Arehiv fiir Mikrobiologie 57, 255--270 (1967)

l~tude de quelques bacilles homolactiques isol6s de vins

E. PEYI~AUD et SIMOlqE DOMERCQ

Station agronomique et cenologique de Bordeaux, France

Manuscrit requ le 10 mars 1967

A Study of some Homo]ermentative Lactic Acid Bacteria Isolated ]rom Wines

Summary. The authors have studied 750 strains of lactic acid bacteria isolated from wines. In this study the test and classification of RoGosA and St~AP~PW were used. Of the strains mentioned 23 belonged to the homolactie bacteria, including 9 strains of Lactobacillus lolantarum, 2 strains of LactobaciUus casei var. easel, 4 strains of Lactobacillus casei var. alactosus, and 8 strains of a non-identified StrelJtobacterium species.

The authors discuss the value of the classification mentioned from the point of view of wine technology. They conclude that it cannot be applied in the case of lactic acid bacteria isolated from acid fermentation products such as wine. I t is only of little practical interest because it does not render the identification of the strains possible, nor does it permit a prediction of the wine constituents which the strains concerned are able to metabolize.

R~sumd. Les auteurs ont 6tudi6 750 bact6ries lactiques isol6es de vins, en utili- sant les tests et le syst~me de classification de RoGosx et S~ARPE. Parmi ce grand hombre de souehes vingt-trois apparbiennent au groupe des baeilles homolaetiques et font l'objet du present travail. Elies se r6partlssent de la fagon suivante: 9 souches de Zactobacillus plantarum, 2 souches de Lactobaciltus casei var. casei, 4 souehes de Lactobacillus casei var. alactosus et 8 souches de Streptobacterlum non class6es, diff&rentes des esp~ces pr6e6dentes.

Les auteurs discu~ent la valeur de eerie classification, lorsqu'on se place au point de rue teehnologique. Ils montrent qu'elle s'applique mal aux bact~ries lactiques isol6cs de milieux fcrment6s acides eomme le vim El lea peu d'int6r~t pratique, ear elle ne permet pas de rep4rer une souehe et de pr6voir par sa position syst6matique les eonstituants du vin que cette souehe est susceptible de m6taboliser.

Nous avons 6tudi6, depuis 1957, 750 souches de ba t te r ies lactiques, don t 647 on t dt~ isolges par nous-m6mes de raisins, de moots, de vins en voie de fe rmenta t ion malolact ique ou alt6r6s. Les vins p rovena ien t des diverses rdgions vinicoles frangaises et de diverses r~coltes, et aussi d ' au t res pays produeteurs . Ces baetgries se r~part issent de la fagon su ivan te : BaeiUes h6t6rolaetiques 238 souehes, Bacflles homolact iques 7 souehes, Coques h6t~rolactiques 368 souehes, Coques homolaet iques 34 souehes.

Nous 6tudions iei sept souches de bacilles homofermentaires , pro- v e n a n t de einq pr~l~vements sur les 250 que nous avons effeetuds. La

256 E. P~r~vAu~ et S. Do~cr

f r 6 q u e n c e de ce g r o u p e d a n s n o t r e m a t 6 r i e l d ' d t u d e es t d o n c t rbs fa ible .

N o u s les c o m p a r o n s a v e e seize a u t r e s souches du m 6 m e t y p e isoldes de

v ins ou de e idres p a r d i f f6rents a u t e u r s e t a v e e q u a t r e souches de r6f6rence

Lactobacillus plantarum et Lactobacillus casei a p p a r t e n a n t ~ des co l lec t ions

bac t6 r i ennes .

A v a n t d ' e x p o s e r nos t r a v a u x pe r sonne l s , nous r a p p e l e r o n s e e u x d6j~

effeetuds sur les bac i l les h o m o f e r m e n t a i r e s d u v i n ou a u t r e s bo issons

f e rmen t6es . Ces t r a v a u x e o n c e r n e n t g g n 6 r a l e m e n t u n p e t i t n o m b r e de

souehes . Le t o t a l des souches s ignal6es es t de q u a t r e - v i n g t env i ron .

Historique OLSEN (1948), parmi une dizaine de baet6ries provenant de vins de fruits, a

identifi6 deux souches de laetobacflles homofermentaires faisant fermenter le xylose et que cet autenr rapproche de Lactobacillus easel

JERCSEL et F~Esc~ (1956, 1958) out d6crit trois baet6ries isol6es de vins du Palatinat qu'ils nomment (~Bacterium gracile~>; ees souches n 'a t taquent pas l 'ara- binose et a t taquent raeide eitrique. L'une d'elles nous a 6t6 adress6e par les autenrs; il s 'agit en fair d 'un baeille homofermentaire.

CARS (1957) a reneontr6 huit souches de baeilles homofermentaires dans des cidres anglais. Leurs caraet~res sont si divers qu'il ne les a pas d6erits en d6tail. Seule une des bact6ries a pu ~tre identifi6e nettement comme L. plantarum, les autres ayant des affinit6s avec cette esp~ce et aussi avec L. casei. Deux souches produisent m6me de la eatalase, ce qui pose la question de la d6finition du genre Lactobacillus.

LAa~BION et MESK~ (1957), s la m~me 6poque, ont isol6 de cidres et de vins de fruits quelques bacilles homolaetiques, pour lesquels ils ont propos6 le nom de Lactobacillus plautarum, var. gracile.

R)~DLER (1958) a isol~ une baet6rie qu'il rapproehe par ses caract~res des espbees Lactobacillus plantarum et Lactobacillus casei. Le m6me auteur (1962) clans une ~tude de la syst6matique des bact6ries laetiques du vin d'apr~s ]es donn6es bibliographiques, envisage trois sor~es de laetobacilles homofermentaires: Lacto- bacillus plantarum, qui forme de l 'acide DL-laetique, Lactobacillus casei qui forme de l 'aeide L (~-) laetique et Lactobacillus delbrueckii qui forme de l 'acide n (--) ]acti- que (Lactobacillus delbrueckii cultive ~ 45~ et pas s 15~

I N G R ~ M et eollaborateurs (1960) ont identifi6 trois baeilles homofermentaires parmi 47 souehes de baet6ries ]aetiques issues de vins de Californie de divers e6pages, de eidres et de lies; fls les ont class6s aussi comme Lactobacillus delbruec~ii. En 1952 et 1955, VAVG~N et collaborateurs avaient obtenu des cultures de Lactobacillus plautarum ~ partir de vins de Californie.

B A ~ E et G~LZY (1962) ont isol6 dans une cave de vinification du littoral m6diterran6en un baeille homofermentaire, a t taquant les pentoses et n 'a t taquant pas raeide tartrique, qu'ils ont class6 comme Lactobacillus plantarum.

POITTEWN et collaborateurs (1963, 1966) out s~par6 de vins d 'Uruguay en fermentation malolactique, sur 23 souches 6mdi6es, 14 souches de bacilles homo- laetiques qu'ils ont identifi6s eomme des vari6t6s de Lactobacillus plantarum.

Du PLESSIS et V~N ZrL (1963), sur 64 bact~ries laetiques de vius d'Afrique du Sud, ont rencontr6 21 souehes de baeilles homofermentaires qu'ils out apparent6es

Lactobacillus leichmaunii. Cependant l 'acide laetique form6 est l 'acide ~ (H-), alors que L. leichmannii donne de l 'aeide D (--). Le type 1 ne f~it pas fermenter les

]~tude de quelques bacilles homolactiques isol~s de vins 257

pentoses et pourrai t ~tre en rdalit~ Lactobacillus casei d'apr~s Ia classification de S ~ (1961). Le type 2 fair fermenter le xylose.

Y o s ~ x z v ~ (1963), sur 101 baet~ries d~composant l 'acide matique isol~es de vins du 5apon, ont reconnu comme Lactobacillus plantarum, 24 souches ayan t des propri~t4s ana~robies facultatives.

~ o ~ o ~ v ~ A et collaborateurs (1965) ont identifi4 deux bacilles homofermentaires parmi les neuf souches issues de vins japonais en fermentat ion malolactique; l ' un appar t iendrai t au type Lactobacillus plantarum; l 'autre, pourvu d 'une flagelle et mobile, n ' a t t aque pas les pentoses et a ~t4 nomm4 Lactobacillus yamanashiensis. Nous avons pu 4tudier la premiere souche; la seconde qui nous a ~t5 ~galement adress~e ne s 'est pas dSvelopp~e clans nos milieux de culture.

Ifi~(~o (1965) a isol~ de vins de Navarre quelques bacilles homofcrmentaires dont deux souches sont ~tudi~es ici.

R~cemment B a ~ (1966,a) sur 58 souches de bact~ries lactiques isol~cs de vins languedociens a trouv~ neuf lactobacilles homofermentaires. Quatre souches sont assimilables s Zactobacillus plantarum; les cinq autres souches out 4t4 ra t ta- ch4es par l ' auteur ~ Lactobacillus casei, bien que l ' a t taque du xylose les diff4rencie de cette esp~ce.

Rappelons enfm que BERRY et VAVGn~ (1952) et K R V ~ R M ~ N et V A U G ~ (1966) ont isol~ de lies de vins et de vins al tar ,s une dizaine de souches de Lacto- bacillus plantarum capables de faire fermenter l 'acide tartr ique.

Travaux Personnels Mgthode de travail. Les techniques d ' isolement et de culture et les tests de classi-

fication utflis~s sont ceux d~crits par PEY~Avn et S. DoM~cQ (1961), par PEYNAUD et coll. (1962), avee cependant certains compl6ments. Ces tests sont inspir6s des t r avaux de C ~ (1957), de ROGOSA et S~ARP]~ (1959), de GARVIE (1960). NOUS avons encore b~n6fici~ des conseils de GASSER (1964).

Nous avons d~crit une technique prat ique pour l '~tude des substances m4taboli- s6es par les bact~ries s 'appl iquant au t ravai l en s~rie, qui consiste s ensemencer un milieu eontenant toutes les substances s essayer; apr~s un d61ai suffisant, on d~tecte par l 'analyse specifique ou par chromatographic sur papier les substances disparues et les substances apparues. L'exp6rience nous a montr~ que cette technique, com- mode pour un premier d6grossissage, doit ~tre compl6t6e par les tests de croissance effectu6s tube par tube, chaque m~tabolite ~tant cssay~ s part . La premiere m~thode peut conduire, en effet, s des interpretat ions incompl~tes. Les a t taques partielles d 'un corps peuvent ~chapper ~ l 'observat ion chromatographique, mais encore l ' a t taque d 'une substance peut ~tre indnite en presence d 'autres m~tabolites ou, au contraire, emp~ch6e par un phdnom~ne de concurrence.

Nous avons ajout6 aux tests d6j~ d~crits dans nos publications la recherche de ]a nature de l 'acide lactique form~, le tes t de la d~samination de l 'arginine, le d~veloppement ~ 15~ et 45 ~ C, la recherche de la temperature de croissance opti- mule, le degr~ alcoolique limite, la d~termination des besoins en facteurs de croissance (PEY~AV]) et S. LA~o~-L~ovRCADE, 1965), la formation de terrains polyols (~)EYi'~AUD et GU~BERTE~V, 1964).

Recherche de la nature de l'acide lactique /ormd. Depnis les t r avaux de P]~)~RSO~ et coll. (1926), eette recherche se fair par s~paration de t 'acide lactique, sous forme de son sel de zinc et mcsure, d 'une part , du pouvoir rotatoire de ce sel, d ' au t re par t , de la quanti t~ d 'eau de cristallisation (18, 18 p. 100 pour le lactate rac~mique et 12, 89 p. 100 pour le lactate opt iquement actif). La mesure n~cessite des quanti t~s assez importantes de lactate.

258 E. PEYNAUD et S. DO~RCQ:

Tableau 1. Liste des bacilles homolactiques dtudids

D6signation des souehes Origine

Souehes isol6es de Q 16 vins par les auteurs 7 souches V 221

V 251 Ch22

Es 3 souches

Souches isol~es de t~ 11 vins par d'autres /~ 2 au~eurs C 2g 16 souehes C 28

JtV U g51 U 555 U 562 U 56~ U 565 U 566 U 571 U 572 1 19 1 19 1 20 0 561

Souches de LA 1 r6f6rence 4 sonehes G 151

G 393 801d

Vin rouge, Cbtes de Bordeaux 1956, fermentation malolactique. Lie de vin rouge conserv~e s pH 3,8 Lie de vin rouge eonserv~e ~ pH 3,8 Champagne 1963, 2es raffles, fermentation malo- laetique Vin blanc, aR6r6, filant, Mancha, Espague.

RADLER, vin blanc allemand RADLER, vin blanc allemand CARR, cidre anglais CXRR, eidre anglais JERCHEL et FLESCH, (~B. gracile)>. 1)OITTEW~r Uruguay, No. 1, ~L. 2)lantarum)) POIT~EVI~r Uruguay, No. 1, ((L. plantarum)) ]?oIT~.vr~r Uruguay, No. 2, ((L. plantarum~) POITTV.W~, Uruguay, No. 2, (~L. plantdrum~) PoI~rEw~, Uruguay, No. 2, ~d). arabinosus)) Porrr]~w~, Uruguay, I%. 2., ((L. arabinosus)) POIT~EW~r Uruguay, No. 3., (d). arabinosus)) PO~T~]~V~, Uruguay, I%. 3., (~L. arabinosus~) I~Go, vin de Navarre, Espague, ((L. lolantarum~) I~I~O, vin de Navarre, Espague, ((L. plantarum)) I~mo, vin de Navarre, Espagne, (~L, leichmanni6) No~o~ur~, moils du Japon, (~L. plantarum~)

~Sactobavillus ~lantarum (I.N.R.A. Station de technologie v6g6tale, Versailles) Lactobacillus casel var. casei (N.I.R.D.) Lactobacillus plantarum (N.I.R.D.) (~Lactobacillus arabinosus~) (A.T.G.C.)

Nous avons pr6f6r6 adopter des mesures quantitatives plus pr6cises des formes L (-~) et D (--) de l'acide lact~que, en utilisant d'un e6t6 le dosage de l'acide lactique total par vole chimique (GU~BERTEAU et coll., 1966) e~ d'un autre e6t6 le dosage enzymatique de la forme L (~-) ~ l'aide de la r. (~-) d6shydrog6nase lactique sp6cifi- que. C'est une m6thode un peu semblable qu'ont d6j~ employ6e C~TO et MOORE (1965). BARRE (1966,b) utilise de mSme le dosage enzymatique de la forme L (-]-), mais estime l'acide lactique total d'apr~s l'augmentation d'acidit6 fixe; cette technique manque de 9r6cision lorsqu'fl s'agit de baser une classification sur la pr6sence de faibles quantit6s d'acide ]) (--) lactique.

Dans le mode op6ratoire du dosage de l'acide lactique total quo nous utilisons, l'acide lactique est fix6 sur cotonne de r6sine anionique, puis transform6 en ac6tal- d6hyde par oxydation c6rique (D~o~A~-Kou~KOV, 1960); les r6sultate de cette m6thode sont oonfirm6s par la technique utilisan~ une double d6f6cation, plombique et barytique en milieu alcoolis6, et une oxydation permanganique en ac6tald6hyde (PEYNAVD et CHXRP~N~, 1950); les deux m6thodes donnen~ des r6sultats trbs

]~tude de quelques bacilles homolactiques isol6s de vins 259

Tableau 2. Croissance baetdrienne sur divers sucres. Les sucres sont ut i l l s~ indl- viduellement eomme seule source de carbone

o o o o o

=

Q16 + + + + + + . . . . V 221 + + + + - + . . . . V 251 + + - - - + . . . . Ch 22 + + + -- -- + + -- -- -- E~ + + . . . . . . . .

.R 11 + + + + -- + . . . . R Z + + + -- + + . . . .

C 2 4 + + -- - - C 28 + + - - - - J F + + + . . . . . . U 551 + + + + + + + + -- -- + U 555 + + + + + + + + -- -- + U 562 + + + + + + + + -- + + U 564 + + + + + + + - - - - - - + U 565 + + + + + + + - + U 566 + + + + + + + - - + U 567 + + + + + + + + U 572 + + + + + + + + 1 1 9 + + + + - - - - 1 20 + + + + 0 561 + + + + + + + + +

L A 1 + + + + + + + + -- + + G 151 + + + -- + + -- -- r 343 + + + + + + + + -- + + 8014 + + + + + + + + _ + +

- - +

- - +4- - - +

- - +

- - +4-

+ + + + + + + + + + +

+ + + +

voisins. On utilise pour le dosage enzymatique de l'acide L (+) la technique de HonoRs% d6erite dans le trait6 de BERG~V.u (1963). Le taux d'acide D (--) lacti- que est connu par diff6rence.

Dgsamination de l'arginine. Le test de l'hydrolyse de ]'arginine est consid6r6 comme permettant une certaine diff6reneiation entre les baet6ries homofermentaires et les baet@ries h6t6rofermentaires. La teehniqfle habituelie eonsiste k introdnire eet aminoaeide dans le milieu de culture et ~ y reehereher directement la presence d'ammoniaque par le r6actif de NEssnE:a, apr~s un d61ai d'incubation suffisant. Pour am6]iorer la r6aetion eolorim6trique, GASSER (1964) cultive ]es bact6ries ~ part, les s6pare et ]es met en pr6sence d'arginine. Nous avons remplac6 la r6action quali- tative par ]e dosage volum6trique du cation l~H~ lib6r6, apr~s s6paration par distilla- tion. Nous utilisons le milieu de B~loSS (1953) avec 3 g de chlorhydrate d'arginine et 20 g de glucose par ]itre.

Par cette technique plus pr6cise, nous avons retrouv6 dans les grandes lignes les observations des auteurs qni ont 6tudi6 ce test, mais avec de nombreuses excep- tions. La d6samination n'est pas absolument sp6cifique des mieroorganismes

260 E . P ] ~ u et S. DOMERCQ:

Tableau 3. C r o i s s a n c e b a e t d r i e n n e s u r d i v e r s a c i d e s et d i v e r s p o l y o l s . L e s a c i d e s et l e s

p o l y o l s s o n t u t i l i s d s i n d i v i d u e l l e m e n t c o m m e s e u l e s o u r c e de c a r b o n e ( s a u / d a n s le c a s

d e l ' a c i d e c i t r i q u e e n m i l i e u e o m l ) l e x e )

~~ ~ ~ ~ ~ .. "~

o o

Q 1 6 + . . . . . + - -

v 2 2 1 + - + . . . . . .

v 2 5 1 + - - - . . . . . .

G h 2 2 + + + - - - - - - + + - -

E s + . . . . . + - - -

B 1 1 + + + -- -- -- + + --

R 2 + + + - - - - - + + - -

r 2 4 + + + - - - - - -

C 2 8 + . . . . .

J F + . . . . . . . .

U 5 5 1 + - - + - - - - - - + - - - -

U 5 5 5 + + + - - - - - - + - - - -

U 5 6 2 + - + - - - - - + + - -

U 5 6 4 + . . . . . + + - -

U 5 6 5 + + + - - - - - - + + - -

U 5 6 6 + - - + - - - - - - + + - -

U 5 7 1 + + + - - - - - - + + - -

U 5 7 2 + - - + - - - - - + + - -

1 1 9 + + . . . . + + - -

1 2 0 + + . . . . + - - -

0 5 6 1 + + + - - - - - + + -

L A I + -- + -- -- -- + + --

G 1 5 1 + + + - - - - - - + - - - -

G 3 4 3 + - - + - - - - - - + + -

8 0 1 d + - - + - - - - + + - -

q

+

hdtdrofermentaires; on note trois tests ndgatifs pour dix-neuf bacilles hdtdrolaetiques et trois 6galement pour dix-neuf eoques hdtdrolaetiques; d'autre part pour cinq bacilles et einq coques homofermentaires, on rel6ve dans ehaque eas un test positif. On voit que cet essai ne peut conduire ~ une classification sfire; ~ eause des excep- tions reneontrdes, m~me s'il y a une tendance g6n6rMe d'un groupe, il n'est pas d6terminant pour elasser une souehe.

R6sultats exp6rimentaux Ils sont groupds dans les t ab leaux ci-apr~s. Le t ab leau 1 donne la

liste et l 'or igine des 27 souehes dtudides. Les t ab leaux 2 et 3 groupent les rgponses aux tests de f e rmen ta t ion lorsque la source de carbone offerte aux bactdries est consti tude d ' u n seul subst ra t , glucides, acides ou polyols ;

]~tude de quelques bacilles homolactiques isol6s de vins

Tableau 4. Conditions de croissance et de /ermentation

261

p H seuils Croissance Acidification m6q/1 Pourcen-

Acide T Sucre m~li- 15 ~ 45 ~ 15 ~ 25 ~ 35 ~ opt imum tagealcool

cn volume que

Q 16 3,4 3,4 q- - 8 178 224 35 ~ 12 V 221 3,0 4,2 - - 0 140 22 30 ~ V 251 3,0 4,2 - - 0 142 24 30 ~ Ch 22 3,0 3,0 q- -- 62 176 188 35 ~ Es 3,0 3,8 q- -- 8 130 90 30 ~

R 11 3,2 3,0 q- -- 68 198 216 35 ~ 15 R 2 3,2 3,0 q- -- 60 196 192 30 ~ 13 C 24 3,2 3,2 q- -- C 28 3,2 3,2 q- -- J F 3,2 3,2 -}- 16g6re 56 172 200 35 ~ 13 U 551 3,4 3,4 q- - - 108 125 98 30 ~ 13 U 555 3,2 3,2 -ff -- U 562 3,2 3,2 -ff - - U 564 3,0 3,0 q- -- 120 133 91 30 ~ 13 U 565 3,2 3,2 q- -- 30 124 70 30 ~ 14 U 566 3,2 3,2 q- -- U 571 3,4 3,4 q- -- 70 142 98 30 ~ 13 U 572 3,0 3,0 -[- - - 1 19 3,8 3,8 q- -- 58 168 160 30 ~ 1 20 3,8 3,8 q- -- 60 142 146 30 ~ 0 561 3,5 3,5 q- -- 13

L A 1 3,2 3,0 q- - - 34 158 98 25 ~ 12 G 151 3,0 4,2 -4- -- 58 178 134 25 ~ 12 G 343 3,0 3,4 ~- -- 8014 3,2 3,0 + -- 50 144 128 30 ~ 12

le s igne ~- i n d i q u e u n e m u l t i p l i c a t i o n b a c t 6 r i e n n e s e n s i b l e a u p h o t o m b t r e

se t r a d u i s a n t p a r u n e f o r m a t i o n d ' a c i d e l a c t i q u e .

L e t a b l e a u 4 r@sume les c o n d i t i o n s l i m i t e s de e r o i s s a n e e c o n c e r n a n t le

p H , l a t e m p e r a t u r e , le degr~ a l coo l ique . L e t a b l e a u 5 6 t u d i e p o u r q u e l q u e s

s o u c h e s l ' i n f l u e n c e de c o n d i t i o n s vari@es d ' a 6 r a t i o n s u r l a m u l t i p l i c a t i o n ,

d@finie p a r le p o i d s d e baet@ries rgeol t6es , e t s u r la f e r m e n t a t i o n l a e t i q u e ,

repr@sent~e p a r l ' a c i d e l a c t i q u e fo rm~.

L e t a b l e a u 6 d o n n e les b e s o i n s e n f a c t e u r s d e c r o i s s a n e e e t a m i n o -

a c i d e s p o u r q u e l q u e s b a c t 6 r i e s . Le t a b l e a u 7 r e p r o d u i t des p r o p r i 6 t S s

p h y s i o l o g i q u e s d ive r se s , i m p o r t a n t e s p o u r l a c l a s s i f i c a t i on : f o r m a t i o n

d ' a e i d e a c g t i q u e , de g lye6ro l e t de b u t a n e d i o l - 2 , 3 , n a t u r e d e l ' a e i d e

l ~ c t i q u e fo rm6 , d ~ s a m i n a t i o n d e l ' a r g i n i n e , e tc . Le t a b l e a u 8 r e p r e n d

p o u r c i n q bact@ries la f o r m a t i o n de e e r t a i n s po lyo l s k p a r t i r de d i f f 6 r e n t s

suc re s (PEu e t GUI~BE~TEAV, 1964).

262 E. P~.YNAVD et S. Do~mcQ:

Tableau 5. Groissance et /ermentation lactique en ]onctiou des conditions d'adration

I I I I I I I V V

Q 16 Poids baet6ries 3j 675 825 825 675 825 Poids maximal 825 1200 1200 975 1200 Aciditd 66 96 88 138 84

_~ 11 Poids bact6ries 3j 675 525 150 675 150 Poids maximal 2020 1875 2020 1875 1500 Aciditd 138 150 82 160 90

LA 1 Poids bact6ries 3j 1200 1875 1875 1650 1875 Poids maximal 1500 1875 2020 2700 2020 Acidit~ 72 118 116 104 108

8014 Poids baet6ries 3j 1350 1875 2020 1875 2175 Poids maximal 1500 2020 2020 2175 2175 Aciditd 66 116 106 108 108

Valeurs Poids baet6ries 3j 975 1275 1217 1218 1256 moyennes Poids maximal 1461 1742 1815 1931 1724

Aciditd 85 122 98 127 98

I -- A6robiose: lore d'6paisseur du milieu de culture eu :Erlenmeyer de 100 ml. I I - - Seml-a6robiose: 15 ml de milieu en tube s essai.

I I I - - Semi-a6robiose: mgmes conditions, tubes plac6s en bocaux ferm6s. IV -- Ana6robiose: flacons pleins, obtur6s sous pression. V -- Ana6rohiose sons pyrogallate de sodium.

Les poids des bact6ries sent donn6s en rag par 1, l'acidit6 form6e en mfq par I.

Tableau 6. Besoins en aminoazides et en /acteur8 de croissance

Q 16 R 11 R 2 LA 1 8014

Alanine + + ? Arginine + + Cys~ine ? -k- + + ? Acide glutamique + + + + + Isoleucine + + + + ? Leueine + + + + ? Ph6nylalanine + + + Proline + S6rine + + Tryptophane + + + + Tyrosine + + Valine + + + + + Riboflavine + + + Acide pantoth6niquc + + ? + ? Nicotinamide + + + + +

Le sig-ae + signifie le besoin absolu; le signe ? un effet activateur. On a essay6 encore les substances suivan~es qui se sent montr6es sans action: aeide aspartique, glycocolle, histidine, lysine, m6thionine, thiamine, pyridoxine, acide p. amino- benzolque, acide folique, acide folinique, biotine, eobalamine, adenine, guanine, uracile, xanthine, thymidine, thimine.

]~tude de quelques bacilles homolacr isolTs de vins

Tableau 7. ProTrigtds physiologiques diverses

263

Fermentation du Formation glucose Acide de Atta-

]) (--) Nature de que du Bu- m6so- Testde lacti- l 'acidelacti- Gly- tane- ino- l'argi-

dit6Aei" volatfleAcidit6 AF/AV que que c~rol diol 1 sitol llJne fixe (~ (m6q) (rag)

Q 16 190 10 19,0 0 L(§ 13 34 V 221 145 12 12,0 32 D ( - - ) -4- L (,4,) 2 306 V251 146 10 14,6 32 D ( - - ) § 2 4 7 18 16 Ch22 177 8,7 20,3 29 D(--) § 2 4 7 10 63 ES 116 4,0 29,0 61 D(--) ~-L(~-) 3 50

R 11 160 8,0 20,0 0 L(§ 0 33 R 2 221 8,7 24,4 3 L(§ 7 9 G 24 87 4,8 18,1 7 90 G 28 54 3,8 14,2 3 13 J-~ 182 6,0 30,3 0 L (.4.) 1 11 U551 129 4,9 26,3 58 I ) ( - - )§247 25 34 U555 128 8,1 15,8 58 D(--) '~-L(.4.) 20 36 U562 105 7,5 14,0 44 D ( - - ) § 2 4 7 16 56 U564 141 4,9 28,7 42 D(- - )~-L(§ 16 45 U565 172 10,0 17,2 43 D(--)-4-L(§ 19 27 U566 130 8,1 16,0 48 D(--)~-~(.§ 30 20 U571 138 3,7 37,2 45 D(--)~-L(,4,) 12 44 U572 146 8,1 18,0 66 D ( - - ) § 2 4 7 17 88 119 182 8,0 22,8 18 D ( - - ) § 2 4 7 5 16 120 153 7,0 21,8 69 D (--) ,4, L(.4. ) 7 18 0561 45 D ( - - ) + L ( §

LA 1 150 8,0 18,7 31 D(--) -4- L (.4.) 1 45 G 151 202 10 20,2 0 L(§ 20 21 G343 111 3,0 37,0 45 D(--) - i -L(§ 22 54 8014 146 7,5 19,4 52 I) (--) -4- L (-4-) --5 31

1 et ac6toine.

§

-4-

-4-

-4-

Enf in le t a b l e a u 9 donne une t e n t a t i v e d ' iden t i f i ea t ion des baetdr ies ~tudides, d ' apr~s la classif icat ion de ROGOSA et S~A~pv. (1959); nous y a jou tons une classif icat ion /t earaet~re cenologique bas6e sur des t es t s p rd sen t an t un in tdr~t p ra t ique .

Discussion L a classif icat ion des Lactobacillus est fond6e sur les t r a v a u x de

O ~ A - J ~ N s ~ N (1919, 1943), qui a divis6 le genre en t ro is groupes princi- p a u x : Thermobacterium r61missant des souehes homofe rmenta i res qui se d6ve loppen t aux hau tes t emp6ra tures , Streptobacterlum , qui comprend 6galement ces souelaes homofermenta i res , mais se dgve loppan t a u x t emp6ra tu re s normales , e t Betabacterium qui rassemble les bacil les h~t6rofermentaires .

18 Arch. Mikrobiol., Bd. 57

264 E. PEYNAUD et S. DOMERCQ:

Tableau 8. Eormatio~ de Tolyols

Sucre fermentd Glycdrol Erythri- Arabitol Mannitol Butane- tol diol

Q 16 Glucose 10 0 0 0 0 Fructose 5 0 0 0,5 1,0

R 2 Glucose 10 1 0 5 0 Fructose 5 1 0 10 0,2 Arabinose 20 0 0 0 0,6

JF Glucose 10 1 0 0 0 Fructose 5 0 0 0,5 0

LA 1 Glucose 10 0 0 0 0 Fructose 5 0 0 0,5 0 Ar~binose 20 0 traces 0 0

8014 Glucose 5 1 1 5 0 Fructose 0 0 0 0,5 0 Arabinose 20 0 traces 0 0

Teneurs en mmol par litre (estimation chromatographique saul butanediol-2,3 dos6 chimiquement). Milieu de culture: extrai t de levure et casdine hydrolysde, ayes les substances min6rales ndcessaires, pH 4,6.

Tableau 9. Classifications des bacilles homolactiq~es isolds de vins

Ddsignation des souches

Classification selon S~ARP~ Classification

caract~re cenologique

Souehes isoldes par les auteurs

Souches isoldes par d 'autres auteurs

Q 16 L. casei vat. easel P - C - V 221 Streptobacterium sp. P-C + V 251 Streptobacterium sp. P - C - Ch 22 Streptobacterium sp. P-C + Es Streptobacterium sp. P - C -

R 11 L. casei car. alactosus P-C + R 2 L. easel car. casei P-C + C 24 L. easel car. alactosus P-C + C 28 L. case~ car. alactosus P - C - JF L. casel car. alactosus P - C - U 551 L. plantarum P+C + U 555 L. plantarum P+C + U 562 L. plantarum P+C + U 56g L. plantarum P-C + U 565 L. Ttantarum P-C + U 566 L. Tlantarum P-C + U 571 L. plantazum P-C + U 572 L. plautarum P-C + 1 19 Streptobacterium sp. P - C - 1 20 Streptobacterium sp. P - C - O 561 L. pIantarum P+C ~

]~tude de quelques bacilles homolactiques isol~s de vins 265

Les bacilles homolactiques isol6s de vins que nous avons ~tudi4s se multiplient ~ basse temp6rature et appart ienncnt donc sans conteste possible au groupe Streptobacterium. Settle la souche J F se multiplie lgg~remcnt ~ 45~ mais elle cultive mieux ~ 15~ qu'~ 45~ et son opt imum de d6veloppement sc situe ~ 35~ Deux souches, V 221 et V 251, ne se d6veloppent que dans une ~troite zone de tempdrature et ne croissent ni ~ 15~ ni s 45~

Le BERGWY'S Manual (1957) reconnait trois csp~ces dans le sous-geure Streptobaeterium: Lactobacillus casei qui produit de l 'acide L (-~) lactique, Lactobacillus plantarum qui produit de l 'acide ,,inactff" et Lactobacillus leichmannii qui n 'a t taque pas le lactose.

D'apr~s SHAPE (1962, 1961), le groupe Streptobacterium comprend seulement deux esp~ces reconnues: Lactobacillus plantarum et Lacto- bacillus casei avec ses trois varidt~s: L. casei var. casei, L. casei var. rhamnosus, et L. casei var. alactosus. Cependant il existe d 'autres souches qui ne peuvent ~tre identifi6es ~ ces esp~ces et qui ne poss~dent pas assez de caract~res communs pour 6tre r6unies dans nne esp~ce nouvelle ; on les consid~re pour le moment comme des ((Streptobacterium non class6s~). Quant ~ LactobaciUus leichmannii, il appart ient au sous-genrc Thermo- bacterium et il forme de l 'aeide D (--) lactique.

On pent juger conventionnel un tel syst~me de classification bas6 sur un hombre r4duit d'analogies pour certaines propri6t~s et faisant abstraction de nombreuses diff6rences pour d 'autres propri~t6s. Tout syst~me de classification suppose d'ailleurs un choix conventionnel. L'4tude d 'un nombre suffisant de propri6t6s physiologiques montre qu'aucune barri~re nette n'existe entre les ((esp~ces)) et que les souches peuvent ~tre class6es dans un ordre d6croissant d '6quipement enzymati- que, dans lequel chaque souche diff~re de ses voisines seulement par un pet i t nombre de propri4t6s. C'est ce qu'on admet implicitement en par lant d'esp~ees s caract~res interm6diaires. Plus le nombre de tests est impor- tant , plus les chances de diff6renci~tion sont grandes, et plus nombreuses sont les ((esp~ces)) individualis6es.

Pour neuf des souches 6tudi6cs, l 'analogie des caract~res avec L. plan- tarum et L. casei est acceptable; par contre pour six souches l 'identit6 ne parai t pas suffisante et ces bactdries occupent une situation interm4diaire ne permet tant pas de les classer dans le syst~me de Ro~os~ et S~A~w.

Lactobacillus plantarum. Cette esp~ce pr4sente les deux earact~res sp~cifiques suivants, sur lesquels repose au fond route la diff6renciation avee L. casei: formation d 'un m41ange des acides ]) (--) et L (~-) lactiques et fermentation du m4libiose. Le nombre des crit~res d~cisffs est donc faible. Une souche qui poss~de seulement Fun de ces deux caract~res devient une ((souche non class6e~). Les autres caract~res nc sont p&s d6terminants. G6n~ralement, mais pas toujours, un ou plusieurs pentoses

18"

266 E. PEYNAVD et S. Do~v.~cQ:

(arabinose, xylose, rhamnose) sont ferment~s par L. plantarum. La fermentat ion positive du raffinose aide encore ~ l'identification, mais n 'es t pas spgeifique.

Les trois souches de collection de L. Tlantarum ont eu exaetement ]es m6mes rdponses aux tests; elles font fermenter l 'arabinose, ]e raffinose, le rhamnose, le mannitol, le sorbitol; i 'aeide citrique est ferment6 en prdsence de glucose, mais non lorsqu'il est sen1.

Les tests eonfirment la position des huit souehes provenant de vins d 'Uruguay et de la souehe 0 561 du Japon classdes comme L. plantarum. Cinq souches d 'Uruguay n ' a t t aquen t pas les pentoses, rams elles at ta- quent le m61ibiose et le raffinose.

Lactobacillus easel vat . casei. Cette vari~t~ est caractdris~e par la formation d'acide/~ (-~) laetique; elle fair fermenter le lactose, le cello- biose, mais pas le m61ibiose, ni les pentoses, n i l e maltose.

Cos propri~t6s correspondent bien ~ celles des souches Q 16 et R 2. Cependant Q 16 fair fermenter aussi le maltose et R 22 fair fermenter aussi le sorbitol et tr~s l~g~rement le glyedrol. Les besoins en facteurs de croissance ne sont pas exactement ]es m6mes pour ces deux baet6ries; par ailleurs R 2 forme de l '6rythritol et pour une souche homofermentMre des quantit6s relat ivement 61ev6es de mannitol s par t i r du glucose et du fructose.

Lactobacillus casei var. rhamnosus se distingue de la varig$6 pr6cddente par la fermentat ion dn rhamnose; aucune des souehes 6tudi6es ne r~pond

eette d6finition. Lactobaciltus casei var. alactosus. Ces bact6ries torment de l 'aeide

r. (-k) lactique; elles ne font fermenter n i l e lactose, n i l e m61ibiose, ni les pentoses. La souche R 11 se classe dans cette eat6gorie; elle fair fermenter le cellobiose, le mannitol, le sorbitol. La souche J/V, quoique un peu diff6rente, se rat tache aussi ~ cette vari6t6; elle se d6veloppe un peu ~ 45~ et contrairement ~ la pr6c6dente ne fair pas fermenter le cellobiose, le mannitol, le sorbitol. Les deux souches de C ~ , C 24 et G 28, se rapprochent de L. casei, var. alactosus.

Streptobacterium non classds. Six souches torment un m61ange des acides D (--) et L (q-) laetiques et no tong pas fermenter le m61ibiose; elles ne peuvent done se elasser dans los esp~ces d6j~ d6crites. Elles different d'ailleurs un peu les unes des autres par quelques propri6tds.

Les souches V 221 et V 251, issues de vins cliff, rents, ont beaueoup de points eommuns: eroissance lente et faible, possible seulement dans une faible marge de temperature entre 25~ et 30 ~ C, pas de fermentat ion du lactose, des pentoses, du raffinose, du mdlibiose, du mannitol, du sorbitol, de l 'acide eitrique. Cependant la souehe V 221 s'dcarte de l 'autre par la fermentation du galactose, du maltose et par une production de butanecliol --2,3 61ev6e pour une bactdrie homofermentaire.

]~tude de quelques bacilles homolactiques isol6s de vins 267

La souche Ch 22 est encore un peu diff@rente; elle ne fair pas fermenter le maltose, mais elle fair fermenter le raffinose, et se d6veloppe sur manni. tol et sorbitol; elle a t taque l'aeide citrique.

Les trois souches Es isol@es d 'un vin filant appart iennent 6galement un type interm6diaire. Elles ne se d@veloppent que snr un peti t nombre

de sucres et font fermenter le mannitol.

1 19 et 1 20 sont de re@me difficiles ~ classer; elles s'@eartent 16g~re- ment des bact@ries prdc6dentes, par leur forme d 'abord de b~tonnets recourb@s, par le fair qu'elles n 'hydrolysent pas le saccharose; riles se diffgrencient l 'une de l 'autre par la fermentation du sorbitol.

Bases d'une classilication h caract~re oenologique. ~qous avons ici l 'exemple des difficult4s de la classification des bact@ries issues de milieux v@g@taux acides. Les souches qui ne peuvent &tre rattach6es ni ~ L. plan- tarum, ni ~ L. casei, ne peuvent pas davantage former une esp~ce nouvelle, leurs caract~res n '4 tant pas homog~nes. A l 'exemple d 'autres autenrs, nous pourrions lenr at tr ibuer des noms nouveaux, par exemple Lacto- bacillus vini, ou en faire encore une sous-esp~ce Zactobacillus casei var. vini.

Dans ce genre de classification on a, en fair, le choix entre deux attitudes. Ou bien faire abstraction de certaines diff@renees jug@es mineures et adopter les noms des esp~ces de r@f@rence, ici au hombre de deux, en se contentant d'analogies approximatives; ou bien, en route riguenr, ne classer que les souehes dont l 'idcntit6 est totale avec les sou- ches de r6f~rence, et distribuer les autres en autant de nouvelles esp~ces. Ainsi si nous ~tablissons une classification statistique non hi@rarchis4e des vingt-trois souches @tudi6es, comme on le fair pour les levures, en tenant compte de tous les tests, nous n 'obtenons pas moins de seize esp~ces.

Dans le premier cas, la classification abouti t ~ un peti t nombre d'esp~ces de noms connus, mais de composition disparate ; dans le second cas, on er6e un grand nombre d'esp~ces et une nomenclature nouvelle. Or une classification t rop restreinte groupant dans une m6me esp~ce des souches un peu diff4rentes, n 'a pas plus d'int6r@t pratique qu'une classi- fication trop d@taillde, off, s l 'extr6me, ehaque souche isol6e repr6sente une ((esp~ce~>. Les t ravaux des auteurs pr6cgdemment eit6s se ra t tachent

l 'une ou l 'autre de ces conceptions et il parai t difficile d '6chapper ~ ce dilemme.

Par aillenrs, la classification des bact@ries du vin est utile seulement dans la mesure off elle apporte au spdcialiste un syst@me de rep6rage des esp~ces, diff@renci@es par des caract~res ayant un int6r@t cenologique. I1 importe surtout de cormaitre, en pr@sence d 'une bact6rie isol@e d 'un vin, quelles sont les eonstituants du vin qu'elle est susceptible de m4ta-

268 E. PEY~AVD et S. DOM]~ReQ:

boliser. Une classif icat ion ~ carac tbre p r a t i q u e est bas6e forcdment sur des t es t s ehoisis e t hidrarchis6s en fonc t ion d ' u n int~r~t teehnologique.

C'est a insi que des not ions comme le p H - - seuil d ' a t t a q u e de l ' ac ide ma l ique et des sucres, que les tes t s de f e r m e n t a t i o n des pentoses , du glye6rol, de l ' ae ide c i t r ique ou de l ' ae ide t a r t r i que , on t p lus d ' in t6r~t pour l 'cenologue que les t emp6ra tu re s l imi tes de cul ture ou la possibi l i t6 de faire f e rmen te r le m~hbiose. Comme nous le d6veloppons ailleurs, il f au t a d m e t t r e , sous peine de faire un t r ava i l inuti le , p lus ieurs sys tbmes de classif icat ion des baetgr ies lae t iques en fonet ion du mil ieu et du b u t rechereh6.

Dans la deuxi~me eolonne du t a b l e a u 9, nous donnons l ' exemple d ' u n e classif icat ion ~ ea rae tbre cenologique bas6e sur la clef su ivan t e :

- - F e r m e n t a t i o n des pentoses et de l ' ac ide c i t r ique :

P+ C + 4 souches

- - Pas de f e r m e n t a t i o n des pen toses : Pas de f e rmen ta t i on de l ' ac ide c i t r ique :

P - C- 9 souches

F e r m e n t a t i o n de l ' ae ide c i t r ique :

p - C + 10 souches

Les a t t a q u e s bae t6r iennes des pen toses et de l ' ac ide e i t r ique expli- quen t en effet les a u g m e n t a t i o n s d ' ac id i t6 vola t i le e t les d6pr6ciat ions gus t a t ives de cer ta ins vins. On pou r r a i t a jou t e r ~ ces ((esp~ces)> les lac to- baci l les homolac t iques qui a t t a q u e n t l ' ac ide t a r t r i q u e et p r o v o q u e n t la tourne , T +, e t ceux qui a t t a q u e n t le glyc6rol, G +.

R e m e r c i e m e n t s . Nous tenons s remercier tousles chercheurs (J. G. CA~, B. I~IGO, D. J]~RO~EL, Y. O~A~A, )L E. POITTEV~, F. RAD/~ER) et les orgamsmes (National Institute for Research in Dairying, Shinfield; American Type Culture Collection, Washington; Station de Teehaologie v6g6tale, I.N.R.A., Versailles) qui oat accept6 de nous adresser des souches de bact6ries lactiques. Ce travail a 6t6 r6alis6 avec la collaboration pour la partie analytique de Mine LAFoN-LAFovReAD~,, eharg6e de reeherches s l ' Insti tut national de la Recherche agronomique, et de G. GUIMBERTEAU.

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Prof. Dr. E. PEu Station agronomique et cenologique Bordeaux, France