Biochimie, 68 (1986) 779-785 © Socift6 de Chimie biologique/Elsevier, Paris

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Esp ces activ6es radicalaires de l'oxyg ne

Christiane FERRADINI

Laboratoire de Chbnie Physique, Universitd Rend-Descartes, 45 rue des Sahlts-Pbres, 1:-75270 Paris Cedex 06, France

(Recu le 18-2-1986, acceptd aprbs revision le 19-3-1986)

R6sum6 - Les esp~ces radicalaires provenant de la r6duction de l'oxyg~ne sont fr6quemment form6es lors des r6actions de photosensibilisation. Les propri6t6s thermodynamiques et cin&iques de l 'anion super- oxyde et du radical hydroxyle sont ici bri6vement rappel6es.

radicaux libres / radical superoxyde / radical hydroxyle

S u m m a r y - Oxygen free radicals. Oxygen free radicals are often formed during photosensitization pro- cesses. Kinetic and thermodynamical characteristics are briefly described for OH and 0=2 radicals.

oxygen free radicals I superoxide ion I hydroxyl radical

Les r6actions de photosensibilisation impliquent fr6quemment la formation de radicaux libres d&ivant de l'oxyg~ne. On salt que le processus ini- tialement invoqu6 lors des r6actions de photosen- sibilisation dites de type I e s t un 6change mono61ectronique. Cet &hange conduit fi la for- mation, h partir du substrat, de radicaux libres selon par exemple:

3S+RH --* SH" +R"

ou bien:

3S + RH --, S .+ + RH-

ou encore:

3S+RH ~ S7 + R H .+

3S symbolisant l'6tat triplet du photosensibilisa- teur, RH le substrat.

Un rapide r66quilibrage acido-basique peut 6ven- tuellement se produire ensuite, ce qui ne modifie pas la nature radicalaire des esp&es en jeu.

D'autre part, le ph6nom~ne de photoionisation

peut conduire, ~t partir du sensibilisateur, h l'6jec- tion d'61ectrons. Apr6s thermalisation, ces 61ectrons se solvatent et se transforment en 61ectrons hydra- tfs e~q.

Les esp&es radicalaires pr&6dentes r6agissent leur tour sur l'oxyg~ne atmosph&ique et donnent naissance ~ des peroxyradicaux RO~ et h l 'anion superoxyde O~ :

R" + O z ~ RO~

R H - + O 2 ~ R H + O ~

RH.++O2 .-. RO~+H +

e~q+O2 --,O~

L'6volution ult6rieure conduit/~(aux) forme(s) oxy- d6e(s) stable(s) du substrat RH. Cette ~volution peut impliquer transitoiremen~ l'existence du radi- cal OH' , comme nous le verrons.

Pour les processus de photosensibilisation dits de type II, l'acte initial est un transfert d'6nergie d'excitation:

3S+302 --, IO2+1S

780 C. Ferradini

I1 n'implique donc pas la formation primaire de radicaux libres. Mais l'oxyg6ne singulet peut ensuite jouer le r61e d'oxydant, ce qui entrMne l'apparition d'anions superoxyde [1] :

I o 2 + x ---* O ~ + X +

Des essais ont 6t6 effectu& afin de mettre en 6vi- dence I'existence de radicaux libres oxyg6n6s lors des processus de photosensibilisation. Dans le cas des porphyrines, des exp6riences de <<spin- trapping>> ont conduit ~ admettre la formation de O~ [2,3] et de OH" [3,4] tandis que, par photolyse-&lair, la pr&ence de eaq pr6curseur de OF a pu &re constat6e [5]. Toutef6is l 'emploi des capteurs traditionnels de O~ s'est, dans un cas analogue, r6v616e inefficace [6].

tr6s sp&ifiques des r6actions d'oxydation par l'oxy- g~ne a permis ~t la mati6re vivante d'utiliser l'enthal- pie libre correspondante.

En fait ces quatre 41ectrons ne sont pas &hang& en une seule &ape, mais le plus souvent en quatre processus 616mentaires cons&utifs: - la premi6re r6duction conduit h l ' ion radical

superoxyde 0 F :

0 2 + e ~ O~

- la deuxi6me ~t l 'eau oxyg4n4e:

O ~ + e + 2 H + --* H 2 0 2

- la troisihme au radical hydroxyle:

H 2 0 2 + e + H + ~ O H ' + H 2 0

1) Couples oxydo-r6ducteurs impliqu6s dans la chimie radicalaire de l'oxyg~ne

Pour mieux estimer la part radicalaire dans les ph6- nom~nes de photosensibilisation, il semble utile de pr&iser la nature et les caract6ristiques des r6ac- tions d'oxydo-r6duction qui sont alors mises en jeu.

Le couple global d'oxydo-r6duction O2/H20 correspond ~ l'6change de quatre 61ectrons:

O 2 + 4 e + 4 H + --' 2 H20

Son potentiel s tandard biologique d 'oxydo- r6duction (h pH 7) est Eo= 0,82 V. Cette valeur 41ev4e montre que, lorsque l'oxyg~ne capte quatre 61ectrons, cette r6duction s'accompagne d 'une lib4- ration d'enthalpie libre bien sup6rieure ~ celles habi- tuellement mises en jeu lors des diverses r6actions biologiques. Heureusement l 'oxyg6ne r6agit avec une vitesse faible ou nulle sur la plupart des com- pos4s biochimiques. C'est ce blocage cin6tique qui a permis le dUicat passage de la vie ana6robie ~ la vie adrobie, lorsque l 'atmosph6re terrestre, initia- lement r~ductrice, s'est enrichie en oxyg~ne au cours de rdactions photochimiques. La mise en place pro- gressive de catalyses trhs compartiment6es et

- enfin le quatrihme h H20:

O H ' + e + H + ~ - H 2 0

Ces quatre &apes font passer les deux atomes d'oxyghne du degr6 d 'oxydation 0 au degr6 d 'oxy- dation - 2. I1 est possible d'envisager ensuite la r4duction des deux hydrog6nes de l 'eau en H 2, r6duction qui ne se produit que rarement en prd- sence d'oxyg6ne.

La s6quence pr6c6dente de r6ductions peut donc s '&rire comme dans l'exemple du Sch6ma 1. On y remarque l'alternance r6guli6re et pr6visible entre les produits mol6culaires (O z, H20 2, H20, H2) et les produits radicalaires (O F, OH' , H') .

Dans Ie cas de Ia r6action envisag6e pr6c6- demment:

R ' + O 2 ~ RO3

R" &ant un radical libre form6 h partir d 'un subs- trat RH, les r6ductions successives de l 'oxyghne peuvent s'6crire, par analogie avec la s6quence pr6- c~dente, un groupement R rempla~ant nn atome d'hydrog6ne (2):

O 2 -* RO~ --, ROOH --, OR" --, ROH --, R" --, RH

SeMma 1.

02 +e+H*l, Og +e+2H~ H202 e+H+ OH"

I 0 2 + 4 e + 4 H + --, 2 H20

+e+H; H20 +e+H~. H" +e+H~. H2

I I J 2 e + 2 H + -, H 2

Espbces activdes radicalaires de l'oxygbne 781

c'est-~-dire que sont successivement form&: - un peroxyradical RO~ - un hydroperoxyde ROOH - un radical alcoxy OR" - une fonction hydroxyle - un radical R" - un produit stable RH.

I1 semble utile de pr6ciser les principales donn6es thermodynamiques et cin6tiques actuellement 6ta- blies permettant de caract6riser les 6changes 61ec- troniques pr6c6dents.

2) Donn6es thermodynamiques

Dans le cas du Sch6ma 1, les potentiels d'oxydo- r6duction sont bien connus (voir [7, 8]). Pour une solution aqueuse ~ pH 7 et une pression partielle d'oxyg~ne 6gale h une atmosph6re, leurs valeurs (en volts) sont les suivantes, en nous limitant cette fois aux esp~ces de l'oxyg~ne:

i 2- 0.33 02 0'94H,O 2 0,46 OH 2,18 H20

0,305 t I 1.32 0,82 [

On peut v&ifier que deux potentiels d'oxydo- r~duction cons6cutifs correspondant ~ l'6change d'un 61ectron (Em et E2/3) sont bien li6s au poten- tiel E m de l'6change bi-61ectronique associ6 par la relation classique:

El 12 + E213 E l l 3 =

2

coup moins pour i'6change du premier 6lectron ( - 0,33 V). C'est ce blocage qui est un des respon- sables de l'absence partielle de r6activit6 du couple O2/H20. En effet, de nombreuses r6actions de l'oxyg~ne ne se produisent pas, bien qu'6tant ther- modynamiquement favorables. Ceci assure la rela- tive stabilit6 du mat6riel biologique en pr6sence d'air et permet que seules des oxydations contr6- 16es aient lieu. La photosensibilisation facilite le pre- mier 6change d'~lectron soit, comme on l'a vu, en formant directement O~, soit en produisant l'oxy- g6ne singulet, ce qui d6clenche dans Ies deux cas le processus oxydatif. c) La connaissance des potentiels d'oxydo-r6duction permet de s61ectionner les r6actions thermodyna- miquement possibles. Citons en particulier:

+ H ÷ O ~ + H202 ~ OH" + 0 2 + H20

dite r6action de Haber et Weiss (OF r~duisant H202);

OH" + H202 --r HO~ + H20

(OH" oxydant H202). Les r6actions de dismutation de O~ et OH" sont

6galement exergoniques :

2H ÷ O~+O~ ~ H202+O2 (puisque 0,94 > 0,33 V)

O H + O H --. H202 (puisque 2,18 > 0,46).

H202 peut se dismuter uniquement par 6change de deux 61ectrons :

Les propri6t6s acido-basiques de ces esp~ces sont aussi connues. Les valeurs des pk a sont:

Acide Base pk a

HOi O~ 4,8 OH" O" 11,9 H202 HO~ 11,7

On voit donc que, ~ pH 7, seul HOt est dissoci6: c'est l'anion superoxyde O~ qui pr6domine.

Les donn6es pr6c6dentes sugg6rent plusieurs remarques : a) Le radical OH" est un oxydant tr~s fort, tandis que O~ peut jouer le r61e d'oxydant ou de rdducteur. b) L'oxyg~ne, tr& oxydant si l'on consid~re la r6ac- tion globale (0,83 V), l'est moins pour l'6change de deux premiers 61ectrons (0,305 V) et encore beau-

2 H202 ~ 02 + 2 H20

et non par la r6action radicalaire:

2 H202 --. Og + O H ' + O H -

d) Le diagramme potentiel - pH peut ~tre construit pour chacun des couples oxydo-r6ducteurs impli- qu6s (Fig. 1), ce qui permet de pr6voir leurs r6ac- tions ~ tous pH.

Les donn6es thermodynamiques ne sont toute- fois pas suffisantes pour pr6voir de fa~on univo- que les r6actions pouvant survenir entre les esp~ces consid6r6es et un solut6. Ainsi si on consid6re le comportement de l'anion superoxyde O~ ~ pH 7 vis-a-vis d'un couple S+/S dont le potentiel d'oxydo-r6duction est compris entre - 0,33 et 0,94 V, ce qui est un large intervalle, on volt qu'en plus

782 C. Ferradini

2 4 - - -

o >

+1

0 ! !

HO'~2 ,5 02 10 pH 0g

Fig. 1. Diagramme potentiel pH des esp~ces d6riv6es de l'oxyg6ne.

de la dismutation, deux autres r6actions sont ther- modynamiquement possibles :

O~-+S + .-, S + O 2

2H ÷ O~+S J'S + + H 2 0 z

Selon les concentrations en Se t S + et les constan- tes de vitesse de ces r6actions, l 'une ou l 'autre d'entre elles se produira pr6f6rentiellement. Le con- tr61e du m6canisme r6actionnel est donc cin6tique. Tel est souvent le cas, ce qui a conduit ~ effectuer sur les esp~ces envisag6es ici un grand nombre de d6terminations cin6tiques, soit en d6veloppant des comp6titions, soit par photolyse ou radiolyse 6clair.

3) Donn~es cin6tiques

Les deux radicaux libres produits par r~duction de 0 2 ont des physionomies cin6tiques tr~s diff6ren- tes. En effet l'esp~ce OH" est un oxydant tr~s r6ac- tif tandis que O~ est relativement inerte.

a) Anion superoxyde

(Pour les donn6es cin6tiques sauf autre indication de O~ voir [9].) iorsqu'on consid~re la r6action de dismutation de O~:

2H + O g + O ~ ~. H202 + O 2

on constate que, bien qu'exergonique, cette r6ac- tion ne se produit pas, par suite d 'un blocage cin6- tique justifi6 par la difficult6 de recouvrement des orbitales impliqu6es [10].

Au contraire les deux r6actions de dismutation faisant intervenir la forme acide HO 2 sont rapides:

H O t + H O t -~ H202+ O 2

(k = 7,6 x 10 5 mol - l- l .s- 1)

+ H ÷ HO~ +O g ' H2Oz+O 2

(k= 8,5 x 107 mol - l . l .s- l)

O~ ne peut donc se dismuter que par capture d 'un proton. En consdquence, l 'anion superoxyde est sta- ble dans les solvants aprotiques tels que l'ac6toni- trile ou le dim6thylsulf0xyde. O~ ne r~agit pas ou r6agit lentement sur: - l 'acide ddoxyribonucl6ique - les acides amin6s - les lipides - le couple N A D + / N A D H sauf si celui-ci est

complex6 par la lactate d6shydrog6nase. L' ion superoxyde O~ peut provoquer certaines

r6ductions. Ainsi il r6agit sur le cytochrome c sous sa forme ferrique (k= 1 ,4x 106 mol - l . l . - I ) ainsi que sur la m6th6moglobine ( k = 1 , 4 x 103 mol- l . l . s -1) [11].

I1 r6duit diverses quinones avec des constantes de vitesse de l 'ordre de l0 s - 109 mol- l.l.s - l , rdac- tion souvent limit6e par la r6action inverse d 'oxy- dation du radical semiquinone par 02:

+H * O~ + Q~------~ QH" + 02

- - H +

I1 rdduit rapidement les ions Cu 2+ (8x109 mol-I . l .s-1) et les superoxyde dismutases ( -2 x 109 mo l - l . l . s - l ) .

L 'anion superoxyde donne en solution aqueuse quelques r6actions d 'oxydation dont les principa- les sont :

acide ascorbique (pH 9,9) [12] adr6naline [13] collag~ne [14] glutathion [15] hydroquinone NADH-lactate d6shydrogdnase superoxyde dismutase Cu +

k (mol- M.s- 1) 1,5 x l0 s 5 ,6x 104 2,4 x 106 22 1 ,6x 107 3 ,6x 104 22 x 109

Espkces activ~es radicalaires de l'oxygbne 783

La relative inertie de O~ ne doit pas n6anmoins conduire fi conclure que ce radical est inactif au point de vue biologique. En effet dans l'organisme, ce radical n'est pr6sent qu'h des concentrations sta- tionnaires faibles. On peut penser que son manque de r6activit~ lui permet de diffuser hors de son lieu de production et d 'atteindre des cibles particulari- s&s. Sa r6gulation dans l'organisme est assur6e par la superoxyde dismutase, enzyme qui catalyse la r~action:

2H + o ~ + O ~ ~' H202+ O 2

bien connu que la r6duction biologique de l 'oxy- g6ne conduit fi des processus oxydants diff&ents de ceux associ6s h la cha~ne mitochondriale, comme par exemple la peroxydation lipidique ou certains effets bact6ricides lors de la phagocytose. II sem- ble difficile d 'admettre que, dans tous les cas, l 'anion superoxyde puisse &re le responsable direct de telles oxydations. Deux hypoth&es ont &6 avan- c6es pour r6soudre cette question: 1) La formation de O~ entraTnerait celle de OH" Nous avons vu en particulier que, lors de la photo- sensibilisation des porphyrines, la prfsence de OH" a 6t6 signal6e. I1 en est de m~me pour la phagocy- tose. I1 a 6t6 sugg6r6 que cette production serait due ~t la r6action dite de Haber et Weiss d6j~ cit6e:

b) Le radical hydroxyle [16]

Le radical OH" est, au contraire, tr~s r6actif. On conna~t plus d 'un millier de constantes de vitesse de r6action d 'oxydation par OH' . Seuls quelques exemples peuvent &re donn6s ici. L'oxydation peut &re produite par divers m&anismes: - soit par &hange d'61ectrons:

O H ' + F e 2+ ~ O H - + F e 3+ ( k = 3 x 10 s mol - i . l . s -1)

OH" + C N - ~ O H - + CN" (k = 4,5 x 10 9 mo l - M.s- 1)

- soit par arrachement d 'atomes H :

k ( m o l - t . l . s - 1)

acide ascorbique 1.2 × 101° cyst6ine 1,3 × 101° ribose 2,1 × 109 thymidine 2,1 × 109

- soit par addition sur les doubles liaisons ou les cycles aromatiques:

k ( tool- l . l .s- t)

adfnine 5 x 109 benz6ne 7,8 × 109 &hyl6ne 1,8 x 109 thymine 5 X 109 tyrosine 2,2 × 101°

+ H + O~ + H20 2 I, O H ' + O 2

I1 s'est toutefois av6r6 que cette r6action &ait exces- sivement lente. I1 a alors 6t6 invoqu6 la possibilit6 d 'une catalyse par des ions Fe 3+, plus ou moins complex6s, toujours pr&ents ~ l '&helle cellulaire. Cette catalyse ferait intervenir les deux r6actions:

Fe 3++Og ~ F e 2 + + O 2

Fe 2+ +H202 ---, Fe 3+ +OH" + O H -

2) On peut calculer que, pour pH 7, le rapport (HO2)/(O~) = 6,3 × 10 -3.

Le radical HO 2 est plus r6actif que O~ comme on peut le voir sur les exemples suivants:

k (mol- l-l.s- l)

HO~ O~

acide ascorbique 1,25 × I06 1,5 × l0 s acide linol6ique 1,18× 103 0 NADH 1,8 × 105 << 24

De telles diff&ences peuvent amplement compen- ser le rapport d6favorable des concentrations aux pH voisins de la neutralitC De plus, HO~ n ' f tant pas charg6, pourrait avoir une interaction pr6f6ren- tielle avec les membranes lipidiques. HO~ pourrait donc &re responsable de divers d6g~ts biologiques [17,181. 3) La cha~ne 2, que nous avons d6jb, 6voqufe:

Le radical OH' , ~ l'inverse de O~, a donc toute probabilit6 de r6agir in vivo ~ proximit6 imm6dkite de son lieu de production. Cette r6activit6 compa- r6e de O~ et de OH" soul&e un probl~me. I1 est

0 2 "-" RO 2 "-* ROOH ~ OR ~ ROH "* R --" RH

est &idemment beaucoup moins bien connue, ses propri&~s dfipendant de la nature du radical R'. Les

784 C. Ferradini

r6actions biradicalaires sont thermodynamiquement possibles et souvent rapides:

RO~ + RO~ ~ ROOR + 0 2

R + R ~ R 2

Pour les lipides, les deux r6actions:

RO~+RH ~ R O O H + R "

R ' + O 2 --* RO;

sont responsables de chMnes de peroxydation. La pr6sence d'ions Fe z+ conduit h u n auto-entretien de cette cha]ne:

+ H +

ROOH + Fe z+ • Fe 3+ + OR" + H20

OR" initiant ensuite une nouvelle s6quence. Par ail- leurs, la r6action:

R" + 02 -~ RO~

est souvent consid&& comme une voie de poten- tialisation d 'un d6g~t radicalaire biologique, sus- ceptible de rfparations au stade R" et irr6parable au stade RO~. 4) R6gulations biologiques: Les esp&es dont la physionomie chimique vient d '&re rapidement esquiss& jouent in vivo des r61es dont on d6cou- vre de jour en jour toute l ' importance. Leur pro- duction biologique peut avoir lieu par plusieurs voies :

- par photosensibilisation, comme nous l 'avons v u ;

- par action des rayonnements ionisants; - au cours du m&abolisme de l'oxyg~ne. Une frac-

tion non n6gligeable de l'oxyg~ne inspir6 passe par l'6tat 0 2 ;

- au cours des m&abolismes de divers toxiques (C2HsOH) et de certains m6dicaments (antitu- moraux par exemple).

Ces radicaux libres, selon leur origine et leur loca- lisation, peuvent jouer des r61es n6fastes ou utiles. Les cons6quences n6fastes sont des ruptures de chMne des acides nucl6iques, l'alt6ration des mem- branes, l'inactivation d'enzymes, etc. Mais ces radi- caux libres sont aussi impliqu6s dans des processus biologiques fondamentaux tels que la phagocytose, la biosynth6se des prostaglandines et diverses autres oxydations.

Leurs r6gulations sont assur&s, de mani&e tr6s stricte par tout un ensemble de mol&ules, en plus de la superoxyde dismutase, d6jh 6voqu6e plus haut.

Citons : - la catalase, qui d6compose l 'eau oxyg6n6e for-

m6e par la dismutation de 02 ou au cours de l 'action oxydante de ce radical:

catalase

2 H202 • H20 + 02

- le glutathion, qui contribue (lui aussi) efficace- ment fi la diminution de I'6tat stationnaire en H202 par le processus:

glutathion

2 GSH + H202 • GSSG + 2 H20 peroxydase

Le glutathion est de plus connu comme un capteur efficace de radicaux libres:

G S H + R" --* G S ' + RH

2 GS" --, GSSG

- la vitamine E (c~ tocophdrol), qui r6agit sur les radicaux de type RO z propageant les chMnes de peroxydation. Elle serait rdg6ndr6e par la vita- mine C;

~TH + RO 2 ~ ocT" + RO2H

c¢T'+vit C --' vit C'+~xTH

Les effets biologiques des esp&es activ6es radica- laires d&ivant de l'oxyg~ne, varient profond6ment selon le mode de production de l 'esp&e consid6- r6e. I1 est par exemple int6ressant de comparer ~t ce point de vue i'efficacit6 des ions superoxyde pro- duits lors du m6tabolisme de l'oxyg~ne et celle des m~mes radicaux provenant de la radiolyse de l'eau. Si on admet que 1°70 des 02 inspir6s passent l '&at de 0 2 (valeur probablement sous-estim6e), on peut calculer qu'il faudrait une dose de 30 krad pour former, dans les m~mes conditions, la m~me quantit6 de radicaux. Or 30 krad repr6sentent une dose extr~mement dangereuse. Les radicaux d'ori- gine biochimique sont donc beaucoup moins toxi- ques que les radicaux de provenance radiolytique. Cette diff&ence peut &re attribu& au fait que les radicaux d'origine biochimique sont produits dans des compartiments off les dispositifs de contr61e sont 6troitement associ6s aux sites de production.

On conqoit alors mieux tout l'int6r& de la pho- tosensibilisation. Cette m&hode consiste fi utiliser un agent de faible entropie, de haute information, pour produire des concentrations stationnaires 61ev&s en radicaux en des lieux habituellement

Espkces activ~es radicalaires tie l 'oxygkne 785

d6pourvus de radicaux et donc de r.6gulation. L'effi- cacit6 des esp6ces radiculaires ares1 creees peut alors 6tre extr~mement importante.

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