La république Algérienne Démocratique et Politique

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mohamed khider-Biskra

Faculté des Sciences exacte et des Sciences de la nature et de la vie

Département de science de la nature et de la vie

Groupe: 01

2011/2012

Chargé de module:

Mr Athamena .A

Thème L’électrophorèse des

acides nucléiques

introduction

Définition

But et principe

Matériels et gels utilisé

Type d’électrophorèse

Conclusion

Plan de travail

applications

Introduction

L’électrophorèse est la principale des techniques utilisées en

biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules.

Elle a quelques applications en chimie, mais principalement

utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation

des protéines ou celle des acides nucléiques.

Alors comment réaliser l’électrophorèse des acides

nucléiques ?

Technique de séparation et d’analyse des

particules chargé grâce à la migration différentielle sous l’action d’un champ

électrique .

Définition

BUT

Séparer, analyser ou purifier des acides nucléiques

Déterminer la taille des fragments d’ADN inconnu

Principe

l'électrophorèse est basée sur le principe du mouvement d’ions sous l’effet d’un champ électrique.

La vitesse de migration des acides nucléiques sera en fonction de :

Taille (PM ) [ ]du gel

vitesse de migration

[ ]du gel support

les petits fragments

Migrent rapidement

Forme III linéaire (deux brins cassés)

Forme II circulaire relachée (un brin

coupé)

Forme I circulaire super enroulée fermée

Les fragments des acides nucléiques peuvent être séparer selon leur conformation tridimensionnelle

Les acides nucléiques sont des macromolécules poly

anioniques chargés négativement à pH 8. Sous un champ

électrique, ils vont migrer vers l’anode (pôle +).

Mobilité élèctrophorétique différente

Les matériels

Tampon d'électrophorèse

(tampon TBE). est une solution contenant du Tris [tris (hydroxyméthyl) aminométhane]Du borate ,de EDTA (Ethyléne diamine tétra acétate )ajustée à PH 8.3

Tampon de charge : bleu de bromophénol - xylène cyanol - glycérol - tampon TBE.

LES GELS UTILISÉS

Gel d’agarose

Gel de polyacrylamide

• Pour les fragments d’ADN de taille (0,5-20kb)

• Pour les fragments de moins de 1000 paires de base

•Séparer des fragments d’ADN double brin•Ne peuvent pas déterminer précisément la taille d’un fragment

•Séparer des fragments d’ADN simple brin

Les gels non dénaturants

Les gels dénaturants (DGGE)

gel de polyacrylamides

Il existe deux types de gel de polyacrylamide :

L’électrophorèse d’ADN est constituée de cinq étapes importantes :

1) Préparation des gels

d’agarose

2) Dépôt de l’ADN dans les puits du

gel

3) Migration

4) Coloration

5) observation

Réalisation du gel d’agarose par dissolution à chaud de poudre d’agarose dans un  tampon TBE à pH 8.2

et refroidissement jusqu’à une température voisine de 50°C.

Préparation du

gel

Électrophorèse sur gel d’agarose

Préparation du moule pour couler le gel :

après avoir obturé les

deux extrémités du moule

avec un scotch fort, placer le

moule sur une surface bien

horizontale et disposer dans

les encoches prévues à cet

effet le peigne nécessaire à la

réalisation des puits dans le

gel.

Coulage du gel :

verser lentement le gel dans la cuve sans dépasser le niveau

supérieur des dents du peigne.

Laisser refroidir 30 mn  environ avant d’enlever délicatement le peigne. Les puits sont alors prêts pour recevoir les dépôts d’ADN et le scotch fermant la cuve peut-être enlevé.

les puits sont placés du

côté de la cathode et la cuve

est remplie de tampon TBE

jusqu’au niveau supérieur

du gel.

Mise en place du gel dans la cuve :

Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre

certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient

pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc

thermique à 65°c avant de le refroidir brutalement.

Préparation de

l’ADN

Dilution et densification de l’ADN par une solution de charge permettant que le dépôt s’enfonce bien au fond de chaque puits. Cette solution est colorée par du bleu de bromophénol  et elle permettra de suivre l’avancement de l’électrophorèse.

On dépose directement

le dépôt de l’ADN dans les

puits et la migration se fait

dans le gel.

On branche la cuve a la prise de courant pendant une heure environ.

Quand le front de migration atteint l’extrémité du gel, on coupe le courant.

pendant la migration, il faut préparer la solution pour révéler les fragments d’ADN : il s’agit d’un colorant bleu dans une solution tampon dont on ajuste le pH à pH= 5.2

Révélation des fragments :

Elimination de la coloration de fond du gel par de l'eau distillée

Après migration

coloration par du bleu de méthylène

Placer le gel sur un rétroprojecteur pour une observation par la classe entière.

Gel d'électrophorèse sur

agarose sur lequel on voit :

les marqueurs (ou

échelle, "ladder") de

longueur (en paires de base)

de fragments d'ADN

un fragment d'ADN

inconnu

Détermination de la taille d'un fragment d'ADN:

Les avantages de l'électrophorèse en gel d'agarose

préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels d'agarose

pas de dénaturation des échantillons

l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide

les échantillons peuvent être récupérés en vue d'analyses

supplémentaires

Électrophorèse en champ pulsé

On change périodiquement l’orientation du champ par rapport au gel ,lors du changement de l’orientation du champ électrique l’acide nucléique change le sens de son orientation .

Les différents types d’électrophorèse en champ pulsé

L’OFGE (Orthogonal Field

Alternating Gel Electrophoresis)

Le FIGE(Field Inversion Gel

Electrophoresis)

Le CHEF(Contour clamped

Homogeous Eletric Field )

Deux champs non homogènes orthogonaux sont appliqués alternativement Les migrations sont plus linéaires que dans la technique originale Séparer des fragments dont la taille peut atteindre 9Mb

champ homogène.Le sens du champ électrique étant simplement inversé périodiquement.

champ homogène et l’angles de réorientation était fixé à 120°Les Migrations sont linéaires Séparer des fragements dont la taille peut atteindre 12 Méga bases. .

A -

A +

B -

B +

A -

A + B -

B +

A -

A +

B -

B +

α = 90°

OFAGE

α = 180° α = 120°

FIGE CHEF

Orthogonal Field Alternation Gel Electrophoresis

Field Invertion Gel Electrophoresis

Contour-Clamped Homogeneous Electric Field

Figure 1: Les différents types d’électrophorèse en champ pulsé

Tube capillaire de faible diamètre (50microns)remplie d’un gel remplie d’un gel séparateur.

Électrophorèse capillaire

Le capillaire est introduit dans le tube contenant l’échantillon.

Sous l’influence d’une haute tension.

pénétration et migration d’acides nucléiques dans le capillaire .

Figure2:instrumentation d’électrophorèse capillaire

Avantages

Le système ne consomme qu’une quantité infime d’échantillon

Il n’est pas nécessaire de faire de dépôt

Les applications de l’électrophorèse

Estimation du poids moléculaire de fragments d'ADN après une digestion par des enzymes de restriction

Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification par PCR

Séparation de fragments d’ADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot.

L’électrophorèse humain a joué un rôle important dans la

cartographie du génome .l’ électrophorèse est la séparation de

particules causées par un courant électrique. 

  Le processus sépare les composants de l'ADN pour

déterminer la présence de certains responsables génétiques et

même la présence de troubles et de maladies 

Conclusion

MERCI À VOTRE ATTENTION