44.8%
fourrage, 32.8% amidon, 24.4% NDF) ou à fort taux de fourrages (HF; 64.1% fourrage, 22.5%
amidon, 30.7% NDF). La synthèse ruminale apparente de chaque vitamine B était calculée en
soustrayant la consommation journalière du flux duodénal.
La ration riche en fourrages (HF) était la plus concentrée en niacine, riboflavine et vitamine
B6 tandis que la ration pauvre en fourrages (LF) était plus concentrée en thiamine. La vitamine B12
était indétectable dans les rations. En conséquence, l’augmentation du taux de fourrages de la ration
se traduisait par une augmentation des consommations journalières de niacine, riboflavine et
vitamine B6, tandis que celle de thiamine était réduite.
L’augmentation du taux de fourrages de la ration réduisait les flux duodénaux et les synthèses
ruminales de thiamine et de niacine, augmentait la dégradation ruminale de la vitamine B6 et
augmentait la synthèse ruminale de vitamine B12. Les synthèses ruminales apparentes de toutes les
vitamines B étudiées étaient corrélées positivement avec l’amidon digéré, et dans une moindre
mesure avec le flux d’azote microbien.
Le taux de fourrages de la ration affectait la consommation journalière de vitamines B et
possiblement, via un effet sur la digestion ruminale de l’amidon, les synthèses ruminales des
vitamines B. Chez la vache laitière, les synthèses ruminales de thiamine, niacine et vitamine B6 sont
meilleures avec une ration pauvre en fourrages en comparaison d’une ration riche en fourrages ; on
observe cependant la situation contraire pour la vitamine B12.
3.3. Introduction
The relevance of the assertion that mature ruminants had no need for an exogenous supply of
B-vitamins has prevailed for decades. Synthesis by rumen microflora was indeed supposed to meet
the needs of the animals, and to prevent any symptoms of deficiency (NRC, 2001; McDowell,
2000). In the case of dairy cows, the dramatic increase in yields of milk and milk components over
the years, and the concomitant increase of nutritional requirements cast doubt over this assertion;
knowing that B-vitamins act as cofactor for the enzymes involved in the metabolism of
carbohydrates, lipids, proteins and nucleic acids.
62
This uncertainty increased interest for research on methods to optimize milk production by
ensuring an optimal supply of B-vitamins. Various studies on B-vitamin supplementation were then
conducted, some showing positive effects of supplementary thiamin (Shaver and Bal, 2000), niacin
(Schwab et al., 2005), biotin (Chen et al., 2011; Lean and Rabiee, 2011) and folic acid (Girard and
Matte, 1998), while others showed no effect (Elliot et al., 1979; Girard et al., 2005).
These contradictory findings led to the necessity of a better understanding of the factors,
particularly dietary ones involved in ruminal synthesis of B-vitamins in dairy cows in order to
define more accurately the need for supplementation. Effects of the forage-to-concentrate ratio on
B-vitamin ruminal synthesis had very early attracted the attention of several researchers (Hunt et al.,
1941, 1943, Conrad and Hibbs, 1954, Hayes et al., 1966, Sutton and Elliott, 1972, Girard et al.,
1994). However most studies were conducted on sheep and steers, and the methodology used
(measurement of B-vitamin concentrations in rumen content) provided only a qualitative evaluation
of the amounts of vitamins available for the animal. Therefore, the objective of the present study
was to determine the effects of dietary forage-to-concentrate ratio on B-vitamin supply and apparent
ruminal synthesis (ARS) in dairy cows.
3.4. Materials and methods
Feed, orts and duodenal digesta samples used were collected during an experiment studying
the effects of a change in dietary forage concentration on intake and digestion responses of dairy
cows. Animals, treatments, data and sample collection, and analyses are described in details in
Voelker Linton and Allen (2007).
3.4.1. Animals and Treatments
The research project was conducted at Michigan State University following approval by the
All University Committee on Animal Use and Care. Prior to calving, 14 multiparous Holstein cows
from the university Dairy Cattle Teaching and Research Center were equipped with rumen and
duodenal cannulas and housed in tie-stalls. Cows were assigned randomly to treatment sequence in
a crossover design with a 14-d preliminary period followed by two 15-d treatment periods. At the
beginning of the preliminary period, cows were 178 ± 120 (mean ± SD) DIM and their DMI was 25
± 2.7 kg/d. Cows were fed a TMR served once daily (11h00) at 110% of the expected intake. All
63
diets used in preliminary and treatment periods were formulated with the same ingredients (Table
3.1). The two treatments were a low-forage diet (LF), and a high-forage diet (HF) served as a
TMR. The forage-to-concentrate ratios (% of DM) were 45:55 and 61:39 for LF and HF,
respectively. Corn and alfalfa silages were used as forages and their relative contribution to total
forage NDF was similar for both diets. Forages provided 82.2% and 87.8% of total NDF for LF and
HF, respectively.
3.4.2. Sample and Data Collection
Individual feed intake was recorded daily. From d 11 to 13 of each period, samples of each
dietary ingredient (500 g) and orts (12.5% of orts) were collected daily and mixed into a sample per
period. Duodenal samples (700 mL each) were collected every 9 h during these 3 d. All samples
were stored at – 20°C.
3.4.3. Laboratory analyses
Frozen duodenal samples were chopped finely using a commercial food processor and a
representative subsample was lyophilized. Dietary ingredients and orts samples were dried in a
forced-air oven at 55°C for 72 h. All samples were ground with a Wiley mill (1-mm screen, Arthur
H. Thomas, Philadelphia, PA). Samples were analyzed for DM, ash, NDF, indigestible NDF and
starch as described by Voelker Linton and Allen (2007).
B-vitamins in orts, feed and duodenal digesta were analyzed at the Dairy and Swine Research
and Development Centre (Sherbrooke, Québec, Canada). Thiamin, riboflavin, niacin and vitamin B6
were analyzed by HPLC (Varian Prostar, Lake Forest, CA) with a solvent delivery system (model
210), an autosampler (model 410), and a fluorescence detector (model 363) as described by Seck et
al. (chapitre 2). The concentration of the biologically active form of vitamin B12 was determined
using the commercial kit Simultrac B12/Folates-S (MP Biomedicals, Fountain Pkwy, Solon, OH) as
described by Seck et al. (chapitre 2).
64
3.4.3. Calculations and Statistical Analyses
B-vitamin concentrations in the two TMR were the summation of B-vitamin concentration in
each ingredient multiplied by the proportion of this ingredient in the TMR, on a DM basis. Daily
intakes (DI) of each vitamin were calculated as the concentration of each vitamin in the TMR
multiplied by the amount of TMR served, minus the concentration of each vitamin in orts
multiplied by the quantity of orts, on a DM basis. Measurements of DM duodenal flow (DF) were
described by Voelker Linton and Allen (2007). Duodenal flow was calculated as B-vitamin
concentrations in duodenal sample multiplied by the daily DM flowing through the duodenum.
Apparent ruminal synthesis was calculated as DF minus the daily intake of each vitamin. Total
niacin DI, DF and ARS were calculated as the sum of nicotinic acid and nicotinamide for these
variables. Total vitamin B6 DI, DF and ARS were calculated as the sum of pyridoxamine, pyridoxal
and pyridoxine for these variables.
Daily intake, DF and ARS for each vitamin, expressed in milligram per day or in milligram
per kilogram of DMI, were analyzed using SAS mixed model in which periods and treatments were
analyzed as fixed effects and cows as random effect. Differences were declared significant at P <
0.05, and as a tendency at 0.05 ≤ P ≤ 0.1.
3.5. Results and discussions
The effects of forage-to-concentrate ratio on DI, DF and ARS of B-vitamins expressed as
milligram per day are presented in Table 3.3. In Table 3.4 the variables are expressed as milligram
per kilogram of DMI to allow comparisons independent of differences in DMI reported by Voelker
Linton and Allen (2007) which were ; 27.8 and 24.7 (SE 0.5) kg/d for LF and HF, respectively (P <
0.0001). Consequently, using this unit of measurement (mg/kg DMI), daily intakes of B-vitamins
depend mostly of the vitamin concentrations in the ingredients and their relative proportions in the
experimental diets.
Assessing ARS does not allow distinguishing between microbial use, ruminal catabolism, or
eventual absorption of B-vitamins across the rumen wall. Consequently, the calculation of ARS
probably underestimates the actual amounts of individual vitamins synthesized by ruminal
65
microflora. This measurement, nevertheless, provides an estimate of the relative importance of
ruminal microflora for vitamin supply.
3.5.1. Thiamin
As observed previously (Schwab et al., 2006; Seck et al., Chapitre 2), corn, soybean meal
and SoyPlus®, a heat-processed soybean meal had the highest thiamin concentrations (Table 3.2).
However, Schwab et al. (2006) reported thiamin concentration in forages (corn silage, grass and
alfalfa hays) averaging at 1.1 mg/kg DM, much more than the average of 0.17 mg/kg DM found in
the forages used in the present study (corn and alfalfa silages). The average thiamin concentration in
the studied diets was 1.0 mg/kg DM, similar to the 1.2 mg/kg DM reported by Seck et al. (chapitre
2). Santschi et al. (2005a, b), and Schwab et al. (2006) reported values ranging from 1.50 to 2.64
mg/kg of DM. As a result of the low concentrations of thiamin in forages, changes in dietary forage
content affected thiamin intake, which was approximately 85% higher (P < 0.0001; Table 3.3) with
LF than HF diets. Similarly, Schwab et al. (2006) reported higher thiamin intake with a 35% forage
diet as compared to a 60% forage diet. Average DF was 1.8 mg/kg DMI, similar to the 1.7 mg/kg
DMI reported by Seck et al. (chapitre 2) but much lower than the 4.3 mg/kg DMI calculated from
Schwab et al. (2006). Average ARS was 0.72 mg/kg DMI, much lower than the values calculated
from Santschi et al. (2005b), Schwab et al. (2006) and Breves et al. (1981), ranging from 1.3 to 3.6
mg/kg DMI. Reducing dietary forage increased (P < 0.01) both thiamin DF and ARS.
The effect of increasing dietary concentrates on thiamin ARS was suggested by results from
Conrad and Hibbs (1954) and Hayes and al. (1966) who observed an increase of thiamin ruminal
concentrations in steers with increasing the concentrate level in the diet, in contrast with Miller et
al. (1989) who noted a reduction of thiamin ruminal concentration in steers fed a high-grain diet
(90% corn) as compared to a low-grain diet (30% corn). Moreover, Santschi et al. (2005a) reported
no effect of dietary forage (40 vs. 60%) on the thiamin concentration in rumen content fractions.
Thiamin ARS (mg/d) was correlated negatively (r = -0.47, P = 0.01) with ruminal pH and positively
with microbial flow of N (r = 0.36, P = 0.06), in accordance with the findings of Schwab et al.
(2006). However these authors reported positive correlation between thiamin ARS and OM
ruminally digested expressed in kilogram per day while the OM ruminally digested (%) was
correlated negatively with thiamin ARS in this study. Breves et al. (1981) also reported positive
correlations between thiamin DF and microbial flow of N and OM digested. In the present study,
66
the starch ruminally digested expressed in kilogram per day tended (r = 0. 31, P = 0.1) to be
correlated positively with thiamin ARS.
3.5.2. Riboflavin
Forages were the main sources of riboflavin, confirming observations from previous studies
(Schwab et al., 2006; Seck et al., chapitre 2). Indeed, 74% of dietary riboflavin was provided by
forages in this study mostly due to the presence of alfalfa silage (13.2 mg riboflavin/kg DM),
because riboflavin concentration was rather low in corn silage (2.4 mg/kg DM). Average dietary
concentrations of riboflavin were 4.4 mg/kg DM, similar to values (4.3 to 6.7 mg/kg of DM)
reported by Santschi et al. (2005a, b), and Schwab et al. (2006), using diets with forages varying
from 35% to 60% of DM. This concentration was however two times lower than the average dietary
riboflavin content (9.3 mg/kg DM) of a previous study (Seck et al., chapitre 2) using orchardgrass
or alfalfa silages as sole forages (no corn silage). In accordance with differences in dietary
riboflavin concentrations, riboflavin intake (110.5 ± 1.55 mg/d) was similar to those of Santschi et
al. (2005a, b) and Schwab et al. (2006), averaging at 123 mg/d, while the intake from the study of
Seck et al. (chapitre 2) was twice higher. As a result of the higher riboflavin concentration in
forages, the HF diet increased (P < 0.0001) riboflavin intake as observed by Miller et al. (1989) and
Schwab et al. (2006). When differences in DMI were taken into account, thiamin DF (15.4 mg/kg
DMI) was similar to those reported by Seck et al. (chapitre 2), Schwab et al. (2006) and Sanschi et
al. (2005b), ranging from 14.8 to 18.3 mg/kg DMI. Duodenal flow was not affected (P ≥ 0.3) by the
dietary forage concentration, in accordance with the findings from Schwab et al. (2006). Riboflavin
ARS (11 mg/kg DMI) was similar to the values reported in the studies mentioned above (Sanschi et
al., 2005b; Schwab et al., 2006), ranging from 11.4 to 13.5 mg/kg DMI. Hunt et al. (1941), Conrad
and Hibbs (1954), and Hollis et al. (1954) observed that increasing the proportion of concentrate in
diets increased ruminal concentration of riboflavin in steers, while Hayes et al. (1966) found no
effect. More recently, Santschi et al. (2005a) reported higher riboflavin concentration in solid-
associated bacteria (which contained most of the B-vitamins) when cows were fed a high-
concentrate diet whereas it had no effect on riboflavin ARS according to Schwab et al. (2006). In
the current study, increasing the proportion of dietary concentrate tended to increase (P = 0.07)
riboflavin ARS. However, this tendency was likely due to the difference in DMI which was 12.6%
higher with LF compared with HF (Voelker Linton and Allen, 2007), as confirmed by the absence
of treatment effect (P = 0.93) when the riboflavin ARS was expressed as milligram per kilogram of
DMI.
67
Riboflavin ARS was correlated positively with the microbial flow of N (r = 0.39, P = 0.04)
and the starch ruminally digested expressed in kilogram per day (r = 0.46, P < 0.01) in accordance
with the findings of Schwab et al. (2006). Contrary to the current study, Schwab et al. (2006) also
reported positive correlation with OM ruminally digested and negative correlation with ruminal pH.
3.5.3. Niacin
As observed in previous studies (Santschi et al., 2005a, b; Schwab et al., 2006; Seck et al.,
chapitre 2), niacin was more concentrated in the diets than any other B-vitamin. Its concentration is
also the most variable amongst diets, ranging from 24 mg/kg DM (Santschi et al., 2005b) to 200
mg/kg DM (Seck et al., chapitre 2). Moreover, the niacin concentrations sometimes varied in the
same ingredients from different sources, as demonstrated by differences in niacin concentrations
observed for alfalfa silage (62.2 vs. 200.8 mg/kg) and SoyPlus® (104.7 vs. 48.3 mg/kg) used in this
study and Seck et al. (chapitre 2). These variations raise the question of the stability of niacin in the
samples and/or the accuracy of the assay methods. As for riboflavin, forages were the main sources
of dietary niacin. Consequently, increasing dietary forage increased (P < 0.0001) daily intake of
niacin from 909 to 1016 mg/d. Daily intake of niacin reported in the literature (Santschi et al.,
2005a, b; Schwab et al., 2006; Seck et al., chapitre 2) varied greatly, ranging from 471 to 2258
mg/d, and reflected the differences in dietary concentrations of niacin discussed above. Except for
soybean meal, NA was the major form present in the ingredients as reported previously (Schwab et
al., 2006; Seck et al., chapitre 2). The ratio of NA to NAM in feed ingredients or digesta is to be
interpreted with caution due to the conversion of a portion of NAM into NA under acidic conditions
during extraction procedures (Ndaw et al., 2002), and the interconversion between the two forms
under the action of ruminal microflora (Harmeyer and Kollenkirchen, 1989; Erickson et al., 1991).
Niacin DF (3443 ± 255 mg/d) was higher than the values reported in previous studies
(Santschi et al., 2005b; Schwab et al., 2006; Seck et al. chapitre 2), ranging from 2105 to 2777
mg/d. Niacin ARS (2288 ± 298 mg/d) was also higher than the values reported by the authors cited
above, ranging from 434 to 2213 mg/d. However, when expressed as milligram per kilogram of
DMI, niacin ARS calculated from Santschi et al. (2005b; 112 mg/kg DMI), was 22% higher than
ours. Duodenal flow and ARS of niacin (mg/d) were increased (P < 0.01) respectively by 30% and
53% with LF diet as compared to HF diet. When expressed as milligram per kilogram of DMI,
these levels of increase were reduced to 12% and 33%, the latter taking into account the higher
DMI when cows were fed the LF diet. Schwab et al. (2006) reported similar findings regarding
68
niacin DF, which increased by 730 mg/d when the dietary forage decreased from 60 to 35%, but in
contrast, the level of forage had no effect on niacin ARS. Our results were consistent with studies
(Hayes et al. 1966; Hollis et al., 1954) showing an augmentation of the ruminal concentration of
niacin in steers and sheep when the level of concentrate in the diet increased. However, in a more
recent study Santschi et al. (2005a) concluded that change in dietary forage concentration had no
effect on the niacin concentration in ruminal fractions of dairy cows.
Microbial flow of N (r = 0.51, P < 0.01) and starch ruminally digested (r = 0.8, P < 0.0001)
were correlated positively with niacin ARS (Table 3.5), supporting previous findings from Schwab
et al. (2006). Mean ruminal pH was correlated negatively (r = -0.45, P = 0.02), and OM ruminally
digested (kg/d) correlated positively (r = 0.49, P < 0.01) with ruminal ARS, in contrast with the
aforementioned authors who reported no correlation.
3.5.4. Vitamin B6
Based on the current study and previous ones (Santschi et al., 2005a, b; Schwab et al., 2006;
Seck at al., chapitre 2), dietary vitamin B6 was mostly constituted by PYR, its proportion ranging
from 50 to 68%. Comparison with the latter two studies cited above confirmed the preponderance of
this form in hay and silages. In contrast, the proportions of different forms were more variable in
dietary concentrates. Comparison with the values reported by our group (Seck et al., chapitre 2)
shows variation of the actual vitamin B6 concentration in dietary ingredients, especially alfalfa
silage and SoyPlus®. Therefore, contrary to our previous data, vitamin B6 concentration was slightly
higher in SoyPlus® as compared to soybean meal.
Vitamin B6 concentration was barely 8% higher in HF diet as compared to LF diet which was
in the range reported by Schwab et al. (2006) and Seck et al. (chapitre 2). The daily intake (96.2
mg/d) was however higher than the average of 65 mg/d reported by these authors, due to a greater
DMI in our study. On the other hand, Santschi et al. (2005a, b) reported a greater vitamin B6 intake
(171.5 mg/d), reflecting the higher vitamin B6 concentration in the diets used, ranging from 6.8 to
8.5 mg/kg DM. Increasing dietary forage increased (P < 0.0001) vitamin B6 intake, when reported
in milligram per kilogram of DMI, but there was no effect (P = 0.27) when the vitamin B6 intake
was expressed as milligram per day. The decrease in DMI compensated for the higher dietary
vitamin B6 concentration with HF compared with LF diets.
69
As observed previously (Seck et al., chapitre 2; Schwab et al., 2006; Santschi et al., 2005a),
there was likely an intraruminal conversion of PYR into PAM: the two forms represented
respectively 52.1% and 31% of vitamin B6 intake whereas the proportions were 7% and 62% at the
duodenal level (Table 3.3).Vitamin B6 DF (Table 3.4) was similar to the 3.1 mg/kg DMI reported
by Seck et al. (chapitre 2), but less than the 4.3 mg/kg DMI calculated from Schwab et al. (2006).
Decreasing dietary forage increased (P ≤ 0.05) daily vitamin B6 DF by 30%, and by 14% when
DMI was taken into account. Vitamin B6 ARS was negative in our study, reflecting less synthesis or
more ruminal degradation. This observation is similar to the findings of Santschi et al. (2005b) and
Seck et al. (chapitre 2) for cows fed alfalfa silage-based diets, and in opposition with the positive
vitamin B6 ARS values reported by Zinn et al. (1987), Schwab et al. (2006) and Seck et al. (chapitre
2) for cows fed orchardgrass silage-based diets. Although vitamin B6 ARS was negative for both
treatments, LF diet reduced (P < 0.01) vitamin B6 ruminal degradation by 72% as compared to HF.
Contrary to what was observed for thiamin, riboflavin and niacin, there was no correlation (P
= 0.2) between vitamin B6 ARS and microbial flow of N. Mean ruminal pH and OM ruminally
digested (%) were correlated negatively (r = - 0.5, P ≤ 0.01) with vitamin B6 ARS, while the
correlation was positive (r = 0.42, P = 0.03) with the starch ruminally digested (kilogram per day).
The latter correlation was also reported by Schwab et al. (2006).
3.5.5. Vitamin B12
No vitamin B12 was detected in the diets, confirming previous findings (Seck et al., chapitre
2), but also in accordance with the very low concentrations reported in the studies of Sanschi et al.
(2005a, b) and Schwab et al. (2006), ranging from 0.006 to 0.02 mg/kg DM. As a consequence,
vitamin B12 intake was null whereas the authors mentioned above reported an average intake of 0.3
mg/d. Vitamin B12 DF and ARS were equal, averaging 12.21 ± 0.45 mg/d and close to the 10.4
mg/d reported by Seck et al. (chapitre 2). However these ARS values were much lower than the
average of 76.4 mg/d reported in the studies by Santschi et al. (2005b) and Schwab et al. (2006).
Contrary to what was observed with all the others B-vitamins studied, increasing dietary forage
increased (P = 0.02) vitamin B12 ARS (mg/kg DMI). Similarly, Sutton and Elliott (1972) observed a
36% decline of the active form of vitamin B12 ruminal production of sheep when the forage-to-
concentrate ratio dropped from 70:30 to 40:60, whereas Santschi et al. (2005a) reported a decrease
of vitamin B12 concentrations in solid-associated bacteria with a low-forage diet.
70
In contrast with these findings, Kon and Porter (1953) and Hayes et al. (1966) observed a
reduction of vitamin B12 concentration in ruminal fluid of steers when the dietary forages were
increased. Schwab et al. (2006) also reported higher daily vitamin B12 ARS with a 35% forage diet
as compared to a 60% forage diet. According to the latter, low-forage diets provided more dietary
sugars, nutrients positively correlated with vitamin B12 ARS. Moreover, Stewart and Bryant (1988)
reported that Selemonas bacteria, which synthesized large quantities of vitamin B12 uses sugars as
fermentative substrates. On the other hand the positive correlation between NDF ruminally digested
and vitamin B12 ARS reported by Schwab et al. (2006) might explain why the vitamin B12 ARS is
greater with a HF diet in the current study.
Vitamin B12 ARS is influenced by the dietary forage content and also likely by the dietary
sugar content but the dietary cobalt content could also be of major importance (Stangl et al., 2000;
Kincaid and Socha, 2007), because cobalt is essential for vitamin B12 synthesis by the bacteria
(McDowell, 2000).
3.6. Conclusions
Increasing the dietary forage content from 45% to 61% altered intakes, DF and ARS of the
B-vitamins studied (except riboflavin) regardless of the DMI. Using HF diet increased intakes of
riboflavin, niacin and vitamin B6 by 16%, 20% and 9%, respectively while thiamin intake was
reduced by 37%. Using LF diet increased DF and ARS of thiamin by 35%, and those of niacin by
10% and 25%, respectively. Although DF is increased when using the LF diet, vitamin B6 ARS is
negative whatever the treatment. The LF diet however reduced the vitamin B6 ruminal degradation
by 72%. Vitamin B12 DF and ARS (mg/kg DMI) are affected differently, decreasing by 8% with the
LF diet. Increasing the proportion of concentrate in the diet augmented the amount of starch
digested, a substrate that likely promoted microbial growth and consequently a better B- vitamin
synthesis, as suggested by the positive correlations between B-vitamin ARS and microbial flow of
N.
3.7. Acknowledgements
The authors thank Véronique Roy and Chrystiane Plante (AAFC, Sherbrooke, QC,
Canada) for their technical support. This study was financially supported by the Coop Fédérée
71
(Montréal, QC, Canada) and the Dairy Farmers of Canada (Ottawa, ON, Canada).
3.8. References
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75
Table 3.1. Ingredients, nutrient composition and B-vitamin concentrations of a low-forage (LF) and a high-forage (HF) diets
Ingredient, % DM LF HF Corn silage
1 29.7 40.5
Alfalfa silage2
15.1 20.9 Dry ground corn 33.9 16.1 Soybean meal (48% CP) 11.0 9.1 Vitamin-mineral mix
3 3.2 4.3
SoyPlus4 5.9 9.1
Urea 0.2 0.2 Nutrient
DM, % as fed 47.0 39.6 OM, % of DM 93.0 92.1 NDF, % of DM 24.4 30.7 Forage NDF, % of DM 19.9 27.3 Indigestible NDF, % of DM 13.2 15.1 Potentially digestible NDF, % DM
5 11.2 15.6
Starch, % of DM 32.8 22.5 CP, % of DM 16.2 16.6 Rumen-undegraded CP
6, % of DM 7.2 7.3
B-vitamins concentrations Thiamin, mg/kg of DM 1.21 0.78 Riboflavin, mg/kg of DM 4.03 4.70 Total niacin, mg/kg of DM 38.07 47.19
Nicotinic acid, mg/kg of DM 30.95 39.10 Nicotinamide, mg/kg of DM 7.12 8.09
Total vitamin B6, mg/kg of DM 3.36 3.685 Pyridoxamine, mg/kg of DM 1.05 1.06 Pyridoxal, mg/kg of DM 0.70 0.45 Pyridoxine, mg/kg of DM 1.62 2.18
Vitamin B12, mg/kg of DM ND7
ND 1Corn silage contained 46.4% NDF, 16% indigestible NDF, 18.6% starch and 8.1% CP; 30-h in
vitro NDF digestibility was 47.5%. 2Alfalfa silage contained 40.6% NDF, 26.4% indigestible NDF, 3.5% starch and 18.3% CP. 30-h in
vitro NDF digestibility was 32.6%. 3Vitamin-mineral mix contained (DM basis) 10.1% dicalcium phosphate, 4.1% trace-mineral mix,
5.7% sodium bicarbonate, 1.2% magnesium oxide, 124.2 kIU/kg of vitamin A, 40.3 kIU/kg of vitamin D, 671.6 kIU/kg of vitamin E, and 60.1% ground corn as a carrier. 4West Central Soy (Ralston, IA). Nutrient composition: 86% DM, 7% ash, 16% NDF, 5% starch
and 51% CP 5(1-indigestible NDF)
6Calculated according to NRC (2001) model.
7Not detected.
76
Table 3.2. B-vitamin concentrations (mg/kg DM) of ingredients used in the experimental diets
Corn silage Alfalfa silage
Corn, dry ground
Soybean meal
SoyPlus®
Thiamin 0.00 0.35 2.56 2.09 1.10
Riboflavin 2.42 13.16 2.04 4.14 2.77
Niacin1
NA 45.79 53.72 12.43 5.12 74.81 NAM 1.95 8.51 0.78 29.40 29.89 Total 47.74 62.23 13.21 34.52 104.71
Vitamin B6
2
PAM 0.23 2.66 0.96 1.60 1.14 PAL 0.32 0.01 1.56 0.58 0.07 PYR 1.61 5.52 0.01 1.21 2.92 Total 2.15 8.19 2.53 3.39 4.13
Vitamin B12 ND
3 ND ND ND ND
1Niacin: NA: nicotinic acid; NAM: nicotinamide; total: summation NA and NAM.
2Vitamin B6: PAM: pyridoxamine; PAL: pyridoxal; PYR: pyridoxine; total: summation PAM, PAL
and PYR. 3Not detected.
77
Table 3.3. Intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis of B-vitamins expressed as milligram per day in responses to low-forage (LF) and high-forage (HF) diets (LSMeans)
Treatment1
HF LF SEM
2 P Values
Thiamin Intake 19.29 34.55 0.461 <0.0001 Duodenal flow 35.95 57.37 2.580 <0.0001 ARS
3 14.63 25.29 2.039 0.001
Riboflavin Intake 112.93 108.04 1.550 0.04 Duodenal flow 377.74 410.37 20.562 0.13 ARS 264.81 302.33 20.362 0.07 Niacin
4
NA
Intake 1015.90 909.39 14.561 <0.0001 Duodenal flow 1806.19 2337.69 190.339 0.02 ARS 790.29 1428.30 185.060 0.004 NAM Intake 194.44 189.37 6.680 0.60 Duodenal flow 1213.95 1528.36 78.759 0.003 ARS 1019.51 1338.99 77.858 0.002 Total Intake 1210.34 1098.76 19.063 0.0004 Duodenal flow 3020.14 3866.05 254.979 0.005 ARS 1809.80 2767.29 297.901 0.001 Vitamin B6
5
PAM Intake 29.78 32.90 0.450 <0.0001 Duodenal flow 42.52 54.19 2.821 0.005 ARS 12.75 21.30 2.531 0.014 PAL Intake 10.70 19.82 0.281 <0.0001 Duodenal flow 18.83 30.08 2.612 0.005 ARS 8.13 10.26 2.568 0.51 PYR Intake 54.64 44.61 0.881 <0.0001 Duodenal flow 7.05 4.10 0.690 0.001 ARS -47.58 -40.51 1.051 0.0006 Total Intake 95.11 97.33 1.401 0.27 Duodenal flow 68.41 88.37 3.760 0.001 ARS -26.70 -8.96 3.269 0.002 Vitamin B12 Intake 0 0 0 - Duodenal flow 11.94 12.48 0.450 0.28 ARS 11.94 12.48 0.450 0.28
78
1Treatments: LF = low-forage diet; HF = high-forage diet.
2SEM = standard error of the mean.
3ARS = apparent ruminal synthesis.
4Niacin: NA: nicotinic acid; NAM: nicotinamide; total: summation NA and NAM.
5Vitamin B6: PAM: pyridoxamine; PAL: pyridoxal; PYR: pyridoxine; total: summation PAM, PAL
and PYR.
79
Table 3.4. Intake, duodenal flow and apparent ruminal synthesis of B-vitamins (expressed as milligram per kilogram of DMI) in responses to low-forage (LF) and high-forage (HF) diets (LSMeans)
Treatment1
HF LF SEM
2 P Values
Thiamin Intake 0.80 1.27 0.007 <0.0001 Duodenal flow 1.41 2.19 0.073 <0.0001 ARS
3 0.61 0.92 0.017 0.006
Riboflavin
Intake 4.71 3.97 0.030 <0.0001 Duodenal flow 15.73 15.06 0.788 0.33 ARS 11.03 11.08 0.788 0.933
Niacin
4
NA Intake 42.30 33.50 0.247 <0.0001 Duodenal flow 74.98 84.50 6.426 0.10 ARS 32.68 51.00 6.405 0.005
NAM Intake 8.07 6.90 0.233 0.002 Duodenal flow 50.54 55.64 2.806 0.09 ARS 42.47 48.74 2.818 0.04
Total Intake 50.37 40.40 0.291 <0.0001 Duodenal flow 125.52 140.15 8.679 0.05 ARS 75.15 99.744 8.642 0.003
Vitamin B6
5
PAM Intake 1.14 1.13 0.010 0.60 Duodenal flow 1.77 1.96 0.106 0.16 ARS 0.63 0.83 0.111 0.16
PAL Intake 0.45 0.73 0.007 <0.0001 Duodenal flow 0.76 1.10 0.099 0.02 ARS 0.32 0.37 0.099 0.65
PYR Intake 2.26 1.64 0.013 <0.0001 Duodenal flow 0.29 0.15 0.028 0.0002 ARS -1.98 -1.49 0.028 <0.0001
Total Intake 3.85 3.50 0.025 <0.0001 Duodenal flow 2.83 3.22 0.138 0.05 ARS -1.02 -0.28 0.144 0.002
Vitamin B12
Intake 0 0 0 - Duodenal flow 0.50 0.46 0.011 0.02
80
ARS 0.50 0.46 0.011 0.02 1Treatments: LF = low-forage diet; HF = high-forage diet.
2SEM = standard error of the mean.
3ARS = apparent ruminal synthesis.
4Niacin: NA = nicotinic acid; NAM = nicotinamide; Total = summation of nicotinic acid and
nicotinamide. 5Vitamin B6: PAM = pyridoxamine; PAL = pyridoxal; PYR = pyridoxine; Total = summation of
pyridoxamine, pyridoxal and pyridoxine.
81
Table 3.5. Pearson correlations coefficients between apparent ruminal synthesis and dry matter intake or ruminal fermentation parameters
Thiamin Riboflavin Niacin Vitamin B6 r P r P r P r P Intake, kg MD/d 0.66 <0.01 0.1 0.61 0.23 0.24 0.23 0.24 Mean pH -0.47 0.01 -0.27 0.17 -0.45 0.02 - 0.47 0.01 MN flow
1, g/d 0.36 0.06 0.39 0.04 0.51 <0.01 0.24 0.22
TRDOM2,% -0.65 <0.01 0.06 0.77 - 0.15 0.46 - 0.5 <0.01
TRDOM, kg/d 0.01 0.96 0.28 0.15 0.49 <0.01 0.01 0.99 TRDS
3, % -0.47 0.14 0.24 0.23 0.22 0.27 - 0.28 0.16
TRDS, kg/d 0.31 0.10 -0.46 0.01 0.80 <0.0001 0.42 0.03 1MN
= microbial nitrogen.
2TRDOM
= true rumen degraded organic matter.
3TRDS
= true rumen degraded starch.
Chapitre 4.
Conclusion générale
83
Ce projet de maîtrise était composé de 3 études, celles dont sont issues les 2 articles insérées
dans le présent mémoire et une troisième sur les effets de la taille des particules de maïs et du type
de mouture sur la synthèse ruminale des vitamines B. Les analyses et le traitement des données
concernant cette dernière sont terminées, mais l’article n’est pas encore rédigé, ce qui explique son
absence dans ce mémoire.
Une des particularités de ce projet était la séparation de la phase animale et des analyses de
laboratoire. Les échantillons utilisés pour le dosage des vitamines provenaient d’études menées aux
États-Unis par J. Voelker Linton et M.S. Allen (co-auteurs des articles) portant sur les effets de
facteurs alimentaires sur la fermentation ruminale et la capacité d’ingestion des vaches laitières.
Par ailleurs, la mise au point des méthodes de dosages pour la biotine (vitamine B8) et les
folates (vitamine B9) n’a pas été concluante assez vite pour en inclure les résultats dans cette étude.
Une autre difficulté était la relative parcimonie des références concernant les vaches laitières
qui auraient permis de mieux soutenir les discussions. En effet, la plupart des études sur les
vitamines B étaient faites sur des ovins et des bovins de boucherie, et les méthodes de dosages alors
utilisées sont devenues obsolètes et ne donnaient qu’une estimation relative de la synthèse ruminale.
Les résultats obtenus dans ce projet, faisant suite aux études antérieures utilisant une
méthodologie similaire (Santschi et al., 2005a et 2005b; Schwab et al., 2006), contribuent à la
constitution d’une base de données sur la synthèse ruminale des vitamines B chez la vache laitière,
comblant ainsi les manques évoquées par le NRC (2001) :« des données adéquates pour quantifier
la biodisponibilité, la synthèse ruminale et les exigences pour la plupart des vitamines
hydrosolubles ne sont pas disponibles».
Ultimement, l’identification des facteurs alimentaires affectant la synthèse ruminale de chaque
vitamine B permettra d’évaluer la pertinence d’une supplémentation en fonction des caractéristiques
de la ration disponible, en vue d’optimiser la production laitière.
