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Etude de facteurs influents sur laproduction de triploides par hybridationEntre clémentiniers et mandariniersdiploides
Handaji N.t, Dantbier D.2, Chaltbar A.t, Arsalane N.t,Hrnouni D.], Benyahia If .t et Ollitrault P.'�1: PB. 257 INM, Kenitra Maroc ([email protected]).2: CIMD FLHOR, TA50/P54, 34398 MONTPELLIER CEDUX 5, FRANCE( Ollir rault @ c i rad.fr ).
ALAWAMIA 113 Vol.2 N'l ,2005
Résumé
In triplol:die est une voie prometteuse pour Ia création de nouvelles variétés d'agrumes à petits
fruits stériles, produisant des fruits sans pépins. Izs çavaw réalisés avaient spécialement pour
objectif d'anaiyser l'inJtuenri d"t Tort"urs génotype et environnement sur la production de tri-
plot'des à partir des croisements entre parents diploïdes'
Deux séries de croisements diploides ont été réalisées. Lapremière série correspondàdes croi-
sements simples, entre le clémentinier Sidi Aissa et huit parents mâles de mandarinier (Wilking'
Chienka, Carvalhal, Chuika, SatsumaWase, læe, Robinson et Osceola) réalisés suivant quaÛe
expositions de l'arbre et sur trois années successives (1996,1997et1998)' Tandis que la
diuxième série correspond à un plan de croisements diallètes réciproques, entre trois variétés
(Sidi Aissa, Cravo et King of Siam) réalisés sur deux années successives (1999 et 2000)' I'es pé-'pins
ont été extraits desirutts mûrs et les embryons dérivés des pépins anonnaux ont été mis en
germination sur un milieu de Murashige et Skoog additionné de Img/L d'acide gibbérellique'
L,analyse par la cytométrie enJlux, de 1/�53 plantules issues des croisements entre parents di'
ploitdes, a permis d'identifier 111 tiploi:des, 1033 diploi:des, 5 tétraploïdes et 4 haploïdes'-L,analyse
ile variance du taux de triploidie montre qu'il existe des différences significatives
entre les combinaisons et entre les années. En revanche, il n'y a pas d'ffit significatif Iié à
I'orientation dans l'arbre. Le pourcentage de triploides parmi les plantules issues des pépins
anormaux de la série I varie enfonction des pollinisateurs. Dans cette série, la mandarine Wil-
king produit les taw les plus éIevés (20,3Vo) suivie de Chuika ( l2,7Vo) et Chienka ( 10,47o)' I'a
clémentine Sidi Aissa utitisée comme parent femelle a montré une bonne aptitude à produire
des triploides evec yn tawc moyen d.e I IVo. Ainsi, les combinaisons (Sidi Aissa x Wilking, Sidi
Aissa x Cravo et Sidi Aissa x King of Siam) ont permis l'induction spontanée de la triploïdie
evec un pourcentage relativement éIevé (20, 3Vo, It,67o et 12,17o respectivement)' Par
ailleurs, ia série 2 qui a utilisé trois pareûs femelles montre que le clémentinier sidi Aissa a
une meilleure capacité à produire des triploides spontanés ( 11,87o) que Cravo (3'9Vo) et King
of Siam (2,6Vo). lzs conditions environnementales semblent influencer les taux de triploïdie
surtout p,our la série l. L'année 1997 a été caractérisée par un taux de triploïdie élevé (20'27o)'
Le développement et la maîtrise de cette méthode de séIection préférentielle des triploïdes
ouvre la voie à la créqtion de populations de variétés de mandarinier à fruits sans pépins et fa-
cites à éplucher. lcs vartétés sélectionnées au sein de ces populations contribueront à la diver-
sification du verger Marocain.
clés : Agrumes, mandarinier, triploidie, sauvetage d'embryons, cytométrie en
29
Motsflux
30 AL AWAMIA I 13 Vol.2 N"1 . 2005
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3 lAL AWAMIA I l3 Vol.2 N'l , 2005
Abstract
Triploidy has played important role in the development of new seedless mandarin cultivars'
Thi present work was uidertak"n to study ffics of genotype and environmental conditions on
spontaneous triPloidY rate s.
Two series of diploid x diploid crosses were assessed. The first is related to simple crosses bet-
ween the monoembryonii female parent " clementine Sidi Aissa" and eight males mandarins
parents (witking , chienkà, carvalhal , chiuka, satsumawase, Ice, Robinson et osceola) rea'
Iised in three successives years (1996, 1gg7 and 1998) andfour tree expositions (North' South'
East, West). While the seiond dialleles and reciprocals crosses were realised between the culti-
vars Sidi Aissa, Cravo et king of Siam in three years ( 1999 et 2000). At mqturity, the fruits have
been harvested, and Small embryos were extracted from undevelopped seed and cultured on
Murashig and Skoog medium supplemented with lmg/L gebberilic acid' Triploid seedlings have
b e e n s el e c t e d fo tl ow in g fl ow cy t omet ry analy s i s'
Analysis, of I153 seedlings from diploid uosses, resulted in the identification of I I1 triploids'
1033 diploids,5 tétraploids and4 haploids.
Variance analysis of triploidy rate showed that there is signiftcant differences between parents
combinations and betw)en years. But, the ffict of tree exposition as not significant' In the first
serie using one female parent Sidi Aissa, the triploid percentage (from plantlets rescued in vitro
from small seeds) varied according to parents combinations. In this serie, Wilking gave the hi-"ghest
number (20,3Vo), follwed by Chuika (12,77o) and Chienka (10,4Vo). While the second
serie, using three females, showed that sidi Aissa has a good capacity to induce spontaneous
triploi:dy ( 1 1 ,8Vo) in comparaison to cravo ( 3 ,97o) and King of siam (2,67o). In addition, year
1997 was characterized by high triploid production (20,21Vo) mainly because the temperature
range during the Jlowering prrioa was high. During this experiment, Sidi Aissa clementine used
as jemale pàrrnt showed the highest phenologic stability and produced the highest number oJ
triploid siedlings, for ay tested combinations. This method of triploid production is promising
and would allow to obtain large population of fiploid hybrids with good potential for superior
cultivars.
Key words : Citrus, mandarin, embryos rescue, triploidy, flow cytometry
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lntroduction
La qualité des fruits est un enjeu majeur pour les marchés d'exportation des petits agmmes.
EIle est en particulier définie par I'absence de pépins dans les fruits. Chez les agrumes,I'aspermie repose sur la combinaison de la parthénocarpie et de deux sources principales de
stérilité : la stérilité femelle ou I'absence de fécondation liée à une stérilité mâle ou à I'auto
incompatibilité. Les plantes triplo'ldes sont connues pour présenter un fort niveau de stérilité
tant pour les ovules que pour le pollen. La stérilité gamétique qui caractérise les hybrides tri-ploïdes est expliquée par un déséquilibre chromosomique lors de la méiose (Fatta Del
Bosco et al., 1992). Cet avortement méiotique offre I'avantage de supprimer les pépins des
fruits. Tous les agrumes et genres apparentés ont un nombre de chromosomes de base x=9,
avec une prédominance du niveau diploide chez toutes les espèces cultivées et sauvages(Soost et Cameron, 1985). Il existe, cependant, de rares polyploides naturels comme les
limes triploïdes Tahiti et Bears (2n=3x=27). Certains aneuploïdes à nombre de chromo-
somes variant de 19 à 4l ont été identifiés par Krug (1943) et Esen et Soost (1972). La tri-
ploidie offre aux améliorateurs des agrumes une opportunité de combiner I'aspermie, la vi-
gueur, la production, la précocité et autres caractères désirables selon le choix des parents
(Esen et Soost, 1971). Soost et Cameron (1975) rapportent que les triploïdes sont vigoureux,
productifs et présentent des fruits sans pépins.
Plusieurs voies ont été développées à l'échelle mondiale pour obtenir des hybrides triploides
à partir des croisements :
. La recherche des hybrides triploïdes spontanés issus de croisements entre deux parents di-
ploïdes : Esen et Soost, ( I 97 I ), Soost et Cameron (197 5) et Oiyama et Okudai, ( 1983) ont
proposé, suite à des études cytogénétiques que les hybrides triploïdes étaient issus de la
fusion de gamètes femelles diploides et de gamètes mâles réduits. Cette hypothèse à été vé-
rifiée par Luro et al! (2000,2004) grâce à des études de marquage moléculaire qui ont
montré que les ovules diploïdes résultent d'une restitution lors de la seconde division de la
méiose (SDR). Par conséquent, le parent femelle est responsable de la détermination du
taux d'apparition d'embryons triploïdes qui est lié au taux de production de mégaspores
non réduits (Esen et Soost, 1977 ; Gerarci et al.,1975,1976 et 1982).La fréquence de ga-
mètes femelles non réduits varie suivant les génotypes de moins de lVo à près de 2OVo. Par
ailleurs, la taille des graines est très corrélée avec le niveau de ploïdie. En effet, Ia dimen-
sion des graines portant des embryons triploïdes est de l'ordre de ll3 à l/6 plus petite que
celle portant des diploïdes. La petite taille des graines contenant des embryons triploïdes
est due à I'arrêt précoce du développement de I'endosperme pentaploide de la graine et
constitue une caractéristique utile de présélection des triploides (Esen et Soost 1973 ; Ge-
raci et al.,l9'75 et Oiyama et Okudai, 1983). De même, Geraci (1978) a rapporté que les
embryons triploïdes issus des parents monoembryonés et auto-incompatibles sont facile-
ALAWAMIA ll3 Vol.2 N"l ,2005
ment identifiables mais avec un pourcentage d'obtention très faible. De plus, la polyembryo-
nie des parents femelles, l'auto compatibilité et la stérilité gamétique, de certains cultivars
élites, limite les possibilités de générer des populations d'hybrides triploïdes. .
Les techniques de culture in vitro ont été utilisées pour le sauvetage des embryons triploïdes
immatures issus des croisements entre les diploldes (Starrantino, 1997). Leur combinaison
avec des méthodes de cytométrie en flux a permis d'améliorer fortement la recherche des tri-
ploldes spontanés dans les croisements entre diploides (Ollitrault et al., 1996a).
Croisements entre les tétraploides et les diploides : Cette voie à été la première à être ex-
ploitée systématiquement pour la création de triploides (Russo et Torrisi, 1953 ; Tachikawa'
1973; Esen et Soost, 1973). Cependant, le principal facteur limitant de I'exploitation com-
plète de cette voie était la faible diversité des géniteurs tétraploides. Deux types de croise-
ments ont été rapportés :
a- Croisements entre parents femelles tétraploides et mâles diploides (4xX 2x) : ainsi 857o
detr ip lo ides et l5%odetétraplo idesontétéobtenusparCameronetBurnet t (1978)quand
le parent femelle est tétraplolde et monoembryoné. En revanche, l'utilisation des parents
femelles polyembryonnés rend difficile la distinction entre les nucellaires et les zygo-
tiques triploïdes.
b- Croisemenrs entre parents femelles diploldes et mâles tétraploïdes (2x X 4x) : Quand le
parent rnâle est tétraploide, les embryons triploides sont mal développés (Esen et Soost,
1972 etEsen et Soost, 1978) et le taux d'hybrides triploides obtenus dans les semis est gé-
néralement faible. Esen et al. (1979) ont rapporté ainsi un taux de 9Vo. Esen et Soost
(1973a) ont monrré que le rapport 3/5 (Embryon triploide : 3xl Endosperme pentaploide :
5x) est le facteur principal cle la petite taille des graines portant des embryons triploïdes.
Les techniques de culture in vitro ont été utilisées pour le sauvetage des embryons tri-
ploides immatures issus des croisements entre les diploides et les tétraploÏdes (Starran-
tino, 1982 ;Starrantino et Recupero, 1982).Le principal facteur limitant I'exploitation de
cette voie était la faible diversité des géniteurs tétraploïdes.
Culture in vitro de I'albumen (3n); Comme la plupart des Angiospermes diploïdes, les
agrumes présentent des graines dont l'albumen est triploldes (3n). Ce tissu provient de
l'union des deux noyaux pc,iaircs et I 'un des deux noyaux spermatiques. Gmitter et Hu
(1990) ont montré que le nombre de chromosomes restait stable au cours de toute les
phases de régénération de plantes à partir d'albumen .Les lignées embryogéniques qui conti-
nuaient à proliférer 18 mois après induction étaient ainsi triploides. Peu de travaux ont été
faits dans ce domaine, car I'isolement des tissus d'albumen des tissus nucellaires est une
technique très délicate (Gao et al., 1989). Par ailleurs, les plantes obtenues par cette voie
étaient en majorité très peu vigoureuses (Grosser et al., com pers).
J J
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Hybridation somatique entre protoplastes diploïdes et haploïdes : Chez les agrumes, lesplantes haploïdes ont pu être obtenus par androgenèse (Germana,1992) et gynogenèse in-duite (Ollitrault et al., 1996b). Elles ne présentent aucun intérêt commercial, mais ouvrent lavoie à la production directe d'hybrides triploïdes par hybridation somatique. La viabilité decette approche a été démontrée par Ollitrault et al., 1998a, 1998b) qui ont obtenus une cen-taine d'hybrides triploïdes par électrofusion de protoplastes haploïdes et diploides, et par
Kobayashi et al. (1997).
Plusieurs voies ont été utilisées pour produire des tétraploïdes :
. dans des semis de graines polyembryonées, la fréquence des tétraploides spontanés varie
de | à3Vo (Ollitrault et De Rocca Sera, 1992). Ces autotétraploïdes sont issus d'un dou-blement des tissus nucellaires de I'ovule (Cameron et Frost, 1968) :
. I'application de la colchicine, in vivo, sur les bourgeons axillaires (Barrett, 1974), ou in
vitro, sur les ovules non fécondées et les cals embryogéniques, permet I'obtention d'auto-
tétraploides (Gmitter et Ling, l99l et Gmitter et al., 1991). Le traitement par la colchicine
combiné avec le greffage permet d'obtenir des résultats plus rapides (Grosser et Gmitter,
1990c) ;
. plus récemment la fusion des protoplastes diploïdes à permis d'élargir considérablement
la diversité du pool tétraploïde par la production d'allo-tétraploïdes (Ollitrault et al, 2000;
Grosser et al., 2000). Ces derniers sont hétérozygotes., très vigoureux et très productifs
que les autotétraploides (Grosser et al., 1992 et Tusa et a1.,1992).
L'INRA Maroc aengagé en 1996 un projet de diversification des petits agrumes au niveau
triploïde afin d'alimenter à terme une politique de segmentation du marché des petits
agrumes (Clémentine, mandarine, tangor, tangelo). La stratégie retenue est la recherche de
triploides spontanés dans des descendances d'hybridations entre diploïdes. La mise en place
de ce projet a été appuyée par un partenariat avec les équipes du CIRAD-FLHOR (France).
Afin d'améliorer I'efficacité de cette stratégie, nous avons étudié I'influence des paramètres
génotype et environnement sur la production de triploïdes. Le présent article est une syn-
thèse des résultats obtenus lors de deux séries d'expérimentations.
35ALAWAMIA l13 Vol.2 N"1 , 2005
Materiel et methodes
Pollinisation
Le choix des géniteurs aétéfaitsur la base des principaux critères de sélection (précocité ou
tardiveté, facilité d'épluchage, calibre, teneur en jus et en sucre, productivité)' Deux séries
de croisement ont été effectuées (Tableau 1).
Tableau I : Variétés retenues comme parents géniteurs dans le programme de croisements pour
la création des variétés triploides (El Menzeh, 1996-2000)
(SAr Cté.""ttre Sidi Aissa Cl : signifie combinaison entre Sidi Aissa et Wilking
La première série correspond à des croisements simples entre huit parents mâles et un parenf
femelle monoembryoné et auto-incompatible (Tableau 1). Les huit mandariniers uti l isés
sont Chienka, Chuika, Osceola, Robinson, Wilking, Lee, Satsuma Wase et Carvalhal. Le pa-
rent femelle est représenté par Sidi Aissa (premier clone du verger marocain de clémenti-
nier). Pour chaque croisement, une moyenne de 60 fleurs par arbre et par exposition de
I'arbre et sur deux arbres adjacents, ont été pollinisées par le même parent mâle durant le
mois de Mars et Avril 1996, 1997 et 1998.
La deuxième série correspond à un plan de croisements diallèles réciproques entre deux va-
riétés de mandarinier polyembryonées et auto-compatibles (Cravo, semi précoce et King of
Siam, tardive) et la clémentine Sidi Aissa. Pour chaque croisement, après castration du pa-
rent femelle auto-compatible, 40 fleurs par arbre sur deux arbres adjacents, ont été pollini-
sées par le même parent mâle durant les mois de Mars et Avril 1999 et 2000.
Les travaux sont menés suivant une série d'étapes successives qui débutent par la poll inisa-
tion contrôlée en verger des parents pour aboutir à la caractérisation précoce des hybrides di-
ploTdes et triploides. Les essais ont été répétés pendant trois années successives pour la série
I et deux années successives pour la série2 et ce afin de conforter les résultats et déterminer
les eflets environnementaux.
Sé r i e l :C ro i semen tss i r996-6
çWilking Chienka Carvalhal Chuika S. Wase Lee Robinson Osceola
S , A C I C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
Série 2 : Croisementsdiallèles réciproques I
Parents i d? -
Sidi Aissa Cravo King of Siam
Sidi Aissa C9 c l 0Cravo c l l c t 2Kins of Siam c l 3 ct4
36 ALAWAMIA 113 Vol.2 N'l ,2005
Germination des embryons in vitro
Toutes les graines sont extraites des fruits mûrs et classées en deux catégories selon leurmorphologie : normales (graines entièrement développées) et anormales (graines partielle-ment développées, de forme plate ou petite).
Sous la hotte à flux laminaire, les graines anormales (plates ou petites) ont été placées dansdes boules à thé et désinfectées, pendant l0 min, dans une solution de mercryl Lauryl puisdans I'alcool à 70o et I'eau de javel à 47o. Ensuite, elles ont été lavées trois fois dans I'eau dis-tillée stérile. La décortication des graines a été faite très délicatement pour éviter d'abîmerles embryons. Le milieu de germination est composé de macro et micro-éléments de Mura-shige et Skoog (1962) additionné de lmg/L' d'acide gibbéretlique. L'autoclavage à lieu à120'C pendant 20 minutes. Chaque embryon a ensuite été mis dans un tube à essai contenantle milieu de culture. Les cultures ont été incubées sous une lumière de 2000 lux, assurée par
des tubes à néon, une photopériode de 16 heures et une température de 27tl"C pendant lejour et 19tl 'C la nuit.
Acclimatation
Deux à trois mois après la germination, les vitroplants enracinés sont passés par une phase
d'endurcissement pour les préparer à I'acclimatation. L'endurcissement consiste à fermer les
tubes à essais par du coton après avoir nettoyé les racines du milieu de culture. Cette étape
dure une trentaine d'heure à température ambiante. Chaque plantule est ensuite repiquée
dans un pot contenant un mélange du sable stérile et du substrat, puis placée sous serre dans
des conditions de température de 27"C et d'humidité de 807o. Les pots ont été recouverts par
un parafilm pendant 3 semaines à un mois, afin de maintenir une forte hygrométrie autour
des jeunes plantules. La suppression progressive du film plastique évite les à-coups de vé-gétation. A noter que le passage de la jeune plantule du milieu in vitro à la terre est délicat et
la croissance est lente durant les premiers mois. Les plantules obtenues sont ensuite analy-
sées par la cytométrie en flux et greffées sur les porte-greffes d'agrumes (bigaradier et Ci-
trange troyer) pour réaliser ensuite les essais de comportement.
Analyse de niveau de ploidie par la cytométrie en fluxLa cytométrie en flux permet de mesurer la quantité de I'ADN. Cette quantité est déterminée,d'une part par sa position dans le cycle cellulaire et, d'autre part, par le nombre de copies dugénome par noyau (niveau de ploïdie). Lorsqu'un témoin interne de ploïdie connu est intégréà I 'analyse, permet de déterminer le niveau de ploïdie des échantil lons. Les plantules issuesde sauvetage d'embryons sont analysées par le cytométre en flux. Le protocole de cette tech-nique est celui utilisé par Ollitrault et al. (1995). Les étapes d'analyse sont décrites ci dessous.
3 lALAWAMIA 113 Vol.2 N"l ,2005
. Extraction des noyaux : Environ 100 mg (1 cm? de feuilles) d'échantillon sont placés dans une
boiie de t'rri contenant 0.5 ml de tampon de PBS (de7.659ll- Chlorure de sodium, 0'124glL
de Phosphate disodique, O.2lgL't de Phosphate monosodique et à pH 7,2) auquel on ajoute du
Dithiothréitol DTT (lmg/ml du tampon PBS), du Triton X-100 (0,3 ml/100m1 de tampon
pBS). L,échantillon est coupé finement et rapidement avec une lame de rasoir. La suspension
obtenue est filtrée à 48 pm sur des tamis montés individuellement sur des tubes'
L'introduction d'un surgactant (triton) réduit I'adhésion des débris cellulaires, disperse la chloro-
phylle non désirée, et minimise les fixations non spécifiques des fluorochromes lipophiles. Les
anti-oxydants (DTT) diminuent le brunissement de la préparation'
. Coloration des noyaux : Le colorant (fluorochrome) rajouté dans l'échantillon filtré volume à
volume avec une solution d'iodure de propidium (0.2 mg/ml), est agité quelques secondes au
vortex avant d'être incubé l0 min à température ambiante. L'iodure de propidium, colorant
spécifique aux acides nucléiques, émet une fluorescence rouge sous ultraviolet (Absorption
maximale à 370-550 "nm et émission maximale à 620"nm).
. Calibrage : Une gamme d'étalonnage doit en théorie encadrer strictement tout échantillon à
analyser. Les noyaux en suspension cellulaires ne sont analysés qu'après étalonnage de I'ap-
pareil par des témoins diploïdes, triploïdes etlou tétraploïdes.
. Cytométrie : Les mesures de I'intensité de fluorescence, correspondant à des quantités d'ADN'
sont exprimées en unités arbitraires. Pour prendre une signification, ces valeurs doivent être
comparées à des valeurs repères (au niveau de ploTdie par exemple) définies à I'aide d'un té-
moin (Figure 1). Les témoins, utilisés dans ce travail sont des triploides (la lime Tahiti), des di-
ploides (mandarine commun) et des tétraploides (porte-greffe allotétraploides issus de fusion
somatique). Les plantules issues de la première série des croisements (1996-1999) ont été ana-
lysées par le cytométre en flux de type EPICS XL (COULTRONICS) au niveau d'un labora-
toire d'analyse médicale à Rabat. Tandis que celles issues de la deuxième série ont été analy'
sées par le cyromérre en flux de type FASCAN au niveau de GIRAD FLHOR.
Figure 1 : Modèle général des histogrammes obtenus après analyses par la cytométrie en flux
des hybrides de mandarinier selon leurs niveaux de ploidie
38 AL AWAMIA 113 Vol.2 N't . 2005
Resultats et discus$ionLe nombre de petits.pépins par fruit etle pourcentage de petits pépins diffèrent significative-ment suivant les croisements (Tableau 2a)-. Pour Ia série t, tes mèifteurs résultats s6nt obtenusavec le pollinisateur Chienka tandis que pour.la Série 2 les combinaisons Sidi Aissa ; ;;lii;i:sateurs Cravo et Cravo x King of Siam pioduisent les meilleurs pourcentages oe petits iefini.Tableau 2a : Nombre moyen de pépins par fruit selon les 14 combinaisons parentales
Combinaisons Parent m..âle parent fenrelle
_. -Nombredepépinsobtenus pepinsI otâl Normau( Anomrâux Anormaux anonnau
Nombred€ fruitsob(enus
c lc2c3c4c5c6c7c8SEFJE 2c9cl0cncl2c l3
Sidi AissâSidi AissaSidi AissaSidi AissâSidi AissaSidi AissaSidi AissaSidi Aissa
SrDr ArssASrDr ArssACnlvoCuvoKrxc or SrauKrNc or Srav
WilkingChienkaCarvalhalChuilaS. WaseLÊ,RobinsonOsceola
CncvoKrNc oF SIAMSrDr ArssAKGoF SIAMSru ArsseCnqvot4
259163l l lil07El l 5lE8136
49E512tlt79llt275691570t9451763
977tE16422t20l 8 lt6
4Æ9824l6tll 0 t I505ln21685t626
731169237693159146
576387l l 0l t 6ul6E2û137
2,227 ? 1
0.991,05o,82r,46r ,381,00
I l ,5o3l ,9 '6, l "t0,2ut t l b
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240184461 A
)',20 t2
l4t4 16346 r2.6Iæs valeurs des mêmes lettres ne diffèrent ms
Tableau 2b: Ploidie des plantules issues de la germination des embryons extraits des pépinsanonnaux
Parent _ Parent _ Nombre d'embryons NomUie àe efantut"" an.oty.g.s ruomolnalson mis en gerrnination Tctal Diploldes TriploidelSérie tC I Sidi Aissa Wilking I 509 162 126 J J
C2 Sidi Aissa ChienkaC3 Sidi Aissa CarvalhalC4 Sidi Aissa ChuikaC5 Sidi Aissa S. Wase
1 1 6 1 8 6 7 6 93303471 9 1
C6 Sidi Aissa Lee 506
< , ) < r 15 5 4 8 74 5 4 2 34 7 4 4 36 6 6 2 4 .4 7 7 A 8
Sidi Aissa Robinson
Sidi Aissa Cravo 4AlSidi Aissa I(ing of Siam 368
C8 Sidi Aissa Osceola7744 1 2
Total Série I Un parent I parent 5234 AOO EZ 6SSérie 2
C7
C9c l o
146 129 t7140 I 19
Cl I Cravoc l 2c l 3
Sidi Aissa 93Kg of Siam 155
24t2a 22 6l 5 t 4
t 7o
CravoKing of Siam Sidi Aissa 44
Cl4 King of Siam Cravo l4l IOO A 2Total Série 2 Parent I 282 s53 682 43Totaux 3 parents I I Parent 6516 I 033 t t lLes valeurs, suivies des mêmes lettres, ne diffèrent pas significativemènt 'zi,
SZÇMF : la cytométrie en flux _ : Parent femelle _ : Parent mâle"' : Taux de triploïdie: Nombre de plantules triploldes/Nombre total des plantules analysées"' : Moyenne de taux de ploidie par série.
39
Un total de 1153 plantules hybrides, issue,s des croisements diploides effectués de 1996 à
iôOO, onr été analysés pui "Vion1erie en flux (Tableau 2,b)'- Quatre.niveaux.de ploïdie -onterc îà.ïi i f ier: l l l 'hybiidetiripfoia.t, 1033 diploides,5 tétraploides et 4 haploïdes' Les
fryUiù*r triploides ont tou, été obtenus à partii de^pépins^partiellement dé-v-elop^pés ce qui
confirme les résultars outànur par Esen et Soost (19?1) ; Gèrarci et al. (1982) ; Starrantino
iiôô;i ;1 ôtyu*u et otuàai it'la:; qyl ont trouvè que l'arêt p..é:o"," du développement. de
i,;;a;;;.;; f"ntuploidË.ti iËtfàntâut" de la formâtion de graines d"t-"i1:.fi*:t::.d"::;
nier caiactère permèt une sélectibn précoce des triploïdes. Le taux de triploidie' rapporte aux
ptpi"i u"*râu^, a ete-OË tt, i lUipour la série I et de l,QVo ggur.la série 2 (Tableau 3)'
L;inui'r" de la varianc" J" t** O" tiiptoidle, dans le cas de la série l, montre la présence de
différence hautement tiinifi.utiuà entie les huit combinaisons parentales et entre les trois an-
ne"t fiuUf"uu 3). Dans ie cas de la série 2, seule une différence significative aété notée entre
ies sii combinaisont put"ntut"t (Tableau 4). Aucune interaction n'a été enregistrée entre les
paramètres étudiés pour les deux sériés'
ALAWAMIA l13 Vol.2 N' l ,2005
Tableau 3 : Pourcentages de triploides, d'haploides, de tétraploides et de diploïdes
selon les séries de croisements entre les parents diploïdes (1996 - 2000)
Total Triplôîdes Diploïdes Tétraploïdes Haploïdes
Nombre de plantules
(Série l)r
Pourcentage 0,8
600
100
68.,:r:, : : : : : t : : ; :
r ' l l l i i :r : ir:,,:l:,1,i:,r,ail
t:ii..s
527
87,9
Nombre de plantules
(Série 2)'
Pourcentage
) ) J
100
506
9 l ,s I , t
,4î
Nombre total
plantules
Pourcentage
de 1 153
100
l 033
89,5
l.:î..l
0,30,49;6
Nombre de plantulescytométrie en flux
issues de la germination in vitro des pépins anormaux analysées par la
Taux de triploïdie (TT): Nombre de plantules triploides/ Nombre total des plantules analysées
40 ALAWAMIA t13 Vol.2 N"l . 2005
Tebl€a$ 4 : Résul'tats d'analyse de la variance du taux de triploidie pour chaque sériede croisements
CM ProbabiliæDISérie ICombinaison {C)Exposition (E)Année(A)C X EC X AE X AErreur
7
22 lt 4620
5-913.899.942.382.9ro.651.46
4"032.656.781.631.98l . 8 l
0.0066 (Hs)0.0765 (NS)0.00s7 (HS)0-1425 (NS)0.0814 (NS)0.r481 (NS)
Série 2Combinaison (C)Année (A)C X A
5I5
0,0170,060,015
8,357 ) )
4,23
0,01E (s)0,6 (NS)0,5 cNS)
dl : degré de liberté SCM : Somme aes èàF:Fréquenceà0.05 Pr:Probabi l i té NS:nonsigni f icat i f HS:hautem;nts igni f icat i f S:s igni f icat ive
Effet de génotypes parentaux
Lg,!*gl de triploidie varie de 6 à20,37o selon les combinaisons. La combinaison Cl (Sidi Aissax. Wilking) a donné le meillerr taux dg triplordie (Tableau 2b).Lamandarine Wilkingie ,uruilè-I'j.
pu,. un pouvoir de pollinisation très élèvé ce qui est susceptible d'augmenter la piobabitite detéconder les ovules non réduits..Cette variété peut être considérée comrÀe le pollinisateur le plusefficace de la clémentine Sidi Aissa dans un programme de création des variétés aspermes'tri-plordes. En revanche, elle n'a aucun intérêt comriercial en raison de la grande pépinisation deses fruits. _Sa suppression des vergers. par arrachage ou par surgreffage a?te ainJi làrgement rà-commandée au Maroc. Viennent ensuite les combinaisons C4 1S1ai nissa x Chuika) av"ec un tauxde triplordie de l2,1%o. Les combinaisons C5 (Sidi Aissa x S. ùase) et C8 (Sidi Aissa x OsceÀtà;on.t donné, quand à elles, un nombre moyen de plants triploides. Pai contre C3 (Sidi Aissa x Cailvalhal) a produit un très faible taux de triploides (l,9Eoi.
Par ailleurs, la deuxième série de croisements diallèles a été caracténsée par des taux de triplol-die variant de O à l2,l%o selon les six combinaisons parentales (Tableau Zb1. faclémentine'SidiAissa mon^oembryonée, prise comme femelle, a induit le meilleur taux moyen de triploidie spon-tanée (11,8%o)*par rapport aux autres mandarines polyembryonées. cravo (3,g8ô et King ofSiam (2,6Vo) (Figure 2). Au cours des deux séries de croisements, la clémentine SiOf ,tisu, ftr"comme parent femelle, s'est caractéri.sée par une bonne aptitude à produire des triploides spônta-nés avec des taux de ll,337o (série l) et de 7,7Vo (série 2). Elle a, par ailleurs, pei-is un b'on dé-roulement de toutes les étapes de la pollinisation et de la sélectioniygotique grâce à son auto-in-compatibilité et sa monoembryonie. En revanche, le choix de Sidi eiJsa, ôomme parent mâle, n'apas permis I'induction de la triploïdie spontanée. Les mandarines Cravo et King oi Siarn, choisiescomme parents femelles, ont produit de très faibles pourcentages de triploidels. Elles sont auto-compatibles et polyembryonées, ce qui.nécessite une castratioÀ manuelÈ avant la pratique de lapollinisation. Par conséquent, les premiers critères de choix des parents femelles sËraient la mo-
+ lALAWAMIA l l3 Vol .2 N" l ,2005
noembryonie, I'auto-incompatibilté et I'aptitude à produire des triploides. spontanés' Par ailleurs'
le choix de parents mâtes d'oit être basé sur les criières de sélection relatifs à la qualité.des. fruits
ài a i" p-a,l.tivité et la capacité de pépinisation' Ces croisements diplo:ides ontpormis. linduc-
rion de la tétraploidie p;Ë;;;ÈiiaLons Cl, C2 et C8 et de I'haploidie par la combinaison
c10.Oiyama et Kobayashi (1991) ont obtenu- pour le même parent femelle Yn têux de triploidie va-
rianr de 25 à 417o,."rfrtiuË1n"nq pout lés parents mâlei Poncirus 'trifoliata et le bigaradier Ka-
wano Natsudaidai. Aussi, oiyanra^et Kobâyashi (1990) ont montré.que la clémentine permet
hd;""d;à" tuu* d;;ùi6rdt;. En revanche, Eien ei Soost (1972) ont montré. que le t49x.d9
triploidie reste constant i""Il!t .ioit"ments diplor'des où le mê19 ry1ent
femelle est pollinisé
par plusieurs parents .afËt. Ils ont expliqué ce phénomène par la iubilié du pourcentage de
nrorlrrction des eametesî-"ttrtnon teauitt. En outre, Geraici et al' (1975' 1976 et 1982) ont
iffiffi;;;i; ;;;;;; f;;ii;esi prpolgqu_le.de la détermination du taux d'induction spontanée
;Ëi;r"pifti" {ui, ,elon Ëren et Soost (r971), peut être l*p9l9uI3 5Vo.Il est lié aux taux de la
p.Ju"tion ae *egâspoÀs non réduits qui peut varier de t iZ07o (Iwamasa et al.' 1988)'
Effet de l'année
Les taux de triploidie ont varié significativement en fonction des années pour la première.série.de
"râiË,o"nt (Figure:1. Four ias?rie 2,|'effet n'était pa.s significatif pour le taux de triplo'idie'
Mais, les rendements "n f-tyUrià"t triplo'rdes ont été meilteuis en 2000 qu'en 1999 (35 triploides
;;; 8 ; i999). L'étude'des données météorologiques-montreque les. deux années présentant
i",,,,, r"iit"urt tuui d" triplordes (1991 et 2000) se èaiactérisent. durant la période. de l'induction
nààf", par des tempéràtures minimales faibles et des maxima élevés. Cette variation cl 'amplr-
i"à"-iï".'.iqo" pouôuii èi.e responsable de la formation de gamètes femelles non réduits. De
pi"., ""it" pËrioàe n'etoit pas p_ltivieuse ce qui a favorisé un bôn déroulement de-la-pollinisation
Dar raDDort aux autres anntes.^Plusieurs autéurs (Esen et Soost, 1972 ; Barret, 1990 ; Oiyama et
kîUriiJi iggt ; fattu del bosco et al., 1992) ont montÉ que les températures élevées ou anor-
malement basses peuvent f-uoqo.t la formation des polyplordes' L'action directe et significa-
tive des facteurs ciimatiquËs (température, photopériode et pluviométrie.) sur différents processus
à'inOu.tlon florale a ere'iurgèr"rit étudiée. Toufefois, il n'est pas possible de contrôler ces fac-
t"u., pou. des arbres "n u.r"g"r. Le choix des génotypes parentaux reste.donc le principal facteur
sur lequel le sélectionneo. f"ut intervenir poui améliorer le taux de triploïdes.
Effet de I'orientation sur I'arbre
Il n'existe pas de différence significative entre.les quatre^expositigrs de. ]-arbre, malgré l'obtention
d,un raux élevé de 4lVo dansËxposition Nord contre, 25 %, l77o et I77o' respectivement' dans
r", "*pàtiiions Sud, Est et Ouesi (Tableau 5). La grande variabilité entre annéeS_pourrait mas-
qu"t ,in tel effet. Les combinaisonÀ, Cl, C2 etC4 ont donné des plants- triplordes dans les quatre
;;;;;iii";r àe l'arbre. Lemée (1978) a montré.que I'exposition d?l,g.ut" influait surtout sur la
il;æ;i"d;, t ungt" d'incidenèe dei rayons solaires et la surface foliaire (intensité de-photosyn-
if,ai"il De ce îait, L'exposition de I'arbré pourrait avoir un effet direct sur I'induction florale et le
taux âe fécondation. Mais, ceci devrait être confirmé dans une autre étude ultérieure.
42 AL AWAMIA 113 Vol.2 N"l , 2005
12
1 0q
o
x
F
king of
Siam
A : Selon les parent femelles: SidiAissa (C9, Cl0) , Cravo (Cl l , Cl2) etKing of Siam (C13, Cl4)
B : Selon les pollinisateurs: SidiAissa (Cl l , Cl3) , Cravo (C9, Cl4)et King of Siam (C10, Cl2)
Parents femelles
0
' r
o
xtF
Sidi Aissa Cravo king ofSiamParents mâles pollinisateurs
Figure 2 : Taux moyen de triploirdie à partir des croisements diallèles etréciproques entre les parents diploirdes (série2: 1999-2000)
Sidi Aissa Cravo
43ALAWAMIA 113 Vol.2 N"l ,2005
,o{,[:,
15 }I
101
5
0
Pl'.i'1.."&'.F:"t
:;
f li":t
c9 c lo
Combinaisons parentalesclz cl3 ,r i
Figure 3 : Effectif d'hybrides triploTdes obtenus durant la série I (1996-1998) (A) et la
série 2 (1999- 2000) (B)
Tableau 5 : Nombre de plants triploides par exposition de I'arbre et par année de croisements(Série 1, 1996-1998)
Nord Ouest Sud TotalEst738Z J
444
0 2 12 0 5 98 s 6
199619971998Total t2 28 t2 l 6 68
M ALAWAMIA 113 Vol.2 N"l .2005
Goncluslon et perspectivesrl synltrcse &srésrltats des deux séries de croisenpnts 6ttre diplcides a permis de rnonfier que la va-riatiol {u taux & triploi'die dépend de la combinaison des deux-parents nrâle et fernelle. I-e choix rai-sonné des géniæun en forrction de leurs carætéristiques plÉrotypiques et de lerrs aptindes à produiredes uipldrdes permetha d'obtenir des populations dhybri&s riftofCes très diversilirés par I'é$oque deproductio.n ainsi que par les _q-u?lité-s orgarnlepiques ef pornologrques. L'énde de I'effet du lenotypepernnt d'orienter d'ores .et dejà le ckÉx du géniteln fenplle ou dès èombinaisons de parens frrn anôi-liorer le taux de friploidie. Ainsi, la clénrentine Sidi Aissa qui se caract&is€ par sa monæmbryonie etson auto incompatibiliÉ a rnonré une bonne apitude à p'roàuire des riploidês. Celle-ci aneinl b tauxde ll%o parmi les plantules issues de pepins anormaux. Par ailleurs,les combinaisons Sidi Aissa xWilking, Sidi Aissa x Cravo et Sidi Aissa x King of Siam ont permis d'obûenir des taux relativenpntélevés de triplo'rdes.
L'analys.-e, par la cytométrie en flux de 1153 planarles issues de croisements entre parcnts diploides apermis d'identifier I I I triploides, 1033 diploides, 5 tétraploides et 4 haplo'rdes. Ceûp tæhnique ouvredes perspectives prometteuses pour I'anÉlioration génétique des agrumes, principalement pôur l'éva-lgatiol de niveau {e ploidie dans le cadre de programmes d'améliôration sàppuyant sur la manipula-fio.n qe la ploidia Elle constinre ainsi un marqueur rapide des doublements ôhromosomiques sponta-nés, de la non réduction des gamètes et de lhaplogenèse. I.a facilité et la rapidité de sa miie en æuvresont des atouts déterminants pour la sélection de cultivars niploides. [æ développernent et la maîtrisede cette méthode de sélection ouvrent ainsi la voie à la création de vastes popùlations d'hybrides demandarinier, à fruits de gros calibre, sans ffpins et faciles à éplucher.
lrs hybrides triploides déjà créés ont été multipliés et sont en phase d'évaluation qualitative dans lastation d'El Menzeh. Iæs meilleun hybrides, sur le plan qualitatif, feront ensuite I'objet d'essais varié-taux multi locaux pour préciser leurs comportements agronomiques. Iæs meilleurs-clones triploidesaspermes de mandariniers dewont passer par les étapes suivantes :
.la description selon le descripteur'LIPOV'en vue de les inscrire au catalogue officiel ;
.le contrôle sanitaire des clones élites en vue de la diffusion du matériel végétal de qualité.
LINRA prendra en charge l'étape fondamentale de maintien du matériel de départ et de pé-base et as-surera les multiplications de base et de greffons de manière à foumir ce matériel végétal en quantitésufftsanûe aux pepiniéristes agréés. Ces demiers auront pour tâche la multiplication végétative àgrande échelle selon la réglementation en vigueur.
Remerciements
Cette étude a été fnancée par le projet PRAD (coopération Maroc-France), les conventiotrs nationales(SODEA, D, Kabbaj) et le marché DPV (Ministère d'agricuhure, Maroc). Izs auteurs marocains tiennent àremercier l'équipe dc laboratoire d'Amélioration des plantes du CIMD FLHOR Montpellier, de l'INRA CorseFrance et aussi Messieurs : Dr Allali Mohnmed (Directeur du Cente technique, ORMVAG/ Kenilra) et DrAbousalim A. ( Professeur à l'lAV Hassan II, Rabat) pour loutes les correctionr apportées à ce docwnent.
ALAWAMIA ll3 Vol.2 N"l ,2005
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