Empreinte génétique des souches Empreinte génétique des souches de de Mycobacterium Mycobacterium

tuberculosistuberculosis

Professeur Férièle MESSADI-AKROUTProfesseur Férièle MESSADI-AKROUTLaboratoire Régional d’HygièneLaboratoire Régional d’Hygiène

E.P.S. Hédi CHAKER de SfaxE.P.S. Hédi CHAKER de Sfax

RFLPRestriction Fragment Length Polymorphism

Technique basée sur la détection des éléments d’insertion

IS 6110

Met en évidence les polymorphismes des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis

Permet d’obtenir les profils (empreintes) génétiques ou

« fingerprints » des souches, les distinguant ainsi entre elles

Outil fiable pour des études épidémiologiques :

sur les sources d’infection

Les chaînes de transmission

Identification de miniépidémies multirésistantes

Le nombre de copies et le site d’insertion dans le chromosome : variables d’une souche à l’autre

relative instabilité de cet élément génétique

Polymorphisme des profils d’IS 6110 est expliqué par:

Le nombre et les différentes positions des IS dans le chromosome

La taille des fragments de restriction dépendant des sites de restriction adjacents aux IS

Transposition : événement extrêmement rare

MATERIEL

237 souches de M. tuberculosis provenant 226 patients

Fin 1992 et 1993 dans 12 hôpitaux tunisiens

74 % de sexe masculin

10371

1298

66665

32

0 20 40 60 80 100 120

SFAX

SOUSSE

KSAR HELAL

MONASTIR

M BOURGUIBA

LA RABTA

LA MARSA

ARIANA

NABEUL

SIDI BOUZID

GABES

HOPITAL MILITAIRE

Nombre de souches

PROVENANCE DES SOUCHES

TYPES DE LOCALISATION

93 % d’origine pulmonaire

7 % d’origine extra-pulmonaire :

urine 0,4 %

ponction lombaire 0,4 %

biopsie 0,8 %

pus 3,3 %

autres ponctions 2,1 %

Étude de la sensibilité des souches aux anti-tuberculeux

technique des proportions Canetti et al.

Fiche de renseignement complétée à partir des dossiers

médicaux et enquêtes épidémiologiques effectuées par

DSSB.

Résistance primaire

Résistance secondaire

METHODES

Technique RFLP: méthode décrite par Van Embden et al

Institut National de Santé Publique et de Protection de

l’Environnement Bilthoven Neederland

1. Extraction ADN génomique des mycobactéries

culture bactérienne Tampon Tris EDTA (pH 8)

mycobactéries tuées par la chaleur (20 mn à 80°C). Digestion par lysozyme (1mg/ml) lyse des parois mycobactériennes

Ajout protéinase K, SDS (dénaturation des protéines) 10 mn à 65° C

Ajout NaCl (0,6M) CTAB (cétylNNN Triméthylammonium Bromide).

Séparation des protéines et des ac. Nucléiques

Ajout chloroforme – Isoamylalcool permet extraction ADN (phase aqueuse) :

Précipitation ADN avec isopropanol

2. Digestion ADN avec une enzyme de restriction

Pvu II (endonucléase) (Boehringer Mannheim

Allemagne)

Reconnaît la séquence palindromique CAG |CTG

Coupe une seule fois dans IS 6110 et en dehors à

distances variables

3. Électrophorèse sur gel d’agarose (0,8 %)

Fragments d’ADN digérés sont séparés selon leur taille

4. Southern blotting

transfert fragments ADN sur membrane de nitrocellulose

5. Préparation de la sonde par PCR

6. Hybridation avec sonde marquée à la peroxydase

(245 pb)

7. Détection par technique chimique non radio active

( ECL: Enhanced ChemiLuminescence)

8. Analyse des profils par ordinateur avec le logiciel Gel compar . ( RIVM Bilthoven, Hollande)

Coefficient de similitude entre les différents profils Poids moléculaires et intensité des bandes

Dendrogramme

RESULTATS

Nombre de copies IS 6110 varie de 3 à 22

Majorité des souches ont entre 7 et 15 copies (91,1 %)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Nombre de copies IS 6110

%

Analyse de profils génétiques montre par ordinateur une faible

hétérogénéité.

72 % des souches sont regroupées dans 3 « clusters » qui

contiennent plus de 10 copies IS 6110

souches proviennent de 3 clones

Souches africaines moins polymorphiques que souches

néerlandaises

Souches Tunisiennes

Souches Néerlandaises

Degré de polymorphisme plus faible

Pays à haute prévalence Pays à basse prévalence

Taux de transmission plus Important Réactivation endogène

Infection récente

Il n’existe pas de relation entre le profil RFLP et l’acquisition de résistance par les souches de M. tuberculosis

Analyse du profil RFLP permet :

d’identifier des miniépidémies (souches résistantes ou sensibles)

d’analyser les circonstances de la transmission (infections nosocomiales)

d’aider à la définition des mesures à prendre pour éviter ce type d’accident

Il n’existe pas de souches ne possédant pas IS 6110 comme celles décrites par Yuen sur des souches vietnamiennes

Au niveau des 3 groupes RFLP principaux:

pas possibilité d’associer un profil à une origine géographique particulière

Mobilité importante de la population

Comparaison aux souches éthiopiennes:

Aucun profil comparable, ceci confirme l’hypothèse d’une possible différenciation par l’origine géographique

Comparaison aux souches néerlandaises:

Profil similaire chez un chauffeur transportant des animaux en Tunisie et au Maroc

Infection probablement contractée en Tunisie

Intérêt de la mise en place d’une collection de

souches provenant du monde entier et présentant

des caractéristiques différentes de manière à pouvoir

associer à des profils particuliers une origine

géographique et peut être des caractères de

pathogénicité et de résistance aux antituberculeux

Différents prélèvements provenant du même patient

même profil RFLP

Malgré polymorphisme des souches de M. tuberculosis.

Phénomène de transposition : rare

Deux prélèvements pulmonaires et une ponction

ganglionnaire provenant d’un même patient

Profils identiques sites pulmonaires

Profil différent pour le site ganglionnaire mais similaire avec une bande en plus

rare phénomène de transposition

Plutôt que d’une infection par 2 souches différentes

La transmission intra familiale de la tuberculose a été

démontrée dans 2 cas :

- 2 frères de Ksar Helal même profil génétique

- 1 frère et une sœur de Sousse même profil génétique

3 souches multirésistantes isolées chez 3 patients de régions (Ariana, Sousse, Sfax)

même profil RFLP

PCR Innolipa Rif-TB

Test même type de mutation (R2) sur le gène rpo B

(responsable de la résistance à la Rifampicine)

Source commune d’infection, transmission de souche M D R

3 souches présentant une résistance à l’isoniazide (Rce primaire)

même profil RFLP.

3 patients résidant dans 3 villes proche de Menzel Bourguiba (Nefza, Mateur, Bizerte)

pas de contact démontré

Source commune d’infection

- même lieu

- même bar (narguilé)

Détection de contaminations intra laboratoires : 8 sujets ne présentant aucun signe radiologique ni clinique de tuberculose ont un profil identique à d’autres souches isolées le même jour dans le même laboratoire.

Souche isolée chez une technicienne de laboratoire

identique à celle d’un autre patient.

investigations épidémiologiques plus approfondies

infection au laboratoire possible

CONCLUSIONCONCLUSION

Technique RFLP : Existence de 3 grands Technique RFLP : Existence de 3 grands groupes mettant en évidence un taux de groupes mettant en évidence un taux de transmission importanttransmission important

Malgré le faible degré de polymorphisme, Malgré le faible degré de polymorphisme, aucune relation retrouvée entre:aucune relation retrouvée entre:les 3 différents clustersles 3 différents clustersl’âgel’âgele tropisme des tissusle tropisme des tissusorigine géographiqueorigine géographique

• A mis en évidence : Des contaminations de laboratoire Recherche de source d’infection Association RFLP et résistance primaire

• RFLP méthode de référence : Différenciation réinfection et rechute Établir la transmission de souches sensibles ou résistantes Déterminer la nature nosocomiale d’une épidémie

• Surveillance de la résistance primaire et secondaire couplée à l’analyse RFLP devrait être poursuivie à long terme afin d’évaluer la performance du traitement antituberculeux

Merci pour votre attention