Eléments de Toxico-protéomique

1

Olivier Laprévote Lab. de Toxicologie Faculté de Pharmacie Paris Descartes

Metabolome

Genome (tous les gènes): que pourrait il se passer

Proteome (toutes les protéines): ce qu’il se

passe

Transcriptome (tous les mRNA’s): Ce qui se passe probablement

4

1 génome

5

1 génome

2 protéomes

Omics et fonction biologique

?

? ? Microarrays

(Affymetrix, Incyte)

Protéomique

Diagnostic Pharmacologie

Toxicologe

Genomique SNPs

Changement de structure protéique

(PTM) Protéine: changement

d’abondance

mRNA : changement d’abondance

Changement fonctionnel

Différence génomique

Les protéines sont responsables de la plupart des fonctions biologiques contrôlées.

Les interactions protéine-protéine contrôlent la plupart des processus cellulaires

Les maladies sont traitées en général au niveau des protéines

Les protéines sont des cibles pour les médicaments ou sont elles-mêmes des médicaments.

Le Protéome est le complément en protéine du génome La protéomique est l ’utilisation de mesures qualitatives et

quantitatives du niveau d’expression protéique pour caractériser des processus biologiques

7

Pourquoi la protéomique ?

Pourquoi la protéomique: les microarrays ne suffisent pas à mesurer les marqueurs pré-cliniques

60 lignées cellulaires humaines (Tew, et al.) Corrélation = 0.43

Protéines sériques humaines (Kawamoto, et al.) Corrélation nulle (hors albumine)

Levure (Gygi, et al.) Corrélation (sous partie) = 0.36

Les abondances Protéines/mRNA sont peu corrélées:

• Serum • Urine

Des échantillons importants ne contiennent pas de mRNA utile

Glutathione-associated enzymes in the human cell lines of the National Cancer Institute Drug Screening Program.

Tew KD et al., Mol. Pharmacol (1996 Jul) 50(1):149-59

Protéines vs mRNA pour les GST π dans 60 lignées cellulaires humaines

0.1

1.0

10.0

100.0

1000.0

0.1 1.0 10.0 100.0

GS

Tπ m

RN

A (n

mol

mR

NA

/mg

prot

ein)

Lung

Ovarian

CNS

Leukemia

Prostate

Renal

Melanoma

Breast

Colon

R=0.43

GSTπ Protein (µg GST/mg protein)

Les profils d’abondance en protéines sont affectées par :

Les perturbations “rapides” d’un état “normal” Etats pathologiques Effets de traitements (médicaments)

Thérapeutique Toxique

Les changements progressifs de l’état “normal” Différenciation (vers diférents types cellulaires) évolution des espèces

Les mécanismes des médicaments impliquent des changements dans la régulation des gènes qui se

retrouvent au niveau protéique

Liaison à Un récepteur

Transduction du signal

Inhibition enzymatique

Action du médicament

Événements nucléairesr

mRNA's Toxicologie

Feedback

Protéines

mRNA's Accumulation des précurseurs

Déficits en Produits

Pharmacologie

Toxicologie Proteins

Feedback

Pharmacologie

Événements nucléaires

La protéomique: un domaine évolutif de la biologie

gènes biologie

Préparation de l’échantillon

Électrophorèse 2D

Spectrométrie de masse

Protéomique structurale Protéomique fonctionnelle

quantification

Analyse d ’image

Expression haut-débit Fonction

protéique

Interactions protéine-protéine

Protéomique: défis

La protéomique est, de beaucoup, plus complexe que la génomique: - Dynamique d’expression (spatiale et dans le temps) - Molécules fragiles, en complexes - Large domaine dynamique: ratios de 1012 entre les protéines plasmatiques les plus et les moins exprimées - pas d’équivalent à la PCR - modifications post-traductionnelles - réseaux d’interactions

Pipeline analytique de la protéomique

échantillon Pré- fractionnement séparation traitement analyse identification

B i o - i n f o r ma t i q u e

Dissection de tissus

lyse cellulaire

Ultra- centrifugation LC préparative

Gels 1D-2D MDLC

coloration décoloration

imagerie analyse d’image

excision digestion

MS MS/MS

Recherche en banque de données

Technologies mises en œuvre en protéomique

- Technologie des gels 2D ou de séparations multiples (reproductibilité) - Technologie de la révélation et de l’imagerie - Spectrométrie de Masse à fin d’identification - Banques de données (protéines et génome) - Algorithmes de recherche en banques

Le défi en recherche protéomique consiste en l’automatisation et l’intégration de ces différentes technologies

Protéomique structurale vs. fonctionnelle

Protéomique structurale

Protéomique fonctionnelle

(identification /quantification De toutes les protéines)

Que font les protéines ? - fonction (activité) - structure 3D/fonction - interaction protéine-protéine - élucidation des voies biochimiques

La protéomique structurale: identification et caractérisation

échantillon séparation digestion Identification

-cellule saine -cellule malade -sérum, LCR -+/- drogue -cinétique

Protéomique structurale: objectifs Connaissance « académique » - quelle protéine est exprimée, où, et à quel niveau relatif ? - quelles modifications post-traductionnelles se sont produites ? Profil d’expression différentiel - quelles sont les différences observables sur un protéome... … sain vs. normal … avant et après traitement thérapeutique → biomarqueurs

Techniques: 1 Séparation grossière des protéines: Électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE)

pH4 pH7

Haut PM

Faible PM

IEF

SDS-PAGE

Séparation fine des protéines: Électrophorèse bidimensionnelle (2D-gels)

Annexin V

SMP-30 CK-I-19

Actin Actin Actin

Cholangiocytes Hepatocytes Unfract. Liver

Types cellulaires rares vs. prédominants dans une Différentiation protéomique Cholangiocyte/Hepatocyte

“Cholangiocyte specific rat liver proteins identified by establishment of a two-dimensional gel protein database and their role in cytoprotection”. Tietz et al. Electrophoresis, 19, 3207-3212 (1998).

Séparation fine des protéines: Électrophorèse bidimensionnelle (2D-gels) Un gel 2D est équivalent à des centaines voire des

milliers de tests protéiques réalisés en une seule fois Chaque spot correspond à un type de protéine distinct (défini par sa position) Chaque spot peut être quantifié pour établir l’abondance de la protéine correspondante

Identification des spots protéiques en spectrométrie de masse

Analyse du gel (imageur)

Excision des spots

Même gel: 200 spots Coloration à l’argent

Digestion en plaques 96 puits

0

10000

20000

30000

40000

Cou

nts

1000 1500 2000 2500 3000

709.

3633

864.

3529

977.

4588

98

3.52

67

1030

.111

10

82.4

95

1098

.507

1118

.55

1285

.751

13

54.7

59

1386

.802

14

30.7

32

1510

.856

15

58.8

05

1711

.753

1806

.876

18

20.8

8

1950

.002

19

87.0

52

2078

.046

2259

.114

23

21.2

2

2694

.231

Tp fr

agm

ent

MALDI-TOF LC-MS/MS + Sequest

Digestion sur gel (après excision des spots) des protéines

Spectrométrie de Masse

25mM NH 4 HCO 3 /50% ACN

Décoloration du gel Réduction Alkylation

(Iodoacétamide)

Digestion trypsique

Séchage au Speed Vac

Solution deiodoacetamide

à l'obscurité

Solution deTrypsine

Solution deDTT

56°C/1h 37°C/4H Surnageantconcentré

α-cyano/ échantillon

Empreintes peptidiques (MALDI) Peptide Map Fingerprinting (PMF)

Spectre MALDI d’un digestat protéique

696.0 973.4 1250.8 1528.2 1805.6 2083.0Mass (m /z)

1712.2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

4700 R eflector Spec #1[B P = 1562.8, 1712]

1562.8336

1348.7311

1476.8306

781.9119982.4231 1272.7095841.4720 1584.8115 1877.0824717.8616

Empreintes peptidiques (MALDI)

Identification de la protéine (Mascot)

Digestion en ligne de protéines et identification

Objectifs: limiter au maximum la durée de l’étape de digestion et d’analyse par

spectrométrie de masse Eviter l’étape de réduction-alkylation des peptides Limiter le nombre d’étapes de manipulation de l’échantillon Optimiser le nombre et la nature des peptides au sein du milieu de

digestion Rendre compatible la méthode analytique avec les échanges

hydrogène deutérium Permettre le couplage en ligne de la digestion et de l’analyse par

spectrométrie de masse

Digestion en ligne de protéines par la pepsine immobilisée

Méthodologie: Injection de 26 μL d’une solution de pepsine à 20 μM dans

H2O/HCOOH, 98:2, v/v, pH 1, dans une ligne de 1 mètre (tube PEEK rouge, diam. 0,13 mm)

10 minutes d’attente Rinçage à l’eau distillée (retour à pH neutre)

Pourquoi la pepsine ? C’est un enzyme actif à pH acide, condition la plus favorable à

l’obtention de spectres electrospray Ruptures du côté C-terminal d’acides aminés hydrophobes (L)

ou aromatiques (W, F),

Spectres de masse de la myoglobine en solution dans eau/méthanol/acide acétique injectée au travers de la ligne de pepsine immobilisée Effet de la différence de potentiel à l’interface de la source d’ions

36 V

84 V

132 V

180 V

Détection sélective des peptides de hautes et faibles masses

Spectres de masse de la myoglobine en solution dans eau/acide acétique injectée au travers de la ligne de pepsine immobilisée Effet du temps de digestion

Détection sélective des peptides de hautes masses (digestion partielle) ou de faibles masses (digestion totale)

5 min

10 min

Identification en banque de données: -logiciel: MS-Fit -banque: Swiss-Prot

1 peptide non reconnu: clivage aspécifique

G. Marie, L. Serani et O. Laprévote

Anal. Chem., 72, 5423-5430 (2000)

Protéomique structurale: EXEMPLES • Mécanismes thérapeutiques et Toxiques de traitements hypocholestérolémiants

• Identifier les protéines impliquées par protéomique structurale • Comparer les mécanismes de drogues-ligands du PPAR (SAR)

• Identifier les protéines impliquées par protéomique structurale • Identifier le mécanisme d’action des dithiolthiones

• Trouver le mécanisme d’action par analogie à d’autres classes médicamenteuses

• Mécanisme de la néphrotoxicité de la cyclosporine A • Identification des protéines impliquées

• Identifier les modifications post-traductionnelles dues à l’action d’un agent toxique: le méthapyrilène

• Influence de la phosphorylation sur le protéome

Exemple: métabolisme du cholestérol Inhibiteurs de l’HMG CoA Reductase Effets thérapeutiques vs mécanismes de toxicité

Voie métabolique finement régulée impliquant un nombre réduit de protéines

Chol. ↓ par Lovastatin via inhibition de l’HMG CoA reductase (HMG: 3-hydroxy-3-méthyl glutarate)

Chol. ↓ par cholestyramine via sequestration des acides biliaires (rupture cycle entérohépatique)

Augmentation par diète riche en cholestérol (5%)

High Cholesterol (5%)

Control

Cholestyramine (1%)

Lovastatin (0.075%)

Lovastatin + Cholestyramine

Master 5 animals/group

Regulation de l’HMG-CoA Synthase cytosolique du foie par les traitements affectant le cholestérol sanguin

Effets des drogues hypocholestérolémiantes sur le protéome du foie de rat

21 Protein Spots AreAffected Through theCholesterol Pathway

6 Low Abundance Spots Are Strongly Induced

Cytosolic HMG CoA Synthase

Mitochondrial HMG CoA Synthase (fragment)

23kd Morphine- binding Protein (104)

PP strong- responder (367)

Proliférateurs du peroxisome SAR on PPARα (peroxisome proliferator-activated receptor) Se lient au récepteur nucléaire PPARα Déclenchent l’induction du métabolisme des acides

gras Appartiennent à des classes structurales diverses Produisent des tumeurs du foie chez le rat Pas de génotoxicité apparente In Vivo

A collaboration with Eli Lilly

OC

HO CH2

H2C

CH3

CH2

H2C

CH2

CH2

C

HN

N

N

N

O

H3C

C

HO CH2

H2C

H2C

CH3

O

H3C OH2C

C

HN

N

N

N

NH

N

N

H3C CH3

Cl

S CH2

C

O

O

WY14643

LY171883

LY163443*

-

C

O

O

H2C

CH

H2C

CH2

H2C

CH3

CH2

H3CC

O

OCH2

CHCH2

H2CCH2

CH3

CH2

H3C

OCl

O

C

C

H3C CH3

O

O

C

C

H3C CH3

O

O

DEHP

Clofibric Acid

Nafenopin

-

-

A= Control B= LY163,443 C= LY171,883 D= DEHP E= Clofibric acid F= WY14,643 G= Nafenopin

Peroxisome Prolferators: 6 Compounds Compared Over 107 Selected Protein Spots The effects of peroxisome proliferators on protein abundances in mouse liver. Anderson, N.L., Esquer-Blasco, R., Richardson, F., Foxworthy, P. and Eacho, P. Toxicology and Applied Pharmacology, 137, 75-89, 1996.

AAA

AAA

AA

AA

AA

A A

A

B

B

B

BB

B

C

C

C

C

CCD

DD

DD DE

EE E

EE

FF

FF

F

F GG

GG

GG

Révélation des différences de mécanismes d’action par protéomique quantitative

Les variations d’expression de plus de 100 protéines permettent de révéler des similitudes et des différences de mécanismes

Chaque symbole représente le pattern protéique hépatique d’une souris individuelle

Dithiolethiones (inhibiteurs de la carcinogénèse chimique): Induction d’enzymes de Phase II Analogies mécanistiques entre classes

S S

N

H 3 C

S Oltipraz (parent)

S S

S

O

H 3 C Anethole Trithione

S S

S

1,2-Dithiole-3-thione

S

S S

1,3-Dithiole-2-thione

O C

C C

C O

CH 3

O

H 3 C

O

Dimethyl fumarate A collaboration with Division of Cancer Prevention and Control, Chemopreventive Investigational Drug Unit, US National Cancer Institute

o2 Group 15: Oltipraz (control) O2 Group 16: Oltipraz (442umol) a Group 17: ANTT (control) A Group 18: ANTT (442umol) m Group 19: DMF (control) M Group 20: DMF (442umol) r Group 21: 1,3-DT-2-T (control) R Group 22: 1,3-DT-2-T (442umol) w Group 23: 1,2-DT-3T (control) W Group 24: 1,2-DT-3-T (442umol)

o2

o2

o2

o2

o2 a a

a a a

m

m

m

m m

r r

r

r r r

w w

w

w w O2 O2 O2

O2

O2 A A

A A A

M

M M

M

R

R

R R

R

W

W

W

W

-4 -3 -2 -1 0 1 2

PC 2: Activité d’induction d’enzymes de phase II

-2

-1

0

1

2

3

4

PC 1

: Act

ivité

selo

n le

méc

anis

me

“R”

2 mécanismes sont distingués par PCA (Analyse en composantes principales)

PCA des données sur 81 spots

Controls

Chaque symbole correspond au profil d’expression d’un animal

o1 Group 1: Oltipraz 21 days in feed + 2 days recovery controls i Group 2: Ibuprofen 21day feed control f Group 3: DFMO 21day feed control h Group 4: 4-HPR 21day feed control cp Group 5: Carbenoxolone and Piroxicam 21day feed control gd Group 6: Ca glucarate and DHEA analogue 21day feed cntrl O1 Group 7: Oltipraz 21 days in feed + 2 days recvry 100mg/kg I Group 8: Ibuprofen 21day feed MTD

F Group 9: DFMO 21day feed MTD H Group 10: 4-HPR 21day feed MTD C Group 11: Carbenoxolone 21 day feed MTD P Group 12: Piroxicam 21 day feed MTD G Group 13: Ca glucarate 21day feed MTD D Group 14: DHEA analogue 21day feed MTD

o2 Group 15: Oltipraz (control) O2 Group 16: Oltipraz (442umol) a Group 17: ANTT (control) A Group 18: ANTT (442umol) m Group 19: DMF (control) M Group 20: DMF (442umol) r Group 21: 1,3-DT-2-T (control) R Group 22: 1,3-DT-2-T (442umol) w Group 23: 1,2-DT-3T (control) W Group 24: 1,2-DT-3-T (442umol)

o1 o1

o1 o1 o1

o1 o1

o1

i

i i i i

f

f

f

f f

h h

h h

h h

cp cp cp

cp cp

gd

gd

gd

gd

gd

O1 O1

O1 O1 O1

I I I

I

I

I I

I

I

F F

F

F

F F F

F

H

H H H

H H

H

H H H C C C

C

C

C

P

P

P

P

P P

P

G

G

G G G G

G G G G D D

D D

D

D

o2

o2

o2

o2

o2 a a

a a a

m

m

m

m m

r r

r

r r r

w w

w

w w O2 O2 O2

O2

O2 A A

A A A

M

M M

M

R

R

R R

R

W

W

W

W

-4 -3 -2 -1 0 1 2

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

Le mécanisme R est analogue à celui du piroxicam

Principal Components Analysis of Data on 81 Spots

PC 1

: Act

ivité

selo

n le

méc

anis

me

“R”

PC 2: Activité d’induction d’enzymes de phase II

Cyclosporine: Marqueurs spécifiques de la Toxicité

Drogue immunosuppressive puissante Utilisée pour éviter les rejets de greffe Produit des effets adverses dans le rein

limitant les doses d’emploi (toxicité tubulaire, calcification rénale, dysfonction rénale)

Pathogenese toxique complexe

Effets sur le protéome rénal de la cyclosporine A Sous expression majeure du spot 75

CsA 15mg/kg/j 12 jours

CsA 50mg/kg/j 12 jours

Arrow Plot here!

Protéine Mitochondriale:

67 Cytochrome C oxidase

peptide II

Protéines cytosoliques:

75 Calbindin 28kD

96 Senescence marker

protein 30

109 a-2U-globulin

119 Tropomyosin

67 75

96

109

119

Cyclosporine A decreases the protein level of the calcium-binding protein calbindin-D 28kDa in rat kidney. Steiner, S., Aicher, L., Cordier, A., Raymackers, J., Meheus, L., Esquer-Blasco, R., and Anderson, N.L. Biochem. Pharmacol., 51, 253-258, 1996.

Rein contrôle: immunomarquege de la calbindin d28k

Rein de rat traité par la cyclosporine A: Dépôts de calcium

Effets histologiques de la cyclosporine A sur le rein de rat

Cyclosporine A decreases the protein level of the calcium-binding protein calbindin-D 28kDa in rat kidney. Steiner, S., Aicher, L., Cordier, A., Raymackers, J., Meheus, L., Esquer-Blasco, R., and Anderson, N.L. Biochem. Pharmacol., 51, 253-258, 1996.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Contrôle CsA FK-506 (tacro.)

Rapamycin (sirol.)

PSC-833 (inhib. PGP, MDR1)

% d

e la

cal

bind

ine

réna

le c

ontrô

le

10 jours 31 jours CsA, SDZ PSC 833: 50mg/kg/jour

FK-506, Rapamycin: 5mg/kg/jour

Effets des drogues sur le niveau de calbindin rénal

Methapyrilene:

Antagoniste du récepteur H1 à l’histamine Retiré du marché en raison de son hépatotoxicité Produit des tumeurs du foie chez le rat Pas de génotoxicité in vivo apparente Cause une prolifération des mitochondries

H 2 C

N

H 2 C

C H 2

N

CH 3

N

CH 3

S

Methapyrilene

Carcinogénicité hépatique non-génotoxique Mise en évidence de modifications protéiques covalentes

Pyrilamine

Le traitement au methapyrilène induit …

1,000ppm MPY Control

grp75

HSP60

F1 ATPase beta

Carbamyl phosphate synthase

Le traitement au methapyrilène induit une modification des charges de quatre enzymes mitochondriales majeures

1,000ppm MPY Control

grp75

HSP60

F1 ATPase beta

Carbamyl phosphate synthase

Autres exemples

Assessment of acetaminophen toxicity in mouse liver

Autres exemples…

Forces de la protéomique quantitative:

Des marqueurs protéiques informatifs peuvent être trouvés pour caractériser: Des états pathologiques Les effets de traitements

Thérapeutiques Toxiques

L’analyse globale de marqueurs (patterns) permet de:

Classer les mécanismes d’action toxique et les états physiopathologiques

Obtenir une détection plus sensible et plus fiable que celle obtenue avec un seul marqueur

Protéomique fonctionnelle: EXEMPLES • Rechercher et identifier des enzymes de dépollution environnementale

• Criblage bio-guidé et identification d’une réductase • Identifier le mécanisme d’inhibition de la ribonucléotide réductase par les espèces réactives de l’azote

• Protéomique moléculaire • Caractériser les cytochromes P450

• vers le profilage des patients… • Modifications post-traductionnelles

• sur les CYP P 450 (phosphorylations) • Adduits covalents des OPs sur l’albumine humaine

Utilisation de la protéomique pour caractériser des enzymes de biodépollution actifs sur des toxiques environnementaux

Après un criblage de nombreuses souches bactériennes, une espèce, Bacillus subtilis patr. apparaît comme le seul micro-organisme capable de réduire de manière constitutive et efficace les deux groupements nitro du 3,5-Dinitro Trifluoro Benzène (DNBTF).

CF3

NO2O2N

CF3

NH2H2N

Patr, B. subtilis

3,5 DNBTF

Intérêt de la biodépollution

La réduction de groupements nitro est une étape clef dans la bio-dégradation des polluants aromatiques et hétérocycliques nitrés. Ex: explosifs (TNT), pesticides, etc.

La caractérisation d’une protéine catalysant la réduction de groupements nitro peut permettre la conception de bio-détecteurs pour des polluants aromatiques et hétérocycliques nitrés. Ex: délimitation des zones contaminées et localisation des mines anti-personnelles.

N H 2 O H O H

O H R R R

N H 3 , N 2 , H 2 O , O 2 , C O 2 . . .

N O 2

R

n i t r o r é d u c t i o n

d e s a m i n a t i o n h y d r o x y l a n t e

La réaction de double réduction peut servir à la conception d’agents anti-tumoraux, à la base d’une approche GDEPT (Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy) qui permet l’activation de molécules nitrées aromatiques (CB1954) comme drogue.

CB1954: S. aziridinyl-2,4 dinitrobenzomide

ADN

R-NO2

(Pro-drogue) R-NHOH

Nitroréductase

R-NO2 +

- Mort de la cellule

Intérêt thérapeutique ?

Objectif

Caractériser la (les) nitro-réductase(s) chez Bacillus subtilis et celle(s) de la souche patr capable(s) de catalyser la double réduction du 3,5 DNBTF.

Stratégie suivie:

1. Culture bactérienne;

2. Extraire la fraction protéique;

3. Fractionnement du mélange protéique

• QFF;

• Mono Q;

• Electrophorèses 1D et 2D;

• Identification des protéines d’intérêt par une approche protéomique.

Toutes les étapes de purifications sont suivies par un test d’activité pour vérifier la présence de la protéine d’intérêt: protéomique bio-guidée

CF3

NO2O2N

Bacillus Subtilis

H2N NH2

CF3

Bande Analysée

97 66

45 33

Identification: Mélange de Protéines

1. Beta-Glucosidase 53.2kDa/5.1pI 30% Cov 30 ppm Err 2. Nitrate reductase 55.4kDa/5.3 17% Cov 500 ppm Err beta chain 3. Protéines non identifiées ?

Echecs initiaux

699.0 1159.4 1619.8 2080.2 2540.6 3001.0 Mass (m/z)

1.7E+

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

1831.7407 1108.5413

1032.4594 1312.5945 955.4344 1389.6175

1046.5455 1672.9347 2466.2171 788.3309 1677.7485 1417.6249 2316.1364 1145.4915 1834.7398 853.4041 1516.7783

R-NO2 R-NH2 NO3- NO2

-Nitro-réductase Nitrate-réductase

?

Résultats suivants

5CP40monoQ300603A7001:1_UV1_280nm 5CP40monoQ300603A7001:1_Cond% 5CP40monoQ300603A7001:1_Conc 5CP40monoQ300603A7001:1_Fractions

-5.0

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

mAU

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 ml

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A9 A10 A11 A12 B12 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 Waste

Identification: Mélange de Protéines

1. Superoxide dismutase GSP24 25.33kDa/5.1pI 52% Cov 12 ppm Err 2. Protéines non identifiées ?

Après modification du protocole d’extraction puis 1D SDS-PAGE

Fraction B10

Fraction b10 Bacillus subtilis Bacillus patr

25µg 5µg 25µg 5µg

Bande analysée Bande analysée

Identification: Mélange de Protéines

1. Superoxide dismutase GSP24 25.33kDa/5.1pI 62%Cov 12 ppm 2. Nitro/Flavin-réductase 28.42kDa/5.8 69% Cov 20 ppm 3. Autres Protéines (identification réalisée, mais fonction sans relation

avec les nitroréductases)

Après modification du protocole: 2D SDS-PAGE

Bacillus subtilis Bacillus patr

2a 2b

Nitro-réductases de Bacillus patr

699.0 1259.4 1819.8 2380.2 2940.6 3501.0 Mass (m/z)

3199.7

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

1646.8003

2086.9883

917.4724 2069.9711

825.1334 1546.8864 1924.0770 1483.7836 2198.0886 877.0814 1066.1211 3175.6280 1907.9241 2744.4728 2460.3477

1450.0 1472.2 1494.4 1516.6 1538.8 1561.0

Mass (m/z)

552.4

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

1546.8864

1547.8877 1483.7836

1485.7897 1548.8804

1499.8122 1455.8007 1486.8233 1500.7895 1456.7817

1457.7778 1501.8079 1549.8940 1531.7667 1478.7912 1513.8716

699.0 1259.4 1819.8 2380.2 2940.6 3501.0 Mass (m/z)

8773.9

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

1646.8142

2086.0317

1455.7920 2070.0020 917.4722 1546.8752

1924.0806

1015.5498 2460.3319 1471.7915 2198.1317 1908.9588 2744.5619 1407.7875 3175.7366 1009.4835 2482.3293

1450.0 1472.2 1494.4 1516.6 1538.8 1561.0

Mass (m/z)

3445.8

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

1455.7920

1546.8752 1456.7936

1547.8822

1457.7943 1548.8805 1471.7915

1472.7881

1473.7980 1458.8005 1512.8220 1549.8810 1475.8140

Conclusion

Réduction de la complexité du mélange protéique indispensable pour l’identification des protéines d’intérêt par spectrométrie de masse.

La sous-unité de la nitrate réductase trouvée lors des premières analyses est un artefact: danger si couverture de séquence trop faible !

Identification de novo de deux nitro-réductases chez Bacillus patr.

P. Chaignon, S. Cortial, A. P. Ventura, P. Lopes, F. Halgand, O. Laprévote, J. Ouazzani Purification and identification of a Bacillus nitroreductase: potential use in 3,5-DNBTF biosensoring system. Enz. Microbial Tech., 39, 1499-1506 (2006)

Action du peroxynitrite sur la Ribonucléotide Réductase (RNR)

La RNR: Elle intervient dans la biosynthèse de l’ADN Elle est inhibée par le monoxyde d’azote (et par l’anion peroxynitrite) Utilisation de donneurs de NO comme agents anticancéreux… Quels sont les mécanismes d’action des oxydes d’azote sur la RNR ? Via l’anion peroxynitrite (issu du couplage de NO et du radical anion superoxyde)

Action cytoxique des oxydes d’azote

Action du peroxynitrite sur la Ribonucléotide Réductase (RNR)

Analyse à l’échelle moléculaire du mécanisme d’inhibition de la RNR par le peroxinitrite Structure: hétérotétramère de type α2 β2

La sous-unité β2 contient deux atomes de fer non hémiques (cluster Fe-O-Fe) et forme un dimère (M 87 kDa) Questions posées: après réaction avec l’anion peroxynitrite ... Modification chimique ? Nature de la réaction chimique ? Conservation de la structure quaternaire? Rendement global de réaction? Localisation des sites modifiés sur la séquence?

Action du peroxynitrite sur la Ribonucléotide Réductase (RNR)

Séquence Homogénéité Structure quaternaire

ESI Cond ° dénaturante

ESI Cond °non-dénaturante

ESI Cond ° dénaturante

ESI Cond °non-dénaturante

Fer

Oxygène

digestion HPLC

Identification

MS/MS

SYTHIIR

Localisation

Stratégie Analytique

+ HOONO

Spectre ESI-MS du domaine Β2 de la RNR (Eau/MeOH/CH3COOH; 50:50:1)

Masse Calc. 43 386 Masse Mes. 43 392

m/z

0

50

100

1635.2

1887.7

2067.6

2285.2

2413.1

2553.5

2722.3 2894.3

3111.9

3350.4 3630.0

3962.6

0

50

100

43544.0

43392.0

Da

Spectre electrospray Conditions non-dénaturante (eau/bicarbonate d’ammonium 50 mM) M2(Fe-O-Fe)2 Masse Calc. 87 028,8 Masse Mes. 87 033,6

m/z 0

50

100

3107.8 3626.0

4352.3

4581.4

4836.0

5806.3 6216.5

%

0

50

100 87033.6

Da

Après addition de peroxynitrite…

Spectre electrospray Conditions non-dénaturante M2(Fe-O-Fe)2(NO2)2-3 Masse Mes. 87 134,7

m/z 0

50

100

3111.0 3630.9

4357.6

4586.8

4841.8 5809.7

0

50

100 87134.7

Da

Localisation de la modification chimique sur le peptide 121-127 LC-MS/MS

I I H Y-NO2 T R S

200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 0

50

100

175.1

223.2

288.3

316.3

401.3

538.3

571.3 639.4

734.4

821.4

847.4

x2.5 934.4

La structure quaternaire n’est pas affectée par le peroxynitrite

Les centres Fe-O-Fe sont conservés dans le site actif de l’enzyme et ne sont pas directement touchés par l’agent inhibant.

La nitration de la tyrosine 122 stabilise le phénol sous forme de radical, ce qui bloque le transfert électronique de la sous-unité R2 vers la sous-unité R1, la réduction des riboses et donc l’activité de l’enzyme.

Bilan: Action du peroxynitrite sur la Ribonucléotide Réductase (RNR)

O. Guittet, P. Deccotignies, L. Serani, Y. Henry, P. Le Maréchal, O. Laprévote, M. Lepoivre Biochemistry, 39, 4640-4648 (2000)

MS/MS des peptides

Les fragmentations ont lieu principalement au niveau des liaisons peptidiques Les différences de m/z entre les ions appartenant à la même série permettent

d’obtenir la séquence Ces différences sont accrues d’un incrément de masse lorsqu’il y a modification

chimie ou post-traductionnelle Ex: + 80 (phosphate ou sulfate), + 42 (acétylation), + 14 (méthylation), -1 (déamidation)

Localisation de la modification chimique sur le peptide 121-127 LC-MS/MS

I I H Y-NO2 T R S

200 300 400 500 600 700 800 900 m/z 0

50

100

175.1

223.2

288.3

316.3

401.3

538.3

571.3 639.4

734.4

821.4

847.4

x2.5 934.4

Caractérisation des cytochromes P450 par l’approche protéomique

Pourquoi les CYP ? Les CYP sont responsables du métabolisme oxydatif des xénobiotiques comme des composés endogènes Grande variabilité individuelle dans l’expression des isoformes Grande variabilité individuelle vis-à-vis de la TK-PK des drogues d’intérêt clinique Nécessité de la caractérisation des CYP en phase pré-clinique Pourquoi la spectrométrie de masse ? Techniques immunologiques (ELISA et WB) pas toujours spécifiques (57 isoformes !) CYP de structures proches difficiles à doser individuellement dans des mélanges Spectrométrie de masse – sensible mais plus spécifique Analyse de mélanges possibles grâce à séparation en amont (LC) et en aval (MS/MS) de la production des ions Quantification possible en mode MRM au sein de mélanges Caractérisation des PTMs

Objectif 1: Identifier des peptides spécifiques

(«protéotypiques ») des différents CYPs étudiés

Objectif 2: mettre au point une méthode de quantification

par spectrométrie de masse

77

Caractérisation des cytochromes P450 par l’approche protéomique

Stratégie Etude dans des tissus: Microsomes foie / cerveau

Gel SDS-PAGE, coloration par le bleu de Coomassie

Découpe des bandes de CYP

Digestion trypsique des bandes de CYP

MALDI-TOF/MS Nano LC-ESI-LTQ-Orbitrap

Recherche dans la base de données protéiques par Mascot ou Sequest

Identification des peptides spécifiques (« protéotypiques »), foie humain

78

Préparation des Microsomes de foie

Foies humains provenant de donneurs pour transplantation hépatique ou d’hépatectomie partielle et conservés à -80°C.

Microsomes préparés à 4°C par centrifugation et ultracentrifugation différentielle.

Conservés à -80°C en présence de glycérol. Glycérol éliminé par centrifugation à 100 000 x g puis

lavage dans un tampon pyrophosphate (100 mM, pH 7,4) et nouvelle centrifugation à 100 000 x g.

Culot re-suspendu dans du tampon phosphate de sodium (100mM,pH 7,4).

79

Purification des CYP (Gel SDS-PAGE)

Séparation électrophorétique des protéines microsomales (20 μg par ligne de 4 échantillons différents)

Gel: Tris-glycine 4-20%

Coloration: bleu de Coomassie

Exemple d’un PMF de CYP

629.0 1305.8 1982.6 2659.4 3336.2 4013.0Mass (m /z)

1.5E +4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

4700 R eflector Spec #1[B P = 1685.8, 15375]

1685.8295

749.3378

1498.7352 1917.9642

1629.7874877.4542

1478.6006 1854.06011097.46192604.32501361.6731 2981.4053

809.4188 1444.2125 2572.3538634.2385 1000.4865 1958.9756 3453.66532593.19311581.7815 3038.3855

81

82

Identification par Mascot

83

Exemple d’un PMF de CYP

Identification des CYP de 2 donneurs

CYP 450 du FH4 couverture en pourcentage

2D6 38,03 3A4 37,97 4A11 35,45 2C8 33,88 1A1 25,39 2 E1 25,15 8B1 24,75 4F2 22,31 3A5 21,31 1A2 18,45 4F3 15,77 4F11 15,65 2C9 15,1 2C19 14,08 4F12 12,4 2A6 12,15

2C18 10,82 51A1 8,15 2B6 5,7 2F1 2,65 2j2 2,59 7B1 1,78

CYP 450 du FH5 couverture en pourcentage

3A4 78,73 4A11 58,13 2 E1 57,61 2C8 54,29 2D6 52,52 2B6 44,6 1A1 43,55 2A6 41,5 8B1 41,12 3A7 40,76 2C9 29,18

2C19 24,29 2A7 22,27

2A13 20,24 2F2 18,27

2C18 14,29 51A1 14,12 4F11 8,21 2F1 2,65 4V2 2,29 84

Identification des peptides spécifiques de chaque CYP

Comparer chaque séquence peptidique détectée à l’ensemble des séquences protéiques et nucléiques présentes dans les banques de données.

Contraintes:

Eliminer les peptides dont les modifications post-traductionnelles sont possibles telles que oxydation des méthionines (modification variable) carboxy-amido-méthylation des cystéines (modification fixe)

Eliminer les peptides issus d’erreur de site de clivage enzymatique (miss-cleavages)

85

CYP Peptides spécifiques [M+2H]²+ cyp1A1 LWVNPSEFLPER 743,888

SHLPYMEAFILETFR 927,466 YLPNPSLNAFK 632,34

cyp1A2 VDLTPIYGLTMK 675,871 ASGNLIPQEK 528,788 DTTLNGFYIPK 634,83 IGSTPVLVLSR 571,351

TVQEHYQDFDK 705,32 YLPNPALQR 536,301

cyp27A ATGAPGAGPGVR 505.773 FFFQLFVQGYALQLHQLQVLYK 1365,744

VVLAPETGELK 578.335 cyp2B6 DLIDTYLLHMEK 745,882

NLQEINAYIGHSVEK 857,942 FHYQDQEFLK 677,825

GYGVIFANGNR 584,299 IAMVDPFFR 548,286

TEAFIPFSLGK 605,329 cyp2A6 GYGVVFSNGER 592,788 cyp2C8 EHQASLDVNNPR 690,337

DQNFLTLMK 555,287 VQEEIDHVIGR 647,841

cyp2C19 EHQESMDINNPR 735,326 NLAFMESDILEK 705,353

cyp2D6 AFLTQLDELLTEHR 843,446 DLTEAFLAEMEK 698,837

EVLNAVPVLLHIPALAGK 927,564 FGDIVPLGVTHMTSR 815,425 GNPESSFNDENLR 739,829

DIEVQGFRIPK 651,364 LLDLAQEGLK 550,322

MTWDPAQPPR 599,787

cyp2E1 FGPVFTLYVGSQR 735,891 FITLVPSNLPHEATR 847,965

GDLPAFHAHR 560,786 GIIFNNGPTWK 623,833

cyp2J2 VIGQGQQPSTAAR 656,852 cyp3A4 GVVVMIPSYALHR 721,403 cyp3A5 DVEINGVFIPK 615,84 cyp3A7 FNPLDPFVLSIK 695,392

cyp4A11 VWPNPEVFDPFR 751,875 cyp4F2 HVTQDIVLPDGR 675,362

SVINASAAIAPK 571,332 cyp4F3 WQLLASEGSAR 609,317

cyp4F11 ILPTHTEPR 532,298 cyp4F12 SITNASAAIAPK 572,322

FLPDHTEPR 556,28 LVHDFTDAVIR 643,349

cyp4V2 SDRPATVEDLKK 679,867 cyp51A1 GVAYDVPNPVFLEQK 838,438

IDDILQTLLDATYK 811,438 NEDLNAEDVYSR 712,818

FAYVPFGAGR 542,782 YLQDNPASGEK 611,291

cyp8B1 GTVPWLGHAMAFR 721,872 SVQGDHEMIHSASTK 813,881 WGFGTMQPSHDVR 759,351

EEATQVLGEAR 601,804 FVYSLLWPR 590,829 LVHEDYTLK 559,298

MLSVSHSQEK 573,285 MSSGQEYLFR 609,285

Réductase TYEHFNAMGK 599,271 86

Identification des peptides spécifiques de chaque CYP

Ajout d’un peptide étalon

- quantité connue - Même séquence - alourdi par un

isotope stable 4 Méthodes : AQUA « absolute

quantification » QConCat Marquage chimique

(Chemical labelling)

PSAQ Anal Bioanal Chem Langenfeld et al, 2008

87

Quantification des CYPs

Identification de CYP phosphorylés

Gorden Redlich et al. J. Proteome Res., 2008, 7 (11), 4678-4688

Identification de CYP phosphorylés

Gorden Redlich et al. J. Proteome Res., 2008, 7 (11), 4678-4688

Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine

Dichlorvos C4H7Cl2O4P

Masse monoisotopique : 220,9532

Masse de l’adduit :

108

Chlorpyriphos C9H11Cl3NO3PS

Masse monoisotopique : 349,9355

Masse de l’adduit :

152

1744.0 1771.2 1798.4 1825.6 1852.8 1880.0Mass (m/z)

344.8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

<<HSA+dichlorvos_120min>> 4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 2229.9, 592]

1853.80

1839.78

1745.81

1805.82 1867.791824.851770.69 1798.741818.731754.77 1827.82 1837.85 1850.81 1861.73

1744.0 1771.2 1798.4 1825.6 1852.8 1880.0Mass (m/z)

713.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 1109.5, 1423]1745.85

1798.77 1805.88 1829.971767.81 1818.781775.76

m/z 1745

m/z 1853Δm = 108 umaHSA+Dichlorvos

HSA non modifiée

Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine

Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine

1712.0 1737.4 1762.8 1788.2 1813.6 1839.0Mass (m/z)

129.0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

<<HSA+dichlorvos_120min>> 4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 2229.9, 592]

1726.71

1745.81

1805.821824.851770.69 1798.74

1767.77 1818.731754.77 1827.821821.81

1712.0 1737.4 1762.8 1788.2 1813.6 1839.0Mass (m/z)

713.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 1109.5, 1423]1745.85

1798.77 1805.88 1829.971767.81 1818.781726.751716.89 1735.66 1775.76

m/z 1717

HSA non modifiée

HSA+Dichlorvos

m/z 1825Δm = 108 uma

Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine

1707.0 1741.8 1776.6 1811.4 1846.2 1881.0Mass (m/z)

3883.5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

<<HSA+chlorpyrifos_120min>> 4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 2230.0, 12316]1830.03

1716.95

1868.95

1745.911798.821767.83

1805.90 1858.051744.98 1820.821792.76

1707.0 1741.8 1776.6 1811.4 1846.2 1881.0Mass (m/z)

1328.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

4700 Reflector Spec #1=>NF0.7=>SM5[BP = 1746.9, 1328]

1745.93

1805.961830.071767.87 1798.841716.98 1728.97 1818.851775.82

HSA non modifiée

HSA+Chlorpyriphosm/z 1717 m/z 1869

Δm = 152 uma

Mise en évidence d’adduits aux organophosphorés sur l’albumine humaine

b4+

b6+b5

+

b7+

244 410 576 742 908 1074Mass (m/z)

87.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

<<ms2_1717_2kV_2>> 4700 MS/MS Precursor 1717 Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>SM5[BP = 858.5, 87]858.53

759.45 875.56

842.47648.38 776.48325.17847.55330.19257.19 520.28412.20 833.52

665.38

244 410 576 742 908 1074Mass (m/z)

49.9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

4700 MS/MS Precursor 1824 Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>SM5[BP = 1731.1, 87]966.55

984.58

983.56

496.30867.44

955.58742.37 884.49

513.22 938.55611.33363.15 860.49325.15614.29 838.51

b2+

b4+

b5+

b6+

b7+

Δm = 108 uma

Δm = 108 uma

Δm = 108 uma

Δm = 108 uma

VRYTKKVPQVSTPTL

Localisation de l’adduit sur la Tyrosine 411 de l’albumine (peptide 1717)