70
ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON Année 2006 - Thèse n° 92 CONTRIBUTION A L'ETUDE DES PESTIVIRUS CHEZ LES CHEVREUILS (CAPREOLUS CAPREOLUS) EN REGION RHONE-ALPES ET DANS LE JURA THESE Présentée à l’UNIVERSITÉ CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 25 octobre 2006 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par Flavien GALLO Né le 4 novembre 1980 à Saint Etienne (Loire)

Etude des Pestivirus chez les Chevreuils - VetAgro Sup Qui nous a apporté une aide précieuse dans l’élaboration de cette thèse, dont la gentillesse et l’hospitalité nous a

Embed Size (px)

Citation preview

ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON

Année 2006 - Thèse n° 92

CONTRIBUTION A L'ETUDE DES PESTIVIRUS CHEZ LES CHEVREUILS (CAPREOLUS CAPREOLUS) EN

REGION RHONE-ALPES ET DANS LE JURA

THESE

Présentée à l’UNIVERSITÉ CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 25 octobre 2006 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

Flavien GALLO Né le 4 novembre 1980 à Saint Etienne (Loire)

ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON

Année 2006 - Thèse n° 92

CONTRIBUTION A L'ETUDE DES PESTIVIRUS CHEZ LES CHEVREUILS (CAPREOLUS CAPREOLUS) EN

REGION RHONE-ALPES ET DANS LE JURA

THESE

Présentée à l’UNIVERSITÉ CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 25 octobre 2006 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

Flavien GALLO Né le 4 novembre 1980 à Saint Etienne (Loire)

- 1 -

- 2 -

- 3 -

REMERCIEMENTS

A Monsieur le Professeur Christian Chidiac, Professeur à la Faculté de Médecine de Lyon, Qui nous a fait l’honneur et la gentillesse d’accepter la présidence de notre jury de thèse. Hommages respectueux. A Monsieur le Professeur Marc Artois, Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui nous a proposé ce travail et guidé tout au long de sa réalisation, Pour sa gentillesse, sa compréhension et sa disponibilité, Avec toute notre reconnaissance. Sincères remerciements. A Madame le Professeur Marie-Anne Arcangioli, Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui nous a fait l’honneur et la gentillesse de participer à notre jury Sincères remerciements. A tous les représentants des FDC qui ont participé à l’étude, En particulier à Adrien Bauer et François Bride, Aux représentants de l’ONCFS et de la FNC, En particulier à Daniel Delorme, Philippe Vuillaume, Charlotte Dunoyer et Jean-Roch Gaillet, A tous les représentants des sociétés de chasse, Qui ont facilité la réalisation de l’étude par leur disponibilité et leur dévouement, et dont le soutien et l’accueil nous ont été très agréable, Sincères remerciements. A tous les représentants des LDAV qui nous ont aidés dans l’étude, Les docteurs vétérinaires Françoise Pozet et Alain Viry pour le Jura, Philippe Béal pour la Loire, le docteur vétérinaire Jacquemine Vialard pour le Rhône, Yvette Game, les docteurs vétérinaires Bertrand Le Tallec, Paul Revelli, Eugénie Mabrut et Yanne Nevejans pour la Savoie, Qui ont pris le temps de nous recevoir, nous ont orienté dans les premières démarches de cette étude et nous ont ouvert leurs portes pour l’étude expérimentale, Sincères remerciements. A Mademoiselle Marie-Eve Terrier, Centralisatrice du réseau SAGIR, à l’AFSSA Nancy, Qui nous a apporté une aide précieuse dans l’élaboration de cette thèse, dont la gentillesse et l’hospitalité nous a énormément touché, Sincère amitié. Cette thèse a été réalisée dans le cadre de la convention ONCFS ENVL n°2005 /16/6171 (continuité de la convention n°2002/86), intitulée « Etudes et recherches écologiques et épidémiologiques sur la pathologie de la faune sauvage ».

- 4 -

A mes Parents, Eux qui se sont toujours sacrifié pour que je réussisse, qui m’ont toujours entouré, dans les bons comme les mauvais moments, et qui m’ont toujours supporté alors que je n’étais pas toujours facile à vivre. Merci du fond du cœur à vous deux. A mon Grand-Frère, Aymeric, Avec qui je n’ai pas toujours été tendre (lui non plus d’ailleurs), mais qui m’a lui aussi toujours soutenu. Qu’il réussisse dans ses projets et qu’il soit heureux. A Mamita, qui est toujours là pour moi et dont les prières me vont droit au cœur, A Mamilise, que j’aurais aimé voir près de nous en ce jour, le destin en a décidé autrement. A Tonton Charly et à mon Parrain Joseph, vous resterez à jamais dans mon cœur. A l’ensemble des familles Gallo, Besset, Blanc et Ottaviano, Dont les mots de soutien et d’encouragement m’ont aidé à aller plus loin. A Marc-Damien, pour moi tu fais partie intégrante de la famille. Merci pour ta bonne humeur et ta joie de vivre. Aux Garniers et à ses occupants, les Sucs, Patouillards et apparentés, Que de merveilleux souvenirs et de joie en votre compagnie. Recevez ce travail en témoignage de mon affection la plus profonde. A mes amis de toujours, tous ceux qui ont traversé ma vie et l’ont éclairé de leur sympathie. A ceux (devenus trop rares) de la Maternelle au Lycée, en particulier à Ludo Aux vétos et pseudo-véto (les anciens Champolliens), en particulier à mon "papa" Pignon qui m'a beaucoup appris dans tous les domaines, aux BEAT's (Juju, Blick, Patrick, Bertrand et Carine… mais aussi Holly! J'ai les photos!) avec qui on est devenus célèbres (euh…), à mes groupes de clinique, d'accueil(s)… et de soirées! (j'en oublierai sûrement si j'essayai de tous les citer…) Spécialement à Papy, qui en particulier m’a demandé un jour de m’occuper de sa poulotte ;-) Et bien entendu à Marie, Qui n’a pas aimé ma thèse et n’aime toujours pas les chevreuils, mais qui m’a quand même soutenu dans tous les instants (et m’a aidé à faire signer les papiers) ! Vous m’avez appris ce qu’était l’amitié, je souhaite qu'elle reste solide même après l’école… Aux vétérinaires qui m’ont accueilli dans leur clinique et qui m’ont appris le métier, Les docteurs Morin, Sarda, Ledevin, Jammes, Fraisse, les cliniques Digoin-Gueugnon… Et spécialement à Gilles Le Sobre, dont j’ai beaucoup apprécié la gentillesse et la franchise, Vous dont la patience et la générosité à mon égard ont été sans faille, Très confraternellement. Et tout le monde s’étonnerai si je n’avais pas un petit mot pour le club de mon cur, Alors « Allez les Verts ! », qu’ils nous fassent encore rêver en retrouvant les sommets !

- 5 -

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS .................................................................................................................. 4 TABLE DES MATIERES ......................................................................................................... 6 INDEX DES FIGURES ............................................................................................................. 8 INTRODUCTION...................................................................................................................... 9 Partie I: Etude Bibliographique sur la Mortalité Anormale du Chevreuil (MAC) en France.. 10

A. Historique ........................................................................................................................ 10 1. Evolution des Populations de Chevreuil ...................................................................... 10 2. Surveillance des Populations : le Réseau SAGIR ........................................................ 11 3. La Mortalité Anormale................................................................................................. 12

a) Historique................................................................................................................. 12 b) Problématique .......................................................................................................... 14

B. Protocoles d'Etude ........................................................................................................... 15 1. Les Différents Intervenants et leurs Rôles ................................................................... 15 2. Objectifs et Méthodes des Premiers Protocoles ........................................................... 16

a) Etude Descriptive ..................................................................................................... 16 Programme de 1999............................................................................................ 16 Programme de 2000............................................................................................ 17

b) Enquête Epidémiologique........................................................................................ 17 Programme de 1999............................................................................................ 17 Programme de 2000............................................................................................ 18

C. Résultats Importants de l'EMAC ..................................................................................... 18 1. Résultats des Protocoles 1999-2000............................................................................. 18

a) Analyses SAGIR ...................................................................................................... 19 b) Caractéristiques de Cas Etudiés ............................................................................... 19 c) Hypothèses ............................................................................................................... 19

2. Discussion .................................................................................................................... 20 a) Difficultés des Protocoles ........................................................................................ 20 b) Bilan de l'EMAC...................................................................................................... 21

3. Conclusion : Questions Soulevées par l’EMAC .......................................................... 22 a) Rumeur? ................................................................................................................... 22 b) Surveillance Accrue? ............................................................................................... 22 c) Démographie et Surpopulation?............................................................................... 22 d) Pathologie Emergente? ............................................................................................ 23 e) Risque de Zoonose? ................................................................................................. 24 f) Comment la Gérer?................................................................................................... 24

4. Hypothèse à Explorer ................................................................................................... 25 Partie II: Etudes sur les Pestivirus de la Faune Sauvage.......................................................... 26

A. Généralités sur les Pestivirus........................................................................................... 26 1. Présentation du Genre .................................................................................................. 26 2. Caractéristiques Structurales et Phénotypiques............................................................ 26

Génome et Variabilité Génétique (Annexe 2) .................................................... 26 Les Biotypes ....................................................................................................... 27 Les Sérotypes...................................................................................................... 27 Les Pathotypes .................................................................................................... 27

3. Propriétés Biologiques ................................................................................................. 27 a) Spécificité d'Hôte ..................................................................................................... 27 b) Tropisme Cellulaire ................................................................................................. 27

- 6 -

c) Immunogénicité........................................................................................................ 27 d) Pouvoir Pathogène ................................................................................................... 27

4. Epidémiologie .............................................................................................................. 28 a) Sources d'Infection ................................................................................................... 28 b) Transmission ............................................................................................................ 28

5. Diagnostic..................................................................................................................... 28 a) Virologie (Isolement Viral)...................................................................................... 29 b) Antigénémie............................................................................................................. 29 c) RT-PCR (Retro-Transcriptase PCR)........................................................................ 29 d) Sérologie .................................................................................................................. 29 e) Interprétation des Résultats ...................................................................................... 29

B. Les Pestivirus dans la Faune Sauvage ............................................................................. 30 1. Importance de ces Découvertes.................................................................................... 30

a) Pour la Faune Sauvage ............................................................................................. 30 b) Pour la Faune Domestique : Interactions ................................................................. 30

2. Transmission ................................................................................................................ 30 3. Espèces Touchées......................................................................................................... 31

C. Travaux réalisés en France .............................................................................................. 32 Partie III: Etude Expérimentale................................................................................................ 33

A. Etat des Lieux dans les Départements étudiés................................................................. 33 a) Dans le Jura .............................................................................................................. 35 b) Dans la Loire............................................................................................................ 36 c) Dans le Rhône .......................................................................................................... 37 d) Synthèse sur les Trois Départements ....................................................................... 38

B. Protocole.......................................................................................................................... 38 1. Objectif......................................................................................................................... 39 2. Matériel et Méthodes (Annexe 4)................................................................................. 39

a) Prélèvements (Annexe 5) ......................................................................................... 39 b) Dépistage.................................................................................................................. 40 c) Rappel sur les Techniques d'Analyse Utilisées (Annexe 11)................................... 41

Sérologie ELISA................................................................................................. 41 RT-PCR .............................................................................................................. 42

d) Traitement des Données........................................................................................... 43 C. Résultats........................................................................................................................... 43

1. Données de l'Etude ....................................................................................................... 43 2. Analyses Sérologiques et PCR..................................................................................... 44 3. Analyses Statistiques.................................................................................................... 44

D. Discussion ....................................................................................................................... 46 1. Choix de la zone........................................................................................................... 46 2. Réalisation pratique de l’échantillonnage .................................................................... 46 3. Techniques d'analyse.................................................................................................... 47

CONCLUSION ........................................................................................................................ 48 BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................... 50 ANNEXES ............................................................................................................................... 53

- 7 -

INDEX DES FIGURES

FIGURE 1 : EVOLUTION COMPAREE DE LA SURFACE FORESTIERE ET DES PRELEVEMENTS

..................................................................................................................................................................... 11 FIGURE 2 : ORGANISATION DU RESEAU SAGIR.................................................................................... 12 FIGURE 3 : MENTION DE CAS DE MORTALITE INEXPLIQUES PAR DEPARTEMENT ................ 13 FIGURE 4 : NOMBRE D’ANALYSES SAGIR PAR ESPECE SUR L’ENSEMBLE DE LA FRANCE

DEPUIS 1986 ............................................................................................................................................. 14 FIGURE 5 : RECAPITULATIF DU CLASSEMENT DES ZONES ET DES ANIMAUX.......................... 18 FIGURE 6 : COMPOSITION DU GENOME DES PESTIVIRUS ................................................................ 26 FIGURE 7 : TABLEAU RECAPITULATIF DES DIFFERENTES INTERPRETATIONS POSSIBLES 30 FIGURE 8 : PRINCIPALES INFECTIONS A PESTIVIRUS DE LA FAUNE SAUVAGE ....................... 31 FIGURE 9 : NOMBRE D'ANALYSES SAGIR DANS LES TROIS DEPARTEMENTS INCLUS DANS

NOTRE ETUDE ........................................................................................................................................ 33 FIGURE 10 : TABLEAU DE CHASSE NATIONAL POUR LE CHEVREUIL .......................................... 34 FIGURE 11 : ANALYSES SAGIR DANS LES DEPARTEMENTS ETUDIES DE 1986 A 2006............... 34 FIGURE 12 : CAUSES DE MORTALITE DES CHEVREUILS DANS LE JURA DEPUIS 1986............. 35 FIGURE 13 : CAUSES DE MORTALITE DES CHEVREUILS DANS LA LOIRE DEPUIS 1986 .......... 36 FIGURE 14 : CAUSES DE MORTALITE DES CHEVREUILS DANS LE RHONE DEPUIS 1986......... 37 FIGURE 15 : COMPARAISON DES CAUSES DE MORTALITE DES CHEVREUILS DANS LES

TROIS DEPARTEMENTS ETUDIES DEPUIS 1986............................................................................ 38

- 8 -

INTRODUCTION Le Chevreuil (Capreolus capreolus) présente un intérêt cynégétique majeur, par l'importance des populations qu'il constitue comme celui des tableaux de chasse qu'il permet. Alors que ses populations étaient en perpétuel accroissement depuis 20 ans (O.N.C., 1999), un phénomène nouveau de mortalité brutale et massive, déroutante pour les fédérations de chasseurs (FDC), a été mis en avant à la fin des années 1990 dans certains départements ; cette information a été relayée entre les différents interlocuteurs par le réseau SAGIR dans sa lettre mensuelle, "Au Service de SAGIR", renommée récemment "Lettre SAGIR". Il semble, d'après des études rétrospectives, que des phénomènes similaires ont été observés au début des années 90 aussi bien en France qu'à l'étranger (en particulier en Suède ; (Anonyme, 1997-2005). La Mortalité Anormale des Chevreuils (MAC), est définie par « l'apparition soudaine et brutale d’une mortalité inhabituelle importante (cadavres ou animaux atteints), localisée (sur un massif, un ensemble de communes ou une commune) et prolongée dans le temps (en quelques semaines ou mois). » (Artois et al., 2001) De nombreuses réflexions et travaux ont été menés de façon à étudier le phénomène, de manière à déterminer l'origine de cette mortalité. Malheureusement, aucun agent pathogène n'a été clairement mis en cause et le phénomène densité-dépendance n'explique pas totalement ce qui a été observé, notamment la soudaineté de l’apparition. Des travaux européens (en particulier ceux du Dr Kaï Frölich en Allemagne ; (Frölich, 1995; FrölichetHofmann, 1995; Fischer et al., 1998; FrölichetFlach, 1998) et un mémoire de thèse publié récemment (Flamant, 2005), ont montré la présence de Pestivirus dans la faune sauvage, en particulier chez le Chevreuil. Ce virus apparait donc aujourd'hui comme une des pistes infectieuses à privilégier pour découvrir la cause de la MAC. Dans ce mémoire consacré à la MAC et à la recherche de sa cause, nous résumerons d’abord l’historique des évènements survenus entre 1997 et le début des années 2000, ensuite nous présenterons l’état des connaissances obtenues sur cette mortalité par les études réalisées en France, puis nous présenterons l’hypothèse du rôle que pourrait jouer le Pestivirus, enfin nous terminerons par la présentation de l’étude que nous avons conduite pour détecter l’exposition au virus dans les populations de chevreuils du Jura et de la région Rhône-Alpes.

- 9 -

Partie I: Etude Bibliographique sur la Mortalité Anormale du Chevreuil (MAC) en France Cette partie bibliographique comportera deux chapitres : le premier est consacré à la description de la chronologie des évènements, le second a pour but de résumer les études entreprises pour comprendre ces évènements.

A. Historique

1. Evolution des Populations de Chevreuil Ce paragraphe s’appuie sur les données récentes de la Fédération Nationale des Chasseurs (F.N.C., 2006) et de l’Office National de la Chasse et de la Faune Sauvage (O.N.C.F.S., 2006). Dans les années 1960, la situation en France des chevreuils était médiocre, pour un pays comptant 13 millions d'hectares boisés, soit près du tiers de sa superficie. En effet, pour se défendre des dégâts causés aux cultures, les agriculteurs disposaient du "droit d'affût", qui leur permettait de tirer les grands animaux sur leurs parcelles, y compris la nuit. Cette pratique interdisait toute forme de gestion durable et les chasseurs, emmenés par l'Association Nationale des Chasseurs de Grand Gibier, obtinrent son abolition en échange : - de la prise en charge financière des dégâts causés par les grands animaux aux cultures ; - de l'établissement d'un plan de chasse obligatoire pour prélever les Cervidés. Ce plan de chasse était tout d’abord facultatif (loi 63-754 du 30 juillet 1963), avant d'être rendu obligatoire aux termes de l'article 17 de la loi 78-1240 du 29 décembre 1978 pour l'exercice de la chasse au grand gibier. Associé à de nouvelles règles de gestion, il a contribué au formidable essor des populations de cervidés et à leur diversité, objectif prioritaire du projet. La législation actuelle est regroupée dans les articles L425-6 à -14 du Code de l’Environnement (http://www.legifrance.gouv.fr). A elle seule, cette gestion n’a pas suffi à l’accroissement des populations de cervidés, dont le taux de croissance est faible. De nombreuses réintroductions d'animaux repris dans des réserves nationales (Chizé et Trois-Fontaines), ont permis l’installation des chevreuils dans des régions où ils étaient naguère oubliés (O.N.C.F.S., 2006). Désormais, le Chevreuil est abondant sur l'ensemble du territoire national. Si le recensement global des populations parait irréalisable, il existe des indicateurs d’évolution des populations au cours du temps : l'examen des prélèvements réalisés, de même que les IKA (indices kilométriques d’abondance) et les comptages effectués par les FDC et les groupements de chasseurs, ... (Mouron et al., 1997; Carsuzaa, 1998; O.N.C., 1999). Ces 20 dernières années, les prélèvements ont été multipliés par 6,5 pour le Chevreuil alors que dans le même temps, la superficie boisée passait de 13,5 à 15,5 millions d'hectares, soit seulement une augmentation de 1,15% (F.N.C., 2006).

- 10 -

Figure 1 : Evolution comparée de la surface forestière et des prélèvements (F.N.C., 2006)

2. Surveillance des Populations : le Réseau SAGIR Afin de contrôler au mieux les populations d'animaux sauvages (aussi bien les chevreuils que les autres espèces animales), il a fallu mettre en place un réseau de surveillance sanitaire de la faune sauvage en France (Mouron, 1997; F.N.C., 2006; Terrier, 2006). Ce réseau a été créé par fusion des réseaux Petite Faune et Grande Faune, déjà existants, en 1986, à l’initiative de l’Office National de la Chasse (ONC, tel que nommé à l’époque), grâce aux efforts de C. Mallet, et des Laboratoires Nationaux des Services Vétérinaires (LNSV, actuellement inclus dans l’AFSSA). La motivation première de la création de ce réseau était uniquement le suivi de populations sauvages, mais il a progressivement évolué, pour répondre à plusieurs attentes :

• la gestion des populations de gibier par la surveillance générale de leur état sanitaire ; • le risque de transmission des maladies aux animaux domestiques ; • le risque de zoonoses.

Ce réseau doit permettre de surveiller, prévenir, pallier et contrôler les maladies de la faune sauvage ; il permet le diagnostic des causes de mort des animaux, l’analyse des maladies associées et la connaissance du statut des animaux vis à vis de certains germes pathogènes, d’où une meilleure connaissance du rôle potentiel de réservoir ou de vecteur pour les maladies transmissibles à l’Homme ou aux espèces domestiques. L’organisation de ce réseau est la suivante : les cadavres d’animaux sont apportés par un membre de la Fédération Départementale des Chasseurs ou par un Agent Technique de l’Environnement au Laboratoire Vétérinaire Départemental qui réalise l’autopsie, les recherches bactériologiques et parasitologiques. Le cas échéant, certains prélèvements peuvent être envoyés à d’autres laboratoires pour des recherches spécifiques (ex : toxicologie). Les analyses sont financées par les Fédérations Départementales des Chasseurs. L’ensemble des résultats est validé, encodé dans la base de données et exploité par l’AFSSA LERRPAS, laboratoire d’étude et de recherche sur la rage et la pathologie des animaux sauvages, sous la coordination de l'ONCFS (unité sanitaire de la faune). La base de données permet également la saisie de données sanitaires en provenance d’autres structures, en assurant la traçabilité des résultats. Le LERRPAS dresse les bilans et peut conduire, le cas échéant, des études particulières pour approfondir les connaissances de certaines maladies.

- 11 -

L’organigramme du réseau SAGIR est décomposé sur la Figure 2 :

4. Bilans, échangesd’information

Laboratoires

ITD SAGIR(FDC et SD)

1. Collecte animaux

2. analyses

3. résultats

spécialisés

FDC

ONCFS

AFSSANancy

LVD/LDA

DDSV

4. Bilans, échangesd’information

Laboratoires

ITD SAGIR(FDC et SD)

1. Collecte animaux

2. analyses

3. résultats

spécialisés

FDC

2. analyses

3. résultats

spécialisés

FDC

ONCFS

AFSSANancy

LVD/LDA

DDSV

Figure 2 : Organisation du réseau SAGIR (Terrier, 2006)

Les résultats SAGIR sont la copropriété de l’Office National de la Chasse et de la Faune Sauvage et des Fédérations Départementales des Chasseurs. Ils ne peuvent donner lieu à des publications sans citer le réseau SAGIR.

3. La Mortalité Anormale a) Historique

En France, on date l’apparition du phénomène (mortalité disparate relatée dans la lettre du réseau SAGIR, (Anonyme, 1997-2005) dès le début de la saison de chasse 1996-1997, en particulier dans les Landes (40). Un certain nombre de correspondant du réseau SAGIR dans d'autres départements, l'Ain (01), la Charente Maritime (17), l'Eure (27), la Gironde (33), les Landes (40), le Loir et Cher (41), la Loire (42), le Lot et Garonne (47), la Haute Marne (52), la Nièvre (58), le Rhône (69), la Saône et Loire (71), les Yvelines (78) et l'Essonne (95) déclaraient constater une mortalité anormale de chevreuils, avec une augmentation sensible du nombre de cas de mortalité, dont un grand nombre impliquant plus d’un cadavre de chevreuils trouvés dans un même massif à la même époque. L'analyse rétrospective montre toutefois que des épisodes sporadiques de mortalité massive inexpliquée ont été signalés auparavant, à la fin des années 1980, dans l'Aube (10) et la Nièvre (58) ; ensuite d’autres cas ont été rapportés en 1995, par les déclarations des FDC de l'Ain (01), du Cher (18) et du Territoire de Belfort (90). A partir de la saison de chasse 1996-1997, le nombre de départements atteints augmente, sans qu’aucun lien ne puisse être établi entre les différentes zones touchées (Figure 3) :

- 12 -

1996-97 1998 1999

Cumul

Figure 3 : Mention de cas de mortalité inexpliqués par département (colorés) (Anonyme, 1997-2005)

Depuis 1998, et au cours des trois années qui ont suivi, presque chaque n° de la lettre mensuelle SAGIR mentionnait une mortalité inexpliquée. Ainsi, de nouvelles FDC se manifestaient pour s'ajouter à la liste de plus en plus longue des départements touchés :

• en 1998, ce sont les Alpes de Haute Provence (04), les Hautes Alpes (05), l'Aube (10), le Cher (18), la Creuse (23), le Loiret (45), le Lot (46), le Lot et Garonne (47), la Mayenne (53), la Meurthe et Moselle (54), le Nord (59), le Bas Rhin (67), le Haut Rhin (68), le Rhône (69), la Haute Saône (70), la Sarthe (72), la Seine et Marne (77), la Vienne (86) et l'Yonne (89) ;

• en 1999, on trouve l'Aisne (02), l'Allier (03), la Charente (16), l'Eure et Loire (28), l'Hérault (34), l’Indre et Loire (37), l'Isère (38), l'Oise (60), le Pas de Calais (62), le Puy de Dôme (63), la Somme (80) et la Vendée (85). A la fin de cette année, on a observé dans la Réserve de Trois Fontaines un phénomène réellement nouveau : alors qu’on n’y recensait qu’un à deux morts par an jusqu’alors, on a dénombré entre août 1999 et janvier 2001 de 10 à 12 cadavres, avec des résultats d'analyses nécropsiques (lorsqu’elles ont pu être effectuées) similaires aux autres départements. Malheureusement la tempête a conduit à l’impossibilité de poursuivre ces observations.

• depuis 2000, le phénomène s'est poursuivi, réparti sur l'ensemble du territoire, sans tendance à l'extension géographique. On note toutefois qu’il y a de moins en moins de mentions à des cas de mortalité massive (Charente Maritime, Loire et Bas Rhin en 2001, Nièvre en 2002), mais aussi avec diminution des cas (Aube en 2001).

Le réseau SAGIR a ainsi enregistré entre 1997 et 2001 deux fois plus d’analyses que sur une période précédente deux fois plus longue (de 1986 à 1996), soit environ 6200 résultats d’analyses de Chevreuils sur tout le territoire métropolitain :

- 13 -

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

avant1986

1987 1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005

artiodactylesautres

Figure 4 : Nombre d’analyses SAGIR par espèce sur l’ensemble de la France depuis 1986 (Terrier, 2006)

Il semble que notre pays ne soit pas la seule victime de ce mystérieux problème (Lettre SAGIR 12/1999). En particulier, en Suède, une étude (Aguirre et al., 1999), décrivait dès le début des années 1990 un syndrome très voisin de celui observé en France, appelé syndrome diarrhéique du chevreuil. Il est caractérisé par les aspects suivants :

• entérite, soit parasitaire à coccidies ou nématodes ou due à une surconsommation de colza (mais dans beaucoup de cas, la cause reste inconnue), soit catarrhale ou hémorragique, avec colite, abomasite et parfois érosion de la muqueuse buccale.

• 70 % des chevreuils à diarrhée sont en mauvaise condition (évolution chronique), contrairement aux autres qui sont en bonne condition (évolution parfois aiguë) ;

• parfois lymphadénie mésentérique, hépatite et hépatomégalie ; • environ 40 % des chevreuils atteints souffrent également d'infestation importante à

Varestrongylus capreoli et Dictyocaulus noerneri ; • pas de différence entre mâles et femelles, la "maladie" apparaissant à tous les âges,

plus fréquemment chez les jeunes, avec plus de cas au printemps ; • phénomène localisé, avec une forte prévalence mais une faible mortalité.

b) Problématique Si la situation des chevreuils en France ne semble pas menacée (F.N.C., 2006; O.N.C.F.S., 2006), aucune étiologie n'est identifiée, ni même soupçonnée, pour cette mortalité qui sévit dans toute la France avec un tableau clinique ou lésionnel assez peu caractéristique (Anonyme, 1997-2005; Artois et al., 2001) :

• le phénomène est perçu par les chasseurs comme brutal et important, d’apparition inopinée, de durée variable, et semble intervenir en automne-hiver. Il touche préférentiellement des massifs à forte densité, mais pas systématiquement ;

• les chevreuils, d'âge et de sexe variable, sont trouvés faibles, souvent avec des troubles oculaires, associés à un parasitisme digestif et un ectoparasitisme significativement important. Ils se laissent facilement attraper par les chiens ou approcher par l'homme ;

• le phénomène s’accompagne souvent d’une chute des densités, souvent très importante (évolution de type chronique : se prolonge assez longtemps), ou parfois n’atteint pas la dynamique de la population (de type aigu : disparaît spontanément). Lors de chute importante de la densité, l’état d’embonpoint des animaux s’améliore. Peu de régions ont eu à déplorer une recrudescence de cette mortalité suivant une période de rémission, mais le cas a été rapporté.

- 14 -

Dans l'optique d'étudier ce phénomène, et plus précisément de mieux connaître et d'expliquer l'origine du phénomène (appelé par la suite MAC), l'UNFDC a sollicité une étude, dans le cadre du réseau SAGIR, conduite à l'AFSSA (lettre SAGIR décembre 1999). Un premier protocole a été élaboré en 1999, qui a été modifié en 2000, puis en 2001.

B. Protocoles d'Etude Afin d’expliquer cette mortalité, et le cas échéant, de trouver comment y remédier, il fut établi dès 1999 un protocole d’étude nommé « EMAC » (Etude de la MAC), comportant deux problématiques : une étude descriptive, et une étude épidémiologique (Artois et al., 2001). Lors du bilan du 07 avril 2000, il a été décidé d'étendre l'étude à la France entière pour sa deuxième année, sur la base du volontariat des FDC intéressées, et selon possibilité et accord des LDAV (car ce sont eux qui assurent les examens). Son application débuta le 12 Octobre 2000, avec l'aide des mêmes intervenants qu'en 1999 (Anonyme, 1997-2005).

1. Les Différents Intervenants et leurs Rôles Les Fédérations Départementales des Chasseurs (FDC) participantes (Annexe1) étaient invitées à mieux étudier les zones à MAC en les comparant aux autres zones non atteintes (témoins), et à rechercher les origines du phénomène, en analysant les données extraites à partir de ces zones (Artois et al., 2001) :

• facteurs de risque de la pathologie (et des lésions) observée (densité élevée?) ; • résultats des examens nécropsiques, en particulier s'ils suggèrent l’association avec

une pathologie infectieuse (isolement plus fréquent que le hasard de bactéries telles que Streptococcus bovis, Clostridium, bacille de Johne) ;

• résultats des examens complémentaires, notamment virologiques et histologiques, notamment s'ils permettent d'identifier un agent pathogène particulier. Les hypothèses sont multiples, virale (pestivirus, type BVD), bactérienne (listériose, paratuberculose, enterotoxémie, borréliose) ou protozoologique (hématozoaires ou cryptosporidies).

Elles devaient veiller en particulier :

• à l'organisation du travail de terrain par les coordinateurs SAGIR, c'est-à-dire au choix des zones atteinte et indemne, au comptage de la densité, à recueillir des données descriptives du terrain et des bio-indicateurs, et à la récolte et l’acheminement rapide des prélèvements vers le LVD ;

• à déterminer précisément une liste d’indicateurs de la condition physique : pesée de l'animal plein et vidé, longueur, hauteur au garrot, longueur du "pied postérieur", pesée des reins avec et sans leur enveloppe de graisse, et pour quelques animaux mesure de la concentration en graisse de la moelle osseuse ;

• au financement des analyses courantes (de base, c'est-à-dire autopsie, bactériologie et parasitologie).

L'Union Nationale des Fédérations Départementales des Chasseurs (UNFDC), actuellement Fédération Nationale des Chasseurs (FNC), quant à elle, participait au financement des analyses complémentaires et des surcoûts (analyses détaillées spécifiques au protocole ou réalisées sur des prélèvements d’animaux de chasse, utilisés comme témoins en bonne santé). Le réseau SAGIR, centralisé à l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA) de Nancy, devait pour sa part :

- 15 -

• former des correspondants à ce protocole (selon demande) et les encadrer (permanence téléphonique et appui technique) ;

• effectuer la centralisation des données ; • coordonner l'étude avec les programmes de recherche sur des sujets proches (par

exemple pour des travaux de thèses) ; • réaliser l'analyse approfondie des données disponibles dans la base SAGIR et rédiger

un bilan détaillé. Un certain nombre d'analyses complémentaires, bactériologiques, parasitologiques ou virologiques ont été réalisées sur chaque animal, conjointement par les différents organismes. Le Laboratoire de Parasitologie de la Faculté de Pharmacie de Reims était en charge de la réalisation d'un protocole d'étude parasitologique. Il participait à la fourniture des protocoles de coprologie, ainsi qu'à la détermination détaillée des parasites, notamment des vers par coproculture. Les Laboratoires Départementaux d'Analyse (LDA, aussi appelés pour certains départements LVD, LDAV, IDEA ou IDAC) avaient pour mission :

• la réalisation des autopsies complètes et détaillées sur chaque animal, et de l'estimation de la condition physique ;

• la réalisation des examens bactériologiques et coproscopiques (selon le protocole mentionné ci-dessus) ;

• la réalisation des prélèvements de sérum et de tissus pour recherches complémentaires et l'envoi d'échantillons aux laboratoires spécialisés ;

• l'envoi d'échantillons pour coproculture ; • la rédaction des comptes-rendus d'analyse ; • l'envoi groupé des données à l'AFSSA Nancy.

Les Ecoles Nationales Vétérinaires (ENV) de Lyon et Nantes, ainsi que l’Unité Médicale de Recherche (UMR) INRA-ENVL en 1999, étaient responsables :

• à Lyon de la recherche antigène et anticorps de rétrovirus ; • à Nantes des examens anatomopathologiques selon spécification des LVD.

2. Objectifs et Méthodes des Premiers Protocoles a) Etude Descriptive

Son objectif était de réaliser une étude rétrospective des cas de mortalité du Chevreuil dans la base SAGIR, grâce aux résultats obtenus dans la cadre du réseau, pour étudier les causes de mort de chevreuils depuis 1990 (Anonyme, 1997-2005; Artois et al., 2001).

Programme de 1999 Afin de faciliter l'analyse de ces données, les techniciens des FDC de l'Allier (03), l'Aube (10), l'Indre et Loire (37), les Landes (40), le Loir et Cher (41), la Haute Marne (52), la Nièvre (58), le Rhône (69), la Seine et Marne (77) et l'Yonne (89) ont bien voulu adresser des indications complémentaires, c'est-à-dire des listes de chevreuils examinés dans un contexte de mortalité anormale (d'après la définition de MAC, seul critère permettant à l'heure actuelle de la distinguer d’une mortalité dite "normale"). Les données disponibles dans la base de données du réseau SAGIR ont fait l'objet d'une étude comparative : l'origine des échantillons a été analysée dans les départements non touchés par

- 16 -

le phénomène et dans ceux atteints, afin de détecter d'éventuelles caractéristiques de variabilité dans l'espace et dans le temps. Ensuite, au sein des départements touchés, les résultats d'examens ont été comparés dans les zones atteintes et dans les zones indemnes. A cette fin on a utilisé une liste de chevreuils trouvés morts ou agonisants dans un contexte de mortalité anormale, liste fournie par les techniciens des fédérations concernées. On a utilisé comme "témoins" les chevreuils analysés au cours des mêmes années (1997 à 1999) dans les départements dont le numéro était inférieur d'une unité à ceux des départements d'où provenaient les chevreuils "atteints".

Programme de 2000 Ce nouveau protocole a été allégé par rapport à l’année précédente. Son but était de décrire le plus précisément possible les circonstances d'apparition d'un phénomène MAC dans un département et à assurer son suivi démographique. Quatorze départements ont proposé d’apporter leur contribution à ce programme, à savoir les Ardennes (08), l'Aube (10), le Cher (18), la Creuse (23), le Doubs (25), le Gard (30), la Haute Garonne (31), le Lot (46), le Lot et Garonne (47), le Morbihan (56), le Rhône (69), la Sarthe (72), la Haute Savoie (74) et le Territoire de Belfort (90). Il était demandé aux FDC d'enregistrer, aux fins d'analyse ultérieures, les variables spatiales et temporelles ainsi que les données démographiques, caractérisant dans un département un ou plusieurs épisodes MAC.

b) Enquête Epidémiologique

Programme de 1999 Il s'agissait d'une enquête d’épidémiologie explicative (formulation d’hypothèses en faveur d’une étiologie déterminée) par une méthode du type «cas-témoin», plus particulièrement par l'étude de la condition physique et des examens nécropsiques (Anonyme, 1997-2005; Artois et al., 2001). Ce protocole prévoyait des analyses approfondies dans quatre départements pilotes : les Landes (40), le Loir et Cher (41), la Saône et Loire (71) et la Seine et Marne (77). En cours de saison, deux secteurs ont adhéré au protocole alors qu’ils n’étaient pas prévus : le Rhône (69) et la Réserve de Trois Fontaines. En revanche, la Saône et Loire s’est retirée. On a distingué des zones «atteintes», c’est à dire dans lesquelles le nombre de cadavres trouvé est anormalement élevé (cas), des zones «atteintes-guéries», c’est à dire des zones dans lesquelles le phénomène a disparu depuis au minimum un an, et des zones «indemnes», dans lesquelles la population locale ne déclare rien d’anormal, c’est à dire tout le reste du département (témoin). Le classement d’une commune dans un type de zone est uniquement lié à la déclaration du coordinateur SAGIR départemental. Dans chaque département, les analyses devaient porter sur :

• des animaux trouvés morts ou mourants, classés «cas» (K) ou abattus ou piégés, «potentiellement latents» (L), provenant d'une zone «atteinte» (A), soumis à un examen nécropsique dans un contexte de mortalité anormale

• couplés à des animaux «témoins» (T) et «potentiellement guéris» (G), provenant respectivement de massifs «indemnes» (I) et d'une zone «atteinte-guérie» (A-G) à la même période. A noter qu'à l'exception d'un animal accidenté de la route, les autres

- 17 -

témoins étaient des chevreuils (ou des viscères) abattus, soit pour les besoins de l'étude, soit à la chasse.

Figure 5 : Récapitulatif du classement des zones et des animaux

Reste du département = Zone indemne = I

Programme de 2000 Cette partie était destinée à la recherche des causes du phénomène, dans la continuation de l'Enquête Epidémiologique (comportant les autopsies) mise en place en 1999 (Anonyme, 1997-2005; Artois et al., 2001). Onze départements se sont portés volontaires pour réaliser ce volet, ainsi l'Ain (01), le Cher (18), la Creuse (23), le Gard (30), la Haute Garonne (31), le Loir et Cher (41), la Loire (42), le Lot et Garonne (47), le Morbihan (56), les Pyrénées Atlantiques (64) et la Sarthe (72). Cette partie de l'étude devait permettre de rassembler des informations de nature à expliquer l'éventuelle cause pathologique, commune à tous les cas ou non, d'une MAC, et ainsi d'expliquer la simultanéité de l'apparition de ces phénomènes. Il s'agissait de simplifier l'étude, tout en ayant le souci d'examiner un nombre significatif d'animaux «témoins» servant de référence aux «cas». L'examen des «cas» et des «témoins» devait suivre un protocole approfondi permettant de rechercher un aussi grand nombre que possible d'agents ou de marqueurs d'infection. En particulier l'état clinique des animaux encore vivants devait être mieux décrit avant qu'ils ne soient sacrifiés, afin de réaliser des examens biochimiques et une exploration de leurs défenses immunitaires. Enfin là où une étude détaillée des «cas» et «témoins» n'était pas possible, il était demandé d'obtenir des descriptions aussi précises que possible du phénomène de MAC :

• quand se déroule-t-il? • combien d'individus ont été atteints? • quel est l'état de la population avant et après le phénomène observé?

C. Résultats Importants de l'EMAC

1. Résultats des Protocoles 1999-2000 A la fin de la première période d'étude, une réunion de bilan a été tenue le 08 mars 2000, au siège de l'UNFDC, dont les résultats ont été relayés par la lettre SAGIR d'avril 2000.

Animaux témoins = T Zone atteinte = A

Animaux trouvés morts ou mourants = K Animaux abattus = L

Zone atteinte guérie = A-G

Animaux potentiellement porteurs de traces de la cause de MAC = G

- 18 -

Puis, suite au second protocole, deux réunions ont été menées : • en mars 2001, au siège de la FDC du Loir et Cher, pour effectuer un pré-bilan ; • le 27 avril 2001, au siège de l'UNFDC, posant le nouveau bilan de l’étude.

a) Analyses SAGIR L'analyse du nombre de résultats d'analyses collectés par le réseau SAGIR depuis 1990 a montré, pour tous les départements représentés à la réunion de bilan de mars 2000, une augmentation brutale de ce chiffre (décrochement net) depuis 1997, alors qu'on observait précédemment une faible variation du nombre de chevreuils analysés chaque année (Artois et al., 2001; Terrier, 2006). Ainsi, l'analyse rétrospective de la base de données SAGIR semblait bien confirmer l'apparition d'un phénomène anormal depuis 1997 et même peut-être avant, sans qu'on puisse corréler le phénomène à un accroissement brutal des effectifs français. Toutefois, l'étude plus approfondie des données enregistrées dans la base du réseau SAGIR a montré que la tendance à l’augmentation du nombre de cas de mortalité de chevreuils n’était pas nécessairement significative par comparaison aux autres espèces animales (cf. Figure 4).

b) Caractéristiques de Cas Etudiés En 1999, les différentes FDC ont pu localiser précisément les massifs atteints, affectés plusieurs années de suite. Ceux-ci sont nombreux, et présentent souvent une MAC persistante, sauf en Seine et Marne, où on note peu de zones affectées, plutôt circonscrites (Anonyme, 1997-2005; Artois et al., 2001). Les zones atteintes présentent les caractéristiques suivantes :

• augmentation de la mortalité plus rapide que dans les zones indemnes, sans tendance à l’extension géographique ni de profil des cas (saison ou âge des animaux),

• effet possible de la densité sur la condition des animaux, sauf dans les départements du Loir et Cher et de l'Yonne (absence de lien avec la densité).

En 2000, les foyers où cette mortalité a été observée sont répartis sur l’ensemble du territoire sans tendance à une extension géographique, ni regroupement sur des zones biogéographiques bien définies. Il est toujours difficile de caractériser de façon nette les MAC, tant en terme de saison qu'en terme de sexe ou d’âge des animaux atteints.

c) Hypothèses L'étude des causes de mortalité ainsi que les résultats d’analyse nécropsique des deux types d’animaux (cas et témoins) n’a toujours pas permis de mettre en évidence un agent pathogène spécifique des MAC. De même, la comparaison de la distribution des causes de mortalité entre départements "atteints" et des départements témoins non affectés, ne révèle pas de différences significatives des grandes causes de mortalité ni même des lésions ou agents pathogènes associés à la mortalité (pour plus de détail se référer à (Artois et al., 2001). Ainsi, celles-ci apparaissent multifactorielles : on note un parasitisme très élevé, mais aussi la présence de bactéries (Clostridium sordellii et perfringens, Streptococcus bovis et Staphylococcus aureus), et des cas d’acidose lactique (sans doute liés au maïs d’agrainage). Quelques agents viraux ou bactériens, présents chez les deux types d'animaux (cas et témoins), ou à l’inverse absents chez les cas, n'ont pas été retenus comme cause de mortalité (IBR, Streptococcus bovis).

- 19 -

Les analyses parasitologiques réalisées à la Faculté de Pharmacie de Reims ont montré toutefois chez les animaux "cas" des niveaux de charge parasitaire très élevés :

• en strongles digestifs (Ostertagia, Spiculopteragia et Trichostrongylus en particulier), et notamment d'Haemonchinae (vers hématophages) du genre Ashworthius, qui ont été signalés pour la première fois à Trois-Fontaines, et semblent être très pathogènes ;

• en Moniezia sp., considérés comme assez pathogènes chez les jeunes. De plus, tous ces chevreuils étaient porteurs de Poux mallophages (Cervicola meyeri), et les infestations par les varons (Hypoderma diana) étaient observées régulièrement. Rien ne permet d'affirmer si ces parasites peuvent être à l'origine de la mortalité, mais nous ne devons pas totalement exclure aussi le rôle d’un éventuel nouveau candidat, et tout particulièrement des parasites considérés jusqu’alors absent chez le Chevreuil en France (comme Ashworthius ou Elaphostrongylus cervi). Deux hypothèses ont été formulées à la suite de l'étude :

Hypothèse 1 : la cause "infectieuse", passage au stade enzootique, après un stade épizootique non détecté au départ, d’une maladie provoquée par un agent immunodépresseur difficile à identifier. Aucune donnée (agent particulier ou simple marqueur d'infection) n’est venue accréditer l'hypothèse d'une nouvelle épidémie. On n’a toutefois pas pu écarter l'hypothèse qu'un agent pathogène inconnu prédispose les animaux à une mortalité de nature opportuniste (germes et parasites "banaux" masquant, chez les individus atteints, une symptomatologie discrète), ou que cet agent soit de nature toxique ou environnementale plutôt que "contagieuse".

Hypothèse 2 : la cause "naturelle", accroissement des densités, favorisant une mortalité perçue comme anormale, survenant de façon aléatoire au delà d’un seuil critique de densité. Son apparition dans la réserve de Trois Fontaines est un argument en faveur d'un phénomène bien réel, non explicable par la mise en place spontanée d'une régulation naturelle.

2. Discussion a) Difficultés des Protocoles

Plusieurs difficultés sont apparues concernant le protocole de 1999. Le Protocole Epidémiologique, lui-même, induisait une confusion :

• entre les animaux cas/témoins et les territoires atteints/indemnes ; • il n'était pas mentionné la possibilité de passage d'animaux entre deux zones de statut

différent, du à la proximité entre celles-ci ; • les données qui auraient permis de vérifier l'hypothèse de régulation naturelle des

effectifs n'étaient pas demandées (mais ce n’était pas l’objectif). De plus, les protagonistes ont du faire face à plusieurs soucis d'ordre pratique :

• les demandes du protocole étant assez lourdes, elles n’ont pas été scrupuleusement respectées par tous. Par exemple, les laboratoires n'ont pas suivi le protocole d'étude parasitologique.

• dans le Loir et Cher, la zone initialement prévue comme «indemne» est devenue touchée par la MAC, donc considérée ensuite comme «atteinte». Ainsi le nombre de cadavres en provenance de la zone «indemne» est devenu supérieur à celui de la zone «atteinte» (absence de témoin) ;

- 20 -

• le département des Landes étant une forêt unique, l’ensemble du département a été considéré comme zone «atteinte» (absence de témoin) ;

• le cas du Rhône était délicat, car il n’y avait pas vraiment de zone atteinte, mais une sorte de «tournante» des déclarations des différentes communes (pas de classification cas-témoin) ;

• le nombre d'animaux ramassés ayant été faible, un ajustement du protocole a été nécessaire, mais mal effectué : on a gardé les animaux cas/témoins en notant leur origine (A/I), mais le critère permettant de différencier les animaux a été mal choisi.

De même en 2000, des difficultés techniques sont apparues concernant les acteurs de l'étude :

• un certain nombre de départements qui s’étaient portés volontaires n’ont finalement pas participé à l’étude, car le phénomène MAC n’y est pas apparu (Ardennes, Creuse, Gard, Haute Garonne, Lozère, Doubs, Morbihan, et Pyrénées Atlantiques) ;

• les cadavres trouvés dans le Territoire de Belfort n’étaient plus exploitables. Malgré cela, d’autres départements ont aidé, alors qu'ils n'ont pas participé au protocole :

• certains ont autopsié quelques animaux dans le cadre du réseau SAGIR (Ain, Aube, Cher, Lot, Lot et Garonne). Ces départements ont permis la comparaison des animaux issus de zones où la MAC a existé puis s’est éteinte (AG) avec des animaux témoins ;

• d'autres ont fait réaliser des autopsies et ont précisé quelles zones étaient touchées par la MAC (Indre et Loire, Landes, …).

Enfin, les résultats ont été réalisés avec des données peut-être approximatives :

• les animaux des différents massifs ont été mis en commun, sans vérifier si le phénomène était le même dans toutes les zones ;

• certaines analyses prises en compte n’étaient pas celles transmises avec une mention « EMAC », mais toutes celles du réseau SAGIR dans les départements concernés.

b) Bilan de l'EMAC Le 27 Avril 2001, un nouveau bilan de l’étude est effectué au siège de l'UNFDC (Artois et al., 2001), suivi de la rédaction d’un rapport complet en janvier 2003 (Terrier, 2006). Le travail accompli au cours de cette première phase a été intéressant mais il a laissé entière l’énigme aux multiples aspects contradictoires. Même si la démarche a semblé bonne dans son principe, la difficulté du protocole de l'étude pilote a empêché d'obtenir un nombre significatif d'animaux. Enfin, l'absence de caractéristiques communes aux épisodes de mortalité anormale est restée troublante. Les analyses réalisées jusqu’alors dans le cadre du réseau SAGIR n’ont pas permis de mettre en évidence un facteur d’explication du phénomène : les causes de mort étaient très variées, voire indéterminées pour beaucoup. L'EMAC a donc montré une absence de facteur déterminant unique, et a orienté les objectifs vers la recherche de facteurs favorisants : stress, surdensité ou encore infections intercurrentes immunodépressives d'origine infectieuse. Après différents échanges entre les protagonistes de l'étude, il a été décidé de continuer le protocole descriptif (allégé donc moins contraignant), mais, concernant le protocole épidémiologique, de tenter un appel national à proposition de recherches visant à "éclaircir la nature de ce problème, à en établir la ou les causes et à en déterminer les conséquences démographiques et cynégétiques", selon les questions soulevées par les deux autres études.

- 21 -

Ces questions pouvaient être résumées de la façon suivante (Artois et al., 2001) :

3. Conclusion : Questions Soulevées par l’EMAC a) Rumeur?

En raison de l’absence de critères qualificatifs précis du phénomène, laissant une part significative à la subjectivité, il est toujours possible qu’un effet «rumeur» se soit développé sur le terrain (amalgames, exagérations, nouveauté…), selon deux voies :

• entre chasseurs sur le terrain, de proche en proche, la société cynégétique étant une société où l’information circule beaucoup par oral et peu par écrit ;

• entre professionnels (techniciens de FDC), c’est-à-dire entre départements, notamment grâce au réseau SAGIR.

On met ici en cause les réseaux de circulation de l’information et les phénomènes qui permettent d’amplifier et de déformer un événement pour lui donner un sens en accord avec l’image que le monde de la chasse peut se faire de la survie d’un gibier emblématique.

b) Surveillance Accrue? L’information de l’existence en France d’un phénomène nouveau/anormal touchant le chevreuil a circulé parmi les professionnels comme les chasseurs. A partir de cette "sensibilisation", il est fort possible qu’il se soit opéré un effort de prospection plus intense sur le terrain (surveillance accrue), et/ou une certaine sélection des informations (alertes) transmises à tous les niveaux :

• le chasseur, plus attentif, signale les cas de mortalité ou de comportement «anormal» des animaux dont il a connaissance, contrairement à ses pratiques antérieures ;

• le professionnel privilégie davantage le «phénomène» parmi toutes les nombreuses d’informations qu’il reçoit ou qu’il demande sur le terrain et qu’il transmet au réseau national.

L’augmentation des «cas» qui en résulte peut alors conduire à une perception d’anormalité par rapport à la situation antérieure, ou en tout cas amplifier la perception de l’importance du phénomène de telle sorte qu’une rupture de pente apparaisse dans la tendance à long terme du nombre des cas de mortalité enregistrés par les différents réseaux.

c) Démographie et Surpopulation? Une augmentation de l’effectif d’une population de chevreuil, s’accompagne nécessairement d’un accroissement de la mortalité, à taux constant ou accru (densité-dépendant). Dans un contexte d'accroissement constant des effectifs, on peut s'attendre à ce que la mortalité naturelle des animaux augmente également. Il est possible qu'en franchissant certains seuils de densité, la mortalité augmente plus vite que l'effectif, le faisant stagner. L’augmentation forte du nombre de cadavres de chevreuils trouvés est un événement très largement répandu au niveau géographique mais variable localement. On peut donc difficilement incriminer :

• un changement local de milieu, non compatible avec la grande échelle du phénomène ; • un changement général de l’utilisation du milieu par l’homme, comme le changement

dans l’exploitation sylvicole, en relation avec les pratiques agricoles, qui ne répond pas aux variations locales des mortalités décelées.

- 22 -

Sous l’hypothèse que la forte augmentation du nombre de cadavres de chevreuil trouvés corresponde bien à une augmentation du nombre de chevreuils qui meurent dans les populations concernées, deux scénarios démographiques contrastés peuvent rendre compte de ce changement :

• l’augmentation du nombre de chevreuils qui meurent dans une population donnée correspond simplement à l’augmentation de l’effectif de cette population. Aucun changement démographique n’intervient alors dans un tel cas. Bien que les populations aient exactement la même dynamique (même taux annuel de mortalité), les gestionnaires concluront à tort à une «mortalité anormale» ;

• l’augmentation du nombre de chevreuils morts trouvés sur le terrain correspond à une augmentation du taux de mortalité des chevreuils soit en réponse à une limitation des ressources disponibles causée par l’augmentation de la densité (régulation), soit pour d’autres causes (limitation). Dans ce cas, le changement démographique est réel et devra être pris en compte par le gestionnaire.

d) Pathologie Emergente? L’apparition brutale d’une mortalité peut traduire l’existence :

• d’une maladie transmissible nouvelle ou prenant une importance nouvelle (épizootie) ; • d’une mortalité provoquée par un agent pathogène d’origine physique ou chimique.

Quel que soit sa nature, l’agent pathogène laisse en général sur le cadavre des lésions plus ou moins caractéristiques, dont l’étendue ou la gravité découlent de la durée et de l’importance des perturbations occasionnées à la biologie de l’espèce atteinte. Malgré cela, s’il est peu connu ou peu répandu, le laboratoire peut éprouver des difficultés parfois insurmontables pour trouver une trace de l’agent de causalité, d'autant plus qu'il n’est pas rare que des agents pathogènes opportunistes se développent sur un terrain fragilisé par une première agression et masquent ensuite les traces de l'agent pathogène primaire. De même, les agents peuvent disparaître à la congélation (pasteurelles) ou dans les heures qui suivent la mort. La variabilité de la distribution des cas n’est pas révélatrice d’un phénomène d’allure contagieuse, toutefois il n’est pas exclu qu’une phase épidémique primitive soit passée inaperçue. En outre, si elle existe, la contagion peut s’exprimer à une échelle locale pendant une durée relativement brève du fait d’un faible renouvellement d’individus sensibles : aire de répartition large avec quasi-absence de chevauchement entre les aires de vie des différents chevreuils, faiblesse de la reproduction (en moyenne une portée par an avec deux chevrillards par portée). Enfin, rien ne permet d’exclure que les animaux atteints soient tous contaminés à une source commune apparaissant dans des circonstances actuellement inconnues. Dès l’apparition des premiers cas de MAC, le rôle du parasitisme a été évoqué et souvent considéré comme prépondérant. En première analyse cette hypothèse est peu étayée puisque :

• les animaux en apparente bonne santé sont souvent parasités ; • pour le moment aucun parasite nouveau ou revêtant une particularité quelconque n’a

été trouvé dans les zones d’étude affectée par une MAC. Néanmoins l’étude de l’influence démographique du parasitisme est encore mal maîtrisé tant par les biologistes des populations que par les vétérinaires :

• la théorie épidémiologique avance que la population de parasites se développe dans la population de son hôte suivant une distribution sur-dispersée. Elle aboutit dans tous les exemples étudiés à ce qu’une faible proportion de la population hôte héberge la plus grande partie de la population de parasites. Si la charge parasitaire dépasse les capacités de résistance des hôtes, ceux-ci décèdent en entraînant dans la mort la plus

- 23 -

grande part de la population de parasites. Or, à la faveur de circonstances environnementales, la mortalité des hôtes sur-parasités peut être synchronisée, donnant alors au phénomène une allure massive (Artois et al., 2001) ;

• il n’est pas exclu qu’un parasite, nouveau pour les populations de chevreuils européens, soit actuellement en phase de colonisation. Un nématode, Ashwortius a été récemment découvert, tant chez le Cerf élaphe (Cervus elaphus) que chez les Chevreuil vivant en syntonie. Probablement introduit à l’occasion de l’acclimatation du Cerf Sika (Cervus sika) en Europe, ce ver, proche des strongles digestifs avec qui il a été parfois confondu, semble être très pathogène pour le Chevreuil (Ferté et al., 2000).

e) Risque de Zoonose? Dans l’hypothèse où le phénomène MAC serait réellement exceptionnel (maladie émergente ou déjà connue) ou multifactoriel, certaines hypothèses doivent être examinées :

• existe-t-il un risque pour l’Homme (contact, ingestion, …) ? Quelles sont les catégories de personnes exposées au danger (chasseurs, forestiers, touristes, consommateurs) ? Peut-on évaluer la probabilité de survenue de ce danger ?

• existe-t-il un danger pour les espèces domestiques vivant dans les mêmes zones que les populations de chevreuils atteintes ? Quelle est la nature de ce danger (mortalité, avortements, amaigrissement) ?

• existe-t-il enfin un risque pour les espèces sauvages partageant le même biotope et quel est ce risque ?

Concernant l'agent pathogène en cause, il est donc nécessaire de rechercher :

• sa circulation ; • ses modalités de transmission ; • la possibilité de porteurs sains ou de réservoirs épidémiologiques ; • sa sensibilité ou sa résistance aux désinfectants, à la température, à la dessiccation ; • des mesures propres à éviter le risque de contagion à l’Homme.

f) Comment la Gérer? La question posée est de savoir quels conseils il faudrait donner aux gestionnaires en cas d’émergence de nouvelles causes de mortalité chez le chevreuil. Tout d'abord, la mise au point d’une méthode d’identification des indicateurs de risques destinée aux gestionnaires (forestiers, chasseurs, naturalistes) est une première nécessité. Pour cela, il est indispensable d’élaborer des critères de gestion (ou d’évaluer des critères préexistants : pesée des chevrillards, quantification de l’état d’engraissement, comptages de nuit, examen des classes d’âge, examen des utérus de chevrettes, …), de nature à prédire, à prévenir et à gérer le phénomène :

• Gestion Prédictive : recherche d’un outil de diagnostic à caractère prédictif (échelle de sensibilité aux risques MAC) ;

• Gestion Préventive : définir des seuils limites, aux niveaux quantitatif et qualitatif, des objectifs cynégétiques, sylvicoles, agricoles et touristiques de nature à prévenir les MAC, et élaborer des méthodes de suivi adaptées ;

• Gestion Offensive : identification et connaissance de l’impact réel d’un épisode MAC sur un territoire, grâce à la mise au point de méthodes d’expertise.

- 24 -

Ainsi, on pourra savoir s'il est possible, pour les gestionnaires, de limiter les conséquences jugées néfastes des MAC, en agissant de manière qualitative et quantitative sur les éléments du système population-environnement dont ils ont la charge.

4. Hypothèse à Explorer Cette analyse est restée sans suite, et, à ce jour, l’état des connaissances n’a donc pas évolué depuis la date où les experts ont rendu leurs conclusions. Indépendamment, et depuis lors, plusieurs hypothèses ont été avancées, en particulier celle de l'Ehrlichiose (celle-ci provoque un état immunodépressif, compatible avec des causes de mort très variées et une sensibilité accrue aux agents bactériens ou parasitaires d’ordinaire peu pathogènes). Cette hypothèse est plausible car de nombreux chevreuils sont trouvés porteurs d’anticorps contre Ehrlichia bovis (U.R.G.T.V.BretagneetLDA22, 2003). De même, l’hypothèse de Pestivirose a été avancée. Elle concorde avec les signes cliniques observés : des études ont montré sa présence un peu partout en Europe (FrölichetHofmann, 1995; Fischer et al., 1998), et dernièrement en France (Flamant, 2005). C’est pourquoi nous avons retenu cette hypothèse comme base de travail.

- 25 -

Partie II: Etudes sur les Pestivirus de la Faune Sauvage Dans cette seconde partie, avant de présenter les résultats d’un travail personnel consacré à une enquête épidémiologie sur le portage du Pestivirus par le Chevreuil, nous résumerons les principales connaissances concernant les Pestivirus de la faune sauvage.

A. Généralités sur les Pestivirus

1. Présentation du Genre Les Pestivirus sont classés dans la famille des Flaviviridés, comprenant les Flavivirus et les Hepacivirus. Ce sont de petits virus (40-60 nm) sphériques, enveloppés, à ARN monocaténaire, responsables d'importantes maladies en élevage : diarrhée virale bovine et maladie des muqueuses (MD-BVD, atteignant comme son nom l'indique préférentiellement les bovins), maladie des frontières ou border disease (BD, concernant les ovins) et la peste porcine classique (PPC, ou Classical Swine Fever, CSF, touchant les porcins ; (Lefèvre et al., 2003). La première description clinique eut lieu au milieu du siècle dernier (Olafson et al., 1946), suivie de leur étude approfondie et de celle des affections engendrées.

2. Caractéristiques Structurales et Phénotypiques Génome et Variabilité Génétique (Annexe 2)

Le génome des Pestivirus est complexe, il code pour différentes protéines, distinctes, composant le virus.

Figure 6 : Composition du génome des Pestivirus (Flamant, 2005)

Les régions non transcrites (5'UTR et 3'UTR) et celles codant pour des protéines non structurales (Npro, p7, NS2/3, NS4a et b, NS5a et b) sont très stables (mais aussi très peu immunogènes) et caractérisent le genre Pestivirus. Les régions codant pour des protéines structurales (C, E0, E1, E2) possèdent une forte variabilité antigénique, car fortement prédisposés à des recombinaisons et mutations, et permettent de différencier les différents virus du genre.

- 26 -

Il existe ainsi, en raison du fort pouvoir mutationnel, de nombreuses souches, et chaque année de nouvelles sont mises en évidence (Annexe 2 ; (Becher et al., 1999; Becher et al., 2003; Le Tallec, 2005). On peut noter qu'il existe, pour chaque souche, plusieurs phénotypes :

Les Biotypes Ce sont les formes non cytopathogène (NCP) et cytopathogène (CP), en référence à leur activité in vitro sur les cellules. Dans les premières, on a une protéine NS2/3, alors que dans les secondes, cette protéine s'est clivée pour donner les protéines NS2 et NS3. Elles se différencient en particulier par leur capacité de dissémination, c'est-à-dire une persistance plus importante et un passage transplacentaire possible pour les NCP.

Les Sérotypes Ils sont déterminés selon la réactivité des antigènes aux anticorps, car la variabilité génétique se retrouve au niveau antigénique.

Les Pathotypes On peut définir, au sein d'un même biotype, différents pathotypes, selon le tropisme tissulaire et la virulence de la souche.

3. Propriétés Biologiques a) Spécificité d'Hôte

Les différents génotypes ne sont pas parfaitement spécifiques d'espèce (affinité très relative pour leur hôte), même si on l'a longtemps cru. En effet, des réactions immunitaires croisées sont possibles, et certains pestivirus peuvent franchir la barrière d'espère et infecter la quasi-totalité des ongulés, et parfois l'homme (Becher et al., 2003).

b) Tropisme Cellulaire Les cellules réticulo-endothéliales, notamment les cellules lymphocytaires et monocytaires (d'où une immunosuppression) sont les cibles privilégiées des virus. Il faut donc préférentiellement rechercher les antigènes viraux au niveau des organes lymphoïdes. Plus précisément, les souches NCP possèdent un tropisme marqué pour les cellules nerveuses et de l'endothélium respiratoires, alors que les souches CP sont plutôt ciblées sur les cellules de l'endothélium digestif (Collectif, 2005).

c) Immunogénicité La synthèse d'anticorps s'effectue en 2-3 semaines :

• les anticorps neutralisants atteignent un taux maximal en 10-12 semaines. Ils peuvent passer dans le colostrum, et persistent plusieurs mois à plusieurs années.

• ceux fixant le complément, en revanche, sont peu persistants. • les précipitants sont détectables pendant environ trois mois.

L'immunité est partiellement croisée (Collectif, 2005).

d) Pouvoir Pathogène En raison de leur tropisme particulier, les Pestivirus sont à l'origine d'une immunodépression, chez le jeune comme chez l'adulte.

- 27 -

La réponse de l'hôte (dépendante de son âge et son immunocompétence), est influencée par : • le biotype du virus (passage transplacentaire du NCP chez la femelle gestante) ; • son pathotype, c'est-à-dire sa virulence et son tropisme (atteinte digestive, respiratoire

ou nerveuse). La particularité de ce genre est la naissance de jeunes infectés permanents immunotolérants (IPI), qui ont été contaminés pendant la gestation suite à un passage viral (NCP) transplacentaire. Les individus IPI reconnaissent le virus comme soi, excrètent le virus et ne forment pas d'anticorps. Ils meurent suite à une recontamination par un virus proche, de biotype CP, ou ne peuvent survivre en raison de leur faible condition.

4. Epidémiologie a) Sources d'Infection

Il s'agit surtout des IPI, "bombes à virus" entretenant et propageant l'infection. Les sécrétions et excrétions sont virulentes et l'infection se fait par contact direct ou indirect (voie aérienne), insectes piqueurs ou matériel contaminé. Les animaux en primo-infection sont aussi excréteurs lors de la virémie (4-10jours post-infection), mais en beaucoup plus faible quantité. Il existe sans doute des réservoirs de virus, dont les ovins, et certains auteurs ont suggéré des ongulés sauvages, comme le Cerf (Cervus elaphus ; (Riekerink et al., 2005).

b) Transmission Celle-ci peut être horizontale, par voie conjonctivale directe (oro-nasale ou génitale) ou verticale, c'est-à-dire lors de la gestation par voie transplacentaire (souche NCP). Les conséquences cliniques de la transmission verticale dépendent du stade de gestation. Les dates de délimitation restent floues, et variables selon les espèces (exemple des bovins) :

• avant 40 jours, le virus a plutôt une affinité génitale. On note des retours en chaleurs tardifs, et des résorptions embryonnaires précoces ;

• entre 40 et 125 jours, c'est la période critique où le fœtus n'est pas encore immunocompétent, et inclut le virus dans le soi, d'où la formation d'IPI.

• entre 125 et 160 jour, le système immunitaire du fœtus se met en place, et on peut alors obtenir des veaux malformés (cœlosomie), surtout au niveau du système nerveux (cataracte, microphtalmie congénitale), ou des avortements tardifs ;

• après 160 jours, le système immunitaire du fœtus est en place, élimine le virus (jeunes en parfaite santé) et fabrique des anticorps.

5. Diagnostic La virologie, l'antigénémie ou la RT-PCR permettent de mettre l’infection en évidence. On pourra déterminer s'il y a eu passage viral par sérologie. En phase clinique, on peut réaliser deux tests à trois semaines d'intervalle pour montrer une séroconversion. Pour déterminer un IPI, on peut réaliser :

• une antigénémie, sur des animaux de plus de 6 mois ; • une RT-PCR, pour un animal de moins de 6 mois ; • une sérologie à la naissance, car un animal infecté après 160 jours de gestation aura

formé des anticorps comme moyen de défense.

- 28 -

a) Virologie (Isolement Viral) C'est une technique de référence, qui s'effectue sur culture cellulaire dans certains laboratoires spécialisés (dont l’Institut Pasteur), à partir de sang total, d'organes frais ou de sécrétions. L'analyse est longue, elle peut prendre plus de 15 jours. Elle permet d'identifier le virus par immunofluorescence (IF, au moins 48h), et aussi de déterminer si on a affaire à une souche CP ou à une souche NCP (au moins 24h). Il faut réaliser des prélèvements dans la première quinzaine de la virémie, avant l'élimination du virus (4-10 jours post-infection).

b) Antigénémie Elle permet de mettre en évidence l'antigène p125 (NS23) ou p80 (NS3), qui sont stables, par une méthode ELISA (trousses diagnostiques). L'analyse s'effectue sur sang total (sur tube EDTA), sur caillot cardiaque, ou sur la rate, car ils contiennent des leucocytes, susceptibles de renfermer le virus. La valeur prédictive positive (VPP) est excellente pour un animal de plus de 6 mois. En effet avant cet âge, il peut subsister des anticorps maternels masquants, qui captent les antigènes.

c) RT-PCR (Retro-Transcriptase PCR) Elle se fait à partir des leucocytes (qui ont une charge virale importante), issus de prélèvement de sang total sur EDTA (pas d'héparine car elle inhibe la PCR), ou dans le sérum, prélevé sur tube sec. On peut aussi les récupérer dans la rate ou les intestins. La VPP est très bonne. Une PCR quantitative (en temps réel) permet de faire la différence entre un IPI et un virémique transitoire, car le premier est décelé plus tôt. De plus, le grand avantage de cette méthode est que la détection du virus est possible chez un animal de moins de 6 mois, même en la présence d'anticorps colostraux, car c'est l'ARN viral qui est recherché, et pas les antigènes.

d) Sérologie Elle met en évidence une exposition virale, et s'effectue par titrage des anticorps anti-p125 ou -p80. Elle peut se faire par :

• séroneutralisation quantitative, avec inhibition de l'Effet CytoPathogène (ECP) du virus en trois jours. C'était une technique de référence, même si on ne peut pas faire la distinction entre IPI et virémiques transitoires, mais actuellement plus très utilisée ;

• ELISA avec des anticorps anti-p125 ou -p80, dont la VPN est très bonne.

e) Interprétation des Résultats Il faut mettre en relation les deux types de recherche. En effet, pour un animal qui répondra négativement à la recherche directe de virus (noté V-), donc en isolement viral, antigénémie ou RT-PCR, la sérologie permettra de différencier :

• l'animal naïf (sans rencontre avec le virus) grâce à une sérologie négative (noté AC-) ; • de l'animal immunisé ayant séroconverti, par une sérologie positive (noté AC+).

- 29 -

De même, pour un animal infecté par le virus (V+) : • s'il y a des anticorps (AC+) on aura affaire à virémique transitoire ; • sinon ce sera un IPI ou un animal en cours de séroconversion (AC-).

V- V+

AC- animal naïf animal IPI ou en cours de séroconversion AC+ séroconversion (signe un passage viral) animal virémique transitoire

Figure 7 : Tableau récapitulatif des différentes interprétations possibles

B. Les Pestivirus dans la Faune Sauvage Depuis le milieu du siècle dernier (Richards et al., 1956), la présence de Pestivirus au sein de la faune sauvage est avérée, et de multiples publications ont relaté leur découverte dans le monde entier, sur de nombreuses espèces d'ongulés (Flamant, 2005).

1. Importance de ces Découvertes a) Pour la Faune Sauvage

Une infestation par des Pestivirus peut être à l'origine d'une baisse d'immunité importante au sein des populations, et induire des maladies cliniquement déclarées se répercutant sur la dynamique de population.

b) Pour la Faune Domestique : Interactions La faune domestique est bien entendu très souvent en contact avec la faune sauvage. La politique d'éradication des maladies infectieuses des animaux de rente ne tient souvent pas compte de cette proximité, ou la néglige. Le souci actuel est donc de savoir quel risque comporte ce contact entre faunes domestique et sauvage. En effet, les interactions et les transmissions de maladies entre ces deux groupes sont encore inconnues (Nielsen et al., 2000). De plus, la faune sauvage serait un réservoir potentiel de maladies (dont les Pestiviroses) pour les animaux domestiques (Frölich et al., 2002; Simpson, 2002). Ainsi, le contrôle à long terme de ces maladies nécessite de mieux connaître et de lutter contre celles présentes dans la faune sauvage. A l’inverse, lorsque des maladies de la faune sauvage ont pour réservoir potentiel des animaux domestiques, leur disparition chez ces derniers peut induire leur disparition de la faune sauvage.

2. Transmission La transmission naturelle des souches virales entre espèces différentes a été observée (Elazhary et al., 1979; DoyleetHeuschele, 1983; Tessaro et al., 1999). L'inoculation expérimentale à partir d'extraits de foie ou de sang d'ongulé malade (bovin ou cervidé) à ongulé sain est possible (Richards et al., 1956), de même que par voie intranasale (Van Campen et al., 1997). D'autres auteurs trouvent improbable la transmission du virus d'espèces sauvages à domestiques, mais l'inverse serait possible (Nielsen et al., 2000).

- 30 -

3. Espèces Touchées Espèce Virologie Séroconversion Signes Cliniques Lieu Références Bibliographiques

Antilocapre

oui oui

oui 3/14+

oui

Zoo USA USA USA

(DoyleetHeuschele, 1983) (Cornish et al., 2003) (Vilcek et al., 2005)

Antilope des Sables oui oui 5/66+

Afrique Zoo USA

(HamblinetHedger, 1979) (DoyleetHeuschele, 1983)

Bison oui oui 5/28+

Parc GB

Williams, 1993 (FrölichetFlach, 1998)

Buffle oui Afrique (HamblinetHedger, 1979) Caribou oui 22/33+ Québec (Elazhary et al., 1979)

Cephalophe de Grimm

oui oui

oui

Afrique Zoo USA

(HamblinetHedger, 1979) (DoyleetHeuschele, 1983)

Cerf Mulet

oui oui

oui 26/76+

oui oui 59%+

oui oui 60%+

oui

oui

non oui

USA USA

Zoo All USA

Amérique Amérique

(Richards et al., 1956) (Couvillion et al., 1980)

(Karstadt, 1981) (Aguirre et al., 1995)

(Van Campen et al., 1997) (Van Campen et al., 2001)

Cerf du Père David oui 11/49+ Parc GB (FrölichetFlach, 1998)

Cerf Rouge

oui

oui

non oui

oui 5.9%+

non oui

GB

Alpes Fr Allemagne

Italie

(Mac Martin et al., 1977) (NettletonetHerring, 1980)

(Baradel et al., 1988) (Frölich, 1995)

(Riekerink et al., 2005)

Cerf de Virginie

oui oui oui

oui

oui non

USA GB

Zoo All Amérique Norvège

(Richards et al., 1956) (NettletonetHerring, 1980)

(Karstadt, 1981) (Van Campen et al., 1997)

(Lillehaug et al., 2003)

Chamois oui 5.6%+

non oui 25.5%+

Alpes Fr Alpes Ita Alpes Ita

(Baradel et al., 1988) (Citterio et al., 2003)

(Riekerink et al., 2005) Chèvre Pygmée oui oui oui Zoo USA (DoyleetHeuschele, 1983)

Chevreuil

oui

oui oui 0.8%+

oui 12/125+

non oui 12%+

non

Alpes Fr

Allemagne

Danemark Norvège Alpes Ita

(Romvary, 1965) (Baradel et al., 1988)

(FrölichetHofmann, 1995) (Fischer et al., 1998) (Nielsen et al., 2000)

(Lillehaug et al., 2003) (Riekerink et al., 2005)

Cob de Buffon oui Afrique (HamblinetHedger, 1979) Cob Defassa oui oui Zoo USA (DoyleetHeuschele, 1983)

Daim oui

oui 4.5%+ oui

oui Suède Italie

Allemagne

(Diaz et al., 1988) (Cuteri et al., 1999)

(FrölichetFlach, 1998)

Elan

oui

oui oui oui oui

non

Afrique Zoo USA

(HamblinetHedger, 1979) (DoyleetHeuschele, 1983)

(Kingscote et al., 1987) (Tessaro et al., 1999)

Girafe oui

oui Afrique Afrique

(HamblinetHedger, 1979) (Avalos-Ramirez et al., 2001)

Gnou oui Afrique (HamblinetHedger, 1979) Grand Kudu oui Afrique (HamblinetHedger, 1979) Hydropote oui 10/137+ Parc GB (FrölichetFlach, 1998)

Isard oui* oui

oui oui

France France

(Arnal et al., 2004) (Frölich et al., 2005)

Mouflon oui oui

Canada (ThorsenetHenderson, 1971) (Lillehaug et al., 2003)

Oryx oui oui 7/37+

oui Zoo USA Parc GB

(DoyleetHeuschele, 1983) (FrölichetFlach, 1998)

Renne

oui

oui 22/30+

oui

oui

oui

Canada

Norvège

Norvège

(Elazhary et al., 1979) (Morton et al., 1990) (Stuen et al., 1993)

(Avalos-Ramirez et al., 2001) (Lillehaug et al., 2003)

Springbok oui oui 2/51+

Afrique Zoo USA

(HamblinetHedger, 1979) (DoyleetHeuschele, 1983)

Wapiti oui 55%+ USA (Aguirre et al., 1995) Figure 8 : Principales infections à Pestivirus de la faune sauvage (Flamant, 2005)

- 31 -

Le tableau (Figure 9) montre la grande diversité d'espèces sauvages qui peuvent être atteintes par les Pestivirus, dans le monde entier. Toutefois, une étude plus approfondie semble indiquer que ces espèces ne sont pas toutes affectées de la même façon, et souvent par des souches différentes (Collectif, 2005).

C. Travaux réalisés en France En 1995, Frölich (FrölichetHofmann, 1995) a mis en évidence en Allemagne un pestivirus propre aux chevreuils ; en outre, la base de données SAGIR révèle que certains chevreuils présents sur le territoire français ont aussi présenté des anticorps contre un Pestivirus (d'après les recherches sérologiques et antigéniques réalisées par les LVD). Une première étude récente a été consacrée au Pestivirus du Chevreuil en France. Cette étude (Flamant, 2005) a permis de mettre en évidence une circulation d'un Pestivirus au sein des populations de chevreuils en France, de manière directe (recherche du virus : ARN ou antigènes) ou indirecte (anticorps). Un protocole détaillé a été fourni aux protagonistes, dans le but d'obtenir des prélèvements et de les analyser. Ceux-ci ont été collectés de trois façons :

• par l'ONCFS, dans le cadre de ses territoires d'étude (Chizé et Trois-Fontaine) ; • par les FDC et chasseurs, lors de la période de chasse ; • directement dans les LDAV, dans le cadre du réseau SAGIR.

Des prélèvements de sérum, de sang frais ou de caillot frais, ainsi que des extraits d'organes (poumon et rate) ont pu être récoltés et analysés par ELISA (kits d'analyse Synbiotics) et RT-PCR, au LDAV 68 (Colmar). Sur 278 chevreuils analysés, les résultats des tests anticorps furent les suivants :

• 24 animaux ont répondu positivement, dont 23 sur les domaines de Trois-Fontaines et Chizé (sur 186 prélèvements, soit 12±4,7%), et seulement 1 sur ceux issus des LDAV et FDC (sur 85 prélèvements, soit 1±2%) ;

• 28 animaux ont donné une réponse douteuse. Concernant les tests antigènes, aucune analyse n'a montré de positifs sur Trois-Fontaines et Chizé, mais deux ont été contrôlés positifs sur les prélèvements des LDAV et FDC. Ces animaux provenaient de l'Yonne, et présentaient à l'autopsie des signes qui se rapprochent de ceux observés lors d'expression clinique de la maladie (immunodépression et diarrhée en particulier). En conclusion, d'après cette étude, il est à penser qu'un pestivirus circule au sein de la population de chevreuils de Trois-Fontaines (20% de séropositifs) et de l'Yonne (animaux IPI ou seulement virémiques?), donc dans l'est de la France. Toutefois il reste à déterminer le virus en cause (proche ou non de celui découvert par Frölich et al.) et d'approfondir l'étude pour préciser la circulation virale en France.

- 32 -

Partie III: Etude Expérimentale Cette étude a été réalisée dans le cadre de la recherche des causes de la mortalité anormale du Chevreuil (EMAC). Elle avait pour but de poursuivre et d'approfondir les études précédentes de Kaï Frohlich (Allemagne) et Sandrine Flamant (ENVL), qui portaient sur la recherche et l'étude de Pestivirus au sein de la population de chevreuils en France. Les départements étudiés étaient le Jura, la Loire et le Rhône.

A. Etat des Lieux dans les Départements étudiés Pour la plupart des départements, la réalisation du plan de chasse a chuté d’une valeur de 97-98% (jusqu’en 2000) à celle de 85%. Dans les trois départements étudiés, cela a été confirmé (F.N.C., 2006; O.N.C.F.S., 2006). Dans ces trois départements, de même que sur l'ensemble du territoire français, le nombre d'analyses SAGIR en fonction des années, concernant les artiodactyles, montre un clocher de mortalité entre les années 1996 et 2002, puis un retour relatif à la "normale" depuis (la pente de la courbe du nombre d'analyses a retrouvé sa valeur d'avant 1996).

0

20

40

60

80

100

120

140

1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005

RhôneLoireJura

Figure 9 : Nombre d'analyses SAGIR dans les trois départements inclus dans notre étude (Terrier, 2006)

En France, le tableau suivant (Figure 11) montre que les populations de chevreuils se portent bien, même si certaines n’augmentent plus, après 25 années de hausse régulière liée à la mise en place du plan de chasse :

- 33 -

Tableau de chasse national pour le chevreuil

0

100 000

200 000

300 000

400 000

500 000

600 000

1973

1974

1975

1976

1977

1978

1979

1980

1981

1982

1983

1984

1985

1986

1987

1988

1989

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

Saison de chasse

Attributions (nombre d'animaux à abattre)Réalisations (nombre d'animaux abattus)

Source : ONCFS -FDC - réseau de correspondants "cervidés-sanglier".

Figure 10 : Tableau de chasse national pour le Chevreuil (O.N.C.F.S., 2006)

On signale de moins en moins de fortes augmentations de la mortalité comme celles qui ont frappé certaines régions dans la fin des années 90, même si, d'après les FDC, celles-ci affectent toujours certaines zones (F.N.C., 2006). Les populations continuent de se développer en plaine, où les animaux restent à demeure, délaissant les massifs boisés. Concernant les analyses SAGIR, le graphique suivant montre le nombre d'analyses effectuées dans les trois départements (résultats détaillés plus loin, Figure 16) :

Rhône29%

Loire13%

Jura58%

Figure 11 : Analyses SAGIR dans les départements étudiés de 1986 à 2006 (Terrier, 2006)

Sur un total de 1153 analyses, plus de la moitié (678 cas) ont été effectuées pour le compte du Jura, un tiers (329 cas) par le Rhône et le reste (146 cas, environ le dixième) par la Loire.

- 34 -

a) Dans le Jura Dans le département, on évalue la densité de chevreuils à environ 3,81 par ha. Les informations sur le statut des individus chassés pendant la saison 2005-2006 pour le département sont sur le tableau suivant :

Attributions 6343 Effectifs 19029 Réalisation Mâles Femelles Indéterminé Total

Jeunes 478 495 4 977 Adultes 2330 1954 0 4284

Indéterminé 0 0 25 25 Total 2808 2449 29 5286

Poids Moyen Mâles Femelles Indéterminé Moyenne Jeunes 13,64 13,47 0 13,56 Adultes 21,96 22,83 0 22,34

Indéterminé 0 0 19,75 19,75

JUR

A

Moyenne 20,51 20,90 19,75 20,69 Dans le département, les sex- et âge-ratios sont respectivement de 0,87 et 0,23. Les analyses SAGIR du département, enregistrées depuis 1986, sont reportées dans ce graphique, et classés en fonction de la cause de la mort (les analyses correspondant au suivi d’état sanitaire ne sont pas prises en compte, cf Annexe 3 pour l’explication des légendes) :

Causes de Mortalité (Jura)

Autres4%

Nerv-Ocul-Cpt18%

Traumatique31%

Général18%

Cardio-Respi-Circu15%

Digestif14%

Figure 12 : Causes de mortalité des Chevreuils dans le Jura depuis 1986 (d’après les analyses SAGIR)

Les causes qui reviennent le plus souvent sont les origines traumatiques. Les affections générales, nerveuses, cardio-respiratoires et digestives sont aussi bien représentées. Il faut noter une proportion de morts d'origine indéterminée de l’ordre de 15%.

- 35 -

b) Dans la Loire Dans le département, on évalue la densité de chevreuils à environ 3,54 par ha. Les informations sur le statut des individus chassés pendant la saison 2005-2006 pour le département sont sur le tableau suivant :

Attributions 5646 Effectifs 16938 Réalisation Mâles Femelles Indéterminé Total

Jeunes 932 871 14 1817 Adultes 1744 1426 24 3194

Indéterminé 81 55 6 142 Total 2757 2352 44 5153

Poids Moyen Mâles Femelles Indéterminé Total Jeunes 14,10 13,78 14,70 13,95 Adultes 23,12 21,50 22,46 22,39

Indéterminé 20,98 19,23 20,72 20,29

LO

IRE

Total 20,01 18,59 19,75 19,36 Les sex- et âge-ratios du département sont respectivement de 0,85 et 0,57. Concernant les causes de mortalité du département (analyses effectuées depuis 1986), on peut voir sur le graphique suivant que celles qui prédominent sont les origines traumatiques, de la même manière que dans le Jura :

Causes de Mortalité (Loire)

Traumatique46%

Digestif16%

Cardio-Respi-Circu11%

Général16%

Autres11%

Figure 13 : Causes de mortalité des Chevreuils dans la Loire depuis 1986 (d’après les analyses SAGIR)

Les affections générales et digestives sont aussi bien invoquées, ainsi que dans une moindre mesure les affections cardio-respiratoires et digestives sont aussi bien représentées. Il faut cette fois encore remarquer une proportion de morts d'origine indéterminée de l’ordre de l’ordre de 25%.

- 36 -

c) Dans le Rhône Dans le département, on évalue la densité de chevreuils à environ 2,75 par ha. Les informations sur le statut des individus chassés pendant la saison 2005-2006 pour le département sont sur le tableau suivant :

Attributions 2983 Effectifs 8949 Réalisation Mâles Femelles Indéterminé Total

Jeunes 334 322 0 656 Adultes 899 829 0 1728

Indéterminé 68 61 0 129 Total 1301 1212 0 2513

Poids Moyen Mâles Femelles Indéterminé Total Jeunes 14,84 14,87 0,00 14,85 Adultes 19,89 19,89 0,00 19,89

Indéterminé 19,88 19,90 0,00 19,89

RH

ON

E

Total 18,59 18,56 0,00 18,58 Dans le département, les sex- et âge-ratios sont respectivement de 0,93 et 0,38. Les analyses SAGIR du département depuis 1986 montrent, de même que dans les deux autres départements, une prédominance des origines traumatiques de la mortalité des chevreuils, associées cette fois avec les affections générales, ainsi que moins fréquemment les affections digestives et cardio-respiratoires :

Causes de Mortalité (Rhône)

Cardio-Respi-Circu8%

Digestif10%

Général25%

Autres12%

Traumatique45%

Figure 14 : Causes de mortalité des Chevreuils dans le Rhône depuis 1986 (d’après les analyses SAGIR)

La fraction de mortalité d'origine indéterminée est d’environ 20% dans ce département.

- 37 -

d) Synthèse sur les Trois Départements Le graphique suivant (Figure 13) détaille les résultats d’analyses SAGIR depuis 1986, classés en fonction de la cause de la mort (les analyses correspondant au suivi d’état sanitaire ne sont pas prises en compte) :

Trau

mat

ique

Ner

v-O

cul-C

pt

Gén

éral

Car

dio-

Res

pi-C

ircu

Dig

estif

Uro

-Gén

ital

Envi

ronn

emen

t

Toxi

que

Der

mat

o

Indé

term

iné

02040

60

80

100

120

140

160

180

Loire

Rhône

Jura

Figure 15 : Comparaison des causes de mortalité des Chevreuils dans les trois départements étudiés

depuis 1986 (d’après les analyses SAGIR) Nous noterons en particulier :

• qu’il y a énormément de mort due à des traumatismes dans les trois départements ; • que le département du Jura présente beaucoup plus de mort liée à une cause nerveuse,

oculaire ou comportementale ; ceci est lié au fait que dans la plupart des départements, la mort de ces animaux, souvent des mâles qui se sont battu (encéphalite purulente avec surinfection par Arcanobacterium pyogenes) sont auto-diagnostiqués et ne sont pas apportés au LDA.

En conclusion, le contexte de l’étude présente une situation sanitaire assez bonne, avec un nombre d’analyses SAGIR qui a retrouvé sa valeur d’avant 1997, et des indicateurs biologiques (en particulier poids moyens et ratios, par rapport aux normes) qui ont retrouvé des valeurs conformes aux standards (F.N.C., 2006; O.N.C.F.S., 2006).

B. Protocole Une circulation virale ayant été mise en évidence dans l’Est de la France (Flamant, 2005), nous avons voulu savoir si le virus étant présent dans trois département de la région Est, afin le cas échéant d’étudier les indicateurs des risques d’infection.

- 38 -

1. Objectif Il s'agissait de réaliser une étude descriptive de la prévalence apparente des anticorps, dirigés contre les Pestivirus, afin de rechercher une éventuelle prévalence de l’infection dans différentes populations de Chevreuils du Jura et de la région Rhône Alpes (Rhône, Loire). L'essentiel du dépistage a été réalisé par sérologie ELISA et RT-PCR. En outre, nous voulions réaliser une étude analytique du risque relatif de présenter des anticorps en fonction de variables explicatives écologiques : âge, sexe, origine, et condition physique des chevreuils.

2. Matériel et Méthodes (Annexe 4) La collecte a été organisée et accomplie en 2005-2006, pendant les dates d'ouverture de la chasse (du 09/09/2005 au 31/01 pour le Jura et le Rhône ou 28/02/2006 pour la Loire). Le protocole a été fourni et exposé à tous les interlocuteurs (SD, FDC, LDAV et chasseurs participants). Le traitement et le stockage des prélèvements au congélateur ont été effectués par les LDAV. Les analyses se sont déroulées en deux temps :

• une partie sérologie dans les LDAV locaux ; • une partie PCR, réalisée par le LDAV73, après envoi des prélèvements (par les

LDAV), avec les fiches d'identification de chaque animal.

a) Prélèvements (Annexe 5) La zone de prélèvements correspond aux départements du Jura, de la Loire et du Rhône. Il était demandé aux participants de ces départements un nombre d'environ une cinquantaine de prélèvements par département. La nature des prélèvements demandés était (sans oublier leur identification) : 1. du sang sur tube sec avec gel séparateur : il était demandé un volume minimal de 0,5 ml

par animal. 2. la rate, récupérée dans un pot à prélèvement : elle permettait la recherche de l’ARN du

virus par RT-PCR. Le matériel nécessaire était fournit à chaque département, sous forme de trousse de prélèvement individuel contenant chacun :

• un bistouri ; • une paire de gants en latex blancs (courts) ; • une paire de gants d’exploration oranges (longs) ; • deux "vacutainers" (tubes sec) avec gel séparateur ; • un pot à prélèvement (flacon stérile à bouchon rouge) de 500 ml ; • une blouse à usage unique.

Des fiches d'identification (Annexe 6) prénumérotées (permettant l'identification de chaque prélèvement) étaient aussi fournies, avec les informations suivantes (à remplir in situ) :

• la date et le lieu de la capture (commune et département, si possible code INSEE) ; • les coordonnées du préleveur ; • le numéro du bracelet de l'animal et, si il y a lieu, de la fiche SAGIR ; • le sexe de l'animal : male ou femelle ; • l'age de l'animal : jeune, adulte ou vieux ; • son poids en kg, qui constitue un indice de condition physique, en précisant si il a été

mesuré plein ou vide.

- 39 -

La collecte de matériel biologique (sang et rate) a été réalisée :

• par les techniciens des Fédérations Départementales de Chasseurs (FDC) et Sociétés et Associations de Chasse (ACCA) lors de battues et d'actions de chasse ;

• par les Interlocuteurs Techniques Départementaux (ITD) de l'Office National de la Chasse et de la Faune Sauvage (ONCFS), dans le cadre du réseau SAGIR ;

• directement par le personnel des LDAV locaux, pour les chevreuils amenés par les ITD du réseau SAGIR.

Ceux-ci ont procédé à l'identification in situ des prélèvements et à l'établissement des commémoratifs (sur la fiche d'identification fournie). Lors de récolte hors des LDAV, pour tous les départements, il était demandé de conserver les prélèvements au frigo ou dans une glacière (maxi 4°C) après récolte. Le ramassage a été réalisé le jour même (lorsque j'étais présent à la battue) ou le lendemain matin, soit par les techniciens des FDC, soit par mes soins, pour transfert au LDAV.

b) Dépistage Les intervenants sont les LDAV :

• du Jura (Lons-le-Saunier, 39), représenté par les docteurs vétérinaires Françoise Pozet et Alain Viry ;

• de la Loire (Montbrison, 42), géré par son directeur Philippe Béal ; • du Rhône (Marcy l’Etoile, 69), dirigé par le docteur vétérinaire Jacquemine Vialard ; • de la Savoie (Chambéry, 74), représenté par son directeur le docteur vétérinaire

Bertrand Le Tallec et Mme Yvette Game, sa directrice, assistée des docteurs vétérinaires Paul Revelli, Eugénie Mabrut et Yanne Nevejans.

Le traitement des prélèvements a été effectué dans les laboratoires départementaux d'analyse vétérinaire (LDAV) locaux : 1. Sang : centrifugation, séparation du sérum et aliquotage dans trois tubes plastique (type

"eppendorf", 500μl au minimum), un pour la sérologie (effectuée au LDAV), un pour la PCR et un témoin (ces deux derniers envoyés par la suite au LDAV 73) ;

2. Rates : transfert dès l’arrivée au LDAV d’un petit morceau dans un tube en plastique type "eppendorf" (avant d'être envoyé au LDAV 73) ;

3. Congélation : rates à -80°C et sérums à au moins -20°C L'envoi des rates et des sérums a été effectué en fin d’étude (à partir du mois de février), sous couvert du froid, accompagné des fiches d'identification (commémoratifs), après en avoir informé le LDAV 73, et en évitant toute rupture de la chaîne du froid. Les analyses ont été réalisées indépendamment par les trois LDAV : 1. une sérologie ELISA, par dépistage semi-quantitatif des anticorps à l'aide d'une trousse du

commerce : kits SYNBIOTICS SERELISA BVD p80 Ab Mono Blocking ou POURQUIER ELISA BVD/MD/BD p80 Anticorps Competition, fournis aux LDAV locaux par le LDAV 73.

2. la mise en évidence du virus par RT-PCR (faite au LDAV 73) sur sérum et rate des individus ayant répondu négativement à la sérologie (animaux IPI ou réellement non exposés), tout d'abord par mélange de cinq prélèvements, puis individuellement si un résultat positif est détecté, suivi d’un séquençage/typage du virus s’il y a lieu.

- 40 -

c) Rappel sur les Techniques d'Analyse Utilisées (Annexe 11)

Sérologie ELISA Elle est ciblée sur des anticorps anti-p80 (NS3) ou p125 (NS2/3), donc destinée à la détection des anticorps spécifiques d'une protéine commune à toutes les souches de Pestivirus, induits lors de la multiplication virale (après infection). Les tests utilisés sont donc :

• sensibles, car la protéine p80 (ou p125, équivalente) est très immunogène ; • à large spectre, du fait de la stabilité de NS3 (ou NS2/3) dans le genre Pestivirus. • les sensibilité et spécificité des deux tests sont équivalents entre les 2 kits.

“Kit” POURQUIER ELISA BVD/MD/BD p80 Anticorps Competition

La protéine p80 est fournie fixée sur les parois de tous les puits des microplaques par l'intermédiaire d'un anticorps monoclonal "WB103" spécifique de la p80:

• Les échantillons à tester sont mis à incuber dans les puits. S'il existe des anticorps spécifiques dans l’échantillon, il se forme des complexes p80-anticorps par lesquels la p80 se trouve masquée.

• Après lavage, un anticorps monoclonal "WB112", dirigé contre un autre épitope de la p80) couplé à une enzyme est mis à incuber. En présence d'anticorps spécifiques du virus dans l’échantillon, la protéine p80 est masquée et le conjugué ne peut pas se fixer sur l'épitope correspondant. Dans le cas contraire, la fixation peut se réaliser.

• Après lavage, le substrat de l'enzyme (TMB) est mis en présence de l'enzyme qui assure sa transformation en un composé bleu devenant jaune après blocage.

L'intensité de la coloration est une mesure de l'inverse du taux en anticorps anti-p80 dans l’échantillon. La limite de positivité est calculée par rapport à un échantillon de contrôle négatif n'induisant aucune extinction, introduit sur chaque plaque.

“Kit” SYNBIOTICS SERELISA BVD p80 Ab Mono Blocking Il utilise une technique immuno-enzymatique monocupule par blocage. La réaction comporte trois étapes :

• Chaque échantillon de sérum ou plasma est distribué dans une cupule sensibilisée avec la protéine p80 (ou p125). Les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon se fixent spécifiquement à l'antigène.

• Après lavage, un conjugué anticorps monoclonal (AcM) anti-p80 (ou -p125) peroxydase est ajouté. Il se fixe sur les sites antigéniques restés libres, formant un complexe : antigène-anti-p80 (ou -p125) peroxydase.

• L'excès de conjugué est éliminé par lavage. L'enzyme liée au complexe est révélée par adjonction d'un substrat qu'elle transforme en un produit coloré.

Les densités optiques correspondantes sont alors enregistrées et s'interprètent de la façon suivante :

• en l'absence d'anticorps dans l'échantillon, une réaction colorée intense sera mise en évidence, du fait de la fixation du conjugué sur les sites antigéniques de la phase solide.

• en présence d'anticorps dans l'échantillon, il y aura moins de conjugué fixé, donc diminution ou absence de réaction colorée.

- 41 -

RT-PCR Principe de la PCR

L’amplification génomique en chaîne (PCR = Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier des séquences d'ADN de manière spécifique et d'augmenter de manière considérable la quantité d'ADN (facteur de 105 à 106) dont on dispose initialement. Après extraction des échantillons biologiques fournis, l'ADN doit impérativement être purifié dans des conditions optimales de qualité et de quantité. La technique comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession de trois phases :

• une phase de dénaturation par la chaleur pour séparer les deux brins d'ADN (92-95°C), qui dure entre 30 secondes et une minute ;

• une phase d'hybridation avec deux amorces spécifiques entre 50-60°C, qui dure elle aussi entre 30 secondes et une minute. Cette température dite d'annealing (accrochage des amorces) est un paramètre important pour la réussite de la PCR. La première amorce se fixe sur un brin d'ADN, l'autre sur le brin complémentaire ;

• une phase d'extension par l'ADN polymérase (ou Taq polymérase, extraite d'une bactérie thermophile, Thermus aquaticus) à partir des amorces, à 70-72°C. La durée de cette phase (une à deux minutes) dépend de la taille du fragment à amplifier.

Cette technique permet une automatisation des différents cycles (dans des appareils appelés thermocycleurs). Le nombre de cycles est généralement compris entre 25 et 40. Les conditions doivent être optimisées en fonction d'un certain nombre de paramètres : concentrations du milieu d’amplification en MgCl2 et amorces, spécificité des amorces, quantité d'ADN matrice, etc. Il existe différents types de PCR :

• la PCR dite "Multiplex", pour amplifier des gènes avec de nombreux exons ou plusieurs gènes différents simultanément. Il est en effet possible d'introduire dans le milieu d'amplification des couples d'amorces spécifiques différentes sans compétition entre ces amorces ;

• la PCR dite "Nested PCR" (PCR nichée), qui fait intervenir une seconde PCR réalisée en utilisant des nouvelles amorces situées à l'intérieur du domaine défini par les amorces de la première PCR et a pour objectif d'améliorer la spécificité ;

• la PCR quantitative, où l'on cherche à estimer le nombre de copies présent dans la séquence cible d'ADN ou d'ARN. La proportionnalité entre le nombre d'amplifications et le nombre de copies n'est valable que pour un nombre de cycles PCR faible.

Particularités de la reverse-transcriptase PCR

La RT-PCR a pour but d’amplifier l’ADN complémentaire d’un fragment d’ARN, elle se déroule en deux phases :

• la première phase correspond à la copie de l'ARN du virus en ADN complémentaire ; • la seconde phase correspond à une réaction PCR classique sur l'ADNc synthétisé.

Dans la première phase, l'ARN à étudier est répéré en utilisant une sonde oligonucléotidique spécifique (amorce 1), qui s'hybride à l'extrémité 3' du brin d'ARN auquel on s'intéresse. Puis, la transcriptase inverse (ou rétrotranscriptase) permet la synthèse du brin complémentaire, sous une forme de ADNc simple brin. Une seconde amorce oligonucléotidique spécifique (amorce 2) permettra la synthèse du second brin par extension.

- 42 -

Dans la seconde phase, l'ADN complémentaire synthétisé servira ensuite de matrice pour une réaction PCR classique. La RT-PCR utilisée dans notre cas est, à priori, capable de reconnaître tous les Pestivirus, du fait de l'utilisation d'une amorce spécifique d'une région commune à toutes les souches (5'UTR, voir la Figure 7).

d) Traitement des Données Les informations (Annexe 7) ont été saisies sur une base de données Access (logiciel de Microsoft®), que nous avons réalisé dans le but de permettre leur traitement statistique à l’aide du logiciel R (http://www.r-project.org). Une cartographie des résultats a été réalisée avec l'aide des données fournies par les FDC (voir les Annexes 8 à 10).

C. Résultats Bien qu’aucun échantillon n’ait répondu positivement aux tests de dépistage, nous décrivons ci-dessous la composition de l’échantillon.

1. Données de l'Etude Les tableaux suivant récapitulent les données (nombre et poids moyens dans chaque catégorie d’âge et de sexe), pour chaque département, concernant les chevreuils d'où provenaient les prélèvements qui ont été analysés dans le cadre de notre étude :

Sexe Réalisation

Mâles Femelles Indéterminé Total

Jeunes 3 8 0 11 Adultes 18 23 0 41 Age

Indéterminé 0 0 1 1 Total 21 31 1 53

Poids Moyen Mâles Femelles Moyenne Jeunes 14,33 14,75 14,64

Age Adultes 22,17 21,48 21,78 D

ON

NE

ES

ET

UD

E J

UR

A

Moyenne 21,05 19,74 19,89

Sexe Réalisation

Mâles Femelles Indéterminé Total

Jeunes 9 12 0 21 Adultes 17 14 0 31 Age

Indéterminé 0 0 0 0 Total 26 26 0 52

Poids Moyen Mâles Femelles Moyenne Jeunes 15,67 14,75 15,14

Age Adultes 23,59 21,86 22,81 D

ON

NE

ES

ET

UD

E L

OIR

E

Moyenne 20,85 18,58 19,71

- 43 -

Sexe

Réalisation Mâles Femelles Indéterminé

Total

Jeunes 4 8 0 12 Adultes 13 21 0 34 Age

Indéterminé 0 0 0 0 Total 17 29 0 46

Poids Moyen Mâles Femelles Moyenne Jeunes 16,25 13,75 14,58

Age Adultes 22,54 21,86 22,12

DO

NN

EE

S E

TU

DE

RH

ON

E

Moyenne 21,06 19,62 20,15 Les données sont détaillées dans un tableau, situé dans l’Annexe 12.

2. Analyses Sérologiques et PCR Sur les 151 sérologies effectuées (53 faites au LDAV du Jura, 52 au LDAV de la Loire et 46 au LDAV du Rhône), tous les animaux testés se sont avérés séronégatifs. Concernant les RT-PCR, qui ont toutes été réalisées à Chambéry (pour éviter toute variabilité due au manipulateur) : les analyses réalisées sur les sérums (pour le Jura et la Loire) et les rates (pour les trois départements) se sont elles aussi révélées négatives. Les résultats sont détaillés dans le tableau de l’Annexe 12.

3. Analyses Statistiques A première vue, les chiffres bruts apparaissent proches, d’abord des tableaux de chasse départementaux, et plus largement de la population vivante en France. Des tests plus précis et plus sensibles vont permettre de vérifier que l'échantillonnage est effectivement correct :

• corrélation entre le nombre d’animaux prélevés dans le cadre de notre étude et celui correspondant au tableau de chasse pour chaque classe d’âge et de sexe, ainsi que les poids moyens dans chaque département, vérifiée à l’aide de tests du Chi² ;

• prélèvement aléatoire sur zones étudiées, qui est vérifié par la localisation des animaux prélevés lors de notre étude, matérialisé par les cartographies que nous avons réalisées avec l’aide des FDC (cf Annexes 8 à 10).

Pour vérifier la première hypothèse, des tests de Chi² sont réalisés entre les données des tableaux de chasse départementaux et les données de l’étude. Ceci est possible car les effectifs dans chaque catégorie sont supérieurs à 5 :

JURA jM jF aM aF I T Effectifs Etude 3 8 18 23 1 53

% 5,6% 15,1% 34% 43,4% 1,9% 100 Effectifs Chasse 478 495 2330 1954 29 5286

% 9% 9,4% 44,1% 37% 0,5% 100 Chi² obs 11,475821 Chi² théo 9,49 DS : 0,05<p<0,01

Poids Etude 14,33 14,75 22,17 21,48 Chi² obs 0,2383753 Poids Chasse 13,64 13,47 21,96 22,83 Chi² théo 7,81 : DNS

- 44 -

LOIRE jM jF aM aF I T

Effectifs Etude 9 12 17 14 0 52 % 17,3% 23,1% 32,7% 26,9% 0 100

Effectifs Chasse 932 871 1744 1426 0 5153 % 18,1% 16,9% 33,8% 27,7% 0 100

Chi² obs 2,3483459 Chi² 7,81 théo DNS Poids Etude 15,67 14,75 23,59 21,86 Chi² obs 0,2586781 Poids Chasse 14,1 13,78 23,12 21,5 Chi² théo 7,81 : DNS

RHÔNE jM jF aM aF I T

Effectifs Etude 4 8 13 21 0 46 % 8,7% 17,4% 28,3% 45,6% 0 100

Effectifs Chasse 334 322 899 829 0 2513 % 13,3% 12,8% 35,8% 33% 0 100

Chi² obs 9,6636248 Chi² théo 7,81 DS : 0,05<p<0,01 Poids Etude 16,25 13,75 22,54 21,86 Chi² obs 0,7665118 Poids Chasse 14,84 14,87 19,89 19,89 Chi² théo 7,81 : DNS

D’après ces tests, nous pouvons noter que :

• dans la Loire, les effectifs et les poids des animaux prélevés lors de notre étude ne présentent pas de différence significative (DNS) avec ceux du tableau de chasse ;

• dans les deux autres départements, les poids des animaux prélevés dans le cadre de l’étude ne présentent également pas de différence significative (DS) avec ceux du tableau de chasse, mais en revanche on note une différence significative (avec 0,01<p<0,05) entre les effectifs de l’étude et ceux du tableau de chasse départemental.

Ainsi, l’échantillonnage dans le département de la Loire est représentatif du tableau de chasse, contrairement aux deux autres départements. Néanmoins, il n’existe pas de biais de sélection d’une catégorie d’individu dans l’échantillon analysé pour ces derniers. Il est aussi nécessaire de rappeler que la chasse représente elle aussi un échantillonnage de la population. Les résultats d’analyse sont négatifs ; toutefois, compte tenu de l’effectif de l’échantillon, on ne peut conclure à une absence totale de l’infection. La prévalence pourrait ne pas être nulle mais très faible (inférieure au seuil de détection autorisé par l’effectif échantillonné). Nous pouvons alors calculer la limite supérieure de la prévalence (p) que pourrait détecter un échantillon de même importance dans les départements étudiés par un intervalle de confiance dissymétrique compris entre 0 et p. En admettant qu’il n’y a pas de différence significative entre les trois échantillon, le calcul de cette prévalence est effectué grâce à la formule simplifiée de calcul de la borne supérieure de l’intervalle de confiance unilatéral à (1-α)% (ici nous prendrons α=95%), selon l’approximation (Toma et al., 2001) :

Nous obtenons grâce à cette formule un intervalle de confiance de [0 ; 2%].

- 45 -

Ainsi, le taux de prévalence des Pestivirus au sein de la population de Chevreuils que nous avons étudié se situe en dessous de 2%. Toutefois, si on admet que les différences entre les trois échantillons sont à prendre à compte, le même calcul aboutirait à une limite supérieure de la prévalence de l’ordre de 6%.

D. Discussion Notre étude avait pour but de confirmer la circulation d’un Pestivirus dans des populations de chevreuils en France. En effet, une étude préliminaire, réalisée dans le cadre d’une thèse vétérinaire (Flamant, 2005) avait démontré la réalité de cette circulation virale. Pour des raisons logistiques, notre étude a été concentrée sur trois départements de l’est de la France dans lesquels cette étude préliminaire n’avait récolté aucun échantillon. Dans ce but, nous avons organisé la récolte et l’analyse de 151 prélèvements réalisés à l’occasion de la campagne de chasse 2005/2006. Malheureusement, les analyses conduites dans les laboratoires vétérinaires des départements ainsi que dans celui de la Savoie, n’ont pas permis de trouver les marqueurs directs ou indirects de l’infection par un pestivirus. Des difficultés ont été rencontrées lors de cette étude et de sa réalisation pratique.

1. Choix de la zone Notre étude a été réalisée sur l'ensemble des trois départements choisis en début d'étude, mais pour lesquels nous n’avions aucune indication de la probabilité d’une circulation locale du Pestivirus. Nous recherchions un nombre de prélèvements suffisant statistiquement, en restant dans les limites fixées par le budget (AN : celui-ci était plafonné à 2000€, avec une part importante et active du bénévolat pour assumer la réalisation de notre étude). Ce type d'étude à visée générale, permettait un premier « état des lieux » mais devait rester suffisant pour mettre en évidence une éventuelle circulation virale. Si les résultats ne permettent pas de conclure à une absence totale de circulation du virus au moment de l’étude, celle-ci montre qu’elle n’a pu qu’être très faible au moment de l’étude.

2. Réalisation pratique de l’échantillonnage Ceux-ci ont été réalisés lors d'action de chasse, standardisés et simplifiés en récoltant uniquement du sérum et la rate de chaque animal. Malgré beaucoup de bonne volonté de la part des préleveurs, ils n'étaient pas toujours d'assez bonne qualité, du fait :

• d'un manque de propreté le plus souvent lors de la collecte : sang ou rate souillés ; • d'une récolte décalée dans le temps par rapport à la mort de l'animal : pour des

raisons pratiques (impossibilité d’interrompre une battue) les cadavres sont souvent restés au moins une demi-journée à température ambiante avant d'être prélevés, et même si en hiver le froid (températures souvent en dessous de 0°C) a permis de conserver les organes, il a pu y avoir une destruction de l'ARN, relativement fragile ;

• de la manipulation, du transport et du stockage des prélèvements : leur conservation au réfrigérateur avant transport au LDAV, ainsi que la minimalisation du nombre des cycles de congélation/décongélation ont permis de réduire les risques de destruction de la matière virulente, sans les exclure.

Nos résultats peuvent donc sous estimer la présence de l’antigène ou des anticorps du fait de perte partielle ou totale des protéines présentes dans les prélèvements réalisés.

- 46 -

3. Techniques d'analyse Les trousses d'analyses utilisées ont été développées exclusivement pour des bovins, ovins ou caprins. Ainsi, lorsqu'on réalise le test chez des chevreuils, pour lesquels nous ne connaissons pas les seuils de positivité (taux et persistance des anticorps chez les infectés), il faut faire l'hypothèse que la sensibilité et la spécificité du test sont égales pour ceux-ci. De plus, la trousse d'analyse anticorps Pourquier comporte deux protocoles de test, suivant qu'on recherche le BVDV (bovins) ou le BDV (ovins ou caprins). Un choix a donc du être effectué, difficile du fait que les chevreuils présentent beaucoup d'analogies avec les petits ruminants, mais sachant que les pestivirus de la faune sauvage sont plutôt de type BVDV (Annexe 2). Ensuite, de même que pour tous les tests, ceux-ci comportent une sensibilité et une spécificité intrinsèque, si nous n’avons pas été confronté à la présence de (faux) positifs (reconnaissance d'un virus similaire, ou d'un élément quelconque comme antigène ou anticorps), en revanche, on ne peut exclure dans notre echantillon, la présence de faux négatifs (manque de detectabilité : perte d'information, destruction des anticorps ou antigènes suite à une mauvaise manipulation, au transport ou au stockage des prélèvements, ou manque de sensibilité d’un test inadapté à l'espèce). Enfin, il existe une variabilité intrinsèque, la reproductibilité, due aux plaques, aux puits, au lecteur de densité optique utilisés dans chaque laboratoire, ainsi qu'au manipulateur, qui est non négligeable et a pu modifier l'interprétation des résultats, toujours dans le sens de la non détection de réponses positives au test. Finalement, les analyses se sont toutes révélées négatives. En admettant que ce résultat ne soit pas attribuable à la méthode, deux types d’interprétation sont possibles :

• soit la prévalence d’un Pestivirus est effectivement nulle, le virus n'était pas présent dans les départements étudiés au moment de l’étude. Le virus pourrait toutefois évoluer par vagues, mais dans ce cas, les chevreuils âgés seraient porteurs d’anticorps. Il serait alors bon de veiller à inclure dans l’échantillon une proportion suffisante de chevreuils âgés lors de futures éventuelles analyses ;

• soit un virus de ce type était présent mais circule avec une prévalence très faible, impossible à détecter lors de notre étude du fait d'un manque d'effectif. Il serait ainsi à ce moment là plus logique d’augmenter la probabilité de détection d’un virus rare, en effectuant les tests sur des animaux trouvés morts ou malades, avec des signes cliniques caractéristiques. Il pourrait être recommandé d’effectuer de façon systématique la recherche d’un Pestivirus sur les chevreuils atteints de syndromes diarrhéiques, en mauvaise condition physique et pour lesquels une autre cause de mort n’a pu être mise en évidence.

- 47 -

CONCLUSION

Le phénomène appelé en France « Mortalité Anormale du Chevreuil (MAC) » reste, à l'heure actuelle, et malgré les différentes études qui ont été mises en place, inexpliqué. Parmi les hypothèses infectieuses envisageables, les pestiviroses ont retenu notre attention, du fait de leur large distribution dans la faune sauvage, mais aussi et surtout de leurs signes cliniques évocateurs (en particulier entérite catarrhale et érosion buccale) et de l'état immunodépressif (dû à une lymphadénie), compatible avec des causes de mort très variées et une sensibilité accrue aux agents bactériens ou parasitaires d’ordinaire peu pathogènes, dont elles sont responsables. Notre étude faisait suite à un premier travail réalisé par Sandrine Flamant en 2005; notre étude avait un but d'approfondissement de l’enquête précédente, de façon à cibler trois départements: le Jura, la Loire et le Rhône. Cette enquête, descriptive, comprenait la collecte de matériel biologique, la réalisation de tests de recherche d'anticorps et de RT-PCR réalisés par les laboratoires départementaux d'analyse vétérinaire des départements collectés et le LDAV de Savoie, ainsi que l'analyse des résultats. Ceux-ci portaient sur des sérums et des rates, prélevés sur des animaux tués en action de chasse, avec l'aide des fédérations départementales des chasseurs du Jura, de la Loire et du Rhône et des associations locales de chasse. A l'issue de cette investigation, aucun chevreuil en bonne santé tiré à la chasse ne présentait de signe d'une exposition à l'infection par un pestivirus. Ceci ne permet pas d'exclure une circulation de l'agent pathogène, qui peut se propager avec une faible incidence. Si ce virus a pu jouer un rôle dans la MAC, celui-ci devra être mis en évidence par un renforcement du suivi des cas cliniques (surveillance passive par le réseau SAGIR) et un dépistage des anticorps sur des chevreuils âgés.

- 48 -

- 49 -

BIBLIOGRAPHIE

Aguirre, A. A., C. Brojer et T. Mörner (1999). "Descriptive epidemiology of roe deer mortality in Sweden." Journal of Wildlife Disease 35(4): 753-762. Aguirre, A. A., D. S. Hansen, E. E. Starkey et R. G. McLean (1995). Serologic Survey of Wild Cervids for Potential Disease Agents in Selected Parks in United States. Preventive Veterinary Medicine. 21: 313-322. Anonyme (1997-2005). Articles "Lettre SAGIR". Lettre SAGIR, Pixérécourt, 54220 Malzeville. Arnal, M., D. Fernandez de Luco, L. Riba, M. Maley, J. Gilray, K. Willoughby, S. Vilcek et P. F. Nettleton (2004). A Novel Pestivirus associated with Deaths in Pyrenean Chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica). Journal of Genetic Virology. 85: 3653-3657. Artois, M., H. Ferté, M. E. Terrier et D. Delorme (2001). Documents dactylographiés : « Dossier EMAC: Protocoles, Appel d'Offres, Rapport d'Etape, Résultats EMAC », Unité MIPI, Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, 1, avenue Bourgelat, 69280 Marcy l’Etoile. Avalos-Ramirez, R., M. Orlich, H. J. Thiel et P. Becher (2001). Evidence for the Presence of Two Novel Pestivirus Species. Virology. 286(2): 456-465. Baradel, J. M., J. Barat, J. Blancou, J. M. Boutin, C. Chastel, G. Dannacher, D. Delorme, Y. Gerard, J. M. Gourreau et U. Kihm (1988). Results of a Serological Survey of Wild Mammals in France Revue Scientifique et Technique OIE. 7: 873-883. Barett, P. et D. MacDonald (1995). Guide Complet des Mammifères de France et d'Europe, Delachaux et Niestlé: 208-210, Planche 39. Becher, P., R. Avalos-Ramirez, M. Orlich, S. C. Rosales, M. König, M. Baroth, M. Schweizer, H. Stalder, H. Schirrmeier et H. J. Thiel (2003). Genetic and Antigenic Characterization of Novel Pestivirus Genotypes: Implications for Classification. Virology. 311(1): 96-104. Becher, P., M. König, D. J. Paton et H. J. Thiel (1995). Futher Characterization of Border Disease Virus Isolates: Evidence for the Presence of more than Three Species within the Genus Pestivirus. Virology. 209: 200-206. Becher, P., M. Orlich, A. Kosmidou, M. König, M. Baroth et H. J. Thiel (1999). Genetic Diversity of Pestiviruses: Identification of Novel Groups and Implications for Classification. Virology. 262(1): 64-71. Becher, P., M. Orlig, M. König et H. J. Thiel (1999). Nonhomologous RNA recombination in Bovine Viral Diarrhea Virus: Molecular Characterization of a Variety of Subgenomic RNAs isolated during an Outbreak of Fatal Mucosal Disease. Journal of Virology. 73: 5646-5653. Becher, P., M. Orlig, A. Shannon, G. Horner, M. König et H. J. Thiel (1997). Phylogenetic Analyses of Pestiviruses from Domestic and Wild Animals. Journal of General Virology. 78: 1357-1366. Boisaubert, B. et J. M. Boutin (1988). Le Chevreuil, Hatier, Paris, 236 p. Cacard, B. (2004). La Mortalité du Chevreuil (Capreolus Capreolus) en France Thèse de Doctorat Vétérinaire. Alfort: 170p. Carsuzaa, J. H. B. (1998). Les Principales Méthodes de Recensement des Populations de Chevreuils. Thèse de Doctorat Vétérinaire. Toulouse: 157p. Caruette, P., P. Etienne et M. Mailler (2004). Le Chevreuil, Delachaux et Niestlé, 192 p. Citterio, C. V., C. Luzzago, M. Sala, G. Sironi, P. Gatti, A. Gaffuri et P. Lanfranchi (2003). Serological Study of a Population of Alpine Chamois (Rupicapra rupicapra) affected by an Outbreak of Respiratory Disease. Veterinarian Research. 153: 592-596. Collectif (1987). Faune Sauvage d'Europe - Surveillance Sanitaire & Pathologie des Mammifères & des Oiseaux, ITSV, Paris, Rosset R. (Ed), N° Spécial Faune Sauvage 96-99: 77-83, 209-215. Collectif (1993). La BVD-MD, Bulletin des GTV, (4), 126 p. Collectif (2005). 6th ESVV Pestivirus Symposium Abstractbook. ESVV Pestivirus Symposium, Thun, Switzerland, 125 p. Collectif (2005). Special BVD. Preventive Veterinary Medicine. 72(1-2): 219p. Cornish, T., A. V. Olphen, J. Cavender et J. Edwards (2003). Herd Health Survey and Isolation of a New Pestivirus on Pronghorn Antelope (Antilocapra americana) in Wyoming. Widlife Disease Association Conference, Saskatoon. Couvillion, C. E., E. W. Jenney, J. E. Pearson et M. E. Cocker (1980). Survey for Antibodies to Viruses of BVD, Blue-Tongue and Epizzotic Hemorragic Disease in Hunter Killed Mule Deer in New Mexico. Journal of American Veterinary Medicine Association. 177: 790-791. Cuteri, V., S. Diverio, P. Carnieletto, C. Turilli et C. Valente (1999). Serological Survey for Antibodies against Selected Infectious Agents among Fallow Deer (Dama dama) in Central Italy. Zentralblatt für Veterinärmedizin Reihe B. 46(8): 545-549. Diaz, R., M. Steen, C. Rehbinder et S. Alenius (1988). An Outbreak of a Disease in Farmed Fallow Deer (Dama dama) resembling BVD-MD. Acta Veterinaria Scandinavia. 29: 369-376. Doyle, L. G. et W. P. Heuschele (1983). Bovine Viral DiarhheaVirus Infection un Captive Exotic Ruminants. Journal of Vetrinary Medicine

- 50 -

Association. 183(11): 1257-1259. Elazhary, M. A. S. Y., R. S. Roy et J. L. Frechette (1979). Serological Evidence of IBR and BVD Infection in Caribou (Rangifer taraudus). Veterinary Record. 105: 336. Euzenat, K. (2004). Causes de Mortalité et de Morbidité du Chevreuil en Suisse, Etude Rétrospective (1992-2002). Thèse de Doctorat Vétérinaire. Nantes: 104p. Ferté, H., D. Cleva, J. Depaquit, S. Gobert et N. Leger (2000). "Status and origin of Haemonchinae (Nematoda: Trichostrongylidae) in deer: a survey conducted in France from 1985 to 1998." Parasitology Research 86(7): 582-587. Fischer, S., E. Weiland et K. Frölich (1998). Characterization of a Bovine Viral Diarrhea Virus isolated from Roe Deer in Germany. Journal of Wildlife Disease. 34(1): 47-55. Flamant, S. (2005). Les Pestiviroses dans les Populations de Chevreuils (Capreolus capreolus) en France. Thèse de Doctorat Vétérinaire. Lyon: 72p. Frölich, K. (1995). Bovine Virus Diarrhea and Mucosal Disease in Free-Ranging and Captive Deer (Cervidae) in Germany. Journal of Wildlife Disease. 31(2): 247-250. Frölich, K. et E. J. Flach (1998). Long-Term Viral Serology of Semi-Free-Living and Captive Ongulate. Journal of Zoo and Widlife Medicine. 29(2): 165-170. Frölich, K. et M. Hofmann (1995). Isolation of Bovine Viral Diarrhea Virus-like Pestiviruses from Roe Deer (Capreolus capreolus). Journal of Wildlife Disease. 31(2): 243-246. Frölich, K., S. Jung, A. Ludwig, D. Lieckfeldt, P. Gibert, D. Gauthier et H. Hars (2005). Detection of a Newly Described Pestivirus of Pyrenean Chamois (Rupicapra pyrenaica pyrenaica) in France. Journal of Wildlife Diseases. 41(3): 606-610. Frölich, K., S. Thiede, T. Kozikowski et W. Jakob (2002). A Review of Mutual Transmission of Important Infectious Disease between Livestock and Widlife in Europe. Annual New-York Academy Science. 969: 4-13. Gaillard, J.-M. (1988). Contribution à la Dynamique des Populations de Grands Mammifères: Exemple du Chevreuil (C. capreolus). Thèse de Doctorat (1988-124). Université Lyon 1: 349p. Gourreau, J. M., B. Garin-Bastuji, A. Simon, C. Sarrazin et J. Oudar (1993). Enquête Sérologique sur l'Etat des Grands Ongulés du Centre et du Sud des Alpes Françaises. Revue Scientifique et Technique OIE. 12(1): 151-152. Hamblin, C. et R. S. Hedger (1979). The Prevalence of Antibodies to Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease Virus in African Wildlife. Comparison Immunology Microbiology and Infectious Disease. 2: 295-303. Hurtado, A., G. Aduriz, N. Gómez, B. Oporto, R. A. Juste, S. Lavin, J. R. Lopez-Olvera et I. Marco (2004). Molecular Identification of a New Pestivirus Associated with Increased Mortality in the Pyrenean Chamois (Rupicapra pyrenaica) in Spain. Journal of Wildlife Diseases. 40(4): 796-800. Karstadt, L. H. (1981). Bovine Viral Diarrhea in Infectious Disease of Wild Mammals, Iowa State University Press: 209-213. Kingscote, B. F., W. D. G. Yates et G. B. Tiffin (1987). Diseases of Wapiti Utilizing Cattle Range in Southwestern Alberta. Journal of Wildlife Disease. 23(1): 86-91. Krametter, R., S. S. Nielsen, A. Loitsch, W. Froetscher, V. Benetka, K. Moestl et B. W. (2004). Pestivirus Exposure in Free-living and Captive Deer in Austria. Journal of Wildlife Diseases. 40(4): 791-795. Lamarque, F., J. Barrat, C. Hatier et M. Artois (1999). Causes of Mortality in Roe Deer (Capreolus Capreolus) diagnosed by an Epidemiological Surveillance Network in France. Gibier Faune Sauvage: 101-122. Larouère, J. (2000). Densité de Population chez le Chevreuil. Etude Bibliographique. Thèse de Doctorat Vétérinaire. Lyon: 77p. Le Tallec, B. (2005). Communication personnelle, diaporama : « Virologie des Pestivirus - Diagnostic et Diversité »: 24p. Lefèvre, P. C., J. Blancou et R. Chermette (2003). Principales Maladies Infectieuses et parasitaires du Bétail. Europe et Région Chaudes. Tome 1. Généralités. Maladies Virales, 764 p. Lillehaug, A., T. Vikøren, I.-L. Larsen, J. Akerstedt, J. Tharaldsen et K. Handeland (2003). Antibodies to Ruminant Alpha-Herpesviruses and Pestiviruses in Norwegian Cervids. Journal of Wildlife Diseases. 39(4): 779-786. Mac Martin, D. A., D. R. Snodgrass et W. Corrigal (1977). Bovine Viral Diarrhea in Scottish Red Deer. Veterinary Record. 100: 187. Meyers, G. et H. J. Thiel (1996). Molecular Characterization of Pestiviruses. Advances in Virus Research. 47: 53-118. Morton, J. K., J. F. Evermann et R. A. Dietrich (1990). Experimental Infection of Reindeer with Bovine Viral Diarrhea Virus. Rangifer. 10: 75-77. Mouron, D. (1997). Le Réseau de Correspondants "Cervidés-Sanglier". Bulletin Mensuel ONC. 218: 10-13. Mouron, D., B. Boisaubert, D. Delorme et D. Maillard (1997). Utilisation Simultanée de l'Indice Kilométrique et des Bio-Indicateurs. Son Intérêt pour le Suivi des Populations de Chevreuils. Bulletin Mensuel ONC. 223: 22-25.

- 51 -

Nettleton, P. F. et J. A. Herring (1980). Isolation of Bovine Virus Diarrheoa Virus from a Scottish Red Deer. Veterinary Record. 107: 425-426. Nielsen, S. S., L. Roensholt et V. Bitsch (2000). Bovine Virus Diarrhea Virus in Free-Living Deer from Denmark. Journal of Wildlife Diseases. 36(3): 584-587. O.N.C. (1993). Le Chevreuil, Office National de la Chasse, 32 p. O.N.C. (1999). La Gestion des Populations de Chevreuils par l'Utilisation d’Indicateurs Population-Environnement (Fiche Technique n°95). Bulletin Mensuel ONC. 244: 6p. O.N.C. (1999). Suivi des Populations de Chevreuils. Bulletin Mensuel ONC. 244: 54-59. Olafson, P., A. D. Mac Callum et A. Fox (1946). An Apparently New Transmissible Disease of Cattle. Cornell Vet. 36: 205-213. Plant, J. W., I. E. Lilttlejohns, A. C. Gardiner, J. T. Vantsis et A. Huck (1973). Immunological Relashionship between Border Disease, Mucosal Disease and Swine Fever. Veterinary Record. 92: 455-461. Richards, S. H., I. A. Shipper et F. Eleveth (1956). Mucosal Diseases of Deer. Veterinary Medicine: 358-362. Ridpath, J. (2003). BVDV Genotypes and Biotypes: Practical Implications for Diagnosis and Control. Biologicals. 31: 127-131. Riekerink, R. G. M. O., A. Dominici, H. W. Barkema et A. J. de Smit (2005). Seroprevalence of Pestivirus in four Species of Alpine Wild Ungulates in the High Valley of Susa, Italy. Veterinary Microbiology. 108: 297-303. Romvary, J. (1965). Incidence of Virus Diarrhoea among Roes. Acta Veterinary Hungary: 451-455. Rozo, J. (1995). Bilan des Enquêtes Sérologiques réalisées en France chez quelques Espèces de Mammifères Sauvages. Thèse de Doctorat Vétérinaire. Nantes: 96p. Saudan, M. (2000). Corrélation entre Facteurs Ecogéographiques et Capacité de Soutien chez le Chevreuil (Capreolus capreolus) dans le Valais. Postgrade "Systématique et Gestion de la Biodiversité" Faculté des Sciences. Lausanne: 33p. Simpson, V. R. (2002). Wild Animals as Reservoirs of Infectious Diseases in the UK. The Veterinary Journal. 163: 128-146. Stuen, S., I. Krogsrud, B. Hyllseth et N. J. C. Tyler (1993). Serosurvey of Three Virus Infections in Reindeer in Northern Norway and Svalbard. Rangifer. 13: 215-219. Terrier, M. E. (2006). Documents réseau SAGIR. AFSSA Nancy, Pixérécourt, 54220 Malzeville. Tessaro, S. V., S. Carman et D. Deregt (1999). Viremia and Virus Shedding in Elk infected with Type 1 and Virulent Type 2 Bovine Viral Dirrhea Virus. Journal of Wildlife Disease. 35(4): 671-677. Thorsen, J. et J. P. Henderson (1971). Survey for Antibody to Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR), Bovine Viral Diarrhea (BVD) and Parainfluenza 3 (PI3) in Moose Sera. Journal of Wildlife Disease. 7: 93-95. Toma, B., B. Dufour et R. Pouillot (2001). "Conditions nécessaires pour considérer un territoire indemne d’une maladie animale." Epidémiologie et santé animale 40: 111-128. Van Campen, H., K. Frölich et M. Hofmann (2001). Pestivirus Infections. Infectious Diseases of Wild Mammals. 3rd Edition. E. S. Williams et I. K. Barker, The Veterinary Press, Manson Publishing, London: 558p. Van Campen, H., J. Ridpath, E. S. Williams, J. Cavender, J. Edwards, S. Smith et H. Sawyer (2001). Isolation of Bovine Viral Diarrhea Virus from a Free-Ranging Mule Deer in Wyoming. Journal of Wildlife Disease. 37(2): 306-311. Van Campen, H., E. S. Williams, J. Edwards, W. Cook et G. Stout (1997). Experimental Infection of Deer with Bovine Viral Diarrea Virus. Journal of Wildlife Disease. 33(3): 567-573. Vilcek, S., P. F. Nettleton, D. J. Paton, B. Durkovic, L. G. Strojny, A. Moussa, A. Loitsch, W. Rossmanith, S. Vega et M. T. Scicluna (2001). Bovine Viral Diarrhoea Virus Genotype 1 can be separated into at least Eleven Genetic Groups. Arch. Virology. 146: 99-115. Vilcek, S., J. Ridpath, H. Van Campen, J. Cavender et J. Warg (2005). Characterization of a Novel Pestivirus Originating from a Proghorn Antelope. Virus Research. 108: 187-193. Adresses Internet consultées le 15 septembre 2006 : F.N.C. (2006). http://www.chasseurdefrance.com/reglementation/dates/dates_ouverture_chasse_2005.pdf, http://www.chasseurdefrance.com/DP_FNC_06_09_2005_ETAT_GIBIER.pdf. et http://www.chasseurdefrance.com/RESEAU_SAGIR.pdf. Martineau, D. (2001). Pathologie de la Faune et de l'Environnement (http://www.medvet.umontreal.ca/PDF/patho_faune.pdf): 101-105. O.N.C.F.S. (2006). http://www.oncfs.gouv.fr/events/. U.R.G.T.V.Bretagne et LDA22. (2003). http://www.zoopole.com/ispaia/urgtv2003/doc/eaph.pdf.

- 52 -

ANNEXES

ANNEXE 1 : PARTICIPANTS AUX PROTOCOLES EMAC ...................................................................... 54 ANNEXE 2 : ARBRE PHYLOGENETIQUE DES PESTIVIRUS BASE SUR LA SEQUENCE NPRO... 55 ANNEXE 3 : LEGENDES DES ANALYSES SAGIR (ORIGINE DE MORTALITE)................................ 56 ANNEXE 4 : RESUME DES PARTICIPANTS A L'ETUDE PESTIVIRUS................................................ 57 ANNEXE 5 : ANATOMIE DU CHEVREUIL ET PRELEVEMENTS ......................................................... 58 ANNEXE 6 : FICHE D'IDENTIFICATION (COMMEMORATIFS)........................................................... 59 ANNEXE 7 : SAISIE DES INFORMATIONS................................................................................................. 60 ANNEXE 8 : LOCALISATION DES PRELEVEMENTS DANS LE JURA ................................................ 61 ANNEXE 9 : LOCALISATION DES PRELEVEMENTS DANS LA LOIRE.............................................. 62 ANNEXE 10 : LOCALISATION DES PRELEVEMENTS DANS LE RHONE .......................................... 63 ANNEXE 11 : METHODES D'ANALYSES .................................................................................................... 64 ANNEXE 12 : DETAILS DES CHEVREUILS ANALYSES LORS DE NOTRE ETUDE.......................... 65

- 53 -

ANNEXE 1 : PARTICIPANTS AUX PROTOCOLES EMAC 1) Protocole EMAC 1999

2) Protocole EMAC 2000

- 54 -

ANNEXE 2 : ARBRE PHYLOGENETIQUE DES PESTIVIRUS BASE SUR LA SEQUENCE NPRO (Collectif, 2005), d'après H.P. Stalder et al.

- 55 -

ANNEXE 3 : LEGENDES DES ANALYSES SAGIR (ORIGINE DE MORTALITE) Les différentes catégories d'origine de mortalité correspondent à ces différents intitulés : Traumatique Traumatisme quelconque, Prédation, Tir, Route, Combats, Chiens, Hernie, Chute et Dérochement, Strangulation, Fausse Déglutition, Piège, Eventration Cardio-Respiratoire et Circulatoire Infection Respiratoire, Pasteurellose (souvent broncho-penumonie, mais parfois septicémie avec congestion généralisée…), Parasitisme Pulmonaire, Aspergillose, Infection Cardiaque, Babésiose, Hémorragie, Syndrome Hémorragique, Troubles De La Fonction Circulatoire, Anémie, Accident Cardiaque, Oestrose Massive Environnementale Orphelin, Mort De Faim, Animal Agé, Misère Physiologique, Epuisement, Cachexie, Noyade Toxique Acidose Ou Alimentation, Intoxication Quelconque ou par Toxique Convulsivant, Bromadiolone, Anticoagulants, Glands, Inhibiteurs des Cholinestérases, Buis Uro-Génitale Néphrite, Infection Génitale, Dystocie, Malformation, Infection Rénale, Leptospirose, Occlusion Urétrale, Métrite Nerveuse, Oculaire et Comportementale Infection Nerveuse ou Cérébelleuse, Rage, Encéphalite, Kératite, Listériose, Paralysie, Animal Aveugle, Kérato-conjonctivite, Comportement Anormal Général Euthanasie, Septicémie, Septicopyoémie, Phlegmon, Leucose, Péritonite, Tumeur, Salmonellose, Surinfection, Abcès, Maladie des Abcès ou Maladie Caséeuse, Gangrène, Tuberculose, Polyarthrite, Toxémie de Gestation, Staphylococcie, Polyparasitisme, Pseudotuberculose, Stress Digestif Enterotoxémie, Parasitisme, Parasitisme Digestif, Colibacillose, Coccidiose, Infection Digestive, Diarrhée, Occlusion Intestinale, Actinomycose Dermato Dermatose, Gale, Parasitisme Externe Indéterminé Indéterminée, A Rechercher, Impossible à Déterminer Suivi Etat Sanitaire = animaux tués à la chasse ou piégés et apportés au LVD pour une recherche particulière (ex : échinococcose) ou pour expliquer des lésions observées par le chasseur (ex : abcès sous cutanés, dépilation, …)

- 56 -

ANNEXE 4 : RESUME DES PARTICIPANTS A L'ETUDE PESTIVIRUS Mon rôle consistait à exposer le protocole à chacun (ainsi qu'à répondre aux différentes interrogations), à coordonner tout le monde et à vérifier que tout se déroulait comme prévu.

Fiches d'identification Matériel à prélèvement

LDA 73

PCR

LDAV locaux

Sérologies ELISA

ITD du réseau

SAGIR

ACCA

Fédération Départementale

des Chasseurs

ONCFS

(Jura, Rhône)

Bordereau d'accompagnement Fiches d'identification

Conditionnement protecteur étanche Envois congelés (-20°C)

Les flèches correspondent aux relations existant entre les différents protagonistes (échange d'informations, envois de matériel ou de prélèvements).

- 57 -

ANNEXE 5 : ANATOMIE DU CHEVREUIL ET PRELEVEMENTS (trouvé sur http ://www.chevreuil.net/Denis_Harvey.htm, chevreuil américain dont l'anatomie est comparable) Mettre des gants pour effectuer les prélèvements et se protéger à l'aide de blouses plastiques fournies. 1) Prélèvement du sang Récupérer du sang des jugulaires (grosses veines du cou) ou du cœur (cf éviscération), à l'aide de seringues 10ml et d'aiguilles, et le placer dans un tube sec avec gel séparateur (ou au pire égorger et faire goutter le sang dans les tubes). Ne surtout pas prendre le sang contenu dans la cavité abdominale.

2) Prélèvement de rate Lors de l'éviscération, prendre soin de prélever la rate intacte (non explosée par une balle, voir schéma pour sa localisation) avec le scalpel fourni, et la placer dans un pot à prélèvement de 500 ml. La cage thoracique contient les poumons et le cœur, protégés par les côtes. Le diaphragme est la paroi flexible qui sépare la cage thoracique de l’abdomen. Dans l’abdomen, on trouve les 4 compartiments gastriques, dont le plus gros est le rumen. Accolé sur la paroi externe gauche du rumen se trouve la rate, un organe foncé plus ou moins sphérique et de grosseur très variable chez le chevreuil. Il ne faut pas confondre la rate avec le foie, qui est plus gros et à droite du rumen. Les reins sont attachés sur le fond de l’abdomen et sont normalement recouverts d’une épaisse couche de gras. Dans la partie arrière de l’abdomen, on peut aussi localiser la vessie. Chez une femelle, vous pourrez facilement visualiser l’utérus et les deux ovaires sous la vessie.

Informations supplémentaires Bien remplir la fiche d’identification, et la joindre aux prélèvements. Inscrire le numéro de la fiche d’identification renseignée (coin supérieur droit) avec le marqueur noir sur le tube de sang et le pot à prélèvement (même numéro pour les deux prélèvements effectués sur le même animal).

- 58 -

ANNEXE 6 : FICHE D'IDENTIFICATION (COMMEMORATIFS)

- 59 -

ANNEXE 7 : SAISIE DES INFORMATIONS

- 60 -

ANNEXE 8 : LOCALISATION DES PRELEVEMENTS DANS LE JURA

- 61 -

ANNEXE 9 : LOCALISATION DES PRELEVEMENTS DANS LA LOIRE

- 62 -

ANNEXE 10 : LOCALISATION DES PRELEVEMENTS DANS LE RHONE

- 63 -

ANNEXE 11 : METHODES D'ANALYSES 1) Principe de la réaction ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) (trouvé sur http ://www.microbes-edu.org/etudiant/methodediag.html) Formation d’un complexe antigène-anticorps (Ag-Ac) : Phase 1 : - Ag connu (réactif commercial) adsorbé sur un support plastique (plaque avec puits) - Sérum supposé contenir les anticorps recherchés, qui se fixent sur l’Ag connu Phase 2 : - Lavage puis Ac anti-Ag connu qui se fixe sur les Ag connus libres Détection du complexe Ag-Ac connu par fixation d’un Ac marqué : - par une enzyme (méthode immuno-enzymatique) - par une molécule fluorescente (immuno-fluorescence) 2) Méthode RT-PCR (reverse transcriptase) (trouvé sur http ://www.dr-addie.com/French/rtpcrfr.htm)

- 64 -

ANNEXE 12 : DETAILS DES CHEVREUILS ANALYSES LORS DE NOTRE ETUDE

Chevreuil Numéro Labo Bracelet Date capture Département INSEE Sexe Poids Age Sérologie RT-PCR sérum RT-PCR rate39-01 R12076/38 5595 14/01/2006 Jura Villards d'Heria Mâle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-02 R12076/2 69856 24/10/2005 Jura Clairvaux les Lacs Femelle 13 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-03 R12076/5 (R12383) 82162 02/11/2005 Jura Sarrogna Mâle 18 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-04 R12076/52 2744 28/01/2006 Jura Saint Germain les Arlay Femelle 19 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-05 R12076/51 2742 28/01/2006 Jura Saint Germain les Arlay Femelle 16 Jeune Négatif Négatif Négatif 39-06 R12076/6 2739 05/11/2005 Jura Saint Aubin Mâle 20 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-07 R12076/1 4070 22/10/2005 Jura Retthouse Femelle 20 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-08 R12076/7 (R12671) 82165 09/11/2005 Jura Vers sous Sellières Femelle 7 Jeune Négatif Négatif Négatif 39-09 R12076/35 5457 11/01/2006 Jura Sarrogna Femelle 18 Jeune Négatif Négatif Négatif 39-10 R12076/17 (R13035) 70558 18/11/2005 Jura Chaux des Crotenay Mâle 10 Jeune Négatif Négatif pas de rate 39-11 R12076/3 4227 30/10/2005 Jura Baresia sur Ain Femelle 20 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-12 R12076/24 82172 28/11/2005 Jura Chatenois Mâle 18 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-13 R12076/4 4039 29/10/2005 Jura Poligny Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-14 R12076/27 (R13638) 05/12/2005 Jura Gatey Femelle 15 Jeune Négatif Négatif Négatif 39-15 R12076/50 5533 29/01/2006 Jura Lect Mâle 20 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-16 R12076/31 1010 18/12/2005 Jura Sellières Mâle 19 Jeune Négatif Négatif Négatif 39-17 R12076/32 1009 18/12/2005 Jura Sellières Femelle 21 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-18 R12076/29 1008 04/12/2005 Jura Sellières Femelle 20 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-19 R12076/14 2451 11/11/2005 Jura Loulle Femelle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-20 R12076/15 2452 11/11/2005 Jura Loulle Femelle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-21 R12076/33 568 08/01/2006 Jura Frasne Mâle 23 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 39-22 R12076/28 797 05/12/2005 Jura Saint Aubin Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-23 R12076/40 876 08/01/2006 Jura Dampierre Mâle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-24 R12076/34 387 08/01/2006 Jura Chevigny Mâle 21 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-25 R12076/53 2457 29/01/2006 Jura Mantry Femelle 25 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-26 39-27 39-28 39-29 R12076/25 1802 26/11/2005 Jura Chaussenans Femelle 19 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-30 39-31 39-32 39-33 R12076/13 3849 13/11/2005 Jura Augea Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-34 R12076/11 3859 13/11/2005 Jura Cuisia Femelle 15 Jeune Négatif Négatif Négatif 39-35 R12076/12 3873 13/11/2005 Jura Mathenay Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-36 R12076/20 2932 20/11/2005 Jura Poids de Fiole Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-37 R12076/10 3335 13/11/2005 Jura Meussia Femelle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-38 R12076/44 3237 22/01/2006 Jura Loulle Femelle 15 Jeune Négatif Négatif Négatif 39-39 R12076/30 2928 17/12/2005 Jura Nogna Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-40 39-41 R12076/23 4811 19/11/2005 Jura Chaux des Crotenay Femelle 18 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-42 R12076/49 29/01/2006 Jura La Rixouse Mâle 14 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 39-43 R12076/8 5530 12/11/2005 Jura Lavancia Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-44 R12076/9 4498 06/11/2005 Jura Maynal Femelle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-45 R12076/26 5587 25/11/2005 Jura Villards d'Heria Mâle 19 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-46 R12076/16 5625 13/11/2005 Jura Lavancia Mâle 25 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-47 R12076/21 2694 05/11/2005 Jura Plainoiseau Mâle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-48 R12076/22 5356 19/11/2005 Jura Legna Femelle 22 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 39-49 R12076/19 5246 20/11/2005 Jura Villechantria Mâle 25 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-50 R12076/18 5160 19/11/2005 Jura Aromas Mâle 27 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-51 R12076/48 4197 28/01/2006 Jura Nancuise Mâle 18 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-52 R12076/36 4095 14/01/2006 Jura Gigny Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-53 R12076/37 4084 14/01/2006 Jura Gigny Mâle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-54 39-55 39-56 39-57 39-58 39-59 39-60 R12076/41 1132 21/01/2006 Jura Aumont Femelle 15 Jeune Négatif Négatif Négatif 39-61 R12076/42 1904 21/01/206 Jura Poligny Inconnu NC Inconnu Négatif Négatif Négatif 39-62 R12076/47 1341 29/01/2006 Jura Mathenay Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-63 R12076/46 28/01/2006 Jura Charcier Mâle 21 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-64 R12076/39 2971 21/01/2006 Jura Verges Mâle 25 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-65 39-66 R12076/45 4958 25/01/2006 Jura Saint Amour Mâle 26 Adulte Négatif Négatif Négatif 39-67 R12076/43 22/01/2006 Jura Thoiria Femelle 17 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-01 64738 14/10/2005 Loire Champoly Femelle 10 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-02 14/11/2005 Loire Renaison Femelle 15 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-03 64742 11/11/2005 Loire Les Salles Mâle 10 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 42-04 42-05 42-06 42-07 1625 19/11/2005 Loire Saint Jean Soleymieux Mâle 25 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-08 1634 05/11/2005 Loire Saint Jean Soleymieux Mâle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-09 1640 05/11/2005 Loire Saint Jean Soleymieux Mâle 21 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-10 1631 05/11/2005 Loire Saint Jean Soleymieux Femelle 20 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-11 1555 25/02/2006 Loire Le Chambon Feugerolles Femelle 18 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-12 42-13 2395 11/02/2006 Loire Saint Marcel d'Urfé Mâle 25 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-14 1042 12/11/2005 Loire Saint Marcel d'Urfé Femelle 17 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-15 2436 11/11/2005 Loire Saint Martin la Sauveté Mâle 24 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 42-16 2418 12/11/2005 Loire Saint Martin la Sauveté Femelle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-17 1063 12/11/2005 Loire Saint Martin la Sauveté Femelle 14 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-18 2437 13/11/2005 Loire Saint Martin la Sauveté Femelle 20 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-19 2300 11/11/2005 Loire Champoly Mâle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-20 11/12/2005 Loire Champoly Femelle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-21 pas de sérum pas de sérum Négatif 42-22 2301 13/11/2005 Loire Champoly Femelle 25 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-23 1014 19/11/2005 Loire Saint Didier sur Rochefort Femelle 12 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-24 2320 03/12/2005 Loire Saint Didier sur Rochefort Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif

- 65 -

42-25 2331 10/12/2005 Loire Saint Didier sur Rochefort Mâle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-26 1010 03/12/2005 Loire Saint Didier sur Rochefort Mâle 12 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-27 2492 14/01/2006 Loire Saint Sixte Femelle 20 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-28 1089 12/11/2005 Loire Saint Sixte Femelle 12 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-29 1086 12/11/2005 Loire Saint Sixte Femelle 18 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-30 2489 14/01/2006 Loire Saint Sixte Mâle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-31 2354 19/11/2005 Loire Saint Georges en Couzan Mâle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-32 2360 31/12/2005 Loire Saint Georges en Couzan Mâle 18 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-33 2358 07/01/2006 Loire Saint Georges en Couzan Femelle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-34 1029 07/01/2006 Loire Saint Georges en Couzan Femelle 15 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-35 2542 07/01/2005 Loire Marcoux Femelle 15 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-36 18/12/2005 Loire Marcoux Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-37 2545 08/01/2006 Loire Marcoux Mâle 17 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-38 2543 07/01/2006 Loire Marcoux Femelle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-39 1638 19/11/2005 Loire Saint Jean Soleymieux Femelle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-40 26/11/2005 Loire Chambéon Mâle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-41 42-42 42-43 42-44 42-45 42-46 1143 18/02/2006 Loire Essertines en Châtelneuf Mâle 18 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-47 2617 25/02/2006 Loire Essertines en Châtelneuf Femelle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-48 1824 25/02/2006 Loire Périgneux Mâle 26 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-49 807 21/02/2006 Loire Périgneux Femelle 17 Jeune Négatif Négatif pas de rate 42-50 1844 26/02/2006 Loire Périgneux Mâle 16 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-51 26/11/2005 Loire Chambéon Femelle 14 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-52 17/12/2005 Loire Chambéon Mâle 25 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-53 2490 19/02/2006 Loire Saint Sixte Femelle 18 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-54 2487 26/02/2006 Loire Saint Sixte Mâle 21 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-56 1730 11/02/2006 Loire Apinac Mâle 23 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-57 1727 11/02/2006 Loire Apinac Mâle 12 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-58 890 18/02/2006 Loire Le Bessat Mâle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-59 883 18/02/2006 Loire Le Bessat Femelle 22 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-60 915 11/02/2005 Loire Tarentaise Mâle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-62 1685 12/02/2006 Loire Estivareilles Mâle 24 Adulte Négatif Négatif Négatif 42-63 1684 11/02/2006 Loire Estivareilles Mâle 15 Jeune Négatif Négatif Négatif 42-64 1764 11/02/2006 Loire Usson en Forez Mâle 23 Jeune Négatif Négatif Négatif 69-01 369 05/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Mâle 25 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-02 409 06/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Femelle 19 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-03 373 13/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Femelle 20 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-04 378 12/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Femelle 22 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-05 374 19/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Femelle 21 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-06 4133 20/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Femelle 14 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-07 248 19/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Mâle 23 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-08 243 19/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Femelle 24 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-09 236 19/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Femelle 14 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-10 247 27/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Femelle 26 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-11 272 27/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Femelle 21 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-12 269 03/12/2005 Rhône Poule les Echarneaux Mâle 25 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-13 253 30/10/2005 Rhône Poule les Echarneaux Femelle 24 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-14 331 12/11/2005 Rhône Saint Vincent de Reins Femelle 16 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-15 332 13/11/2005 Rhône Saint Vincent de Reins Mâle 20 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-16 4115 20/11/2005 Rhône Saint Vincent de Reins Mâle 15 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-17 20/11/2005 Rhône Saint Vincent de Reins Femelle 25 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-18 20/11/2005 Rhône Saint Vincent de Reins Femelle 23 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-19 4247 11/11/2005 Rhône Quincie en Beaujolais Femelle 14 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-20 723 20/11/2005 Rhône Quincie en Beaujolais Mâle 25 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-21 722 03/12/2005 Rhône Quincie en Beaujolais Femelle 24 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-22 717 04/12/2005 Rhône Quincie en Beaujolais Femelle 23 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-23 734 18/12/2005 Rhône Quincie en Beaujolais Femelle 20 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-24 835 02/11/2005 Rhône Claveisolles Mâle 24 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-25 69-26 839 02/11/2005 Rhône Claveisolles Mâle 16 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-27 840 02/11/2005 Rhône Lamure sur Azergues Femelle 22 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-28 4287 13/11/2005 Rhône Claveisolles Femelle 17 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-29 4197 27/11/2005 Rhône Les Ardillats Femelle 15 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-30 556 27/11/2005 Rhône Les Ardillats Femelle 25 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-31 538 05/12/2005 Rhône Les Ardillats Femelle 23 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-32 69-33 549 20/11/2005 Rhône Les Ardillats Mâle 25 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-34 557 20/11/2005 Rhône Les Ardillats Mâle 25 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-35 552 12/11/2005 Rhône Les Ardillats Femelle 23 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-36 372 20/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Mâle 20 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-37 4145 20/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Mâle 16 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-38 379 20/11/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Femelle 21 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-39 4136 04/12/2005 Rhône Saint Nizier d'Azergues Femelle 11 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-40 4078 12/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Femelle 12 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-41 257 12/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Mâle 16 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-42 4092 12/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Femelle 14 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-43 232 19/11/2005 Rhône Poule les Echarneaux Femelle 23 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-44 633 06/11/2005 Rhône Ouroux Mâle 16 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-45 69-46 69-47 632 20/11/2005 Rhône Ouroux Mâle 28 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-48 4211 20/11/2005 Rhône Ouroux Femelle 13 Jeune Négatif pas de sérum Négatif 69-49 69-50 69-51 274 21/12/2005 Rhône Poule les Echarneaux Mâle 21 Adulte Négatif pas de sérum Négatif 69-52 271 21/12/2005 Rhône Poule les Echarneaux Mâle 18 Jeune Négatif pas de sérum Négatif

- 66 -

NOM PRENOM : GALLO FLAVIEN TITRE : CONTRIBUTION A L'ETUDE DES PESTIVIRUS CHEZ LES

CHEVREUILS (CAPREOLUS CAPREOLUS) EN REGION RHONE-ALPES ET DANS LE JURA

Thèse Vétérinaire : Lyon, 25 octobre 2006 RESUME : Depuis la fin des années 90, une mortalité anormale est apparue dans les populations de Chevreuils (Capreolus capreolus) en France. Des études ont été menées afin d'étudier ce phénomène, dénommé "MAC" (Mortalité Anormale du Chevreuil). A ce jour, aucune cause n'est identifiée, et plusieurs hypothèses: «surdensité» ou maladie infectieuse immunodépressive (pestivirose, ehrlichiose) ont été avancées, mais non vérifiées. Nous avons effectué, en partenariat avec l'O.N.C.F.S., une recherche de marqueurs d’infection de pestivirus dans les populations de Chevreuils du Jura, de la Loire et du Rhône à l’occasion de la saison de chasse 2005/06. Du matériel biologique a été prélevé sur 151 Chevreuils abattus et analysés par les LDAV locaux (sérologies) et de Chambéry (RT-PCR). Les analyses se sont toutes révélées négatives, mais ne permettent pas d’affirmer l’absence d’une circulation virale dans ces départements, celle-ci pouvait être très faible au moment de l’étude. MOTS CLES :

- Chevreuil - Diagnostic - Pestivirus - Rhône-Alpes - Epidémiologie

JURY :

Président : Monsieur le Professeur Christian CHIDIAC 1er Assesseur : Monsieur le Professeur Marc ARTOIS 2ème Assesseur : Madame le Professeur Marie-Anne ARCANGIOLI

DATE DE SOUTENANCE :

Mercredi 25 octobre 2006 ADRESSE DE L’AUTEUR :

31, Lotissement du Guillon 42340 VEAUCHE