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BTS BIOPHYSICIENS ETSL

2014/2015

TRAVAUX PRATIQUES de BIOCHIMIE PROTOCOLES et COMPTE RENDUS C. SAUNIER

C. SAUNIER 2biophysiciens version 2014-2015

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Table des matières

TP n° 1 : Le FER ................................................................................................................................. 3

Protocole et compte rendu ........................................................................................................... 7 TP N°2 : Les PROTEINES ............................................................................................................. 11

Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 14

TP N° 3 : PHOSPHATES et CHOLESTEROL ............................................................................. 24 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 26

TP N° 4 : LA BETAGALACTOSIDASE ......................................................................................... 32 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 34

TP N° 5 : L’ACIDE URIQUE ........................................................................................................... 39

TP n° 6 : DOSAGES DE L’ASPARTATE, DE L’ASPARAGINE ET DE L’ACIDE GLUTAMIQUE ................................................................................................................................. 42

Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 43

TP N° 7 : DOSAGES du GLUCOSE, du FRUCTOSE et du SACCHAROSE ............................ 51 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 55

TP n° 8 : REVISIONS GENERALES ............................................................................................. 64 Protocole et compte rendu ........................................................................................................ 65


TP 1 : Le FER page 3/71

TP n° 1 : Le FER Le fer, est un élément chimique, de symbole Fe et de numéro atomique 26. C'est le métal de transition et le matériau ferromagnétique le plus courant dans la vie quotidienne, sous forme pure ou d'alliages. Le fer pur est un métal mou (davantage encore que l'aluminium), mais l'adjonction de faibles quantités d'éléments d'additions (quelques pourcents) le rend considérablement plus dur. Allié au carbone et avec d'autres éléments d'additions, il forme les aciers dont certains peuvent être mille fois plus durs que le fer pur. Propriétés chimiques principales

1. Oxydation du métal Le fer, combiné à l'oxygène, s'oxyde, suivant les conditions en trois oxydes de fer :

• l'oxyde de fer (II) FeO (« oxyde ferreux »), • l'oxyde de fer (III) Fe2O3 (« oxyde ferrique »), • l'oxyde de fer (II, III) Fe3O4 (« oxyde magnétique »).

À l'air libre en présence d'humidité, il se corrode en formant de la rouille.

2. Les ions du fer en solution aqueuse En solution aqueuse, l’élément chimique fer est présent sous forme ionique avec deux valences principales :

• Fe2+ (l'ion fer (II), anciennement appelé ferreux) : suivant l'environnement chimique en solution, il peut prendre différentes couleurs. La solution obtenue par dissolution de sel de Mohr, par exemple, présente une couleur vert pâle. Une telle solution est stable pour les pH inférieurs à 6. Pour un pH supérieur à cette valeur, l'hydroxyde de fer (II) Fe (OH)2 précipite ;

• Fe3+ (l'ion fer (III), anciennement appelé ferrique) : les solutions de chlorure de fer (III) sont oranges, et celle de nitrate de fer (III) sont incolores. Ces solutions doivent avoir un pH inférieur à 2 car l'hydroxyde de fer (III) Fe (OH)3 est peu soluble.

3. Oxydoréduction des ions du fer

L'oxydoréduction est une manière de titrer les ions fer (II), par exemple par les ions cérium (IV) (couple Ce4+/Ce3+) ou par les ions permanganate MnO4

- (couple MnO4- / Mn2+ en milieu

acide sulfurique).

4. Complexation des ions fer De nombreux complexes du fer en solution aqueuse se forment facilement, par simple addition du ligand (au bon pH). Parmi les complexes les plus courants se trouvent ceux impliquant les ligands :

• ion cyanure CN- : o pour Fe (II) : Fe (CN)6

3-, ion hexacyanoferrate (II), jaune ; o pour Fe (III) : Fe (CN)6

2-, ion hexacyanoferrate (III), orange ; Ces complexes permettent de préparer le bleu de Prusse.



• ion fluorure F- : en chimie analytique, ce complexe permet de marquer la couleur des ions fer (III).

• 1,10-phénantroline (o-phen en abrégé) pour Fe (II) : Fe(ophen)3

2+, rouge, ions triorphophénantrolinefer(II) pour Fe (III) : Fe(ophen)3

3+, vert, ions triorphophénantrolinefer(III) Le couple redox constitué de ces deux complexes est utilisé comme indicateur de titrage d'oxydoréduction.

• ions thiocyanate SCN- : pour Fe (III) : Fe (SCN)2+, rouge sang, ion thiocyanatofer (III) ; Ce complexe permet de mettre en évidence de petite quantité d'ion fer (III) en solution grâce à sa couleur caractéristique.

Rôles et utilisation 1. Complexe bioinorganique : L'hémoglobine du sang est une métalloprotéine constituée d'un complexe du fer (II). Ce complexe permet aux globules rouges de transporter le dioxygène des poumons aux cellules du corps. La solubilité du dioxygène dans le sang est en effet insuffisante pour alimenter efficacement les cellules. Ce complexe est constitué d'un cation Fer (III) complexé par les quatre atomes d'azote d'une porphyrine et par l'azote d'un résidu histidine appartenant à la chaîne protéique. Le sixième site de complexation du fer est soit vacant, soit occupé par une molécule de dioxygène. Il est notable que le fer (II) fixe une molécule de dioxygène sans être oxydé. Cela est dû à l’encombrement du fer par la protéine. 2. Composant de l’acier : Le fer n'est pratiquement pas utilisé à l'état pur (hormis pour résoudre certains problèmes de soudabilité, notamment sur aciers inoxydables). C'est le principal élément entrant dans la composition de l'acier. Le fer métallique et ses oxydes sont utilisés depuis des décennies pour fixer des informations analogiques ou numériques sur des supports appropriés (bandes magnétiques, cassettes audio et vidéo, disquettes). L'usage de ces matériaux est cependant désormais supplanté par des composés possédant une meilleure permittivité, par exemple dans les disques durs. 3. Dans l'alimentation Le fer est un oligo-élément et fait partie des sels minéraux indispensables qu'on retrouve dans les aliments, mais peut être toxique sous certaines formes. On le retrouve dans la bière, le vin blanc ou rouge…. 4. En pharmacie Le fer est utilisé pour la préparation de médicaments. Du XVIIe siècle au début du XXe siècle, il était l'un des principaux composants des boules d'acier vulnéraires, boules de Nancy, boules de Molsheim, boules minérales des Chartreux, qu'on faisait tremper dans de l'eau pour la charger en substances réputées bénéfiques. Importance biologique Le fer est essentiel au transport de l'oxygène et à la formation des globules rouges dans le sang. Il est un constituant essentiel des mitochondries, puisqu'il entre dans la composition de



l’hème du cytochrome C. Il joue aussi un rôle dans la fabrication de nouvelles cellules, d'hormones et de neurotransmetteurs. Absorption Le fer contenu dans les végétaux (fer dit « non héminique ») Fe3+ ou fer ferrique est moins bien absorbé par l'organisme que celui contenu dans les aliments crus d'origine animale (fer « héminique ») Fe2+ ou fer ferreux. La cuisson des viandes transforme une partie du fer héminique en fer non héminique, moins biodisponible. Toutefois, l'absorption du fer est favorisée si on le consomme avec certains nutriments, comme la vitamine C ou le jus de citron1. En revanche son absorption est inhibée par la consommation de thé et/ou de café car les tanins (polyphénols) sont des chélateurs de fer. Les buveurs de thé en très grande quantité ont donc parfois des anémies ferriprives. Proportion et Toxicité L'accumulation de fer dans l'organisme entraîne la mort cellulaire. Des chercheurs de l'INSERM suspectent, à cause de cela, que l'excès de fer pourrait être impliqué dans la dégénérescence des neurones chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Une carence en fer est source d'anémie et peut affecter le développement cognitif et socio-émotionnel du cerveau de l'enfant ou exacerber les effets de certaines intoxications (saturnisme par exemple). Pour la femme en ménopause et l’homme adulte, les apports journaliers recommandés de fer sont de 10 mg ; ce besoin nutritionnel est de 16 à 18 mg pour la femme de sa puberté à la ménopause.

Questions préliminaires Première Partie : DETERMINATION de la LONGUEUR d’ONDE OPTIMALE

• Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 7 tubes s’étalant régulièrement de 0 à 30 µg/tube à partir d’une solution de fer II à 20 mg.L-1. Le volume final de chaque tube est de 10 mL.

Comment allez-vous procéder pour réaliser vos tubes étalon (dilution de l’étalon, volumes d’étalon à prélever)

o Dilution de l’étalon (formule littérale, application numérique et matériel utilisé)

o Volumes d’étalon à prélever (exemple de calcul pour le tube coloré 4)

• Explicitez votre critère de décision pour le choix de la longueur d’onde de travail.

1 Mettre du jus de citron sur ses aliments est donc une excellente habitude culinaire si l'on manque de fer ; par contre, un complément en vitamine C est inutile si l'on ne souffre pas de carence en vitamine C (la carence extrême est le scorbut), même si cela ne peut pas mener à une hypervitaminose puisque la vitamine C est hydrosoluble (et donc son surplus s'élimine par la sudation et la voie urinaire).



Deuxième partie : DOSAGE d’une SOLUTION de FER par la METHODE à l’ORTHOPHENANTROLINE

• Votre solution inconnue est comprise entre 6,00 à 12,0 mg.L-1. Afin de la doser, il est nécessaire de la diluer avant de l’utiliser. Comment allez-vous procéder ? (formule littérale, application numérique et matériel utilisé)

• La limite de linéarité de cette méthode est de 3 mg.L-1. Que signifie cette

information ?



Protocole et compte rendu Le but de ce TP, en deux parties, est de mettre en évidence l’application de la spectrophotométrie dans les dosages biochimiques en :

• déterminant la longueur d’onde de travail à utiliser pour doser l’élément fer contenu dans un échantillon de bière ;

• dosant par la méthode colorimétrique à l’orthophénantroline le fer II contenu dans l’échantillon de bière.

Première Partie : DETERMINATION de la LONGUEUR d’ONDE de TRAVAIL

1. Principe L'ion fer II étant incolore, pour pouvoir utiliser la spectrophotométrie d’absorption moléculaire, dans le visible pour le doser, il faut le complexer par l'orthophénantroline qui est très stable dans le temps en milieu légèrement acide.

Fe 2+ + 3 C12H8 N2 ----->[ ( C12 H8 N2 )3 Fe ] 2+

Le complexe obtenu est stable 6 mois, indépendant du pH s'il est compris entre 2 et 9. Un tampon redox au chlorhydrate d'hydroxylamine ou à l'hydroquinone empêche le fer II de s'oxyder en fer III. Le dosage de l’ion fer II se réalise alors dans le domaine du visible par mesures spectrophotométriques et par report sur une gamme d’étalonnage fabriquée à partir d’une solution étalon contenant une concentration bien définie de fer II. Cette gamme d’étalonnage sera mesurée dans les meilleures conditions expérimentales : temps d’attente à l’obscurité, longueur d’onde optimale… Dans cette première partie de TP, nous nous proposons de déterminer graphiquement cette longueur d’onde optimale qui correspond à la longueur d’onde à laquelle la solution colorée mesurée absorbe au maximum (sensibilité maximale).

2. Préparation de la gamme d’étalonnage Les réactifs utilisés sont :

• solution de chlorhydrate d'hydroxylamine à 10 g.L-1 ; • solution d'orthophénantroline à 2 g.L-1 dans l'éthanol ; • solution tampon pH 4 (acide acétique /acétate de sodium) ; • solution étalon mère d'ions fer II à 200 mg.L-1 préparée à partir de sulfate

double de fer et d'ammonium hexahydraté (sel de Mohr) ; • solution inconnue de bière dégazée.

Protocole : Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 7 tubes s’étalant régulièrement de 0 à 30 µg/tube à partir d’une solution de fer II à 20 mg.L-1. Votre solution inconnue est comprise dans une fourchette de 6,00 à 12,0 mg.L-1. Vous devrez alors préparer 3 tubes « inconnue » de prise d’essai à calculer.



Les volumes de réactifs, à mettre dans l’ordre, sont les suivants : • 1 mL de tampon dans tous les tubes ; • 0,2 mL de chlorhydrate d’hydroxylamine dans tous les tubes ; • 0,5 mL d’orthophénantroline dans tous les tubes.

Le volume final de chaque tube est de 10 mL. Le diluant à utiliser est l’eau ultrapure.

3. Recherche de la longueur d’onde optimale • Mélanger les tubes et attendre au moins 15 minutes à l’obscurité ; • La lecture se fera dans des macrocuves en plastique de 1 cm de trajet optique ; • Choisir une des solutions colorées de la gamme d’étalonnage réalisée ; • Saisir son spectre dans le domaine du visible contre une cuve contenant de l’eau

ultrapure ; • Déterminer par le logiciel la longueur d’onde optimale ; • Rendre le graphe obtenu légendé correctement.

4. Conclusion Deuxième partie : DOSAGE d’une SOLUTION de FER par la METHODE à l’ORTHOPHENANTROLINE

1. Principe Lorsque la bière présente une mousse grisâtre et une mauvaise stabilité colloïdale, on suspecte une pollution par le fer au cours de la fabrication. La bière contient habituellement 0,1 mg de fer par litre. A partir de la longueur d’onde déterminée précédemment, il s’agit de déterminer la concentration en ions fer II de la solution inconnue par la gamme d’étalonnage réalisée précédemment.

2. Tableau de la gamme d’étalonnage Complétez le tableau de mode opératoire et détaillez vos calculs pour le tube étalon n° 4. Tous les volumes sont en mL.



Tubes 0 1 2 3 4 5 6 X

Quantité en /tube

Vol. étalon à mg.L-1

Vol. inconnue au

Vol. tampon 1 1 1 1 1 1 1 1

Vol. eau 5 5 5 5 5 5 5 5

Vol. de chlorhydrate d’hydroxylamine

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Vol. orthophénan-troline

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Vol. eau qsp 10 mL

Conc en mg.L-1 (après réactif)

Incubation

Abs à nm

Calculs sur le tube étalon n° 3 : ΔQ Volume étalon Volume eau Conc. Etalon (après réactif)

3. Résultats : analyse et conclusion A partir des résultats, rendre le graphe abs = f (concentration de fer II) correctement légendé et exploité.



Déterminer la concentration de la solution inconnue fer en mg.L-1 avec 4 chiffres significatifs. Noter le résultat en première page du rapport. Conclure. Calculs pour X (formule littérale et application numérique) : Conclusion :


TP 2 : LES PROTEINES page 11/71

TP N°2 : Les PROTEINES Les protéines appartiennent à une des plus importantes classes de molécules présentes dans tous les organismes vivants et les virus. Elles assurent l’essentiel des fonctions de la cellule. Elles existent sous différentes formes :

• Les enzymes ; • Les hormones ; • Les récepteurs ; • Les neurotransmetteurs, etc.

Elles sont classées selon deux catégories :

• Les holoprotéines : polypeptide constitué uniquement d’acides aminés : ! Les protéines globulaires comme l’albumine, la globuline, les histones ; ! Les protéines fibrillaires, soit solubles telles que le fibrinogène, la myosine,

l’actine, soit insolubles comme le collagène, la kératine, la fibroïne ;

• Les hétéroprotéines : protéine constituée d’une partie protéique, l’apoprotéine (composée d’acides aminés), et d’une partie non protéique appelée groupement prosthétique (cofacteurs fixés durablement) :

! Les chromoprotéines comme l’hémoglobine ; ! Les lipoprotéines ; ! Les glycoprotéines ; ! Les phosphoprotéines telles que la caséine, les protéines de chromatine, la

phosvitine.

Les protéines sont donc un enchaînement d’au moins 100 acides aminés. Ces derniers sont liés par une liaison covalente appelée liaison peptidique. La liaison peptidique s’installe entre le groupe amine (-NH2) d’un acide aminé et le groupe carboxyl (-COOH) d’un autre acide aminé. Le groupement fonctionnel amine libère un hydrogène et le groupement acide un hydroxyde qui se combinent pour donner une molécule d’eau. L’un des acides aminés en bout de chaîne présente un groupe fonctionnel acide (extrémité C terminale) et l’autre un groupe fonctionnel

amine (extrémité N terminale) qui pourront permettre l’association avec d’autres acides aminés. Cette réaction est réversible ; les deux acides aminés peuvent être libérés mais il faut préalablement casser une molécule d’eau pour pouvoir compléter le groupement amine de l’un et le groupe acide de l’autre. On parle alors d’hydrolyse.



Les protéines peuvent être dosées selon plusieurs méthodes : • La méthode de Biuret ; • La méthode au bleu de Coomassie ; • La méthode de Bradford ; • La méthode de Folin-Lowry ; • La méthode au BCA.

Ces différentes techniques de dosages sont toutes basées sur des réactions colorées détectées par spectrophotométrie dans le visible.

Questions préliminaires Première partie : DOSAGE d’une SOLUTION de SAB par la METHODE DE BIURET

• La solution inconnue est comprise entre 8 et 18 g.L-1. Afin de la doser, il est nécessaire de la diluer avant de l’utiliser. Comment faut-il procéder ? (formule littérale, application numérique et matériel utilisé)

Deuxième partie : DOSAGE d’une SOLUTION de SAB par la METHODE DE FOLIN LOWRY

• La solution inconnue est comprise entre 8 et 18 g.L-1. Afin de la doser, il est nécessaire de la diluer avant de l’utiliser. Comment faut-il procéder ? (formule littérale, application numérique et matériel utilisé)

• Vous disposez d’une solution mère étalon de SAB à 10 g.L-1; il faut la ramener à 0,5 g.L-1 (solution fille). Comment faut-il procéder pour préparer cette solution fille ? (formule littérale, application numérique et matériel utilisé)

• La limite de linéarité de cette méthode est de 300 µg/tube. Quelle sera la conséquence

de cette information pour votre dosage ? Troisième Partie : DOSAGE d’une SOLUTION de SAB par la METHODE AU REACTIF DE BRADFORD Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 6 microcuves s’étalant régulièrement de 0 à 10 mg. L-1 à partir d’une solution de SAB à 500 mg.L-1, en prévoyant des volumes d’étalon adaptés au matériel que vous possédez et d’un volume maxi de 1 mL. La solution inconnue est comprise entre 160 et 360 mg.L-1. Il faut donc diluer l’inconnue et préparer ensuite 3 tubes « inconnue diluée» de 1 mL de prise d’essai maxi. Le volume final de chaque tube est de 1 mL. Le diluant est de l’eau distillée. Le volume de réactif de Bradford est de 0,25 mL dans tous les tubes.

• Dilution de l’étalon (formule littérale, application numérique et matériel utilisé) • Dilution de l’inconnue (formule littérale, application numérique et matériel utilisé)





Protocole et compte rendu Le but de ce TP, en trois parties, est de doser selon trois méthodes différentes des protéines contenues dans une solution inconnue de sérum albumine bovine (SAB fraction V) et de conclure sur la meilleure méthode. Première Partie : DOSAGE d’une SOLUTION de SAB par la METHODE AU BIURET

1. Principe La réaction du Biuret met en évidence les liaisons peptidiques. Il s’agit de mesurer l’absorbance du complexe coloré (violet) formé entre les ions Cu2+ du sulfate de cuivre du réactif de Biuret et la liaison peptidique de la protéine étudiée. Plus les liaisons sont nombreuses, plus l’absorbance est grande. C’est une méthode simple et moyennement rapide dont la sensibilité est faible c'est-à-dire un seuil de 100 µg.


• Réactif de Biuret : mélange de sulfate de cuivre pentahydraté, de tartrate de sodium et potassium et d’hydroxyde de sodium (de couleur bleu) ;

• Solution mère étalon de SAB à 1% (p/v), préparée par pesée de SAB fraction V dans du sérum physiologique.

Protocole : Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 6 tubes SAB s’étalant régulièrement de 0 à 10 g.L-1 à partir d’une solution de SAB à 1% (p/v), en prévoyant des volumes d’étalon adaptés au matériel que vous possédez. La solution inconnue est comprise dans la fourchette suivante : 8 à 18 g.L-1. Vous devez préparer 3 tubes « inconnue diluée» de 1 mL de prise d’essai maximum. Le volume final de chaque tube est de 1 mL. Le diluant est de l’eau distillée. Le volume de réactif de Biuret est de 4 mL dans tous les tubes. Après homogénéisation et une attente minimum de 20 minutes, les mesures sont à effectuer en macrocuves plastiques de TO 1 cm à 540 nm sur le même spectrophotomètre que celui du second dosage.

3. Tableau de mode opératoire Compléter le tableau de mode opératoire.



Tous les volumes sont en mL. Tubes 0 1 2 3 4 5 X

Conc en g.L-1 (avant réactif)

Vol. étalon à g.L-1

Vol. inconnue au

Vol. eau

Vol. réactif de Biuret

Quantité en

Conc en g.L-1 (après réactif)

Incubation

Abs à nm

4. Résultats : analyse et conclusion A partir des résultats, rendre le graphe abs = f (quantité) correctement légendé et exploité. Déterminer la concentration de la solution inconnue en g.L-1 avec 3 chiffres significatifs et conclure sur la limite de validité de la loi de Lambert Beer. Noter le résultat en première page du rapport. Comparer ce résultat avec celui attendu. Calculs pour X (formule littérale et application numérique) : Conclusion :



Deuxième partie : DOSAGE d’une SOLUTION de SAB par la METHODE DE FOLIN LOWRY

1. Principe Autre méthode colorimétrique permettant le dosage des protéines comme la SAB. On mesure l’absorbance du complexe coloré (en bleuté) par les deux réactions suivantes :

• La réaction du Biuret sur la liaison peptidique ; • La réduction du réactif de Folin (mélange de phosphomolybdate et phosphotungstate)

par les acides aminés Tyrosine et Tryptophane et dans une moindre proportion les acides aminés Cystéine et Histidine.

C’est une méthode moyennement simple et moyennement rapide dont la sensibilité est élevée c'est-à-dire un seuil de 1 µg. La limite de linéarité de cette gamme étant < 500 µg/tube, la linéarité de la représentation graphique de votre gamme ne sera donc pas possible.


• Réactif de Folin Ciocalteu : solution commerciale jaune diluée au ½ dans l’eau distillée ;

• Mélange alcalin sous agitation permanente : mélange de trois solutions préparées

individuellement contenant du sulfate de cuivre, du tartrate de sodium potassium, du carbonate de sodium et de l’hydroxyde de sodium ;

• Solution mère étalon de SAB à 1% (p/v), préparée par pesée de SAB fraction V dans

du sérum physiologique. Protocole : Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 6 tubes SAB s’étalant régulièrement de 0 à 0,5 g.L-1 à partir d’une solution de SAB à 500 mg.L-1 (choisir des concentrations amenant à des volumes corrects c'est-à-dire maximum 1 mL). La solution inconnue est comprise dans la fourchette suivante : 8 à 18 g.L-1. Vous devrez alors préparer 3 tubes « inconnue diluée » de 1 mL de prise d’essai. Le diluant est de l’eau distillée. Ajouter 5 mL de mélange alcalin dans tous les tubes. Agiter et attendre 10 minutes à température ambiante en bouchant les tubes avec du parafilm. Ajouter enfin 0,5 mL de réactif de Folin dans tous les tubes. Après homogénéisation et une attente minimum de 30 minutes, les mesures sont à effectuer en macrocuves plastiques de TO 1 cm à 750 nm sur le même spectrophotomètre que celui utilisé pour le dosage précédent.

3. Tableau de mode opératoire Compléter le tableau de mode opératoire et détailler uniquement les calculs pour le tube étalon coloré n° 3.



Tous les volumes sont en mL. Tubes 0 1 2 3 4 5 X

Conc en mg.L-1 (avant réactif)


Vol. inconnue au

Vol. eau

Quantité en

Vol. mélange alcalin

5 5 5 5 5 5 5

Incubation

Vol. réactif de Folin

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5


Incubation

Abs à nm

Calculs sur le tube étalon n° 3 : ΔC Volume étalon Volume eau



Quantité Conc. Etalon (après réactif)

4. Résultats : analyses et conclusion A partir des résultats, rendre le graphe abs = f (concentration) correctement légendé et exploité. Déterminer la concentration finale (en tenant compte de la dilution) de la solution inconnue en g.L-1 avec 3 chiffres significatifs. Noter ce résultat en g.L-1 sur la première page. Discuter de la limite de la linéarité de la gamme à cette concentration. Conclure sur la meilleure méthode. Calculs pour X (formule littérale et application numérique) : Résultat final pour les 2 méthodes : Méthode au Biuret Méthode de Folin Lowry Concentration finale g.L-1 Conclusion : Troisième Partie : DOSAGE d’une SOLUTION de SAB par la METHODE AU REACTIF DE BRADFORD

1. But Utilisation d’une troisième méthode de dosages pour déterminer la concentration inconnue de la même solution de protéines (SAB) et pour vérifier la qualité des dilutions en fioles et des prélèvements.



2. Principe Bradford et al (1976) ont développé une méthode basée sur l'adsorption du colorant bleu de Coomassie G250 (colorant rouge/brun à l’état libre). En milieu méthanolique acide, ce colorant s'adsorbe sur les protéines et cette complexation provoque un transfert de son pic d'adsorption qui passe du rouge au bleu. Cette adsorption se fait principalement par des liens ioniques avec des acides aminés basiques (arginine, histidine, et lysine) et des interactions hydrophobes (acides aminés hydrophobes). C'est une méthode très sensible (2-5 µg de protéines) et très rapide. Elle est aussi assez résistante à la plupart des interférents qui nuisent à la plupart des autres méthodes. Seuls les détergents et autres surfactants, comme le Triton et le dodécylsulfate de sodium (SDS), et des bases fortes interfèrent fortement avec cette méthode.

3. Préparation de la gamme d’étalonnage

Les réactifs utilisés sont : • Réactif de Bradford : mélange aqueux de bleu de Coomassie et de méthanol ;

• Solution mère étalon de SAB à 0,5 g.L-1 (préparée préalablement par dilution

de la solution mère à 1 %). Protocole : Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 6 microcuves SAB s’étalant régulièrement de 0 à 10 mg.L-1 à partir d’une solution de SAB à 0,5 g.L-1, en prévoyant des volumes d’étalon adaptés au matériel que vous possédez et d’un volume maxi de 1 mL. La solution inconnue est comprise entre 160 et 360 mg.L-1. Il faut donc la diluer et préparer ensuite 3 tubes « inconnue diluée» de 1 mL de prise d’essai maxi. Le volume final de chaque tube est de 1 mL. Le diluant est de l’eau distillée. Le volume de réactif de Bradford est de 0,25 mL dans tous les tubes. Après homogénéisation et une attente minimum de 15 minutes, les mesures sont à effectuer en microcuves plastiques de TO 1 cm à 595 nm sur le même spectrophotomètre que celui utilisé pour les autres dosages.

4. Tableau de mode opératoire Compléter le tableau de mode opératoire et détailler les calculs uniquement pour le tube coloré n° 3. Tous les volumes sont en mL.



Tubes 0 1 2 3 4 5 X

Conc en mg.L-1 (avant réactif)


Vol. inconnue au

Vol. eau

Quantité

Vol. réactif de Bradford


Incubation

Abs à nm

Calculs sur le tube étalon n° 3 : ΔC Volume étalon Volume eau Quantité Conc. Etalon (après réactif)



5. Résultats : analyse et conclusion A partir des résultats, rendre le graphe abs = f (?) correctement légendé et exploité. Déterminer la concentration finale (en tenant compte de la dilution) de la solution inconnue en mg.L-1 avec 4 chiffres significatifs. Noter le résultat en première page du rapport. Comparer ce résultat avec celui obtenu avec le réactif de Folin (après la dilution) et conclure sur la meilleure méthode. Calculs pour X (formule littérale et application numérique) : Résultat final pour les 2 méthodes : Méthode au Bradford Méthode de Folin Lowry Concentration finale mg.L-1 Conclusion :



ANNEXE 1 LES ACIDES AMINES ET LA STRUCTURE PRIMAIRE DES

PROTEINES Structure générale et stéréochimie des acides aminés A l'exception de la glycine (Gly), tous les acides aminés possèdent un carbone α asymétrique (ou chiral). Il existe donc pour chacun d'entre eux deux isomères stéréochimiques, images en miroir, appelés énantiomères (figure 1). La convention pour définir la stéréochimie du carbone a s'appuie sur celle des énantiomères du glycéraldéhyde. A quelques rares exceptions près, les acides aminés constitutifs des protéines sont tous de configuration L. Dans la cellule (pH neutre), le groupe carboxyle et le groupe aminé sont ionisés :

• pKa groupe carboxyle : 1,8 à 2,5 • pKa groupe aminé : 8,7 à 10,7

Les acides aminés sont des ions amphotères (ou zwiterrions).

Figure 1 : représentation schématique d'énantiomère



Structure des chaînes latérales R La figure ci-après montre les chaînes latérales R (en rouge) des 20 acides aminés les plus fréquemment utilisés pour la synthèse des protéines. Le nom de l'acide aminé selon le code à trois lettres est écrit entre parenthèses. 2 cas particuliers :

• Glycine (Gly) : seul acide aminé non chiral et le plus petit ;

• Proline : acide α-iminé (groupe aminé secondaire). Sa chaîne latérale est liée à la fois au groupe carboxyle ET au groupe aminé.


TP 3 : PHOSPHATES ET CHOLESTEROL page 24/71

TP N° 3 : PHOSPHATES et CHOLESTEROL Le cholestérol est le principal stéroïde du corps humain. Il est en faible part d’origine alimentaire et pour la plus grande part d’origine endogène selon deux voies : synthèse à partir de l’acétylcoenzyme A pour 90 % de la production de tout l’organisme et origine intestinale. Le sérum sanguin renferme environ 7 g.L-1 de lipides. Ces derniers sont essentiellement le cholestérol libre et estérifié, les triglycérides, les phospholipides et les acides gras libres. Le cholestérol est donc un constituant important des lipoprotéines plasmatiques et peut être dosé par de très nombreuses méthodes colorimétriques, enzymatiques ou chromatographiques. Apparues récemment, les méthodes enzymatiques sont basées sur l’utilisation d’enzymes de micro-organismes agissant sur le cholestérol. La méthode de dosage utilisée en TP fait appel à la réaction de Trinder. En présence de 4-amino-antipyrine, de phénol et de peroxydase, il se forme une quinone imine (coloré en rose) qui présente un maximum d’absorption à 500 nm permettant ainsi sa détermination. Les méthodes enzymatiques sont en général très reproductibles (C.V. < 2 %). Leur spécificité est meilleure que celle des méthodes chimiques. Les interférences médicamenteuses, de la bilirubine ou de l’hémoglobine du sérum ou d’autres stérols sont négligeables ou nulles. Le dosage du cholestérol est utilisé pour dépister les hypercholestérolémies et les troubles du métabolisme des lipides et des lipoprotéines. Il permet ainsi d’évaluer le risque d’athérosclérose et d’effectuer le suivi de l’efficacité d’un traitement. Définition : l’athérosclérose désigne la perte d'élasticité des artères due à la sclérose provoquée par l'accumulation de corps gras (lipides, essentiellement cholestérol LDL) au niveau d'une des trois tuniques constituant la paroi des artères (l'intima) et intéressant avant tous les grosses et les moyennes artères. La variété de lipides concernée porte le nom d'athérome.

Il est toutefois très difficile de définir une valeur normale pour la cholestérolémie. Les résultats varient selon la technique utilisée. Il est donc préférable de ne comparer que les valeurs obtenues avec une même technique de dosage. D’autre part, si l’on veut définir un taux de cholestérol moyen au sein d’une population normale, il faut tenir compte de la race, du sexe, de l’âge, du mode d’alimentation et des conditions de vie de l’individu.



Dans notre cas, les valeurs usuelles obtenues sont, d’après la Société Européenne d’Athérosclérose :

Cholestérolémie Evaluation du risque < 2 g.L-1 Risque faible, en particulier si Cholestérol HDL > 0,6 g.L-1

2 – 2,5 g.L-1 Risque modéré si Cholestérol HDL < 0,35 g.L-1 > 2,5 g.L-1 Risque élevé, en particulier si Cholestérol HDL < 0,35 g.L-1

Questions préliminaires

Première Partie : DOSAGE des PHOSPHATES URINAIRES ET SANGUINS selon la METHODE DE BRIGGS

• Vous disposez d’une solution mère étalon de phosphores à 1 g.L-1 préparée par pesée de dihydrogénophosphate de potassium KH2PO4. Vous devez réaliser une dilution au 1/100ème (solution fille).

o Si vous aviez à préparer 500 mL de solution mère étalon, comment faut-il procéder ?

• Donner la dilution exacte de l’inconnue avec le TCA. • On vous demande de préparer 400 mL de sulfite de sodium à 20 % (p/v). Quelle masse

de sulfite de sodium faut-il peser ? • Calculer la prise d’essai d’inconnue « urine » à réaliser pour le dosage des phosphates

urinaires. Deuxième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE du CHOLESTEROL dans un SERUM

• Quel rôle joue la quinone imine dans ce type de dosage ? • Le cholestérol est-il un lipide simple ? Dans le cas contraire, expliquer pourquoi. • Donner, en justifiant, la composition de la cuve témoin.



Protocole et compte rendu Le but de ce TP, en deux parties, est de :

1. doser par gamme d’étalonnage colorimétrique des phosphates urinaires et sanguins ; 2. doser par méthode enzymatique colorimétrique du cholestérol total dans un sérum.

Première Partie : DOSAGE des PHOSPHATES URINAIRES ET SANGUINS selon la METHODE DE BRIGGS

1. Principe En présence d’un excès de solution acide de molybdate d’ammonium et de réactif sulfo-molybdique, les ions phosphates (PO4)3- donnent un complexe phosphomolybdique. En rajoutant un réducteur, l’hydroquinone et du sulfite de sodium, on forme un second complexe phosphomolybdeux molybdique stable, soluble dans l’eau, de coloration bleu intense détectable à 700 nm. Pour réaliser ce dosage, on doit préalablement précipiter les protéines sanguines avec de l’acide trichloroacétique (TCA) ; on évite ainsi leur précipitation par le réactif molybdique qui entraînerait alors une solution trouble, assez gênante. Remarque : cette déprotéinisation ne concerne que l’échantillon « sérum » et non l’inconnue « urine » qui est non albumineuse. Inconvénients de la méthode : il faut absolument éviter

• toute présence d’ions Cuivre, Nickel ou Chrome qui donnerait une coloration bleue parasite ;

• une nouvelle oxydation du complexe et une réduction de l’excès de réactif molybdique qui se transformerait en bleu de molybdène qui absorbe à 630 nm.


Les réactifs utilisés sont : • Acide trichloroacétique à 20 % ; • Réactif molybdique composé de molybdate d’ammonium et d’acide

sulfurique ; • Hydroquinone à 1 % (p/v) (antivitaminique B1) ; • Sulfite de sodium à 20 % (p/v) ; • Solution mère étalon de Phosphores à 1 g.L-1 préparée par pesée de

dihydrogénophosphate de potassium KH2PO4. Protocole :

! Préparation de l’inconnue « urine » Aucune préparation préliminaire n’est nécessaire.

! Préparation de l’inconnue « sérum » Dans 2 tubes à hémolyse de 10 mL en plastique, déposer 0,75 mL de sérum inconnu et 5 mL de TCA à 20 %. Mettre du parafilm et mélanger délicatement.



Laisser reposer 10 minutes à température ambiante puis centrifuger 10 minutes avec les parafilms à 3800 tours/min à température ambiante. Prélever délicatement des prises d’essai de 2 mL maximum de surnageant limpide sur chaque tube centrifugé. Attention : le prélèvement est très délicat. Faites attention de ne prélever que du surnageant limpide.

! Préparation de la gamme Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 5 tubes s’étalant régulièrement de 0 à 120 µg/tube à partir d’une solution étalon de phosphores de 10 mg.L-1, en prévoyant des volumes d’étalon adaptés au matériel que vous possédez. La solution inconnue « sérum » est comprise entre 30 et 60 mg.L-1. Vous devez préparer 3 tubes « inconnue sérum» de 2 mL de prise d’essai maxi (après centrifugation). La solution inconnue « urine » est comprise entre 85 et 110 mg.L-1. Vous devez préparer 3 tubes « inconnue » de prise d’essai maxi 1 mL. Le diluant est l’eau distillée. Le volume des réactifs est de 3 mL dans tous les tubes (1 mL de chaque réactif par tube). Le volume final de chaque tube est de 20 mL. Après homogénéisation et une attente minimum de 30 minutes, les mesures sont à effectuer en macrocuves plastiques de TO 1 cm à 700 nm.

3. Tableau de mode opératoire Proposer un tableau de mode opératoire conforme et détailler les calculs pour le tube étalon coloré n° 3. Calculs sur le tube étalon coloré n° 3 :



Tubes 0 1 2 3 4 X Sérum (x 3)

X Urine (x3)

4. Résultats : analyse et conclusion

A partir des résultats, rendre un graphe unique abs = f (?) correctement légendé et exploité. Déterminer la concentration des solutions inconnues en mg.L-1 avec 4 chiffres significatifs. Noter les résultats en première page du compte rendu. Conclure sur la limite de linéarité de la gamme. Conclure sur les résultats attendus. Calculs pour inconnue Sérum2 : Calculs pour inconnue Urine : Conclusions : 2 Cf. votre réponse aux questions préliminaires.



Deuxième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE du CHOLESTEROL dans un SERUM

1. Principe Le cholestérol est dosé en utilisant la séquence cholestérol estérase - cholestérol oxydase –peroxydase selon les réactions suivantes : Cholestérol estérifié ⎯⎯⎯⎯⎯ →⎯ lestérasecholestéro cholestérol + acides gras Cholestérol + O2 ⎯⎯⎯⎯⎯ →⎯ loxydasecholestéro cholestène-4, one-3 + H2O2 H2O2 + phénol + amino-4 antipyrine ⎯⎯⎯ →⎯peroxydase quinone imine + 4 H2O L’intensité de la coloration de la quinone imine mesurée à 500 nm est proportionnelle à la quantité de cholestérol présente dans l’échantillon. Tous les calculs nécessaires à l’exploitation des résultats sont détaillés dans le chapitre intitulé Cours et TD. Données : Coefficient d’extinction molaire de la quinone imine à 500 nm = 5,04 L.mmol-1.cm-1

Masse molaire du cholestérol dosé = 387 g.mol-1

2. Mode opératoire Les réactifs utilisés sont :

• Réactif de travail 1 (prêt à l’emploi) composé de : " Tampon pH 7 20 mmol.L-1 " Phénol 15 mmol.L-1 " Amino – 4 antipyrine 0.5 mmol.L-1 " Peroxydase 1000≥ UI/L " Cholestérol oxydase 200≥ UI/L " Cholestérol estérase 125≥ UI/L

• Etalon cholestérol à environ 2 g.L-1 dans l’isopropanol (le titre exact sera donné le jour du TP) ;

• Inconnue sérum (en eppendorf) comprise entre 1,650 et 2,790 g.L-1 Protocole : Vous devez effectuer les mélanges suivants directement en microcuves plastiques de 1 cm de TO. Vous réaliserez 3 cuves « étalon », 3 cuves « essai » et 1 cuve témoin3. Après homogénéisation et une attente minimum de 10 minutes à température ambiante, les mesures sont à effectuer à 500 nm. Remarque : la coloration est stable 1 heure à 20-25 °C. La méthode utilisée pour les dépôts d’eau distillée, d’étalon et d’inconnue est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes.

3 Vous devrez suivre le même protocole que celui donné dans l’exercice 2 du TD 2.



Compléter le mode opératoire suivant : Tous les volumes sont en mL. Tubes Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 X1 X2 X3

Vol. réactif de travail 1

Vol. étalon à g.L-1

Vol. inconnue

Vol. eau distillée

Incubation

Abs à nm


A partir des résultats, vérifier le titre de l’étalon en g.L-1 avec 4 chiffres significatifs selon la loi de Lambert Beer. Déterminer la concentration de la solution inconnue cholestérol en g.L-1 et en mmol.L-1 avec 4 chiffres significatifs par rapport à l’étalon théorique et avec la loi de Lambert Beer. Noter le résultat obtenu selon la méthode de l’étalon théorique en g.L-1 sur la première page du compte rendu. Conclure. Vérification du titre de l’étalon : Choix du meilleur étalon : Calculs pour X d’après l’étalon théorique :



Calculs pour X d’après la loi de Lambert Beer : Résultat final pour les 2 méthodes : Par l’étalon théorique Par la loi de Lambert Beer Concentration finale g.L-1

Concentration finale mmol.L-1

Conclusion :


TP 4 : BETAGALACTOSIDASE page 32/71

TP N° 4 : LA BETAGALACTOSIDASE C’est une enzyme intracellulaire très abondante dans les bactéries, surtout chez Escherichia Coli qui utilise le lactose comme source de carbone, et qui présente une grande spécificité pour les groupements β galactosyl. Son absence ou faible présence dans l’intestin est la principale cause de l’incapacité à digérer du lactose chez l’homme ; on parle d’intolérance au lactose. Elle est recherchée dans les galeries d’identifications bactériennes à l’aide du test de l’ONPG. Cette enzyme est un tétramère de 4 sous unités identiques deux à deux inactives séparément. Pour stabiliser leurs associations, on utilise des ions Mg2+ et du β mercaptoéthanol (comme conservateur) car celui-ci maintient les fonction « thiols » à l’état réduit évitant ainsi la formation d’un complexe substrat-substrat en présence d’oxygène qui conduirait alors à des dimères inactifs. La βgalactosidase hydrolyse le lactose en glucose + galactose. Pour étudier la cinétique de cette enzyme, on utilise à la place du lactose un substrat synthétique qui est l’ONPG (orthonitrophényl-β-D-galactopyrannoside) (cf. figure ci-contre). L’hydrolyse de l’ONPG libère du galactose (incolore) et de l’ONP (orthonitrophénol) de couleur jaune en milieu basique. Ce dernier absorbe dans le visible. Le maximum d’absorption se situe à 420 nm. Il est donc possible de suivre à l’aide d’un spectrophotomètre l’apparition de l’ONP et par conséquent, la réaction d’hydrolyse catalysée par la βgalactosidase.

Figure 2 : Avancement de la réaction d’hydrolyse en fonction du temps



Questions préliminaires

Première Partie : DETERMINATION DU COEFFICIENT D’EXTINCTION MOLAIRE de l’ONP

• Quel est le but de cette partie du TP ? • Vous devez préparer, directement en macrocuves plastiques de TO 1 cm, une gamme

d’étalonnage de 6 tubes de 0 à 1 µmol/cuve à partir de la solution mère étalon d’ONP à 10-3 mol.L-1.

Le volume final de chaque tube est de 3,1 mL. Le diluant est du tampon phosphate pH 7,0. Compléter en justifiant le tableau suivant : Tous les volumes sont en mL. Tubes 0 1 2 3 4 5

Vol. étalon à mmol.L-1

Vol. tampon pH 7,0

• A quoi correspond le coefficient d’extinction molaire dans votre gamme

d’étalonnage d’après la calculatrice ? • A quoi correspond le coefficient d’extinction molaire dans votre gamme

d’étalonnage d’après le graphe ? Deuxième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE de la β GALACTOSIDASE

• D’après le graphe Abs = f (temps)4, estimer, en justifiant, la durée totale des mesures spectrophotométriques.

• Calculer le facteur de concentration F avec εVCV = 3000 L.mol-1.cm-1 à 25 °C (en 5 chiffres significatifs) et selon l’unité adéquate.

Troisième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE d’une SOLUTION d’ONPG

• Donner, en quelques lignes, le principe de ce dosage. • Justifier le type de cuve utilisé pour ce dosage. • Quel rôle joue l’ONP ?

4 Figure 2 du document.



Protocole et compte rendu Le but de ce TP, en trois parties, est de :

1. déterminer le coefficient d’extinction molaire de l’ONP par gamme d’étalonnage ; 2. déterminer par méthode enzymatique continue la concentration catalytique de la β

galactosidase ; 3. doser par méthode enzymatique colorimétrique une solution d’ONPG.

Première Partie : DETERMINATION DU COEFFICIENT D’EXTINCTION MOLAIRE de l’ONP

1. Principe Il est indispensable de connaître le coefficient d’extinction molaire de l'ONP à 420 nm pour la suite de cette séance ; en effet, vous utiliserez ce coefficient dans le calcul du facteur de concentration F. Pour réaliser cette étape, vous allez mesurer ce coefficient ε420nm en utilisant des solutions d’ONP de concentrations variables et un spectrophotomètre. Rappel : la mesure de la densité optique (DOλ) ou absorbance Abs d'une solution de molarité connue (c) dans une cuve de trajet optique connu (l) à une longueur d'onde donnée λ permet de calculer le coefficient d’extinction molaire ε420nm du soluté à cette longueur d'onde par application de la loi de Beer - Lambert : Abs = ε420nm x l x C


• Tampon phosphate pH 7,0 composé d’hydrogénophosphate disodique et de dihydrogénophosphate de potassium ;

• Solution mère étalon d’ONP à 10-3 mol.L-1 préparée par pesée d’ONP (C6H5NO3).

Protocole : Vous devez préparer, directement en macrocuves plastiques de TO 1 cm, une gamme d’étalonnage de 6 tubes s’étalant régulièrement à partir de la solution mère étalon d’ONP préparée, selon un mode opératoire que vous déterminerez en remplissant correctement le tableau suivant5. Le diluant est du tampon phosphate pH 7,0. Après homogénéisation et aucune attente, les mesures sont à effectuer à 420 nm.

3. Tableau de mode opératoire Compléter le tableau de mode opératoire en détaillant les calculs pour le tube étalon n° 3. Tous les volumes sont en mL.

5 Cf. votre réponse aux questions préliminaires.



Tubes 0 1 2 3 4 5

Calculs sur le tube étalon n° 3 : Quantité étalon Conc. Etalon

4. Résultats : analyses et conclusion A partir des résultats, rendre le graphe abs = f (?) correctement légendé et exploité. Déterminer le coefficient d’extinction molaire de l’ONP en L.mol-1.cm-1 avec 4 chiffres significatifs. Comparer les résultats selon une VCV de 3000 L.mol-1.cm-1 Détermination du coefficient d’extinction molaire d’après la calculatrice : Détermination du coefficient d’extinction molaire d’après le graphe : Conclusion :



Deuxième partie : DETERMINATION DE LA CONCENTRATION CATALYTIQUE de la β GALACTOSIDASE

1. Principe Vous allez maintenant déterminer la concentration catalytique de la β galactosidase en mesurant l’absorbance de deux cuves « essai » en fonction du temps et à une température donnée. Préalablement, vous devez calculer le facteur de concentration F à l’aide du coefficient d’extinction molaire VCV donné dans la première partie de ce TP.


• Réactif de travail : tampon phosphate pH 7,0 composé de dihydrogénophosphate de potassium et d’ hydrogénophosphate disodique ;

• Etalon ONPG à 12,5 mmol.L-1; • Inconnue enzyme (en eppendorf) auprès du spectrophotomètre.

Protocole : Vous devez effectuer les mélanges suivants directement en microcuves plastiques de 1 cm de TO. Vous réaliserez 2 cuves « essai ». Après homogénéisation et une attente minimum de 1 minute à température ambiante, les mesures sont à effectuer à 420 nm toutes les 30 secondes pendant une durée précisée le jour du TP. N’oubliez pas de prendre la température à la fin du dosage pour les deux cuves. Le zéro optique se réalise contre une des deux cuves « essai » contenant uniquement le tampon et l’étalon. La méthode utilisée pour les dépôts d’étalon est la méthode traditionnelle avec pré rinçage de cônes. La méthode utilisée pour les dépôts d’enzyme est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes. Tous les volumes sont en mL.

Tubes X1 X2

Vol. tampon pH 7,0 1,0 1,0

Vol. étalon ONPG à mmol.L-1

0,2 0,2

Vol. enzyme 0,01 0,01

Incubation

Lectures à nm



3. Résultats : analyse et conclusion A partir des résultats, sur le même graphe, tracer les deux droites Abs = f (temps) correspondant aux deux cuves « essai ». Déterminer l’activité enzymatique expérimentale de chaque essai puis calculer la concentration catalytique moyenne de l’enzyme inconnue en UI.L-1 avec 4 chiffres significatifs à 25 °C à l’aide du facteur F que vous avez préalablement calculé6. Calculs pour X à 25 °C : Conclusion : Troisième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE d’une SOLUTION d’ONPG

1. Principe A l’aide de deux méthodes de calculs, vous allez déterminer la concentration d’une solution inconnue d’ONPG par dosage enzymatique colorimétrique en point final de la β galactosidase.


• Réactif de travail : tampon phosphate pH 7,0 composé de dihydrogénophosphate de potassium et d’hydrogénophosphate disodique ;

• Etalon ONPG à environ 3,125 mmol.L-1 (le titre exact sera donné en TP) ;

• Enzyme en commun (en eppendorf) ;

• Inconnue ONPG (en eppendorf).




Protocole : Vous devez effectuer les mélanges suivants directement en microcuves plastiques de 1 cm de TO. Vous réaliserez 3 cuves « étalon », 3 cuves « essai » et 1 cuve témoin selon le protocole suivant :

- composition de la cuve témoin : ! 1,5 mL de tampon pH 7,0 ; ! 0,05 mL d’enzyme ;

- adapter ce mode opératoire aux cuves « essai » et « étalon » sachant que les volumes des solutions étalon et essai seront respectivement de 0,1 mL.

Après homogénéisation et une attente minimum de 10 minutes à température ambiante, les mesures sont à effectuer à 420 nm. La méthode utilisée pour les dépôts d’étalon, d’inconnue et d’enzyme est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes. Compléter le tableau de mode opératoire suivant : Tous les volumes sont en mL. Tubes Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 X1 X2 X3


A partir des résultats, vérifier le titre de l’étalon en mmol.L-1 selon la loi de Lambert Beer avec 4 chiffres significatifs. Déterminer la concentration molaire de la solution inconnue en mmol.l-1 avec 4 chiffres significatifs par rapport à l’étalon théorique. Noter le résultat en première page du compte rendu. Conclure.


TP 5 : L’ACIDE URIQUE page 39/71

TP N° 5 : L’ACIDE URIQUE

L’acide urique de l’organisme est issu de la dégradation des purines.

Définition d’une purine : molécule azotée hétérocyclique. Deux des bases des acides nucléiques sont des purines : l’adénine et la guanine. Les purines, en plus d’être des composants de l’ADN et de l’ARN, se trouvent dans des biomolécules importantes, telles que l’ATP, l’AMP cyclique, le NADP ou le coenzyme A.

L’origine de l’acide urique peut être : • Soit exogène, c'est-à-dire qu’il est issu de l’alimentation carnée (80 à 120 mg/100 g) ; • Soit endogène, c'est-à-dire qu’il est le produit final issu de la synthèse des purines et

de la dégradation des acides nucléiques. Dans le sang, l’acide urique est sous forme libre d’urate mono sodique. Il est éliminé essentiellement par voie urinaire ; mais une partie est également déversée dans l’intestin et dégradée par la flore bactérienne intestinale. Le dosage enzymatique de l’acide urique permet de diagnostiquer des désordres métaboliques et rénaux et de favoriser le suivi de patients recevant des médicaments cytotoxiques : on parle alors d’évaluation de l’uricémie et de l’uricurie. Les hyperuricémies peuvent être de deux ordres :

• Primitives : dans ce cas, le fort taux d’acide urique est lié à des déficits enzymatiques innés du métabolisme (comme des maladies rares telles que la maladie de Von Gierke) ;

• Secondaires : l’hyperuricémie résulte alors d’un excès de production (catabolisme intense) ou d’un défaut d’élimination rénale aggravée par des excès alimentaires.

Les complications des hyperuricémies sont liées au dépôt ou à la précipitation d’acide urique : complications rhumatologiques (comme la goutte), et urologiques et néphrologiques. L’effet inverse est également possible : on constate une diminution de l’uricémie en cas d’insuffisance hépatique sévère, en cas de maladie de Hodgkin (lymphome des ganglions). Chez les enfants (cf. les valeurs usuelles données ci-après) et chez les femmes enceintes (jusqu’au 6ème mois de grossesse), le taux d’acide urique est également plus bas. On peut évaluer l’uricémie selon deux méthodes de dosages enzymatiques :

• En utilisant la réaction de Trinder : dosage enzymatique colorimétrique (apparition de la quinone imine) ;



• En utilisant la méthode de Haeckel : dosage enzymatique UV (apparition du coenzyme NADH).

DOSAGE ENZYMATIQUE UV de l’ACIDE URIQUE dans un SERUM

1. Principe Dans ce dosage, l’acide urique est dosé selon les réactions suivantes :

acide urique + O2+ 2H2O ----( uricase )-------> allantoïne + CO2 + H2O2 H2O2 + éthanol ----(catalase )-------> acétaldéhyde + 2 H2O

acétaldéhyde + NAD+----( aldéhyde déshydrogénase )-------> acétate + NADH + H+

Cette méthode de dosage utilise la séquence uricase-catalase-aldéhyde déshydrogénase avec apparition du coenzyme NADH. L’absorption à 340 nm du NADH formé est alors proportionnelle à la concentration d’acide urique présent dans l’échantillon sérum. Tous les calculs nécessaires à l’exploitation des résultats sont détaillés dans le chapitre intitulé Cours et TD. Données : Coefficient d’extinction molaire du couple d’oxydo-réduction à 340 nm = 6,30 L.mmol-1.cm-1

Facteurs de conversion tels que mg.L-1 * 5,95 = µmol.L-1

µmol.L-1 * 0,0168 = mg.dL-1

Valeurs usuelles pour le sérum et plasma : µmol.L-1 mg.L-1 mg.dL-1 Nourrissons 119-208 20-35 2,00-3,49 Enfants 150-360 25-60 2,52-6,05 Hommes 200-420 34-71 3,36-7,06 Femmes 150-360 25-60 2,52-6,05

2. Préparation des cuves Les réactifs utilisés sont :

• Tampon pyrophosphate à 50 mmol.L-1 et pH 8,5 ; éthanol à 1,71 mol.L-1 et chlorure de potassium à 50 mmol.L-1 ;

• Mélange de NAD+ 0,75 mmol.L-1, catalase > 500 kUI.L-1 et aldéhyde déshydrogénase > 300 UI.L-1 ;

• Etalon d’acide urique à 104,8 mg.L-1 ; • Uricase dans glycérol > 1400 UI.L-1 ; • Inconnue sérum obtenue selon la préparation suivante : 0,5 mL/ qsp 2 mL.

Protocole : Ce dosage est à faire directement en microcuves plastiques de TO 1 cm. Vous devez effectuer 3 cuves « essai », 3 cuves « étalon » et 1 cuve témoin. Les prises d’essai de l’étalon et de l’essai sont respectivement de 0,05 mL.



3. Tableau de mode opératoire Compléter le tableau de mode opératoire. Tous les volumes sont en mL.

Cuves Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3

Vol. tampon 1,2

Vol. NAD 0,1

Vol. étalon Acide urique à mg.L-1

Vol. essai

Vol. eau distillée 0,3

Incubation et lecture A1 après 3 min d’attente à 340 nm

Vol. enz. ? 0,02

Incubation et lecture A2 après 30 minutes d’attente à 340 nm


A partir des résultats, vérifier le titre de l’étalon en mg.L-1 selon la loi de Lambert Beer avec 4 chiffres significatifs. Déterminer la concentration de la solution inconnue en mg.L-1 et en mmol.l-1 avec 4 chiffres significatifs par rapport à l’étalon théorique et avec la loi de Lambert Beer. Conclure. Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3 A1 0 -0,001 0,002 0,003 -0,002 -0,004 -0,001 A2 0 0,119 0,118 0,118 0,198 0,200 0,206 A ?-A ?


TP 6 : Les ACIDES AMINES page 42/71

TP n° 6 : DOSAGES DE L’ASPARTATE, DE L’ASPARAGINE ET DE L’ACIDE GLUTAMIQUE

Première Partie : DOSAGES ENZYMATIQUES de L.ASP & L.ASN

• Donner les formules semi-développées des acides aminés suivants : L. Asp et L. Asn. • Calculer leurs masses molaires au pH du milieu réactionnel avec 3 chiffres

significatifs et selon l’unité adéquate. (avec justifications) • Quel rôle réactionnel joue l’ASAT ? De quel type d’enzyme s’agit-il ? • D’après vous, dans quel sens évoluera la variation d’absorbance lors de ce dosage ?

(avec justifications) Deuxième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE du L.GLU dans un produit alimentaire

• Donner la différence entre l’Asp et l’acide glutamique. • Expliquer pourquoi le zéro optique de ce dosage peut être effectué sur la cuve dite

témoin. Justifier le raisonnement. • La méthode de l’étalon interne permet-elle de choisir le meilleur étalon ? Justifier la

réponse. • Donner la formule littérale qui permet de donner le résultat en g/100 g.




1. doser par méthode enzymatique UV, une solution inconnue de L. Aspartate et de L. Asparagine selon la méthode de l’étalon externe (pour l’Asn, cela se fera sous forme d’exercice) ;

2. doser par méthode enzymatique UV, le glutamate d’un produit alimentaire selon la méthode de l’étalon interne.

Première Partie : DOSAGES ENZYMATIQUES de L.ASP & L.ASN

1. Principe On trouve principalement l’aspartate, ou l’acide aspartique (Asp) dans la mélasse de betteraves et l’asparagine (Asn) dans les germes d’asperges, de betteraves et de pois. Il existe trois formes d’asparagine dont deux seulement sont actives sur la lumière polarisée : les formes D et L. Cependant, les enzymes pouvant être très spécifiques, elles ne transforment que la forme L. L’acide aspartique et l’asparagine sont ainsi dosés selon les réactions suivantes :

1) L.Aspartate + α-cétoglutarate ⎯⎯ →⎯ASAT oxalo-acétate + L-Glutamate

2) Oxalo-acétate + NADH + H+ ⎯⎯ →⎯MDH malate + NAD+

3) L.Asparagine + H2O ⎯⎯ →⎯ASNase L.Aspartate + NH3

Il s’agit de réactions enzymatiques couplées qui réagissent de façon stoechiométrique. Le principe de dosage est de quantifier les concentrations d’inconnues L.Aspartate et L.Asparagine selon la variation d’absorbance du NADH qui se transforme en NAD+, forme oxydée qui n’absorbe pas à 340 nm. L’aspartate est dosé selon les réactions 1 et 2 ; quant à l’inconnue asparagine, son dosage débutera lorsque l’aspartate sera entièrement dosé et s’effectuera selon l’ordre de réactions suivant 3, 1 et 2 (car il y a formation d’aspartate en réaction 3, puis dosage par les réactions 1 et 2). L’enzyme ASAT (Aspartate Transaminase) ou GOT (dite Glutamate Oxaloacétate Transaminase) permet le transfert de la fonction amine. La Malate Déshydrogénase (MDH) permet la déshydrogénation de l’oxaloacétate en malate et l’Asparaginase (Asnase), la désamination de l’asparagine en acide aspartique. L’α-cétoglutarate est mis en excès afin de déplacer toute la réaction 1 vers la droite et de favoriser la réaction.



La variation d’absorbances de ces deux dosages successifs est donnée par la figure suivante : Dans ce dosage, la méthode de l’étalon externe, choisie pour ce dosage, présente l’avantage de diminuer l’influence du spectrophotomètre sur les résultats. Enfin, tous les résultats obtenus dans ce dosage par cette méthode pourront être analysés d’après les indications fournies dans le chapitre précédent intitulé Cours et Travaux Dirigés, rubrique Dosages enzymatiques.


• Tampon phosphate à 0,25 mol.L-1 et pH 7,2 composé d’hydrogénophosphate disodique et de dihydrogénophosphate de potassium ;

• Mélange volume à volume de NADH-Na2 6 mmol.L-1 et α-cétoglutarate à 0,1 mol.L-1, préparé le jour même ;

• Mélange étalon de L.Asp à environ 1,5 mmol.L-1 et de L.Asn à environ 1,5 mmol.L-1 (les titres exacts seront précisés le jour du TP) préparé par pesées de L.Asp et de L.Asn (de masse molaire déterminée selon le pH du milieu réactionnel7)

• MDH à 5 mg.mL-1 (environ 2000 U/mg de protéine) ; • ASAT à 2 mg.mL-1 (environ 200 U/mg de protéine) ; • Asnase à 2,5 mg.mL-1 (environ 200 U/mg de protéine) ; • Solution inconnue de L.Asp et L.Asn d’environ 1,5 mmol.L-1.

Protocole : Ce dosage est à faire directement en microcuves plastiques de TO 1 cm. Vous devez travailler selon la méthode de l’étalon externe : 3 cuves « essai », 3 cuves « étalon » et 1 cuve témoin. Les prises d’essai de l’étalon et de l’essai seront respectivement de 0,05 mL.


A

temps

A1

A2

A3

ΔΑ1= A1-A2 (pour Asp)

ΔΑ2= A2-A3 (pour Asn)



La méthode utilisée pour les dépôts d’étalon et d’essai est la méthode traditionnelle avec pré rinçage de cônes. La méthode utilisée pour les dépôts d’enzymes est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes.



Vol. tampon pH 7,2 0,5

Vol. NADH + α-cétoglutarate

0,1

Vol. étalons Asp à mmol.L-1 et Asn à mmol.L-1

Vol. essai

Vol. eau distillée 0,75

Vol. enz. ? 0,01

Incubation et lecture A1 après 3 min d’attente à nm

Vol. enz. ? 0,01

Incubation et lecture A2 après 30 minutes d’attente à nm

Vol. enz. ? 0,01



A partir des résultats, vérifier les titres des étalons en mmol.L-1 selon la loi de Lambert Beer avec 4 chiffres significatifs. Exprimer la concentration de la solution inconnue L.Asp en mmol.L-1 et en g.L-1 avec 4 chiffres significatifs par rapport à l’étalon théorique. Conclure. Rendre les résultats en première page en mmol.L-1 avec 4 chiffres significatifs. Pour le dosage de l’Asn, calculer sa concentration en mmol.L-1 selon la méthode de votre choix et en utilisant les résultats expérimentaux fournis. Données : Coefficient d’extinction molaire du NADH à 340 nm = 6,3 L.mmol-1.cm-1

Résultats pour L.Asp

Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3 A1 A2 A ?-A ?



Vérification du titre de l’étalon L.Asp : Choix du meilleur étalon : Calculs pour X Asp d’après l’étalon théorique : Conclusion : Résultats expérimentaux pour L.Asn Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3 A2 1,360 1,041 1,045 1,036 1,134 1,133 1,139 A3 1,338 0,610 0,618 0,610 0,540 0,530 0,520 A ?-A ? ΔA-ΔAT Vérification du titre de l’étalon L.Asn :

ΔA-ΔAT



Choix du meilleur étalon : Calculs pour X Asn : Conclusion : Deuxième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE du L.GLU dans un produit alimentaire

1. Principe Vous allez maintenant réaliser le dosage en point final d’une solution inconnue de glutamate, ou acide glutamique (L-Glu) contenu dans une soupe lyophilisée Royco « Velouté de légumes ». On peut trouver le L-Glu dans la mélasse de betteraves, dans le blé, le maïs et le soja, dans des milieux organiques (muscles et système nerveux). Cet acide aminé augmente le seuil d’excitabilité des cellules nerveuses : il améliore l’efficacité intellectuelle mais en trop grande concentration, il est susceptible d’entraîner des effets pathologiques comme ceux rencontrés dans la maladie d’Alzheimer. C’est également un transporteur d’ammoniaque. Il permet de relever le goût alimentaire (cf. les paquets de soupe, par exemple) : c’est un exhausteur de goût. Le L-Glu est dosé selon la réaction suivante :

L-Glu + NAD+ + H2O ⎯⎯ →⎯GLDH α-cétoglutarate + NADH, H+ + NH4

+ Le principe de dosage est de mesurer, par la méthode de l’étalon interne, une variation d’absorbances caractérisée par l’apparition de NADH, H+ telle que la concentration de cette forme de coenzyme est proportionnelle à la concentration de L-Glu contenue dans la cuve. La réaction est catalysée par la GLDH (Glutamate Deshydrogénase) en présence de NAD+. En général, on utilise un complexant (l’hydrazine) qui, combiné avec l’α-cétoglutarate, donne un complexe coloré jaune absorbant à 450 nm.



Dans notre cas pratique, la lecture s’effectuant à 340 nm, le dosage ne sera pas faussé. Dans ce dosage, la méthode de l’étalon interne choisie permet d’éliminer les effets d’inhibitions et les erreurs dues à un mauvais calage du spectrophotomètre. Cette méthode peut également s’appliquer car elle respecte et suit la loi d’additivité des absorbances. Ainsi, tous les résultats obtenus dans ce dosage par cette méthode pourront être analysés d’après les indications fournies dans le chapitre précédent intitulé Cours et Travaux Dirigés, rubrique Dosages enzymatiques. Remarque : ce dosage s’effectuant sur un produit alimentaire, contenant des inhibiteurs d’enzymes, il se pourrait que votre titre étalon ne soit pas retrouvé : vous devriez obtenir un titre d’étalon calculé très inférieur à celui annoncé en théorie.


• Tampon glycocolle à 0,5 mol.L-1 et pH 9,0 ; stabilité de 3 mois à 4°C ; • Mélange de NAD+ 18 mmol.L-1 et ADP, Na2 11,17 mol.L-1 • Etalon de L-Glu à environ 0,1 mg.mL-1 (le titre exact sera précisé le jour du TP)

préparé par pesée de L-Glu (de masse molaire déterminée selon le pH du milieu réactionnel)

• GLDH à 186,3 mg/2 mL (environ 3000 U) ; • Inconnue soupe (lyphilisat) < 2,5 % (p/p).

Préparation de la solution inconnue : Selon la nature de votre inconnue (solution alimentaire liquide ou solide), le protocole de préparation de celle-ci diffère légèrement. Dans notre cas, l’inconnue est issue d’une masse de soupe alimentaire Royco contenant un pourcentage indéterminé de L.Glu. Avant de commencer le dosage, il est donc obligatoire de réaliser les étapes suivantes :

• Peser environ exactement 1 g de soupe inconnue dans un bécher propre et sec ; • Extraire à l’eau chaude distillée dans le bécher (50 °C < T° < 70 °C) ; • Mettre en fiole de 100 mL le produit de l’extraction froid ainsi que les eaux de

rinçage ; • Filtrer environ 2 mL deux fois de suite sur deux filtres différents (filtres réalisés par

vos soins avec du papier filtre blanc Vélin) ; • Doser sur le filtrat obtenu.

Protocole : Ce dosage est à faire directement en microcuves plastiques de TO 1 cm. Pour la méthode de l’étalon interne, vous devrez préparer 3 cuves « essai » dilué, 3 cuves « étalon + essai dilué» et 1 cuve témoin. La méthode utilisée pour les dépôts d’étalon et d’essai est la méthode traditionnelle avec pré rinçage de cônes. La méthode utilisée pour les dépôts d’enzyme est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes.



3. Tableau de mode opératoire

Compléter le tableau de mode opératoire en suivant les indications : pour la cuve témoin, le mode opératoire est le suivant : - 1,3 mL de solution tampon pH 9 - 0,1 mL de mélange NAD + ADP - 0,3 mL d’eau distillée

- mélanger et lire l’absorbance à 340 nm après 3 minutes d’attente

- 0,02 mL de GLDH - mélanger et lire l’absorbance à 340 nm après 45 minutes d’attente.

Adapter ce mode opératoire aux cuves « essai » dilué et « essai dilué + étalon », sachant que les volumes des solutions « essai » dilué et « étalon + essai dilué » seront respectivement de 0,1 mL et de 0,2 mL. Tous les volumes sont en mL.

Cuves Témoin (étalon + essai) 1

(étalon + essai) 2

(étalon + essai) 3

Essai 1 Essai 2 Essai 3

A1 après min d’attente à nm

A2 après minutes d’attente à nm


A partir des résultats, déterminer le titre de l’étalon en mg.mL-1 selon la loi de Lambert Beer avec 4 chiffres significatifs. Exprimer la concentration de l’inconnue L.Glu en g.L-1 avec 3 chiffres significatifs par rapport à l’étalon théorique et avec la loi de Lambert Beer et en g/100 g à l’aide de la masse pesée. Conclure. Rendre le résultat en première page en g/100 g avec 3 chiffres significatifs selon la méthode de l’étalon théorique. Témoin (étalon +

essai) 1 (étalon + essai) 2

(étalon + essai) 3

Essai 1 Essai 2 Essai 3

A1

A2



A ?-A ?

ΔAmoyen

Δ Absorbance moyenne de Etalon = Calcul du titre de l’étalon L.Glu : Calculs pour X L.Glu d’après l’étalon théorique : Calculs pour X L.Glu d’après la loi de Lambert Beer : Résultat final Par l’étalon théorique Par la loi de Lambert Beer g.L-1 g/100 g g.L-1 g/100 g Concentration finale Glu

Conclusion :


TP 7 : Les SUCRES page 51/71

TP N° 7 : DOSAGES du GLUCOSE, du FRUCTOSE et du SACCHAROSE

Le NADP Le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP)

est un coenzyme d’oxydoréduction très proche du NAD, dont il diffère par un résidu phosphate estérifié en C2’ du ribose lié à l’adénine (cf. figure 1). Sa forme réduite est désignée par la forme NADPH, H+. C’est un co-substrat (coenzyme libre) associé à des oxydoréductases

Figure 1 : structure schématique de la forme oxydée du NADP

Rappel : dans les méthodes désignées en tant que tests UV, les réactions utilisées sont NADH ou NADPH dépendantes.

Figure 2 : courbe d’absorption du NADP/NADPH

Le saccharose Le saccharose ou sucrose est un diholoside non réducteur, le plus répandu de tous, extrait de la canne à sucre et de la betterave. Il est formé de la condensation de deux oses, le glucose et le fructose reliés par une liaison osidique α (1-2) β. Sa formule non développée est C12H22O11 (cf. structure semi - développée en figure 3). Son nom officiel est le β D-fructofuranosyl (2-1) α D-glucopyranoside.

Figure 3 : structure semi -développée du saccharose



Le saccharose a 5 isomères naturels qui diffèrent par la position de la liaison osidique, le maltose, par exemple est du glucose α (1-4) fructose. Il est hydrolysé de deux manières :

! Chimiquement, par chauffage en milieu acide ; ! Enzymatiquement par l’action de deux enzymes : l’α-glucosidase (ou saccharase

intestinale) et la β fructosidase (ou invertase dans les levures). En présence d’eau et à température modérée, le saccharose par l’effet de la β fructosidase s’hydrolyse en glucose et fructose (permettant alors son assimilation par l’organisme). Le mélange produit est un mélange équimolaire de glucose et de fructose, appelé sucre inverti. Détermination des résultats Chaque molécule inconnue de votre TP du jour est dosée selon la méthode au point final. Rappel : les variations d’absorbances du coenzyme lié à la réaction enzymatique permettent de déterminer proportionnellement la concentration de celui-ci et donc également celle de la molécule dosée. Les réactions parasites Une réaction parasite peut parfois se superposer à la réaction principale. Il subsiste alors une faible dérive qui peut être rectifiée par extrapolation graphique ou par calcul (cf. figure 4). Ces réactions secondaires, de quatre types différents (cf. figure 4) sont la conséquence de la présence de substances annexes dans les produits alimentaires qui entraînent l’augmentation ou la diminution des absorbances. Pour déterminer l’absorbance réelle, il faut poursuivre les lectures d’absorbances après le temps indiqué par 4 ou 6 lectures supplémentaires à intervalles réguliers de 10 minutes jusqu’à stabilisation des absorbances. Graphiquement, il faut prolonger la partie linéaire post réactionnelle obtenue par ces dernières lectures jusqu’à la droite parallèle à l’ordonnée passant au temps t0 (instant initial de la réaction). Le point d’intersection constitue alors l’absorbance réelle.



Figure 4 : extrapolations graphiques dues aux réactions parasitaires en enzymologie



Questions préliminaires Première Partie : DOSAGES ENZYMATIQUES du GLUCOSE & FRUCTOSE

• A l’aide d’un exemple, justifier la signification du terme aldose ? Donner la masse molaire avec 3 chiffres significatifs et selon l’unité adéquate.

• A l’aide d’un exemple, justifier la signification du terme cétose ? Donner la masse molaire avec 3 chiffres significatifs et selon l’unité adéquate.

• Quel est l’acronyme de la glucose 6 phosphate déshydrogénase ? Quel rôle fonctionnel joue cette enzyme ?

• Indiquer le couple de coenzyme utilisé dans ce dosage. A quelle classe de coenzyme appartient-il ?

• Pour ce dosage du glucose-fructose, le zéro optique peut se faire contre la cuve témoin. Expliquer pourquoi ceci est possible.

• Donner la définition d’une réaction parasite. Deuxième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE du SACCHAROSE

• Quelle est la nature chimique du saccharose ? Donner la masse molaire avec 3 chiffres significatifs et selon l’unité adéquate.

• Dans ce dosage, quel est le rôle de la β fructosidase ? Est-ce une enzyme principale ? • Pour les calculs de concentration étalon, faut-il tenir compte du facteur de dilution

100 ? Justifier la réponse. • Pour tous les dosages de ce TP, expliquer pourquoi il est obligatoire d’utiliser le même

spectrophotomètre.




1. doser par méthode enzymatique UV le glucose et le fructose d’une solution inconnue de jus de fruits ;

2. doser par la même méthode le saccharose contenu dans le même jus de fruits. Première Partie : DOSAGES ENZYMATIQUES du GLUCOSE & FRUCTOSE

1. Principe Le glucose et le fructose sont dosés selon les réactions suivantes :

1) glucose + ΑΤP ⎯⎯⎯ →⎯hexokinase glucose-6-phosphate + ADP

2) fructose + ATP ⎯⎯⎯ →⎯hexokinase fructose-6-phosphate + ADP

3) glucose-6-phosphate + NADP+ ⎯⎯⎯ →⎯ PDHG6 gluconate-6-phosphate + NADPH, H+

4) fructose-6-phosphate ⎯⎯→⎯PGI glucose-6-phosphate Il s’agit de réactions enzymatiques couplées qui réagissent de façon stoechiométrique. Le principe de dosage est de quantifier les concentrations d’inconnues de glucose et de fructose selon la variation d’absorbance du NADPH+ selon le schéma suivant :

2. Préparation des cuves

Les réactifs utilisés sont : • Tampon triéthanolamine à 0,75 mol.L-1 et pH 7,6 ; Mg2+ à 10 mmol.L-1 ; • Mélange de NADP 5,75 mmol.L-1 et ATP 40,5 mmol.L-1 ; • Mélange étalon de glucose à environ 0,2 g.L-1 et de fructose à environ 0,3 g/L

(les titres exacts seront précisés le jour du TP) préparé par pesées de glucose et de fructose (de masses molaires déterminées précédemment8) ;


Abs

temps

ΔAbs = A3-A2

ΔAbs = A2-A1

A3

A2

A1



• Mélange de HK (hexokinase) à 2 mg.mL-1 et de G6PDH (glucose-6-phosphate déshydrogénase) à 1 mg.mL-1 ;

• PGI (phospho gluco isomérase) à 1 mg.mL-1 ; • Inconnue jus de fruits.

Préparation de l’inconnue à doser : Avant de déposer l’inconnue à doser dans les cuves « essai », vous devez préalablement la diluer dans de l’eau distillée selon un facteur de dilution qui vous sera communiqué le jour du TP. Protocole : Ce dosage est à faire directement en cuves plastiques de TO 1 cm selon la méthode de l’étalon externe. Pour la cuve témoin, le protocole est le suivant : - 0,5 mL de solution tampon pH 7,6 - 0,1 mL de mélange NADP + ATP - 1 mL d’eau distillée

- mélanger et lire l’absorbance à 340 nm après 3 minutes d’attente - 0,01 mL de HK-G6PDH

- mélanger et lire l’absorbance à 340 nm après 30 minutes d’attente - 0,01 mL de PGI

- mélanger et lire l’absorbance à 340 nm après 30 minutes d’attente - puis effectuer des lectures des cuves essais toutes les 10 min si présence de réactions

parasites. Adapter ce mode opératoire aux cuves «essai» dilué et «étalon», sachant que les volumes de solution «essai» et «étalon» seront respectivement de 0,05 mL. La méthode utilisée pour les dépôts d’étalon et d’essai est la méthode traditionnelle avec pré rinçage de cônes. La méthode utilisée pour les dépôts d’enzyme est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes. Mesurer toutes les absorbances sur le même spectrophotomètre que celui utilisé pour le dosage du saccharose.

3. Tableau de mode opératoire Proposer un tableau de mode opératoire conforme au protocole donné.




Enz ?


Enz ?

Incubation et lecture A3 après 30 minutes d’attente à nm Puis toutes les 10 minutes si réactions parasites


A partir des résultats, vérifier les titres des étalons en g.L-1 selon la loi de Lambert Beer avec 3 chiffres significatifs. Exprimer les concentrations en glucose et fructose de la solution inconnue en g.L-1 et en mmol.L-1 avec 3 chiffres significatifs par rapport à l’étalon théorique et avec la loi de Lambert Beer. Conclure. Rendre les résultats en première page en g.L-1 selon la méthode de l’étalon théorique. Données : Coefficient d’extinction molaire du NADPH à 340 nm = 6,18 L.mmol-1.cm-1

Résultats pour le glucose : Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3 A1 A2 A ?-A ? Vérification du titre de l’étalon glucose : Choix du meilleur étalon : Calculs pour X Glu d’après l’étalon théorique :



Calculs pour X Glu d’après la loi de Lambert Beer : Résultats pour le fructose : Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3 A2 A3 A3 + 10 A3 + 20 A3 + 30 A ?-A ? Vérification du titre de l’étalon fructose : Choix du meilleur étalon : Calculs pour X Fruct. d’après l’étalon théorique : Calculs pour X Fruct. d’après la loi de Lambert Beer :



Résultat final pour les 2 sucres : Par l’étalon théorique Par la loi de Lambert Beer mmol.L-1 g.L-1 mmol.L-1 g.L-1 Concentration finale glucose

Concentration finale fructose

Conclusion : Deuxième partie : DOSAGE ENZYMATIQUE du SACCHAROSE

1. Principe Vous allez maintenant réaliser le dosage du saccharose contenu dans le jus de fruits Oranges de Minute Maid pour lequel vous aurez aussi dosé préalablement le glucose et le fructose. Le saccharose, ou plus exactement le glucose total, est dosé selon les réactions suivantes :

1) glucose + ΑΤP ⎯⎯⎯ →⎯hexokinase glucose-6-phosphate + ADP

2) glucose-6-phosphate + NADP+ ⎯⎯⎯ →⎯ PDHG6 gluconate-6-phosphate + NADPH, H+

3) saccharose ⎯⎯⎯⎯ →⎯ sidasebétafructo glucose + fructose Le principe de dosage est de mesurer, par la méthode de l’étalon externe, une variation d’absorbance caractérisée par l’apparition de NADPH, H+ telle que la concentration de cette forme de coenzyme est proportionnelle à la concentration molaire de glucose total contenue dans la cuve. Or, on sait que :

1. concentration molaire de saccharose = concentration molaire de glucose hydrolysé 2. concentration molaire de glucose total = concentration molaire de glucose libre +

concentration molaire de glucose hydrolysé d’où,

concentration molaire de saccharose = concentration molaire de glucose total – concentration molaire de glucose libre

Rappels :

• Le glucose total vous est donné par le dosage du saccharose et le glucose libre par le dosage du glucose précédent ;

• Le résultat obtenu en glucose total (en mol.L-1) doit être supérieur à celui obtenu en glucose libre (en mol.L-1).




• Tampon triéthanolamine à 0,75 mol.L-1 et pH 7,6 ; Mg2+ à 10 mmol.L-1 ; • Tampon citrate à 0,32 mol.L-1 et pH 4,6 ; • Mélange de NADP 5,75 mmol.L-1 et ATP 40,5 mmol.L-1 ; • Etalon de saccharose à environ 0,6 g.L-1 (le titre exact sera précisé le jour du

TP) préparé par pesée de saccharose (de masse molaire déterminée précédemment9) ;

• Mélange de HK (hexokinase) à 2 mg.mL-1 et de G6PDH (glucose-6-phosphate déshydrogénase) à 1 mg.mL-1 ;

• β fructosidase à 2,5 mg.mL-1 ; • Inconnue jus de fruits.

Préparation de votre inconnue : Avant de déposer l’inconnue à doser dans les cuves «essai», vous devez préalablement la diluer dans de l’eau distillée selon un facteur de dilution qui vous sera communiqué le jour du TP. Protocole : Ce dosage est à faire directement en cuves plastiques de TO 1 cm. Vous devez effectuer 3 cuves «essai», 3 cuves «étalon» et 1 cuve témoin. Les volumes de solution «essai» diluée et «étalon» seront respectivement de 0,05 mL. La méthode utilisée pour les dépôts d’étalon et d’essai est la méthode traditionnelle avec pré rinçage de cônes. La méthode utilisée pour les dépôts d’enzyme est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes. Mesurer toutes les absorbances sur le même spectrophotomètre que celui utilisé pour le dosage du glucose -fructose.



Vol. tampon citrate 0,1

Vol. étalon Saccharose à mg.L-1

Vol. essai

Vol. enz. ? 0,01




Incubation Mélanger sans retournement et attendre 30 minutes à température ambiante

Vol. tampon pH 7,6 0,5

Vol. NADP + ATP 0,1

Vol. eau distillée 1


Vol. enz. ? 0,1



A partir des résultats, vérifier le titre de l’étalon saccharose en g.L-1 selon la loi de Lambert Beer avec 3 chiffres significatifs. Exprimer la concentration en glucose total de la solution inconnue en g.L-1 et en mmol.L-1 avec 3 chiffres significatifs, selon deux méthodes de calculs différentes. Exprimer la concentration en saccharose de la solution inconnue en g.L-1 et en mmol.L-1 avec 3 chiffres significatifs, selon deux méthodes de calculs différentes. Conclure. Rendre les résultats en première page en glucose total en g.L-1 avec 3 chiffres significatifs selon la méthode de l’étalon théorique. Résultats pour le saccharose : Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3 A1 A2 A ?-A ? Vérification du titre de l’étalon saccharose : Choix du meilleur étalon saccharose :



Transformation de la concentration de l’étalon saccharose en concentration d’étalon glucose : Calculs pour X glucose total : Calculs pour X saccharose :



Récapitulatif des résultats Par l’étalon théorique Par la loi de Lambert Beer g.L-1 mmol.L-1 g.L-1 mmol.L-1 Concentration finale en glucose total

Concentration finale en saccharose

Conclusion


TP 8 : REVISIONS GENERALES page 64/71

TP n° 8 : REVISIONS GENERALES

Questions préliminaires Première Partie : DOSAGE d’une SOLUTION de PROTEINES par la METHODE AU BLEU de COOMASSIE

• Dilution de l’étalon (formule littérale, application numérique et matériel à utiliser) • Dilution de l’inconnue (formule littérale, application numérique et matériel à utiliser) • Quel type de cuves faut-il utiliser ? Pourquoi ? • Le domaine de lecture se situe dans le visible. Pourquoi ? • La limite de linéarité de ce dosage est de 12 µg/tube. Quelles seront les conséquences

de cette information pour vos calculs ? Deuxième partie : DOSAGE de GLUCOSE par DOSAGE ENZYMATIQUE COLORIMETRIQUE

• Donner, en mots clés, le principe de ce dosage. • Rappeler la masse molaire du glucose • Donner la définition de la glycémie. Quel rapport avec votre TP ? • Donner la composition de la cuve témoin (avec justifications).

Troisième partie : DOSAGE de l’ACTIVITE ENZYMATIQUE de la GAMMAGT

• Quel rôle le Glutamylcarboxy-3 nitro-4 anilide joue-t-il ? • Vous devez utiliser des microcuves plastiques. Pourquoi ? • Indiquer et justifier le type de pipetman à utiliser pour le dépôt de l’inconnue. • Justifier la méthode de prélèvement choisie pour le dépôt de l’inconnue.



Protocole et compte rendu Le but de cette dernière séance, en trois parties, est de vous permettre de réviser les types de TP sur lesquels vous êtes susceptibles d’être interrogés à l’examen final de TP de Biochimie. Première Partie : DOSAGE d’une SOLUTION de PROTEINES par la METHODE AU BLEU de COOMASSIE

1. But • Utilisation d’une solution de protéines (SAB) pour vérifier la qualité de vos dilutions

en fioles et de vos prélèvements ; • Discussion sur la limite de linéarité d’une gamme d’étalonnage.


Les réactifs utilisés sont : • Réactif au Bleu de Coomassie : mélange aqueux de bleu de Coomassie,

d’éthanol dénaturé et d’acide orthophosphorique à 85 % ; • Solution mère étalon de SAB à 500 mg.L-1 préparée par pesée de SAB fraction

V dans du sérum physiologique. Protocole : Préparer une gamme d’étalonnage de 6 cuves s’étalant régulièrement de 0 à 20 µg/tube à partir d’une solution de SAB à 0,5 g.L-1, en prévoyant des volumes d’étalon adaptés au matériel que vous possédez et d’un volume maxi de 1 mL. La solution inconnue est comprise entre 25 et 50 mg.L-1. Vous devrez préparer 3 tubes « inconnue » diluée ou non de 1 mL de prise d’essai maxi10. Le volume final de chaque tube est de 1 mL. Le diluant est de l’eau distillée. Le volume de réactif au Bleu de Coomassie est de 1 mL dans tous les tubes. Après homogénéisation et une attente minimum de 15 minutes, les mesures sont à effectuer à 612 nm.

3. Tableau de mode opératoire Calculer pour chaque tube de gamme la quantité en ? /tube, la concentration avant et après réactifs en ? Faire le détail de ces calculs uniquement pour le tube coloré n° 3. Proposer un tableau de mode opératoire conforme.




Cuves

Calculs pour le tube coloré n° 3 :



4. Résultats : analyse et conclusion A partir de des résultats, faire deux exploitations graphiques :

• Sur papier millimétré, un graphe abs = f (?) correctement légendé et exploité sous forme courbe ;

• A l’aide de Régressi, un graphe abs = f(?) correctement légendé et exploité sous forme linéaire.

Déterminer la concentration en protéines de la solution inconnue en mg.L-1 avec 4 chiffres significatifs selon les deux exploitations. Conclure sur la fourchette de résultats selon les deux graphes et la limite de linéarité de cette gamme d’étalonnage. Calculs pour X pour la forme linéaire : Calculs pour X pour la forme courbe : Conclusion : Deuxième partie : DOSAGE du GLUCOSE par DOSAGE ENZYMATIQUE COLORIMETRIQUE

1. But Réaliser un dosage enzymatique par méthode colorimétrique d’une solution glucose contenue dans un échantillon de sérum de type Séronorm. Le glucose est alors dosé selon les réactions suivantes :

Glucose + O2+ H2O ----( glucose oxydase )-------> acide gluconique + H2O2 Amino-4-antipyrine + phénol+ 2H2O2 ----( peroxydase )-------> quinone imine (rose) + 4H2O




• Réactif de travail ; • Etalon glucose (de masse molaire à déterminer11) à environ 1 g.L-1 (le titre exact

sera communiqué en TP) ; • Inconnue sérum (en eppendorf) comprise entre 0,720 et 1,80 g.L-1.

Protocole : Vous devez effectuer les mélanges suivants directement en microcuves plastiques de 1 cm de TO. Vous réaliserez 3 cuves « étalon », 3 cuves « essai » et 1 cuve témoin selon le modèle de protocole suivant :

- composition de la cuve essai ou étalon : ! 1,0 mL de réactif de travail ; ! 0,01 mL d’essai ou d’étalon.

Après homogénéisation et une attente minimum de 20 minutes à température ambiante, les mesures sont à effectuer à 505 nm. La méthode utilisée pour les dépôts d’étalon et d’inconnue est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes. Remarque : stabilité de la coloration = 1 heure à température ambiante. Compléter le tableau de mode opératoire suivant : Tous les volumes sont en mL.


A partir des résultats, vérifier le titre de l’étalon en g.L-1 selon la loi de Lambert Beer avec 4 chiffres significatifs et déterminer la concentration en glucose plasmatique de la solution inconnue en g.L-1 et en mmol.L-1 avec 3 chiffres significatifs selon une méthode de calcul (au choix). Conclure. Rendre le résultat en première page en g.L-1 avec 3 chiffres significatifs. 11 Cf. votre réponse aux questions préliminaires.



Données : Coefficient d’extinction molaire de la quinone imine à 505 nm = 7,56 L.mmol-1.cm-1. Valeurs usuelles : Sérum ou plasma 0,70 – 1,05 g.L-1 3,89 – 5,83 mmol-1 Liquide céphalo-rachidien 0,50 – 0,70 g.L-1 2,78 – 3,89 mmol-1 Calculs : Conclusion : Troisième partie : DETERMINATION DE LA CONCENTRATION CATALYTIQUE de la GAMMAGT

1. But Déterminer par méthode cinétique l’activité enzymatique en UI/L à 25 °C de la Gamma Glutamyl Transferase (GGT) dont l’activité est de catalyser la réaction suivante : Glutamylcarboxy-3 nitro-4 anilide + glycylglycine ----( γGT )-------> glutamyl-glycylglycine + amino-5 nitro-2 benzoate (jaune)




• Solution réactionnelle : tampon Tris pH 8,25, glycylglycine, L gamma glutamyl carboxy 3 nitro anilide ;

• Inconnue sérum comprise entre 30,8 UI/L à 25°C & 79,2 UI/L à 25°C (en eppendorf). Protocole : Vous devez effectuer les mélanges suivants directement en microcuves plastiques de 1 cm de TO. Vous réaliserez 2 cuves « essai » selon le mode opératoire suivant :

! 1 mL de solution réactionnelle ; ! 100 µL de sérum à doser ; ! mélanger et attendre 1 minute à température ambiante ; ! lecture toutes les 30 secondes pendant environ 3 minutes à 405 nm.

Ne pas oublier de prendre la température à la fin du dosage des deux cuves. Le zéro optique se réalise contre une des cuves essai contenant la solution réactionnelle. La méthode utilisée pour les dépôts d’inconnue est la méthode inverse avec pré rinçage de cônes.

4. Résultats : analyse et conclusion A l’aide d’un graphe, déterminer la concentration catalytique de la γGT en UI.L-1 avec 3 chiffres significatifs à 25 °C à l’aide du facteur de concentration F à calculer. Conclure. Données : Coefficient d’extinction molaire de l’amino-5 nitro-2 benzoate à 405 nm = 9,499 L.mmol-1.cm-1. Concentration catalytique à 25°C = concentration catalytique à T° dosage x 1,093 (25-T°dosage). Valeurs usuelles dans le sérum : 25 °C 30 °C 37 °C Femme 4 – 18 UI/L 5 – 24 UI/L 7 – 32 UI/L Homme 6 – 28 UI/L 8 – 37 UI/L 10 – 49 UI/L Calculs de F :



Calculs de la concentration catalytique moyenne : Conclusion :