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UNIVERSITE PARIS 12-VAL DE MARNE
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
THESE
pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université Paris XII-Val de Marne
Spécialité : Biologie cellulaire et moléculaire
Présentée et soutenue publiquement par
SANDRA HUGUENIN
le 2 Juillet 2004
ETUDE DU POTENTIEL ANTI-TUMORAL DE MOLECULES ANTI-INFLAMMATOIRES NON STEROIDIENNES DONNEUSES D’OXYDE NITRIQUE S
UR DES LIGNEES TUMORALES HUMAINES DE VESSIE ET DE
PROSTATE
Directeur de thèse
Dr. Marie-Claude JAURAND
Rapporteurs
Pr. Jean FIET
Dr. Pascal ESCHWEGE
Membres du jury
Pr. Dominique K. CHOPIN
Dr. Jocelyne FLEURY-FEITH
Dr. Manlio BOLLA
Dr. Marie-Claude JAURAND
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1
REMERCIEMENTS
Je tiens à exprimer ici toute ma gratitude envers Marie-Claude Jaurand, à la fois pour
son aide sur le plan scientifique et pour le soutien moral qu’elle m’a apporté au cours de ces
années de thèse.
Un grand merci à tous les membres de l’équipe du centre de recherches chirurgicales,
qu’ils soient passés ou présents, stagiaires, étudiants ou statutaires. J’ai passé de formidables
moments en votre compagnie.
Merci à toute l’équipe de l’unité E03-37 (ex E99-09) pour son soutien.
Merci aux membres du service d’histologie et de biologie tumorale de l’Hôpital Tenon
qui m’ont aidé dans la mise en œuvre et l’interprétation des expériences de cytométrie en flux.
Merci à la société NicOx pour cette très fructueuse collaboration. Je remercie
particulièrement Messieurs Manlio Bolla et Jean-Pierre Riffaud pour toute l’aide qu’ils m’ont
apportée au cours de ce projet commun.
Merci à toutes les personnes qui m’ont apporté leurs conseils et/ou une aide technique
pour la réalisation de mes travaux.
Merci enfin au professeur Dominique K. Chopin de m’avoir accueillie dans son
laboratoire et sans l’aide logistique duquel rien de tout cela n’aurait été possible.
2
TABLE DES MATIERES
1 INTRODUCTION ..............................................................................................................9
1.1 Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ...........................................................10
1.1.1 Historique ...............................................................................................................10
1.1.2 AINS et inflammation .............................................................................................10
1.1.2.1 AINS et la voie des eicosanoïdes ......................................................................10
1.1.2.2 Les isoformes de COX ......................................................................................13
1.1.2.3 Le concept COX-1 bénéfique/COX-2 néfaste ...................................................14
1.1.3 AINS et cancer ........................................................................................................16
1.1.3.1 Premières observations : cas du cancer du colon .............................................16
1.1.3.2 AINS et autres cancers .....................................................................................17
1.1.3.3 Mécanismes impliqués dans l’effet anti-tumoral des AINS..............................18
1.2 AINS et cancers de vessie et de prostate.........................................................................28
1.2.1 Développer de nouvelles thérapies ou améliorer les traitements existants, une étape
nécessaire.........................................................................................................................28
1.2.1.1 Cancer de la vessie ...........................................................................................28
1.2.1.2 Cancer de la prostate ........................................................................................30
1.2.2 Inflammation et risque de cancer de la vessie et de la prostate ...............................35
1.2.3 Surexpression de COX-2 et son implication dans la tumorigenèse des cancers de la
vessie et de la prostate ......................................................................................................36
1.2.3.1 COX-2 dans la vessie ........................................................................................36
1.2.3.2 COX-2 dans la prostate ....................................................................................37
1.2.4 Autres facteurs impliqués dans la tumorigenèse des cancers de la vessie et de la
prostate ............................................................................................................................38
1.2.4.1 NF-κκκκB ..............................................................................................................38
1.2.4.2 La ββββ-caténine ...................................................................................................40
1.2.5 Etudes pré-cliniques et épidémiologiques ...............................................................41
1.2.5.1 Cancer de vessie ...............................................................................................41
1.2.5.2 Cancer de prostate ............................................................................................42
3
1.3 Les effets secondaires des AINS ....................................................................................44
1.3.1 Effets secondaires sur le tractus gastro-intestinal...................................................44
1.3.2 Effets secondaires sur les reins ...............................................................................46
1.4 L’oxyde nitrique (NO) une molécule étonnant ..............................................................48
1.4.1 Généralités ..............................................................................................................48
1.4.2 Le NO, une molécule paradoxale ............................................................................49
1.4.3 Biologie chimique du NO........................................................................................51
1.4.3.1 Effets directs du NO .........................................................................................51
1.4.3.2 Effet indirects du NO .......................................................................................53
1.4.4 Intérêts du NO pour une association avec les AINS ..............................................56
1.4.4.1 Effet gastroprotecteur du NO ...........................................................................56
1.4.4.2 Effet anti-tumoral du NO .................................................................................57
1.4.5 NO et carcinogenèse ...............................................................................................64
1.4.5.1 NO et lésions de l’ADN ....................................................................................64
1.4.5.2 Dommages épigénétiques liés aux RNOS.........................................................65
1.5 Les anti-inflammatoires non stéroïdiens donneurs d’oxyde nitrique (NO-AINS) .........66
1.5.1 Structure .................................................................................................................66
1.5.2 Métabolisation.........................................................................................................67
1.5.2.1 Un catabolisme non spontané ..........................................................................67
1.5.2.2 Une libération en petite quantité et étalée dans le temps ..................................69
1.5.2.3 A quel niveau la dégradation des NO-AINS se fait elle dans l’organisme ? ....70
1.5.2.4 La faible concentration de NO libérée, garante d’un effet bénéfique sans
induction de la carcinogenèse......................................................................................71
1.5.3 Le NO-AINS ont moins d’effets secondaires que les AINS classiques....................71
1.5.4 Les NO-AINS ont conservé, voire augmenté, leur potentiel anti-inflammatoire.....73
1.5.4.1 Activité anti-inflammatoire...............................................................................73
1.5.4.2 NO-AINS et douleur.........................................................................................74
1.5.5 NO-AINS et potentiel anti-tumoral .........................................................................74
4
1.5.5.1 Les NO-AINS ont un potentiel anti-tumoral supérieur à celui des AINS
classiques. ....................................................................................................................74
1.5.5.2 Mécanismes impliqués dans le potentiel anti-tumoral des NO-AINS ...............75
1.5.6 Quels sont les avantages des NO-AINS par rapport aux inhibiteurs spécifiques de
COX-2 tels que les Coxibs ?.............................................................................................78
1.6 Objectifs de la thèse .......................................................................................................80
2 PRESENTATION DES ARTICLES.................................................................................82
Evaluation of the anti-tumoral potential of different Nitric Oxide-donating Non
Steroidal Anti-inflammatory Drugs (NO-NSAIDs) on human urological tumor cell
lines..................................................................................................................................83
Antiproliferative effect of nitrosulindac (NCX 1102), a new nitric oxide-donating non
steroidal anti-inflammatory drug, on human bladder carcinoma cell lines. ..............103
Nitrosulindac (NCX 1102): a new Nitric Oxide-donating Non Steroidal Anti-
inflammatory Drug (NO-NSAID), inhibits proliferation and induces apoptosis in
human prostatic epithelial cell lines. ............................................................................113
3 RESULTATS COMPLEMENTAIRES...........................................................................125
3.1 L’effet cytotoxique du NCX 1102 sur les lignées épithéliales tumorales humaines de
vessie n’est pas affecté par un excès de putrescine. .......................................................126
3.2 Mise à part pour PNT1A, l’effet antiprolifératif du NCX 1102 sur les lignées de
vessie et de prostate n’est pas affecté par un excès de putrescine. .................................127
3.3 L’effet cytotoxique du NCX 1102 sur les lignées de vessie et de prostate n’est affecté
ni par l’adjonction d’un inhibiteur de la guanylyl cyclase (ODQ) ni par celle d’un
inhibiteur de la cGMP phosphodiestérase 5 (Zaprinast)................................................128
3.5 Le sulindac exerce un effet cytotoxique dose dépendant sur les lignées cellulaires de
vessie et de prostate testées.............................................................................................132
3.6 La combinaison de sulindac et de SNP n’entraîne aucun effet synergique de
cytotoxicité sur les lignées de vessie et de prostate testées..............................................133
3.7 Aucune libération de nitrate ni de nitrites n’est détectée après incubation du NCX
1102 en présence des différentes lignées de vessie et de prostate ...................................134
5
4 DISCUSSION.................................................................................................................136
4.1 Le NCX 1102 (NO-sulindac) est la molécule la plus active parmi les NO-AINS testés137
4.2 Le NCX 1102 a un potentiel anti-tumoral* supérieur à celui du sulindac...................138
4.3 Quels sont les effets du NCX 1102 sur les lignées testées? ..........................................141
4.3.1 NCX 1102 exerce un effet antiprolifératif sur les lignées cellulaires ....................141
4.3.1.1 Effets sur le cycle cellulaire............................................................................142
4.3.1.2 Blocage en mitose et cellules multinucléées ...................................................147
4.3.2 NCX 1102 induit la mort cellulaire .......................................................................147
4.4 Quelle partie du NCX 1102 est impliquée dans son activité anti-tumorale ? ...............149
4.4.1 L’activité anti-tumorale du NCX 1102 est-elle due à sa partie AINS, à savoir le
sulindac ?.......................................................................................................................149
4.4.2 L’activité du NCX 1102 est-elle due à la partie sulindac-espaceur ? ....................150
4.4.3 L’activité du NCX 1102 est-elle due au NO ?.......................................................151
4.4.4 L’activité du NCX 1102 est-elle la résultante d’une synergie entre le NO et la partie
AINS ? ...........................................................................................................................153
4.5 Quels sont les mécanismes impliqués dans l’action anti-tumorale du NCX 1102 ?.....155
4.5.1 L’inhibition de COX-2 ..........................................................................................155
4.5.2 L’inhibition d’iNOS ..............................................................................................156
4.5.3 NF-�B ...................................................................................................................157
4.5.4 Voie de la �-caténine/TCF ....................................................................................158
4.6 Le NCX 1102 exerce des effets différents selon le degré de transformation tumorale de
la lignée cellulaire .............................................................................................................160
4.6.1 Cas des lignées de vessie .......................................................................................161
4.6.2 Cas des lignées de prostate ....................................................................................161
4.6.3 Comment expliquer l’effet sélectif du NCX 1102 sur les lignées tumorales par
rapport aux cellules normales ?.....................................................................................162
4.7 Applications thérapeutiques du NCX 1102 ..................................................................163
6
4.7.1 Agent de chimiothérapie, seul ou en combinaison avec d’autres molécules
anticancéreuses..............................................................................................................163
4.7.2 Adjuvant à la BCG thérapie dans le traitement des tumeurs superficielles de vessie
.......................................................................................................................................164
4.7.3 Adjuvant pour augmenter la sensibilité des cellules tumorales à la radiothérapie.
.......................................................................................................................................165
4.7.4 Agent de chémoprévention des cancers de vessie et de prostate ............................166
5 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES..........................................................................168
6 BIBLIOGRAPHIE .........................................................................................................172
7 ANNEXES......................................................................................................................198
7
FIGURES ET TABLEAUX
Figure 1: Voie de synthèse des prostaglandines....................................................................12
Figure 2: Les différents mécanismes impliqués dans l’action anti-tumorale des AINS. ........27
Figure 3: Classement des stades de tumeurs de vessie selon la classification TNM. .............34
Figure 4: Classement des stades de tumeurs de prostate selon la classification TNM............34
Figure 5: Les paradoxes du NO............................................................................................50
Figure 6 : Réactions chimiques générées à partir du radical ·NO. .........................................55
Figure 7: Les différentes voies d’induction de l’apoptose par le NO.....................................60
Figure 8 : Voies impliquées dans l’effet antiprolifératif du NO. ...........................................63
Figure 9: Les NO-AINS, structure et métabolisation. ...........................................................68
Figure 10: Les différentes voies d’action possibles des NO-AINS pour exercer leur effet anti-
tumoral. ........................................................................................................................77
Figure 11: Effet cytotoxique du NCX 1102 en absence ou en présence de putrescine.........126
Figure 12: Effet antiprolifératif du NCX 1102 en absence ou en présence de putrescine.....127
Figure 13 : Cytotoxicité du NCX 1102 sur les six lignées cellulaires en présence ou en
absence d’ODQ. .........................................................................................................129
Figure 14 : Cytotoxicité du NCX 1102 sur les six lignées cellulaires en présence ou en
absence de zaprinast....................................................................................................129
Figure 15 : Effet antiprolifératif du NCX 1102 en absence ou en présence d’ODQ ou de
zaprinast. ....................................................................................................................131
Figure 16 : Effet cytotoxique du sulindac sur les six lignées cellulaires..............................132
Figure 17 : Comparaison de l’effet cytotoxique du NCX 1102, du sulindac, du SNP et d’un
mélange sulindac/SNP sur les six lignées cellulaires. ..................................................133
Figure 18: Suivi de la libération de nitrates et/ou de nitrites par le NCX 1102 . ..................134
Figure 19 : Différentes hypothèses sur la ou les parties impliquées dans l’effet anti-tumoral
du NCX 1102..............................................................................................................154
Figure 20 : Différents mécanismes possibles pouvant expliquer l’effet anti-tumoral du NCX
1102 sur les lignées de vessie et de prostate utilisées dans cette étude. ........................159
8
Tableau 1: Comparaison des IC50% obtenues au bout de 24h d’incubation avec le NCX 1102
et sa molécule d’origine, le sulindac............................................................................139
Tableau 2: Récapitulatif des IC50% après 48h du NCX 1102 dans la littérature.................140
Tableau 3 : Concentrations en NCX 1102 capables d’inhiber l’incorporation de thymidine
tritiée de 50% (IG50%) dans les lignées cellulaires. ....................................................141
Tableau 4 : Effets notables du NCX 1102 sur le profil de répartition des cellules dans les
phases du cycle cellulaire en fonction de la concentration du NCX 1102.....................144
Tableau 5 : Récapitulatif des différents effets du NCX 1102 sur les lignées cellulaires
utilisées dans cette étude. ............................................................................................160
9
1 INTRODUCTION
10
1.1 Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)
1.1.1 Historique
Un des plus ancien anti-inflammatoire est sans aucun doute l’aspirine. Dans l’antiquité
grecque, l’écorce de saule blanc (salix alba) était donnée à mâcher aux personnes fiévreuses et
sujettes à des douleurs diverses. Ce n’est qu’au 19ème siècle que le principe actif de l’écorce de
saule fût isolé et identifié. Il s’agissait de la saliciline, rapidement métabolisée en salicylate. Il
fallut attendre 1893 pour que le chimiste allemand Félix Hoffman, en voulant réduire les
effets secondaires des salicylates, mette au point une voie de synthèse de l’acide acetyl-
salicylique, commercialisé par la suite sous le nom d’aspirine. Bientôt, d’autres molécules
ayant des propriétés anti-pyrétiques, anti-inflammatoires et analgésiques similaires à
l’aspirine, furent développées. Apparurent ainsi le phenylbutazone dans les années 40, les
fenamates, l’indomethacine dans les années 60, les propionates et enfin les oxicams dans les
années 80.
Ces nouvelles molécules, composées en majorité d’acides carboxyliques, furent
appelées anti-inflammatoires non stéroïdiens pour les différencier des glucocorticoïdes,
molécules possédant elles aussi des propriétés anti-inflammatoires.
1.1.2 AINS et inflammation
1.1.2.1 AINS et la voie des eicosanoïdes
En 1971 Vane expliqua le mécanisme impliqué dans le potentiel thérapeutique des
AINS. Il montra que ces molécules exerçaient leur effet anti-inflammatoire en inhibant la
11
synthèse des prostaglandines via un blocage de l’activité enzymatique de la cyclooxygénase
(COX), également connue sous le nom de prostaglandine H synthase (PGHS) [1].
Les prostaglandines (PGs) sont des composés lipidiques de la famille des
eicosanoïdes. Elles sont synthétisées par la plupart des types cellulaires de l’organisme et
agissent comme des médiateurs autocrine et paracrine, le signal qu’elles véhiculent se limitant
à ou aux environs immédiats de leur site de synthèse. Cette synthèse est activée par de
nombreux facteurs de natures différentes : traumatisme mécanique, cytokines spécifiques,
facteurs de croissance, signaux inflammatoires… Les PGs ne sont pas stockées et sont
produites de novo à partir de l’acide arachidonique issu des phospholipides membranaires
grâce à l’activité de la phospholipase A2 (PLA2). L’acide arachidonique est transformé en
PGG2 puis en PGH2 par le complexe COX. La PGH2 est à son tour convertie en prostanoïdes,
c'est-à-dire en diverses prostaglandines (PGE2, PGD2, PGF2 alpha), prostacyclines (PGI2) et
en thromboxane A (TXA2) via différentes enzymes (synthases ou isomérases) tissu
spécifiques (voir figure 1). Le profil des prostanoïdes produits est fonction de l’expression
des différentes isomérases ou prostaglandines synthases spécifiques du tissu dans lequel à lieu
le phénomène inflammatoire. Ces prostanoïdes exercent leurs effets physiologiques grâce à au
moins 9 récepteurs spécifiques identifiés à ce jour : la PGE2 se lie à 4 récepteurs, EP1 à EP4 ;
la PGD2 se lie aux récepteurs DP1 et DP2 ; PGF2 à FP ; PGI2 à IP et TXA2 au récepteur TP
[2].
Certains de ces métabolites, tels PGE2 et PGI2, jouent un rôle important dans la
réaction inflammatoire, la fièvre et la douleur [3, 4]. D’autres métabolites, tels que le TXA2,
sont importants dans l’agrégation des plaquettes sanguines [5].
Par conséquent, inactiver COX revient à bloquer la production de ces médiateurs
lipidiques et ainsi atténuer voire éliminer la douleur et/ou l’inflammation ou garder le sang
fluide en empêchant l’agrégation plaquettaire.
12
Figure 1: Voie de synthèse des prostaglandines.
Les AINS classiques inhibent la synthèse des prostaglandines en bloquant l’activité à la fois
de COX-1 et COX-2. Ils inhibent également la phospholipase A2 cytoplasmique.
13
1.1.2.2 Les isoformes de COX
Une quinzaine d’années après les travaux de Vane, l’hypothèse de l’existence de
plusieurs isoformes de COX a été vérifiée grâce à la découverte d’une seconde
isoforme appelée COX-2 [6-8]. Plus récemment, une troisième isoforme, COX-3, à été mise
en évidence [9].
Bien que les deux isoformes COX-1 et COX-2 catalysent les mêmes réactions et ont
une structure protéique primaire similaire [8], leur expression est régulée très différemment
[10].
COX-1 est considérée comme étant la forme constitutive de COX et est retrouvée de
façon ubiquitaire dans la plupart des tissus normaux [11], même s’il s’avère qu’elle peut être
induite dans certaines conditions [12, 13]. Cette isoforme est importante pour différents
processus physiologiques normaux comme la préservation du flux sanguin rénal, l’agrégation
des plaquettes sanguines [14] et l’hémostase ainsi que la protection de la muqueuse
gastrointestinale.
Au contraire, COX-2, bien qu’exprimée constitutivement dans les reins [15, 16] et le
cerveau [10] est peu ou pas exprimée dans les autres tissus normaux. Cette isoforme est
considérée comme étant la forme inductible de COX. Son gène contient une TATA box et des
sites de liaison pour différents facteurs de transcription incluant le facteur nucléaire NF-κB
(nuclear factor NF-κB) et le facteur nucléaire pour l’expression de l’interleukine 6 (NF-IL-6)
[17]. De ce fait, la synthèse de COX-2 est activée par de nombreux facteurs tel que des
cytokines, des mitogènes, des facteurs de croissance et des promoteurs tumoraux [18-21] et
surexprimée dans les sites inflammatoires.
14
1.1.2.3 Le concept COX-1 bénéfique/COX-2 néfaste
Etant donné que COX-1 est impliquée dans des processus physiologiques normaux,
son inhibition risque d’entraîner des perturbations plus ou moins néfastes. COX-2 quant à elle
semble responsable en grande partie des phénomènes pathologiques liés à l’inflammation.
L’idée que les propriétés anti-inflammatoires et analgésiques des AINS soient
principalement dues à l’inhibition de COX-2 et que leurs effets secondaires soient liés à
l’inhibition de COX-1 a émergé de ces observations et a mené au développement
d’inhibiteurs spécifiques de COX-2. Masferrer et coll ont ainsi montré que l’inflammation
induite par de la carragénine injectée dans des poches d’air sous cutanées faite
experimentalement sur le dos de rats était corrélée avec l’apparition de COX-2 dans la lésion
et que l’inhibiteur COX-2 spécifique utilisé (NS398) bloquait la production de
prostaglandines dans le site inflammatoire sans causer de lésions intestinales ni modifier la
synthèse des prostaglandines gastriques [19]. Des résultats similaires ont étés obtenus par
d’autres auteurs utilisant d’autres inhibiteurs spécifiques de COX-2 dans des modèles
différents comme l’œdème de la patte induit par injection sous-plantaire de carragénine [19]
ou l’arthrite adjuvant de Freund induite chez le rat [22]. Ces résultats ont étés confirmés chez
l’homme par des essais cliniques comparant l’impact sur le tractus digestif d’inhibiteurs
spécifiques de COX-2 avec celui d’AINS non sélectifs (rofecoxib/ibuprofène et
celecoxib/diclofenac) confirmant l’implication de COX-2 dans le phénomène inflammatoire
et ses corollaires tout en minimisant son implication dans les effets secondaires liés aux AINS
[23, 24].
Cependant, ce concept est contredit par certaines données expérimentales. En effet,
des études menées sur des souris dont soit le gène de COX-1 (cox-1 null) soit le gène de
COX-2 (cox-2 null) a été désactivé ne donnent pas de résultats en accord avec la répartition
15
des rôles respectifs donnés à COX-1 et COX-2 : les souris cox-1 null, bien que n’exprimant
pas COX-1, ne présentaient pas spontanément de lésions gastrointestinales, même si le niveau
de PGE2 dans l’estomac n’était équivalent qu’à 1% de celui de souris normales. De plus,
lorsque ces souris ont été traitées avec un AINS connu pour entraîner des ulcères,
l’indomethacine, les souris cox-1 null développaient moins de lésions que les souris normales
[25]. Les souris cox-2 null quant à elles ont développé de sévères lésions rénales et ont
développé des réponses inflammatoires, malgré la présence du gène cox-1 fonctionnel et une
absence de COX-2 [26].
Une nouvelle interprétation de toutes ces données a été apportée par l’équipe de
Wallace, qui a montré que l’inhibition d’une des isoformes pouvait être compensée par
l’activité de l’autre [27]. Cette hypothèse est appuyée par une autre étude ayant montré que
l’utilisation d’un inhibiteur de COX-1 entraînait une induction de COX-2 dans la muqueuse
gastrique [28]. De plus, bien que COX-2 ne soit pas exprimé normalement dans le tractus
digestif [29], son expression est augmentée très rapidement après 1h d’ingestion d’aspirine
[30] ou administration d’agents irritants [31]. L’administration d’inhibiteurs sélectifs de
COX-2 chez des rats ayant des ulcères gastriques ou des colites induites expérimentalement
inhibe profondément la guérison des lésions et de surcroît exacerbe l’inflammation [32, 33].
Cette réaction s’explique par le fait que les prostaglandines induites par COX-2 semblent
jouer un rôle important dans la guérison des lésions du tractus gastrointestinal en contribuant
à la résorption du phénomène inflammatoire [34, 35].
Ainsi, COX-2 est impliqué à la fois dans les phénomènes pathologiques mais permet
également de générer une forme d’adaptation compensatoire en cas d’atteintes au bon
fonctionnement du tissu gastrointestinal, dû par exemple à une inhibition de COX-1.
16
L’inhibition des enzymes COX par les AINS peut être médiée par différents
mécanismes [36] :
• via une modification conformationnelle du site actif de la cyclooxygénase par liaison
covalente, comme une acétylation de la sérine 530 pour COX-1 ou la sérine 516 pour
COX-2 par l’aspirine [37-39],
• via une inhibition par compétition avec l’acide arachidonique, comme il a été montré
pour l’ibuprofène. Ce type d’inhibition n’est pas affecté par le temps de contact entre
l’inhibiteur et l’enzyme,
• via une inhibition de COX augmentant en fonction du temps de contact entre
l’inhibiteur et l’enzyme, caractérisée par une liaison forte, comme pour l’indométhacine
[40],
• via une inhibition de COX plus ou moins dépendante du temps de contact entre
l’inhibiteur et l’enzyme correspondant à des liaisons faible et réversibles, comme pour le
naproxène [36].
1.1.3 AINS et cancer
En plus de leurs activités anti-inflammatoire, anti-pyrétique et analgésique, les AINS
exercent également un fort potentiel anti-tumoral.
1.1.3.1 Premières observations : cas du cancer du colon
Cet effet anti-tumoral a tout d’abord été mis en évidence dans le cadre du cancer du
colon. En effet, Waddell et coll. [41] ont observé une régression des polypes rectaux chez les
patients qui prenaient une combinaison de sulindac et d’indométhacine contre la douleur. Le
17
potentiel du sulindac de faire régresser les polypes chez les patients atteints de polypose
adénomateuse familiale à été démontrée par plusieurs études cliniques [42-44] et la
corrélation entre prise d’aspirine et diminution du risque relatif de cancer du colon a été
vérifiée à maintes reprises [45-47].
Les effets antitumoraux du sulindac et de l’aspirine ont étés confirmés dans des
modèles animaux : le sulindac était capable de supprimer la tumorigenèse dans un modèle de
souris Min (ou ApcMin) [48, 49]. Ces souris présentent une mutation dominante du gène Apc
(adenomatous polyposis coli) et développent spontanément des adénomes de l’intestin
environ 3-4 mois après leur naissance. L’aspirine quant à elle diminue l’incidence, le nombre
ainsi que la taille d’adénocarcinomes du colon dans un modèle de rats traités avec le
carcinogène azoxymethane (AOM) [50]. Dans ce modèle, l’AOM induit des lésions pré-
néoplasiques (foyer de cryptes abérrantes) qui évoluent normalement en carcinomes du colon
[51].
1.1.3.2 AINS et autres cancers
L’incidence de la prise d’AINS sur la carcinogenèse a été examinée dans d’autres
types de cancers épithéliaux. Les résultats sont moins nets que dans le cas du cancer du colon.
Farrow et coll ont montré que la prise d’AINS réduisait le risque de cancers de
l’estomac et de l’oesophage [52], alors qu’un autre groupe n’a trouvé de réduction
significative du risque de cancer lié à la prise d’AINS que pour le cancer de l’estomac et pas
pour celui de l’œsophage [53]. Globalement, les études montrent cependant un effet
protecteur des AINS vis-à-vis du développement de ces deux types de cancers [54-57].
Les résultats obtenus pour le cancer du pancréas sont encore plus contradictoires
puisque par exemple une étude montre une diminution du risque associé à la prise d’aspirine
18
mais pas avec d’autres AINS [58], une autre montre qu’il n’y a pas de réduction significative
du risque [53] alors qu’une troisième étude, au contraire, montre une augmentation du risque
de cancer du pancréas en association avec la prise d’AINS [54].
De même, pour le cancer du sein, certaines études montrent un effet protecteur des
AINS contre ce cancer [59-61], tandis que d’autres indiquent que ces composés n’ont pas
d’effet sur ce type de cancer [54, 62, 63].
Enfin, les données pour le cancer des ovaires montrent qu’il y a peu ou pas de
corrélation entre ces molécules et ce type de cancer [64-66].
Dans le chapitre 1.2 seront examinés en détail les résultats obtenus dans les études
ayant portées sur les effets des AINS sur les cancers de vessie et de prostate.
Malgré des données parfois difficiles à interpréter, les AINS semblent globalement
exercer un effet protecteur vis à vis des cancers épithéliaux.
1.1.3.3 Mécanismes impliqués dans l’effet anti-tumoral des AINS
1.1.3.3.1 Inhibition de COX-2
Les AINS semblent donc avoir un effet anti-tumoral ; or il a été montré qu’ils exercent
leur potentiel anti-inflammatoire en inhibant COX-2. La première question qui peut être posée
est la suivante : COX-2 est elle impliquée dans la cancérogenèse ?
Relations entre inflammation et cancer
COX-2 est connu pour être surexprimé pendant le phénomène inflammatoire et
contribue dans un premier temps à entretenir cette inflammation [67, 68]. Or un phénomène
inflammatoire persistant présente un facteur de risque pour plusieurs types de cancers et peut
19
induire la carcinogenèse. En effet, l’incidence du cancer du colon est 5,7 fois plus importante
chez les patients avec une colite ulcerative chronique. Cette augmentation du risque est
corrélée avec la sévérité de la pathologie et la durée de la maladie [69]. Autre fait important,
la colite ulcérative n’augmente pas le risque d’autres types de cancers [69] ce qui est en
accord avec l’hypothèse que les lésions néoplasiques résultent d’un phénomène inflammatoire
localisé. Enfin, comme il fallait s’y attendre, COX-2 est fortement surexprimée dans la colite
ulcérative [70, 71].
De même, l’association du phénomène inflammatoire avec l’augmentation du risque
de cancer à été observée dans :
� le poumon du fait de l’asthme [72-74]
� l’estomac du fait d’une infection due à Helicobacter pylori [75]
� les ovaires du fait d’une inflammation épithéliale [76, 77] ou d’une endométriose
chronique [78]
� le pancréas, lié à la pancréatite [79, 80]
� l’œsophage, où la dysplasie est augmentée par l’œsophage de Barret [81, 82]
La sarcoïdose quant à elle augmente le risque de cancer à la fois du poumon, du foie
et de la peau [83].
Comment expliquer que le phénomène inflammatoire entraîne localement des lésions
pré-néoplasiques pouvant dégénérer en cancer ? Les neutrophiles impliqués dans
l’inflammation sécrètent des radicaux libres très réactifs tel que le peroxyde d’oxygène [84,
85] ou l’oxyde nitrique [86, 87], exposant ainsi les cellules adjacentes à des substances
mutagènes. D’autres molécules réactives sont également produites au cours de l’inflammation
tel que les prostaglandines A1 et A2, appelées aussi prostaglandines électrophiles, issues de la
PGE2.
20
Ces molécules réactives peuvent agir de deux façons différentes pour initier la
carcinogenèse :
� soit par une réaction directe avec l’ADN des cellules [88, 89]. Des neutrophiles activés
ont ainsi la capacité de transformer des lignées cellulaires en variants ayant des
caractéristiques néoplasiques [90, 91], via la production de radicaux issus de l’oxygène
appelés éspèces oxygène réactives (ROS (reactive oxygen species)),
� soit par une inactivation épigénétique de p53 par les radicaux libres. En effet, le NO et
les PGs électrophiles sont capables d’inhiber la fonction de p53 par action directe sur la
protéine [92, 93]. Une fois p53 inactive, la réparation de l’ADN et l’induction de
l’apoptose sont compromises, conduisant là encore à des lésions néoplasiques.
L’inhibition de COX-2 par les AINS permettrait donc d’inhiber le phénomène
inflammatoire, diminuant ainsi grandement le risque de carcinogenèse lié à l’inflammation.
Les AINS sont donc de bon candidats potentiels pour la chémoprévention de nombreux
cancers.
Cependant, la surexpression de COX-2 dans les cancers est en général indépendante
du phénomène inflammatoire : l’inflammation n’intervient pas dans le développement de
certaines pathologies comme par exemple la polypose adenomateuse familiale. D’autre part, il
arrive souvent que les tissus pré-néoplasiques montrent une surexpression de COX-2 alors
que le tissu adjacent normal ne la surexprime pas, ce qui ne serait pas le cas s’il s’agissait
d’une inflammation, où toutes les cellules, pré-tumorales ou pas seraient également affectées.
La surexpression de COX-2 dans ce cas pourrait être due à des mutations somatiques activant
de façon permanente certaines voies de signalisation comme les MAP kinases [94] ou à une
21
dérégulation de facteurs de stabilisation de l’ARNm de COX-2 [95, 96]. La surexpression de
COX-2, et donc la surexpression des PGs qui en résulte, serait alors la cause de la
tumorigenèse et non pas sa conséquence.
Surexpression et rôle de COX-2 dans les cancers
COX-2 ou son ARNm sont surexprimés dans les tumeurs par rapport aux tissus sains
dans de nombreux types de cancers comme celui de l’œsophage [97], du poumon [98, 99], du
sein [99], du pancréas [100], de la tête et du cou [101] ou encore de l’estomac [102].
Dans le cas du colon il a été montré que COX-2 est surexprimée dans 85% des
carcinomes colorectaux et dans 50% des adénomes, alors que l’expression de COX-1 ne
variait pas entre le carcinome et le tissu normal [103]. Ces résultats ont étés confirmés par
deux autres études [104, 105]. De plus, l’ARNm de cox-2 est surexprimé dans les modèles
animaux de carcinome du colon tel que les souris Min (ayant un gène Apc muté) [106] et les
rats AOM [107], ceux-là même qui ont servi à démontrer l’effet anti-tumoral du sulindac et de
l’aspirine [48, 50].
Mais l’implication de COX-2 dans le cancer n’est pas seulement liée à une sur-
expression. En effet, Oshima et col ont montré que le nombre des polypes dans les souris
Apc∆716, un modèle proche des souris Min, était réduit de 86% dans les souris cox-2 -/- par
rapport aux souris ayant les deux allèles de cox-2 (cox2 +/+). Le traitement des souris
Apc∆716/cox-2 +/+ avec du sulindac (inhibiteur de COX-1 et COX-2) ou un inhibiteur
spécifique de COX-2 diminue également le nombre de polypes dans ces souris, mais avec une
meilleure efficacité pour l’inhibiteur COX-2 spécifique [108]. D’autre part, la surexpression
de COX-2 induite via le promoteur MMTV (murine mammary tumor virus) dans les glandes
mammaires des souris transgéniques suffit à induire la tumorigenèse dans ces organes [109].
22
Une étude similaire a été menée sur des souris transgéniques exprimant constitutivement
COX-2 dans les keratinocytes et où des lésions pré-néoplasiques au niveau de la peau ont pu
être associées à l’expression de COX-2 [110]. Cette implication de COX-2 dans la
tumorigenèse est également appuyée par le fait que COX-2 ou son ARNm soient exprimés
dans les lésions pré-cancéreuses de plusieurs types de cancers comme par exemple
l’épithélium alvéolaire atypique précurseur du cancer du poumon [98], ou les cellules
métaplasiques et adenomateuses de l’estomac [102].
Ainsi COX-2 n’est pas seulement surexprimée dans les cancers déclarés, elle est
également présente dans les lésions pré-néoplasiques et indispensable pour induire la
tumorigenèse dans plusieurs types de cancers.
Enfin COX-2 est aussi impliquée dans l’angiogenèse et la néovascularisation des
tumeurs [111-113] .
Effet anti-tumoral des AINS et inhibition de COX-2
Vu la relation étroite entre COX-2 et la pathologie cancéreuse, il est donc permis de
penser qu’une des voies majeures impliquées dans l’effet anti-tumoral des AINS est
l’inhibition de la production de prostaglandines par inhibition de COX-2.
Plusieurs éléments vont dans le sens de l’implication de la voie COX-2 dépendante
dans l’effet anti-tumoral des AINS, notamment les résultats des études menées sur le cancer
du colon avec l’inhibiteur spécifique de COX-2, le celecoxib. Cet inhibiteur spécifique de
COX-2 diminue le nombre de polypes dans les souris Min [114] et diminue l’incidence des
tumeurs de colon et leur nombre dans le modèle de rats AOM [115, 116]. De leur côté,
Oshima et coll. [117] ont montré que le rofecoxib, un autre inhibiteur spécifique de COX-2
diminuait le nombre de polypes dans un autre modèle de cancer du colon, les souris Apc∆716.
23
Cet effet inhibiteur de la carcinogenèse et/ou du développement tumoral par les
inhibiteurs spécifiques de COX-2 à été observé également soit in vitro soit in vivo dans
d’autres types de cancers, tel que celui de l’œsophage [118], du foie [119], du pancréas [120],
du mésothéliome [121] ou encore dans cancer mammaire chez le rat [122, 123]. D’autre part,
il à été montré que l’inhibiteur spécifique de COX-2, NS-398, exerce un effet antiprolifératif
et pro-apoptotique dans une lignée de carcinome hépatique surexprimant COX-2 et non dans
la lignée ne surexprimant pas COX-2 [124], ce qui met en exergue l’importance de
l’inhibition de COX-2 dans l’effet du NS-398.
A coté des activités antiprolifératives et/ou pro-apoptotiques liées à l’inhibition de
COX-2, les AINS sont aussi capable d’inhiber l’angiogenèse, autre étape importante du
développement tumoral [112, 113].
Les AINS sont donc capables d’empêcher la synthèse de PGs en inhibant COX-2.
Mais ils peuvent également agir sur d’autres cibles de la voie des eicosanoïdes que les
enzymes COX. En effet, Yuan et coll ont montré que l’aspirine et le sulindac supprimaient
l’expression de l’ARNm de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2), l’enzyme qui permet
d’extraire l’acide arachidonique (AA) à partir des phospholipides membranaires [125] dans
les fibroblastes de souris, NIH3T3. L’AA étant le substrat de COX, les AINS exerceraient
donc une régulation de la production des PGs en amont de COX.
Néanmoins, les AINS semblent également exercer leur effet anti-tumoral par des voies
COX-2 indépendantes. En effet, une étude a permis de démontrer que le sulfide de sulindac et
le piroxicam étaient capables d’inhiber la croissance et d’induire l’apoptose de cellules
tumorales de colon exprimant ou non COX-2 et que l’effet antiprolifératif des AINS n’était
pas inversé par administration exogène de prostaglandines [126]. De même, Zhang et coll ont
24
montré que les effets antiprolifératif et pro-apoptotique des AINS étaient comparables sur des
lignées fibroblastiques dérivées de souris exprimant cox-1 et cox-2 et de souris cox-1-/-, cox-
2-/- ou cox-1-/-/cox-2-/-. Enfin, le dérivé du sulindac, le sulindac sulfone est un composé
inactif sur COX et cependant il exerce un effet antiprolifératif sur la lignée tumorale de colon
HT-29 exprimant COX-1 et COX-2 [127] et réduit le nombre de néoplasmes du colon dans
des rats AOM [128].
1.1.3.3.2 Autres mécanismes impliqués dans l’activité anti-tumorale des AINS
Plusieurs autres cibles ont été proposées pour expliquer les effets COX-indépendants
des AINS (voir figure 2).
Le facteur de transcription NF-κB.
NF-κB est un facteur de transcription qui induit l’expression de gènes cibles
appartenant à quatre classes différentes : des gènes impliqués dans la régulation négative du
NF-κB lui-même, des gènes impliqués dans la régulation des phénomènes immunologiques et
inflammatoires, des gènes anti-apoptotiques et des gènes impliqués dans la prolifération
cellulaire.
Ce facteur semble actif de façon permanente dans plusieurs types de cellules tumorales
humaines via l’activation constitutive de kinases en amont dans la signalisation [129]. Il a été
montré que l’aspirine et le sulindac sont capables d’altérer l’activité de l’IKKβ kinase,
enzyme indispensable pour phosphoryler IκB, la sous unité inhibitrice du NF-κB [130, 131].
Si IκB n’est pas phosphorylée, elle ne se dissocie pas du NF-κB et celui-ci ne peut pas se lier
à l’ADN pour transcrire les gènes nécessaires pour la survie et la prolifération, notamment des
gènes anti-apoptotiques [132, 133]. Il est à noter que NF-κB peut induire l’expression de
25
COX-2, comme cela a été démontré dans le cas d’infections de l’estomac dues à Helicobacter
pylori [134]. Les NSAIDs sont donc en mesure d’agir à plusieurs niveaux dans la réaction
inflammatoire.
Les PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors).
Il existe trois isoformes de ces facteurs de transcription ligand-activés: PPAR�, � et �
[135]. Les AINS peuvent agir de deux façons différentes, en fonction de l’isoforme de PPAR :
par activation directe de PPAR� comme l’indométhacine [136] ou par inhibition de PPAR�
comme pour le sulindac [137]. En effet, l’utilisation d’agonistes de PPAR� a montré que
l’activation de ce récepteur induisait la différenciation et l’apoptose dans plusieurs types de
cellules tumorales [138-140], suggérant que l’activation de PPAR� supprime la tumorigenèse.
Cette hypothèse est renforcée par l’observation que le cancer du colon est associé avec des
mutations entraînant la perte de fonction de PPAR� [141].
La fonction du PPAR� ainsi que les gènes que ce facteur de transcription est sensé
activer ne sont pas connus. Cependant, il semble être une des cibles de la voie APC
(adenomatous polyposis coli)/beta-caténine-Tcf et est surexprimé dans les carcinomes de
colon [142]. Or le sulindac, en se liant directement au PPAR� et empêchant ainsi toute
interaction entre le facteur de transcription et l’ADN, induit l’apoptose dans des cellules
tumorales colorectales [137]. Les AINS, en inhibant l’activité de PPAR� pourraient donc
contrebalancer les anomalies liées à la voie APC/β-caténine-Tcf souvent rencontrées dans les
cancers et particulièrement dans celui du colon.
Les protéines de la famille Bcl-2
BAX et BCL-XL sont des protéines mitochondriales de la famille de Bcl-2, la première
étant pro-apoptotique tandis qu’au contraire la seconde inhibe l’apoptose. BAX semble
26
impliquée dans l’effet pro-apoptotique des AINS. En effet, le sulindac et l’indomethacine
induisent l’apoptose dans les cellules tumorales de colon HCT116 lorsque celle-ci ont un
génotype bax+/+ ou bax +/-. Lorsque ces cellules sont bax -/-, l’induction du phénomène
apoptotique par les AINS n’a pas lieu [143]. En fait, le sulindac et l’indométhacine diminuent
l’expression de la protéine BCL-XL, augmentant ainsi le ratio BAX/BCL-XL [143]. BAX
étant de ce fait majoritaire, l’apoptose est induite.
NAG1 (NSAID-activated gene)
En utilisant l’hybridation substractive, l’équipe de Baek et coll à isolé l’ADNc d’un
gène appelé NAG-1 (gène activé par les AINS-1) à partir de la lignée tumorale humaine du
colon HCT-116, n’exprimant pas les enzymes COX, traitée avec de l’indométhacine.
L’incubation de cette lignée HCT-116 avec des AINS augmente l’expression de NAG et
induit l’apoptose des cellules de façon concentration et temps dépendante. D’autre part, des
cellules transfectées par ce même gène montrent un apoptose accrue et une tumorigenicité
réduite [144]. L’expression de NAG-1, protéine membre de la super-famille des TGF beta
(transforming growth factor), n’est affectée ni par la surexpression de COX-1 ou COX-2, ni
par la PGE2 ou l’acide arachidonique. La transcription de NAG-1 se fait via les facteurs de
transcription Sp [145]. Ces résultats indiquent que les AINS induisent NAG-1 et les effets
pro-apoptotiques et antitumorigènes qui lui sont associés de façon indépendante de la voie des
eicosanoïdes, et ce dans plusieurs types de tissus différents [146].
27
Figure 2: Les différents mécanismes impliqués dans l’action anti-tumorale des AINS.
A : voie du NF-κB. Les AINS inhibent l’enzyme IKKβ, empêchant ainsi la dissociation du
complexe NF-κB et de sa sous-unité inhibitrice IκB. Le NF-κB ne peut donc pas se lier à
l’ADN pour transcrire des protéines nécessaires à la survie et à la prolifération des cellules ;
B : voie des PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors). Les AINS activent
PPARγ ou inhibent PPARδ, entraînant la mort cellulaire. C : voie de NAG-1 (NSAID-
activated gene-1). Les AINS stimulent l’expression de la protéine pro-apoptotique NAG-1 via
les facteurs de transcription Sp, notamment SP1 et Sp3. D : voie des protéines de la famille de
Bcl-2. Les AINS diminuent l’expression de Bcl-XL, ce qui rend la protéine pro-apoptotique
BAX majoritaire au niveau de la mitochondrie, activant ainsi la voie apoptotique
28
1.2 AINS et cancers de vessie et de prostate
Les AINS possèdent un potentiel intéressant pour servir de base au développement de
nouvelles stratégies contre le cancer, en particulier dans le cas du cancer du colon. Mais qu’en
est il des cancers de vessie et de prostate ?
1.2.1 Développer de nouvelles thérapies ou améliorer les traitements
existants, une étape nécessaire.
1.2.1.1 Cancer de la vessie
Le cancer de vessie, ou carcinome transitionnel (TCC) est la quatrième cause de
cancer chez l’homme [147].
Si 70 à 80% des tumeurs de vessie sont superficielles (n’envahissant pas le muscle),
elles peuvent cependant être de nature différente (voir figure 3) et classées selon le système
TNM 1997 :
� 40% des tumeurs totales de vessie sont des tumeurs de type Ta, carcinome papillaire
superficiel respectant la membrane basale
� 30% sont des tumeurs de type T1, carcinome papillaire envahissant le chorion de la
muqueuse
� 2 à 5% sont des carcinomes in situ (CIS ou Tis) respectant la membrane basale. Cette
lésion, classifiée en trois types [148] est considérée comme une lésion précurseur du
carcinome transitionnel de vessie [149].
29
Le reste est constitué de tumeurs infiltrantes : T2a ou b envahissant le muscle ; T3a ou
benvahissant la graisse périvésicale et T4 envahissant une structure périvésicale, comme la
prostate par exemple. Le degré d’envahissement ganglionnaire (caractéristique N) et la
présence de métastases à distance (caractéristique M) sont également évalués dans ce système
de classification.
Les deux risques associés aux tumeurs superficielles de vessie sont la récidive et la
progression vers un stade plus agressif, invasif et/ou métastatique. Pour aider à la décision
quant au traitement à utiliser, les tumeurs ont été classées en trois groupes : risque faible (pTa
de grade G1 ou G1-G2 non récidivante après 3 mois), risque intermédiaire (pTa de grade 2 ou
3, pTa à récurrence multiple et pT1 de grade 2 quand la tumeur est unique) et risque élevé
(pT1 de grade 3, CIS diffus, pT1 multifocal ou pT1 récurrente avant 6 mois).
Les tumeurs à risque faible sont traitées par résection endoscopique. Pour les tumeurs
à risque intermédiaire, la résection endoscopique est suivie d’instillations endovésicales soit
chimiotherapique avec de la mitomycine C soit immunothérapique avec le bacille Calmette-
Guérin (BCG). De même pour les tumeurs à risque élevées sauf que ces traitements sont en
général administrés après une seconde résection trans-urétrale. De tous les traitements actuels,
seule l’immunothérapie par instillation endovésicale de bacille Calmette-Guérin est efficace à
la fois contre la récurrence et la récidive. La chimiothérapie intravésicale avec la mitomycine
C est quant à elle efficace pour diminuer les risques de récidive [150]. Cependant, ces deux
alternatives thérapeutiques entraînent des effets secondaires gênants (irritations vésicales et
infections urinaires) qui mènent parfois à l’interruption du traitement. La tuberculose vient
également s’ajouter aux effets secondaires générés par l’immunothérapie par instillation de
BCG. D’autre part tous les patients ne répondent pas positivement à ces thérapies.
Il y a donc une nécessité d’améliorer les traitements existants en augmentant leur
efficacité et en diminuant leurs effets secondaires et/ou de développer de nouveaux
30
traitements locaux non invasifs permettant de traiter les patients résistants aux thérapies
existantes. Ce besoin est particulièrement marqué pour les tumeurs superficielles de risque
intermédiaire car un bon traitement à ce stade permettrait d’éviter à la fois les récidives et une
progression du cancer vers un stade nécessitant une intervention chirurgicale lourde telle que
la cystectomie radicale.
1.2.1.2 Cancer de la prostate
Le cancer de la prostate est le premier cancer chez l’homme suivi du cancer du
poumon. Il est la troisième cause de décès par cancer chez l’homme et de 9% des décès par
cancer chez l’homme en Europe [151].
Le cancer de la prostate est très majoritairement du type adénocarcinome et se
développe de préférence dans la zone périphérique de la glande prostatique [152].
Les cancers sont classées en trois groupes, eux même divisés en sous groupes, selon la
classification TNM 1997 (voir figure 4) :
� les cancers infra-cliniques de découverte fortuite après examen histologique de
copeaux de résection, biopsies systématiques ou pièce d’adénomectomie. : T1a (tumeur
représentant moins de 5% du tissu analysé), T1b (tumeur représentant plus de 5% du tissu
analysé) et T1c (tumeur identifié sur élévation isolée du PSA (prostate specific antigen),
protéine secrétée majoritairement par la prostate et dont l’augmentation du taux sérique
est associée au cancer, à l’adénome ou à l’inflammation de la glande prostatique).
� les cancers limités à la glande prostatique : T2a (tumeur occupant un lobe), T2b
(tumeur occupant les deux lobes).
� les cancers d’invasion locale : T3a (tumeur présentant une extensions extra-capsulaire
unilatérale), T3b (tumeur envahissant les vésicules séminales), T4 (tumeur fixée aux
structures adjacentes autres que les vésicules séminales).
31
Associées aux caractéristiques de la tumeur (caractéristique T), viennent ensuite la
classification des types d’extension métastatique ganglionnaire régionale (caractéristique N)
et celle des métastases à distance (caractéristique M).
Lorsque le cancer est localisé à la glande prostatique (T1 ou T2), des traitements
curatifs peuvent être utilisés. Il s’agit généralement de la prostatectomie radicale et de la
radiothérapie externe. Ces traitements ont cependant des complications importantes telles que
l’impuissance et l’incontinence et il existe des risques de récidives locales liées aux tumeurs
résiduelles n’ayant pas été éliminées.
Il se peut également que le cancer soit découvert à un stade localement avancé (ayant
dépassé les limites de la glande) ou métastatique. A partir de ce stade, il n'y a pas de possibilité
thérapeutique curative [153, 154] et les traitements sont purement palliatifs.
Le traitement spécifique de ces cancers dits avancés est appelé traitement hormonal ou
hormonothérapie. Il est basé sur la déprivation androgénique depuis la démonstration par Huggins
de l'androgénodépendance du cancer prostatique.
Il existe plusieurs formes d’hormonothérapies:
La déprivation androgénique
� agissant directement au niveau du site de production de la testostérone, la pulpectomie
consiste à retirer la pulpe du testicule, ce qui supprime 95% de la testostérone circulante
� agissant sur le complexe hypotalamo-hypophysaire, la castration chimique via les analogues
de la LH-RH (luteinizing hormone-release hormone) va entraîner dans un premier temps la
production de LH et de FSH par l’hypothalamus, stimulant la production de testostérone par les
testicules. Dans un second temps la testostérone va exercer un rétrocontrôle négatif sur
l’hypothalamus et sa propre production va chuter, atteignant un taux correspondant à celui de la
castration. Un anti-androgène doit être administré pendant les premières semaines du traitement
avec ces analogues de la LH-RH pour éviter le flare-up (augmentation de la testostérone) qui
32
risque de déclencher une flambée évolutive du cancer prostatique et qui provoque des effets
secondaires désagréables tel que les bouffées de chaleur.
� de même, le traitement par les oestrogènes, qui va bloquer la sécrétion de la LH-RH et de la
LH au niveau de l’hypothalamus et de l’hypophyse, supprimant ainsi la sécrétion de la
testostérone par les testicules.
Le blocage androgénique
� agissant au niveau des cellules cibles, le blocage androgénique utilisant des anti-androgènes
va permettre une compétition réversible avec la dihydrostérone (métabolite actif de la
testostérone) au niveau des récepteurs androgéniques des cellules androgéno-sensibles.
Le traitement hormonal peut aussi être un traitement combiné entre privation androgénique
et blocage androgénique. Il est alors appelé blocage androgénique complet (BAC) et présente
l’avantage de supprimer à la fois l’action des androgènes testiculaires et surrénaliens.
Cependant en dépit de ses résultats souvent spectaculaires dans un premier temps, et quelle que
soit la modalité du traitement hormonal, les cellules tumorales finissent généralement par
développer une résistance au traitement. Ce stade de la maladie, appelé échappement hormonal
s’accompagne en général d’une résistance aux autres traitements disponibles et la médiane de survie
est de 6 à 9 mois.
Enfin, la chimiothérapie par mitoxandrone/prédnisone promue par Tannok et Kantof depuis
1999 n’améliorait pas la survie mais uniquement la qualité de vie. Depuis l’ASCO 2004, la
chimiothérapie par Taxotère associée à l’Estracut a montré une amélioration de la qualité de vie et
un gain de survie de 6 mois.
33
Ainsi, tout comme pour le cancer de la vessie, il y a un réel besoin de nouveaux
traitements pour prendre en charge les patients atteints de cancers avancés de la prostate et ce
à deux niveaux :
� au stade androgéno-dépendant avec un traitement efficace et pourquoi pas curatif
permettant d’éliminer les cellules tumorales androgéno-dépendantes sans engendrer de
résistances
� au stade androgéno-indépendant avec un traitement capable d’agir sur les cellules
ayant développé des résistances aux traitements existants.
De même, pour les cancers de prostate localisés, de nouveaux traitements permettant
d’éradiquer le cancer sans risquer l’impuissance ou l’incontinence sont tout à fait
souhaitables.
34
Figure 3: Classement des stades de tumeurs de vessie selon la classification TNM.
Figure 4: Classement des stades de tumeurs de prostate selon la classification TNM.
35
1.2.2 Inflammation et risque de cancer de la vessie et de la prostate
Comme pour les autres cancers, le phénomène inflammatoire dans la vessie et la
prostate peut augmenter le risque de cancer et être à l’origine de lésions pré-néoplasiques qui
peuvent se transformer en cancer.
Ainsi, plusieurs études épidémiologiques ont montré une association significative
entre des infections bactériennes aiguës du tractus urinaire, telle que les cystites, et un risque
accru de cancer de vessie [155-157]. Cependant, bien que ce type d’inflammation semble
effectivement entraîner des carcinomes transitionnels, il semble engendrer beaucoup plus de
cancers de type squameux que dans la vessie [158]. Il en va de même avec les infections
schistosomales (dues a un parasite nommé Schistosoma haematobium) qui sont associées
avec le cancer de vessie de type squameux [159-161].
Concernant la prostate, plusieurs études montrent que les prostatites et les infections
liées aux maladies sexuellement transmissibles telles que la syphilis augmentent le risque de
cancer dans cette glande [162, 163]. D’autre part, une lésion décrite récemment, l’atrophie
proliferative inflammatoire (PIA) semble être en quelque sorte une étape intermédiaire entre
l’inflammation et le cancer de prostate [164]. La PIA est une lésion inflammatoire chronique
focalisée contenant des cellules épithéliales n’ayant pas effectué leur différenciation en
cellules sécrétoires. Elle se retrouve le plus souvent dans la zone périphérique de la prostate,
là où se développe la majorité des cancers, et est souvent adjacente aux néoplasies
intraepitheliales prostatiques (PIN), lésions considérées comme étant précurseurs du cancer de
prostate [165]. Pour l’instant, le lien entre les deux lésions n’a pas encore été clairement
établi.
36
Etant donné qu’il y semble y avoir une corrélation entre inflammation et cancer à la
fois dans la vessie et la prostate les AINS seraient susceptibles d’exercer un effet préventif via
leur potentiel anti-inflammatoire pour empêcher la carcinogenèse liée à l’inflammation.
1.2.3 Surexpression de COX-2 et son implication dans la
tumorigenèse des cancers de la vessie et de la prostate
Les AINS exercent leur effet anti-tumoral en partie grâce à leur effet inhibiteur de
COX-2. Il est donc intéressant d’examiner le statut de COX-2 dans les cancers de vessie et de
prostate.
1.2.3.1 COX-2 dans la vessie
Plusieurs études ont montré que la protéine COX-2 était surexprimée dans les
carcinomes transitionnels de vessie (TCC) invasifs et non invasifs et dans les lésions
considérées comme précurseur du cancer, les carcinomes in situ (CIS), par rapport à
l’urothélium humain normal ou COX-2 est pas ou peu détectée [166-169]. De plus, la
surexpression de la protéine COX-2 à été corrélée avec une forte expression de l’ARNm de
cox-2 dans des carcinomes transitionnels de haut grade [170].
Le lien entre la surexpression de COX-2 et le stade ou le grade du cancer n’est pas très
clair car les résultats sont contradictoires : une équipe montre une corrélation de l’expression
de COX-2 avec le stade [167] alors qu’une autre ne trouve une corrélation qu’en comparant
les tumeurs invasives avec les non invasives [170]. D’autres auteurs ne trouvent aucune
corrélation entre l’expression de COX-2 et le stade d’invasion du cancer [166, 169]. De la
même façon, Ristimäki et coll. ne trouvent pas de corrélation significative entre le grade des
37
TCC et l’expression de COX-2 [169] alors qu’une autre équipe a trouvé une association
significative entre l’expression de COX-2 et des grades élevés de TCC [170].
Néanmoins, la surexpression de COX-2 dans les CIS suggère un rôle précoce de COX-
2 dans la tumorigenèse du cancer transitionnel de vessie. Cette hypothèse est appuyée par des
études menées in vivo montrant que les inhibiteurs spécifiques de COX-2 étaient capables
d'inhiber la carcinogenèse et le développement du cancer de vessie. Ainsi, le nimesulide
diminue l’incidence de TCC dans un modèle de cancer de vessie chémo-induit chez le rat
[171] et le celecoxib inhibe le cancer de vessie chémo-induit dans des souris et des rats [172].
COX-2 semble donc bien impliquée dans la carcinogenèse des TCC de la vessie.
1.2.3.2 COX-2 dans la prostate
Plusieurs études montrent que la protéine COX-2 ainsi que son ARNm sont
surexprimés dans le carcinome de prostate [173-176] mais également dans les néoplasies
intraépithéliales prostatiques (PIN) [177] considérées comme les lésions précurseurs du
carcinome par rapport à l’hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) ou le tissu de prostate
normale.
D’autre part, l’expression de COX-2 est corrélée positivement avec l’augmentation du
grade des tumeurs prostatiques [175, 176], suggérant un rôle de COX-2 dans la carcinogenèse
prostatique. Cette implication de COX-2 dans la tumorigenèse a été démontrée grâce à la
tranfection d’ADNc de la COX-2 humaine dans la lignée épithéliale prostatique humaine
androgéno-dépendante LNCaP. Les cellules transfectées surexprimaient COX-2 ainsi que le
facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF). De plus, leur taux de prolifération in
vitro se trouvait augmenté par rapport aux LNCaP normales. D’autre part, leur potentiel
tumorigénique était accru in vivo, où elles induisaient des tumeurs plus volumineuses dans des
38
souris SCID (avec un syndrome d’immunodéfiscience combiné sévère) et avec un taux de
croissance tumorale supérieur aux cellules non transfectées [178].
D’autres éléments impliquant COX-2 dans la carcinogenèse et le développement du
cancer de la prostate ont étés apportés par les études menées avec des inhibiteurs spécifiques
de COX-2. Ces inhibiteurs supprimaient la prolifération cellulaire dans les lignées tumorales
PC3 et LNCaP exprimant COX-2 mais pas celle de cellules stromales prostatiques (PrSC) où
COX-2 n’est pas exprimée [179]. L’inhibiteur spécifique de COX-2 NS398 induisait
l’apoptose dans les lignées PC3 et était également capable de diminuer de 93% la surface des
tumeurs induites par inoculation de PC3 dans des souris nude. Cet effet anti-tumoral
s’accompagnait d’une induction de l’apoptose des cellules tumorales et d’une diminution de
l’angiogenèse et de l’expression du VEGF [180].
COX-2 semble donc bien impliquée dans le développement du cancer de la prostate,
notamment au niveau de l’angiogenèse des tumeurs prostatiques.
1.2.4 Autres facteurs impliqués dans la tumorigenèse des cancers de
la vessie et de la prostate
1.2.4.1 NF-κκκκB
Les AINS exercent aussi leur potentiel anti-tumoral via des voies COX-2
indépendantes en ciblant des molécules telles que le NF-κB. Cette molécule est elle impliquée
dans les cancers de vessie et/ou de prostate ?
Il y a peu de données concernant une action directe du NF-κB dans le développement
du cancer de vessie dans la littérature. Il a cependant été montré que son inhibition dans une
lignée cancéreuse de vessie l’exprimant constitutivement de façon activée (KU-19-19)
entraînait l’apoptose et inhibait la prolifération de ces cellules [181]. De la même façon, la
39
croissance tumorale et le nombre de métastases de ganglions lymphatiques induits par une
lignée de TCC transfectée avec l’inhibiteur de NF-κB, IκB-α muté, étaient réduits in vivo
chez les souris nude. Cette inhibition était associée avec une réduction de la production
d’interleukine 8, de la prolifération et de l’angiogenèse [182]. Enfin, l’utilisation d’un
inhibiteur chimique du NF-κB inhibait complètement son activité de liaison à l’ADN dans la
lignée cancéreuse de vessie KU-19-19 et induisait l’apoptose dans ces cellules [183]. NF-κB
semble donc impliqué dans la survie des cellules tumorales de vessie en les protégeant de
l’apoptose mais aussi dans l’angiogenèse et le phénomène métastatique.
D’autre part, NF-κB semble également impliqué dans l’inflammatoin de la vessie que ce soit
dans un modèle d’inflammation induite par des lipopolysaccharide (LPS) [184] chez la souris
ou dans la cystite interstitielle chez l’homme [185].
Le NF-κB est constitutivement activé dans le cancer de prostate [186] et semble
fortement impliqué dans la progression de la maladie. En effet, NF-κB régule l’expression du
PSA, marqueur important de la progression du cancer de prostate et l’activité de liaison à
l’ADN du NF-κB NF est augmentée dans les xénogreffes androgéno-indépendantes par
rapport aux androgéno-dépendantes [187] . En parallèle, de plus en plus d’élément sont en
faveur d’une implication du NF-κB dans l’invasion, l’angiogenèse et le phénomène
métastatique. Ainsi, une étude in vitro sur des lignées PC3 ayant des potentiels invasifs
différents à montré que l’activité transcriptionnelle du NF-κB était 10 fois plus importante
dans les PC3 possédant le potentiel invasif le plus élevé que dans celles ayant un potentiel
invasif faible [188]. De même, l’inhibition de NF-κB par transfection de cellules tumorales
PC3 avec son inhibiteur IκB-α muté entraînait une inhibition de la tumorigenèse et de la
formation de métastases dans les souris nude, une inhibition de l’invasion et la diminution de
l’angiogenèse associée à une diminution de l’expression du VEGF, de l’Interleukine 8 [189].
40
1.2.4.2 La ββββ-caténine
La β-caténine est une molécule à la fois impliquée dans l’adhésion intercellulaire via
sa liaison avec l’E-cadhérine [190] et qui joue le rôle de transducteur de signal dans la voie de
signalisation Wnt [191]. Cette voie régule plusieurs fonctions comme la croissance cellulaire,
l’apoptose ou la migration cellulaire. Une activation constitutive de cette voie, en amont ou
due à des mutations de la β-caténine, conduit souvent à l’accumulation de celle-ci dans le
noyau et à l’expression de gènes favorisant la progression tumorale dans de nombreux tissus
dont le colon [192, 193].
Il y a peu d’éléments reliant la β-caténine au cancer vessical. Thievessen et coll. ont
montré qu’il n’y avait pas d’activation constitutive de la voie Wnt/β-caténine dans les TCC de
vessie [194] et aucune accumulation nucléaire ou cytoplasmique n’a pu être détectée dans
diverses lignées tumorales de vessie [195]. Cependant, une diminution de l’expression
protéique de la β-caténine semble être corrélée à la progression du cancer de vessie,
notamment du stade non invasif au stade invasif et pour les tumeurs de haut grade [196, 197].
Il en va tout à fait autrement pour le cancer de la prostate. Bien que de fréquence faible
(5%), des mutations de la β-caténine dans les tumeurs de prostate ont été mises en évidence
[198]. Cinq types de mutations de la β-caténine ont été détectées dans le cancer de prostate,
dont trois sont du même type que celles retrouvées dans le cancer du colon [199]. Ces
mutations apparaissent de façon focale et ne sont pas réparties sur l’ensemble du tissu
cancéreux, indiquant quelles apparaissent certainement au cours de la progression du cancer
[199]. Des études sur la localisation intra-cellulaire de la β-caténine ont montré une
accumulation anormale, c'est-à-dire au niveau du noyau et/ou dans le cytoplasme, dans les
tumeurs de prostate. La localisation anormale de la β-caténine semble être corélée avec les
tumeurs de haut grade et surtout avec l’acquisition de l’hormono-indépendance [200, 201]. La
41
relation entre hormono-résistance et accumulation anormale de β-caténine a également été
mise en évidence in vitro, en comparant la localisation de la molécule dans la lignée cellulaire
androgéno-dépendante, LNCaP, avec celle observée dans les lignées dérivées androgéno-
indépendantes, LNCaP TR et LNCaP SSR [201].
1.2.5 Etudes pré-cliniques et épidémiologiques
1.2.5.1 Cancer de vessie
Plusieurs études menées dans des modèles animaux ont donné des résultats
intéressants quant au potentiel chémopréventif et anti-tumoral des AINS dans le cancer de
vessie. Ainsi par exemple, l’aspirine et l’indomethacine diminuent la quantité d’adduits
formés entre un carcinogène (l’ochratoxine A) et l’ADN cellulaire dans la vessie de souris
[202]. Le sulindac et le ketoprofène diminuent de près de 70% l’incidence de TCC dans un
modèle de cancer de vessie chémo-induit chez la souris [203]. Les AINS empêchent
également la croissance tumorale en induisant l’apoptose, en inhibant la prolifération
cellulaire ou en diminuant le potentiel invasif des cellules tumorales : le piroxicam diminue le
volume des tumeurs de vessie en induisant l’apoptose des cellules tumorales dans le cancer de
vessie spontané chez le chien [204] et dans un modèle d’invasion in vitro, l’ibuprofène inhibe
le potentiel invasif d’une lignée de TCC vésical [205]. Enfin, l’indométhacine inhibe la
prolifération et perturbe le cycle cellulaire de cellules tumorales de vessie in vitro [206].
Peu d’études épidémiologiques ont porté sur l’impact des AINS sur le cancer de
vessie. Cependant, une étude cas-témoin américaine portant sur 1514 patients atteints de
cancer de la vessie a révélé que la prise régulière d’AINS était associée avec une réduction de
près de 20% du risque de cancer de vessie. Cette réduction dépendait du type d’AINS, avec le
meilleur résultat obtenu avec les acides acétiques (indomethacine, sulindac) alors que
42
l’aspirine et les oxicams étaient les moins efficaces [207]. D’autres études cas-contrôle
menées en Angleterre [54, 208] et en Allemagne [209] n’ont pas démontré de corrélation
entre la prise d’AINS et l’attenuation du risque de cancer de vessie.
1.2.5.2 Cancer de prostate
Les données tirées des études sur les animaux montrent que les AINS ont un rôle
inhibiteur du développement du cancer de prostate, notamment en inhibant le phénomène
métastatique. Ainsi, l’indométhacine diminue le nombre de métastases par animal [210, 211]
mais aussi le nombre d’animaux présentant des métastases [212] dans des modèles de
xénogreffes de cellules tumorales chez le rat. Des résultats similaires ont été obtenus avec le
piroxicam [213]. Par ailleurs, une étude menée avec le sulfone de sulindac (dérivé du sulindac
n’exerçant pas d’effet inhibiteur sur les enzymes COX) sur des xenogreffes de la lignée
androgéno-dépendante LNCaP chez le rat, a montré une forte inhibition du développement
des tumeurs. Cette inhibition était due à l’augmentation du taux de cellules tumorales
apoptotiques [214].
Plusieurs études épidémiologiques cas-contrôle ont démontré une association entre la
prise d’AINS et la diminution du risque de cancer de la prostate [215, 216]. Une seule étude
présentait une corrélation positive entre la prise d’AINS et l’augmentation risque de cancer de
prostate [54]. Des études de cohortes vont dans le sens de la diminution du risque de cancer
de prostate en fonction de la prise d’AINS [217, 218]. Il est intéressant de noter que la
diminution du risque de cancer lié aux AINS semble plus marquée chez les patients les plus
âgés, suggérant là encore un rôle des AINS dans l’inhibition de la progression de la maladie
[218].
43
Du fait de l’implication de COX-2 dans la carcinogenèse et le développement de ces
deux pathologies et des résultats encourageants obtenus au cours des essais précliniques, les
AINS semblent être une alternative intéressante pour développer de nouvelles stratégies
thérapeutiques ou chémopréventives pour la prise en charge des cancers de vessie et de
prostate. Malheureusement, leurs effets secondaires limitent largement leur utilisation.
44
1.3 Les effets secondaires des AINS
Les AINS classiques tels que l’aspirine, le diclofenac, le flurbiprofène, le sulindac (ou
sulphide de sulindac), l’ibuprofène, le piroxicam ou encore l’indométhacine inhibent à la fois
COX-1 et COX-2, sans être beaucoup plus sélectifs pour l’une ou l’autre forme (voir la
classification des AINS par Warner [219]) même si leur activité inhibitrice varie en fonction
des conditions expérimentales utilisées [36].
C’est donc cette inhibition non sélective à la fois de COX-2 et de COX-1, bloquant
l’activité des deux isoenzymes sans permettre une compensation « protectrice » pour
maintenir la physiologie normale des tissus qui est à l’origine de leurs effets secondaires.
Ces effets secondaires des AINS s’exercent principalement sur deux cibles distinctes : le
tractus gastro-intestinal et les reins.
1.3.1 Effets secondaires sur le tractus gastro-intestinal
Une dose unique d’aspirine (650mg) cause des hémorragies de la muqueuse gastrique
et 650mg d’aspirine pris en quatre fois au cours de 24h entraîne une érosion de la muqueuse
gastrique [220]. Ces événements sont bénins et n’entraînent généralement pas de
complications telles que saignements importants, obstruction ou perforation. Ces
complications se produisent généralement chez des sujets présentant un ulcère. Or, des ulcères
gastriques ou duodenaux se retrouvent chez 15 à 30% des patients consommant régulièrement
des AINS [221].
Plusieurs études ont également montré que l’utilisation d’AINS augmentait le risque
de complications de 2 à 6 fois [222-224].
45
La capacité de l’estomac et des intestins à résister aux attaques des enzymes
digestives, des acides gastriques et d’agent irritants ingérés est fondée sur plusieurs
phénomènes physiologiques régulés étroitement par les prostaglandines : sécrétion de mucus
et de bicarbonate, vasodilatation des muqueuses et rapide régénération épithéliale [225, 226].
Les AINS, par leur capacité à inhiber COX-1 et COX-2 inhibent la production des
prostaglandines indispensables à ces phénomènes et entraînent la formation d’ulcères [27].
Ainsi les AINS inhibent la vasodilatation induite par les PGs des vaisseaux de la muqueuse,
entraînant une réduction du flux sanguin gastrique [227-229]. La diminution du flux sanguin
entraîne une diminution rapide du pH au niveau du site touché ce qui réduit la capacité de la
muqueuse à résister aux reflux acides et à régénérer son épithélium [230] d’où la formation
d’une lésion.
Un autre effet qui semble impliqué dans la formation des lésions gastro-intestinales est
l’accumulation de neutrophiles autour des vaisseaux sanguins après la prise d’AINS. Ce
phénomène a été mis en évidence chez le rat après administration d’AINS [231-234] et il a été
montré qu’il pouvait être inhibé par administration de prostaglandines exogènes [232, 235].
L’inhibition de la fixation des neutrophiles sur les vaisseaux, que ce soit grâce à des anticorps
dirigés contre la molécules d’adhésion leucocytaire CD 18 des neutrophiles ou des anticorps
dirigés contre des molécules d’adhésion endothéliales diminue les effets nocifs des AINS sur
le tractus digestif dans les rats et les lapins [234, 236]. L’adhésion des neutrophiles découlant
de l’action des AINS pourrait induire des lésions gastro-intestinales par au moins deux
mécanismes :
� la libération de radicaux dérivés de l’oxygène (ROS) [237, 238]. Ce phénomène est là
encore inhibé par les prostaglandines [239]
� l’obstruction des capillaires sanguins, entraînant la aussi une diminution du flux
sanguin.
46
Ainsi, l’action délétère des AINS sur le tractus digestif est fortement liée à leur
capacité à éliminer, via une inhibition à la fois de COX-1 et de COX-2, la production de
prostaglandines nécessaire pour maintenir l’homéostasie au niveau du tractus digestif et éviter
l’accumulation de neutrophiles au niveau des vaisseaux de la muqueuse gastro-intestinale.
1.3.2 Effets secondaires sur les reins
L’autre organe touché par les effets secondaires des AINS est le rein où des lésions
comme la nécrose papillaire, des nephrites interstitielles ou encore une réduction de la
perfusion rénale se produisent après un traitement prolongé d’AINS [240]. Environ 1 à 5%
des patients exposés aux AINS développent des lésions graves [241].
En effet, dans cet organe, les prostaglandines PGE2 et PGI2 sont synthétisées par les
structures vasculaires et tubulaires et régulent la dynamique sanguine et les fonctions du
transport tubulaire [242, 243]. C’est grâce à ces PGs, notamment à la PGE2, qu’un flux
sanguin et un fonctionnement normal du rein est maintenu en cas de stress physiologique
[244]. Ce métabolite augmente en particulier le flux sanguin, le taux de filtration
glomérulaire et l’excrétion de sels et d’eau. Une inhibition de la synthèse des prostaglandines
par les AINS a donc des conséquences directes sur la physiologie de l’organe, menant par
exemple à une rétention d’eau et de sels entraînant des œdèmes et de l’hypertension. Les
AINS affectent également sévèrement la fonction rénale et le taux de filtration glomérulaire
[245]. Enfin, l’inhibition de la synthèse de PGs par les AINS entraîne la diminution du flux
sanguin dans le rein et la dégradation des tissus, notamment par nécrose.
47
C’est à cause de ces effets secondaires que les inhibiteurs spécifiques de COX-2 ont
étés élaborés, permettant de cibler l’isoforme majoritairement impliquée dans l’inflammation
et le cancer sans interférer avec l’activité de COX-1.
Parallèlement une autre méthode, la greffe d’un groupement libérant de l’oxyde
nitrique (NO), a été mise en œuvre pour diminuer les effets secondaires des AINS classiques
tout en conservant leurs propriétés intrinsèques (comme l’effet d’antiagrégation plaquettaire
par exemple, absent chez les inhibiteurs spécifiques de COX-2) et améliorant leur potentiel
anti-tumoral .
48
1.4 L’oxyde nitrique (NO) une molécule étonnant
1.4.1 Généralités
L’oxyde nitrique (NO) est une molécule lipophile et hautement diffusible produite
naturellement par les cellules. Elle est impliquée dans de nombreux phénomènes biologiques
tels que la vasodilatation [246], l’inhibition de l’agrégation des plaquettes [247], la
transmission synaptique [248], la cytotoxicité des macrophages ou encore la mort cellulaire.
Le NO endogène est synthétisé à partir de la L-arginine grâce à une famille d’enzymes
appelées NO synthases (NOS). Il existe trois formes de NOS : endothéliale (eNOS),
neuronale (nNOS) et inductible (iNOS). Les enzymes eNOS et nNOS sont des enzymes
calcium-dépendantes exprimées de façon constitutive dans les cellules. Elles produisent du
NO à des concentrations faibles (de l’ordre du pico au nano-molaire). L’expression d’iNOS
par contre, est activée par de multiples stimulations extérieures telles que des produits
microbiens (lipopolysaccharides) [249], des protéines virales [250], des agents impliqués dans
le phénomène inflammatoire comme les cytokines [251, 252] ou encore par le tumor necrosis
factor alpha (TNFα) ou l’interféron gamma (IFNγ) [253]. A la différence d’eNOS et nNOS,
cette enzyme est calcium-indépendante et produit localement du NO en grande quantité (de
l’ordre du micro-molaire).
49
1.4.2 Le NO, une molécule paradoxale
La grande particularité du NO est que cette molécule est susceptible de produire des
effets totalement contradictoires. D’une part le NO peut inhiber l’apoptose et/ou stimuler la
prolifération et d’autre part il peut exercer un effet antiprolifératif et/ou pro-apoptotique.
Une idée communément admise pour expliquer ce phénomène est que l’activité du NO
est fonction de sa concentration : à faible concentration, le NO induit la prolifération cellulaire
et protège les cellules de l’apoptose ; à forte concentration NO inhibe la prolifération
cellulaire et induit le phénomène apoptotique (voir figure 5). Par exemple, de faibles doses de
NO protègent les lymphocytes B de l’apoptose induite par des infections virales [254] alors
qu’à fortes doses, le NO induit l’apoptose dans de nombreux types cellulaires comme les
macrophages, les hepatocytes ou les neurones [255-257] . Hajri et coll. ont montré que pour
un même donneur de NO, le nitroprussiate de sodium (SNP) et dans un même modèle
cellulaire, la prolifération cellulaire était augmentée à faible concentration du donneur, alors
qu’elle était inhibée de façon concentration dépendante après une concentration seuil [258].
L’activité du NO peut également dépendre du modèle ou du type de cellule utilisé. Par
exemple, le donneur S-nitroso-N-acetyl-D,L-penicillamine (SNAP) inhibe la prolifération de
cellules endothéliales de veines ombilicales [259] alors que ce même donneur stimule la
prolifération des cellules osteogéniques [260].
Enfin, l’activité du NO peut aussi être fonction du mode de production du NO. Celui-
ci peut être produit de façon endogène via les NOS ou résulter d’un donneur exogène.
Lemaire et coll. ont comparé l’effet cytostatique de la production endogène de NO et de
plusieurs donneurs de NO exogènes sur les cellules humaines d’erythroleucemie (K562). Ils
ont pu montrer que les mécanismes impliqués dans l’effet cytostatique étaient différents en
fonction des diverses sources de NO [261].
50
Figure 5: Les paradoxes du NO.
Ce schéma résume les différents effets du NO en fonction de sa concentration. Cependant,
d’autres facteurs tels que le type cellulaire, le type de donneur de NO ou l’environnement
autour de la source de NO peuvent venir moduler les effets du NO en plus du paramètre
« concentration du NO ».
51
1.4.3 Biologie chimique du NO
L’activité du NO dépend fortement à la fois de sa concentration et de la forme
chimique sous laquelle il se trouve dans les cellules. Son action est définie comme étant
directe lorsque le NO interagit directement avec des molécules biologiques. Elle est indirecte
lorsque le NO a, au préalable, interagi avec d’autres molécules : anion superoxyde ou
oxygène moléculaire, générant des espèces réactives dérivées de l’azote et de l’oxygène
(communément appelées reactive nitrogen/oxygen species ou RNOS). Ce sont ces espèces
chimiques qui vont alors interagir avec les molécules biologiques (voir figure 6).
Ces effets directs ou indirects peuvent également être classés en fonction de la
concentration locale du NO, produit de manière endogène ou apporté de façon exogène.
Ainsi, les effets directs du NO ont généralement lieu à faibles concentrations (inférieures à
1µM) et les effets indirects à fortes concentrations locales en NO (supérieure à 1µM).
1.4.3.1 Effets directs du NO
Les réactions importantes en biologie sont celles qui sont assez rapides pour avoir un
impact physiologique. Le NO n’interagit que très lentement avec les groupements thiols ou
amines. Par contre, il réagit très rapidement avec certains complexes métalliques et certains
radicaux libres pour induire une réponse biologique.
Le NO peut interagir avec les métaux de plusieurs façons différentes :
• par action directe sur le noyau métallique de métalloprotéines entraînant la
formation de complexes métal-nitrosyl (Me-NO). Les métaux concernés sont le fer, le
cuivre et le zinc. Cette métal-nitrosylation permet d’inhiber ou d’activer des enzymes ou
des protéines comportant un hème (par exemple les enzymes de la chaîne respiratoire
52
comportant un groupement Fe-S), d’inactiver les facteurs de transcriptions (en agissant
sur le zinc des structures en doigt de zinc) [262] ou les protéines se liant à l’ARNm
(comme par exemple l’iron regulatory protein 1). C’est également par ce mécanisme (ici
la formation d’un Fe-nitrosyl) que le NO active la guanylate cyclase, enzyme produisant
le cGMP, messager secondaire induisant de nombreuses fonctions de régulation dans les
cellules [263]. Au contraire, toujours via la formation d’un complexe Fe-nitrosyl, l’oxyde
nitrique peut inhiber l’activité de l’iNOS. En effet, plusieurs études ont montré que le NO
exerce un rétrocontrôle négatif sur iNOS pour réguler sa propre production [264, 265]. Ce
mécanisme permet également au NO de se fixer sur la deoxy-hémoglobine pour former la
nitrosyl-hémoglobine (HbFe(II)NO), tout en gardant sa bioactivité [266, 267]. C’est en
partie sous cette forme que le transport du NO sera effectué à travers l’organisme.
• par réaction d’oxydo-réduction avec les complexes métal-oxygène. La réactivité du
NO avec les métaux ne se limite pas à des liaisons covalentes. De nombreux complexes
métal-oxygène réagissent rapidement avec le NO. Un exemple connu est l’interaction du
NO avec l’oxyhémoglobine pour former la met-hémoglobine et du nitrate (NO3-) [268,
269]. Cette réaction est un des mécanismes qui permet de contrôler la concentration du
NO in vivo [270]. C’est également une des premières étapes du mécanisme de
détoxification du NO.
• par réaction d’oxydo réduction avec des oxo-complexes métalliques. Les oxo-
complexes métalliques sont issus de l’oxydation de métaux ou de complexes métal-
oxygène par des agents tel que le peroxyde d’hydrogène. Ces oxo-complexes métalliques
sont des oxydants très puissants pouvant entraîner des dommages cellulaires. Le NO
réagit rapidement en réduisant ces oxo-complexes métalliques, exerçant ainsi un effet
protecteur contre ces agents oxydants [271, 272] et plus généralement protégeant la
cellule contre les dommages induits par les peroxydes [273].
53
Le NO est également capable de réagir de manière directe avec plusieurs radicaux
libres comme par exemple les radicaux tyrosyl [274] ou encore les radicaux alkoxy ou peroxy
résultants de la peroxydation des lipides [275], protègeant ainsi les cellules contre les
peroxydes liés aux lipides ou limitant la peroxydation lipidique pouvant créer des maladies
comme l’athérosclérose [276, 277]. Le NO interagit aussi avec les radicaux à centre carboné
produits dans l’ADN par l’action de radiations ionisantes, pour former des adduits C-nitrosés
très stables, augmentant ainsi la sensibilité des cellules aux radiations [278, 279].
D’une façon générale, le NO semble exercer un effet protecteur contre les radicaux
libres dérivés de l’oxygène ou ROS (reactive oxygen species) [280].
1.4.3.2 Effet indirects du NO
Les effets indirects du NO sont dus à l’interaction des RNOS avec différentes cibles
biochimiques. Les deux principaux RNOS sont le trioxyde de nitrogène (N2O3) issu de la
réaction entre le NO et l’oxygène, et le peroxynitrite (ONOO-) issu de la réaction entre le NO
et l’anion superoxyde (O2-). Ces RNOS agissent essentiellement par oxydation, nitrosation et
nitration. Si elles n’interagissent pas avec d’autres molécules, finissent pas se dégrader en
nitrates et nitrites.
Les principaux effets dus aux RNOS sont :
• la S-nitrosylation : la S-nitrosylation est due à la réaction entre N2O3 et un
groupement thiol porté par la cystéine. Cette nitrosylation modifie la fonction des
protéines, en augmentant ou en inhibant leur activité, par exemple en diminuant l’activité
des caspases [281] ou en stimulant celle de la thioredoxine [282]. La S-nitrosylation va
également réguler l’activité de facteurs de transcription tels que le NF-κB [283] ou
l’hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) [284]
54
• la déamination passant par la nitrosation d’amines : le N2O3 est également capable de
nitrosyler les amines, formant des nitrosamines. Ces nitrosamines sont très rapidement
transformées en alcool avec libération de N2. La résultante de ces réactions est donc une
déamination :
NH2-R + N2O3 → R-NHNO + NO2- R-NHNO → R-OH + N2
• la nitrosation de la tyrosine: cette réaction est due au ONOO- [285, 286]. L’impact
exact de la nitration de la tyrosine dans la physiologie cellulaire n’est pas encore très bien
déterminé. Il se pourrait cependant que les modifications de structure et de fonction que
cette nitrosation entraîne au niveau protéique contribuent au phénomène de
carcinogenèse (voir plus loin).
Le ONOO- est également capable d’oxyder les groupements thiols et de générer des
acides sulféniques et sulfoniques.
L’action du NO dépend donc de sa concentration, de la nature du donneur et de
l’environnement (teneur en oxygène ou présence de l’anion superoxyde) proche de la source
de NO. Ces éléments vont déterminer la forme chimique de NO (NO, N2O3, ONOO-…) qui
sera générée. Le type cellulaire, quant à lui, à également une influence puisque l’action du NO
ou de ses dérivés est liée au type de cibles qu’il pourra rencontrer au niveau de la cellule.
55
Figure 6 : Réactions chimiques générées à partir du radical ·NO.
Le NO agit de plusieurs façons au niveau moléculaire. A : Il peut agir de manière directe en
formant des complexes métal-nitrosyl (Me-NO) avec les métaux conenus dans les hèmes
protéiques ; il peut agir de manière indirecte par l’intermédiaire des espèces nitrogène-oxyde
réactives (RNOS) qu’il engendre. B : Voies indirectes liées au peroxynitrite (ONOO-) : le NO
va nitroser des tyrosines ou générer des acides sulféniques et sulfoniques (R-SO2H ou R-
SO3H). C : Voies directes liées au trioxyde de nitrogène (N2O3) : le NO peut ainsi nitrosyler
des amines pour former des nitrosamines ou S-nitrosyler les groupements thiols des résidus
cystéines des protéines.
56
1.4.4 Intérêts du NO pour une association avec les AINS
Il est intéressant d’examiner à présent les avantages d’utiliser le NO pour réduire les
effets secondaires des AINS et pourquoi une combinaison NO/AINS pourrait s’avérer
bénéfique dans la lutte contre le cancer.
1.4.4.1 Effet gastroprotecteur du NO
En temps normal, les prostaglandines protègent la muqueuse par plusieurs mécanismes
incluant la dilatation des vaisseaux sanguins. Il a été évoqué dans le chapitre précédent que
l’administration d’AINS entraînait l’inhibition de la formation de prostaglandines dans la
muqueuse de l’estomac, entraînant une diminution du flux sanguin via la constriction des
vaisseaux sanguins de la muqueuse et facilitant l’adhésion de neutrophiles sur ces mêmes
vaisseaux. La résultante de ces phénomènes est une ulcération et une hémorragie de
l’estomac.
Or des observations expérimentales ont montré que le NO réduisait les blessures de la
muqueuse gastrique [287, 288]. L’inhibition de la synthèse de NO entraîne les mêmes effets
qu’une inhibition des prostaglandines, à savoir une diminution du flux sanguin et l’adhérence
de neutrophiles à l’endothélium des vaisseaux de la muqueuse gastrique [289-291] . Par
ailleurs, il a été montré que le NO stimulait la sécrétion de mucus, autre facteur de protection
de l’estomac [292] et maintenait l’intégrité du flux sanguin de la muqueuse gastrique [293].
Enfin, l’adhésion de neutrophiles sur les cellules endothéliales était inhibée par le NO [294].
Le NO pourrait donc jouer un rôle de substitution en mimant les effets des
prostaglandines et contribuer ainsi à la protection de la muqueuse gastrique.
57
1.4.4.2 Effet anti-tumoral du NO
En plus de l’effet gastroprotecteur, le NO possède également des propriétés pro-
apoptotiques et antiprolifératives qui pourraient venir s’associer avec les propriétés anti-
tumorales des AINS.
1.4.4.2.1 NO et apoptose
Les premières observations concernant l’effet apoptotique du NO ont étés faites sur les
macrophages [295, 296]. Depuis, l’induction de l’apoptose par le NO a été vérifiée dans de
nombreux autres types cellulaires [297].
Le NO peut induire l’apoptose cellulaire selon plusieurs mécanismes (voir figure7) .
L’accumulation de la protéine p53.
Les dommages à l’ADN infligés par les RNOS induisent une surexpression de la
protéine p53 et son accumulation dans les cellules via à une stabilisation qui empêche sa
dégradation [298-300]. Cette accumulation de p53 induit l’arrêt du cycle cellulaire via la
surexpression de p21 [301] pour permettre la réparation de l’ADN. Si la réparation n’est pas
possible, la cellule entre en apoptose. La surexpression de p53 entraîne une diminution de
l’expression des protéines anti-apoptotique Bcl-2 et Bcl-XL et une augmentation de
l’expression de la protéine pro-apoptotique Bax [302, 303]. Ceci initie la cascade des
caspases via la libération du cytochrome c. Cependant, le NO induit également l’apoptose
dans des cellules dépourvues de p53 [298]. Il existe donc des mécanismes p53-indépendants
permettant au NO d’exercer son effet pro-apoptoqtique
58
La voie mitochondriale.
Le NO est capable de moduler la transition de perméabilité en activant l’ouverture des
pores mitochondriaux [304, 305]. Cette ouverture entraîne la chute du potentiel
transmembranaire mitochondrial et la libération du cytochrome c qui active la voie des
caspases dans le cytoplasme ainsi que d’autres facteurs pro-apoptotiques mitochondriaux tel
que l’apoptosis inducing factor (AIF) [306].
Le NO, notamment via son dérivé peroxynitrite, peut également inhiber la respiration
mitochondriale [307, 308]. A faible concenration, le NO inhibe le cytochrome c oxydase ce
qui amène une augmentation de la production d’anion superoxyde et de H2O2 et, de ce fait, à
la formation de peroxynitrite. Le peroxynitrite est capable d’induire l’apoptose dans plusieurs
types cellulaires tels que les thymocytes [309], les cellules neuronales [310] ou encore des
cellules tumorales [311].
A plus forte concentration, le NO inhibe de nombreuses protéines impliquées dans la
respiration mitochondriale via des phénomènes d’oxydation ou de S-nitrosylation. Le
peroxynitrite induit le gonflement de la mitochondrie, la dépolarisation de la membrane et
l’altération de la transition de perméabilité, signes de mort cellulaire et particulièrement de la
nécrose.
La voie du cGMP.
Une des voies par laquelle le NO induit l’apoptose est la voie du cGMP. Il a été
montré que la liaison du NO sur le fer de l’hème de la guanylyl cyclase activait la production
de cGMP et induisait l’apoptose dans des cardiomyocytes [312, 313].
59
La voie des céramides.
Il a été rapporté que l’apoptose induite par différents donneurs de NO dans différents
types cellulaires était accompagnée d’une augmentation de la formation de céramides,
inducteurs bien connus de l’apoptose [314]. C’était notamment le cas du SNP dans les
cellules de leucémie HL-60 [315] et du SNAP ou du S-nitrosogluthatione dans des cellules
glomérulaires endothéliales ou des cellules de neuroblastome [316, 317]. La voie des
céramides est ainsi une autre voie p53 indépendante utilisée par le NO pour déclencher
l’apoptose.
Activation de kinases.
Plusieurs études ont révélé que le NO pouvait induire l’apoptose en passant par
l’activation de la c-Jun N-terminal kinase (JNK)/stress- activated protein kinase (SAPK), de la
p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) et de la caspase 3 [318, 319]. L’inhibition de
l’activité de p38 MAPK protégeait les cellules tumorales HL-60 de l’apoptose induite par le
SNP [318]. Ces kinases sont donc importantes pour l’induction de l’apoptose induite par le
NO.
60
Figure 7: Les différentes voies d’induction de l’apoptose par le NO.
A : le NO entraîne une accumulation de p53, ce qui va mener à une prévalence de la protéine
pro-apoptotique Bax engendrant la libération du cytochrome c par la mitochondrie et
l’activation de la voie des caspases. B : le NO peut faire chuter le potentiel transmembranaire
de la mitochondrie ou perturber sa respiration, entraînant la libération du cytochrome c et
l’activation de la voie des caspases. C : le NO peut entraîner une surexpression de céramides,
qui vont agir sur la mitochondrie et permettre la libération du cytochrome c donc l’activation
de la voie des caspases. D : le NO active la guanylyl cyclase, entraînant la production du
cGMP. Ce « second messager » induit une cascade signalétique aboutissant au phénomène
apoptotique dans certains types de cellules. E : Le NO active des kinases qui semblent
impliquées dans l’induction de l’apoptose.
61
1.4.4.2.2 NO et antiprolifération
En plus de l’effet pro-apoptotique, le NO exerce également un effet antiprolifératif sur
de nombreux types cellulaires [320-322] et notamment des cellules tumorales [261, 323,
324].
Les mécanismes impliqués dans cet effet antiprolifératif sont de deux types différents
(voir figure 8) : soit cGMP dépendants, soit cGMP-indépendants et sont généralement
fonction du modèle d’étude utilisé.
La voie cGMP-dépendante.
Comme il a déjà été discuté plus haut, le NO active la guanylyl cyclase soluble et
induit la production du second messager cGMP. Bien que le mode d’action du cGMP dans
l’effet antiprolifératif du NO ne soit pas connu, l’inhibition de la production de ce second
messager entraînait l’inhibition de l’effet antiprolifératif [325]. Dans le même ordre d’idée,
l’utilisation d’un analogue du cGMP, le 8-bromo-cGMP, induisait le même effet
antiprolifératif que le NO dans certains modèles [321, 322, 325] et l’utilisation d’un inhibiteur
de la phosphodiestérase (empêchant la dégradation du cGMP), le zaprinast, augmentait l’effet
antiprolifératif sur des cellules musculaire lisses [326]. Enfin, chen et coll ont montré que le
NO était incapable d’inhiber la synthèse d’ADN dans des cellules musculaires lisses de rats
âgés chez lesquels la guanylyl cyclase était dépourvue de sa sous-unité beta alors que
l’inhibition avait bien lieu dans les mêmes cellules de rats jeunes avec une guanylyl cyclase
intacte [327].
62
Les voies cGMP-indépendantes.
• Inhibition de la voie de synthèse des polyamines. Les polyamines, à savoir la
putrescine, la spermidine et la spermine, sont des molécules importantes pour la
croissance cellulaire [328]. L’inhibition de la synthèse des polyamines par le NO se fait
via l’inactivation de deux enzymes primordiales dans la transformation de l’arginine en
polyamines, l’arginase [329, 330] et l’ornithine décarboxylase (ODC) [320, 330-332].
L’arginase transforme l’arginine en ornithine. L’ODC convertit l’ornithine en putrescine,
qui est ensuite convertie en spermidine et spermine. Le NO inactive ces enzymes grâce à
la S-nitrosylation de résidus cystéines [333, 334], entraînant une diminution des
polyamines dans la cellule et ainsi un arrêt de leur prolifération.
• Inhibition de la ribonucléotide réductase. Il a été montré que le NO pouvait inhiber
la synthèse de l’ADN en inhibant la ribonucléotide réductase [335-337] via une réaction
avec un radical tyrosyl [274, 338].
63
Figure 8 : Voies impliquées dans l’effet antiprolifératif du NO.
A : voie cGMP dépendante. Le NO active la guanylyl cyclase et par conséquent la production
de cGMP. Le cGMP active des voies de signalisation menant à un effet antiprolifératif. B : Le
NO inhibe la synthèse d’ADN en bloquant la ribonucléotide réductase. C : voie des
polyamines. Le NO inhibe l’arginase et/ou l’ODC, bloquant ainsi la formation des polyamines
nécessaires à la prolifération cellulaire.
64
1.4.5 NO et carcinogenèse
1.4.5.1 NO et lésions de l’ADN
Les actions délétères du NO sur l’ADN sont dues aux RNOS et peuvent être de
plusieurs types :
� Une déamination. Le N2O3 est un puissant agent nitrosylant capable de déaminer les
bases constituant l’ADN [86, 339]. Cette déamination transforme la guanine en xanthine
ou en oxanosine, l’adénine en hypoxanthine, la cytosine en uracile et la methyl-cytosine
en thymine et entraîne des cassures dans l’ADN et des mutations.
� Une formation d’agents alkylants genotoxiques. Le N2O3 peut réagir avec des
amines secondaires et former des N-nitrosamines. Ces N-nitrosamines endommagent
l’ADN via un phénomène d’alkylation. Une formation accrue de ces nitrosamines a été
décrite in vivo dans des modèles animaux d’inflammation aiguë et chez les sujets
humains avec des infections ou des phénomènes inflammatoires [340].
� Diverses réactions dues au peroxynitrite. Le ONOO- est une molécule très réactive
capable d’endommager l’ADN par des réactions de nitration, nitrosation et oxydation
[341], il induit des cassures de l’ADN in vitro [342] et entraîne également la formation
d’adduits tel que la 8-nitroguanine ou la 8-oxoguanine [343-345].
De façon générale, les RNOS induisent des mutations et des cassures dans l’ADN
[339].
65
1.4.5.2 Dommages épigénétiques liés aux RNOS
En plus d’un effet direct sur l’ADN, les dérivés du NO sont en mesure d’entraîner des
modifications de structure et de fonction de nombreuses protéines via des réactions de
nitrosation, nitrosylation ou d’oxydation.
La nitrosation du résidu tyrosine des protéines a souvent pour conséquence de leur
faire perdre leur activité enzymatique [346, 347]. L’accumulation de p53 induite par un excès
de NO est concomittante avec la perte de la capacité du p53 à se lier à l’ADN [92]. Cette
altération pourrait être due à une S-nitrosylation [92] et/ou à la nitration de tyrosines [348].
Au contraire, le NO active le protooncogène c-Ha-ras p21 via S-nitrosylation [349].
Le NO et ses dérivés inhibent des enzymes importantes pour l’intégrité de la cellule,
comme par exemple les enzymes de réparation de l’ADN [350]. Ils peuvent aussi empêcher
l’apoptose en inhibant les caspases ou d’autres enzymes pro-apoptotiques [351], stimuler
l’activité replicative des cellules en activant la telomérase [352] ou encore favoriser l’invasion
des cellules en activant des métalloprotéases [353]. Enfin, le NO et ses dérivés stimulent
également l’angiogenèse[354].
Par son action directe sur l’ADN et son action épigénétique, NO semble donc
contribuer à la carcinogenèse et au développement tumoral.
On retrouve ici tout le côté paradoxal du NO qui peut ainsi être utilisé comme agent
anti-tumoral via ses propriétés pro-apoptotiques et antiprolifératives, mais qui contribue
également à l’initiation du phénomène cancéreux et au développement de cette maladie. Dans
ce cas encore, tout dépend de l’environnement cellulaire entourant la source de NO, de la
concentration de NO libéré et du type de cibles accessibles aux diverses éspèces chimiques
dérivées du NO produites.
66
1.5 Les anti-inflammatoires non stéroïdiens donneurs
d’oxyde nitrique (NO-AINS)
Ces nouvelles molécules ont été synthétisées dans l’idée de conserver les propriétés
des AINS tout en diminuant leurs effets secondaires via l’activité gastroprotectrice du NO.
Les NO-AINS constituent ainsi une nouvelle classe de molécules donneuses de NO, sensée
combiner les propriétés de chacune de leurs deux parties principales : l’AINS et le NO.
1.5.1 Structure
Les anti-inflammatoires non-stéroïdiens donneurs d’oxyde nitrique (NO-AINS) sont
des AINS classiques sur lesquels un groupement donneur d’oxyde nitrique a été greffé via un
groupement chimique nommé espaceur (Figure 9A). Ils ont étés élaborés et développés au
début des années 90 et caractérisés pour la première fois par Wallace et Cirino [355].
La partie AINS peut être constituée, en théorie, de n’importe quel AINS classique. La
fixation de l’espaceur sur l’AINS se fait par esterification. Cette réaction est d’autant plus
aisée que l’AINS présente des groupements réactifs adéquats pour établir des liaisons
chimiques covalentes entre l’AINS et l’espaceur (par exemple –COO- dans le cas de
l’aspirine).
L’espaceur peut être aliphatique ou aromatique. Il semblerait que sa longueur et sa
nature, (notamment le positionnement isomérique) puissent influer sur la capacité de
libération du NO par la molécule NO-AINS [356]. De plus, les NO-AINS comportant un
espaceur aromatique apparaissent plus actifs que ceux ayant un espaceur aliphatique : le NO-
67
aspirine NCX 4016, composé d’un espaceur aromatique, s’est révélé être un inhibiteur de
cyclooxygenase et un libérateur de NO plus efficace que le NCX 4215, disposant d’un
espaceur aliphatique [357]. La cinétique de libération du NO semble donc jouer un rôle
important dans l’activité finale des NO-AINS.
Enfin, l’espaceur est relié à un groupement nitrooxy (-ONO2) qui va servir de donneur
d’oxyde nitrique.
Compte tenu du grand nombre d’AINS existant et des différents espaceurs utilisables
pour élaborer un NO-AINS, cette classe de molécule n’a pas encore livré tout son potentiel
thérapeutique.
1.5.2 Métabolisation
1.5.2.1 Un catabolisme non spontané
Contrairement aux donneurs d’oxyde nitrique classiques tel que le SNP, le SNAP (S
nitroso N acetyl D,L-penicillamine) ou encore le isosorbide-5-mononitrate, les NO-NSAIDs
ne libèrent pas spontanément de NO en milieu aqueux. Plusieurs études montrent la nécessité
d’un facteur biologique, contenu dans le sang, les plaquettes ou les cellules pour que le
catabolisme des NO-AINS ait lieu. En effet, Wallace et coll. ont montré dans un système in
vitro que le NO-aspirine NCX 4215 était capable de relarguer du NO en présence de
plaquettes sanguines humaines alors qu’il n’y avait aucune libération de NO lorsque NCX
4125 était incubé dans le milieu de culture seul [358]. De même, dans un modèle murin de
ligature du pylore, l’accumulation de nitrates et de nitrites, dérivés métaboliques du NO, était
significativement plus élevé dans le sérum des animaux après administration orale de NCX
4016 que dans le cas des rats témoins [359].
68
Les enzymes impliquées dans l’hydrolyse des NO-AINS permettant la libération du
NO et de l’espaceur ne sont pas encore précisément identifiées. Cependant, plusieurs données
laissent à penser que l’hydrolyse de la liaison AINS-espaceur serait le fait d’ésterases, tandis
que la libération du NO pourrait résulter d’autres enzymes, membres de la famille des
cytochromes, capables de rompre la liaison espaceur-NO (figure 9B) [360].
Figure 9: Les NO-AINS, structure et métabolisation.
A : Structure d’un NO-AINS. B : Hydrolyse du NO-AINS. Par une estérase qui génère la
partie AINS et l’espaceur-NO2 et/ou par une enzyme de la famille des cytochromes qui coupe
la liaison entre l’espaceur et le groupement NO2, rapidement transformé en NO. C : Forme
dénitrée du NO-AINS
69
1.5.2.2 Une libération en petite quantité et étalée dans le temps
La libération du NO peut être mesuré de différentes façons, plus ou moins directes :
augmentation du taux de GMP cyclique dans les plaquettes sanguines et inhibition de
l’agrégation plaquettaire in vitro, ou bien quantification des dérivés métaboliques du NO
(nitrites/nitrates) et de la nitrosylhemoglobine in vivo. La nitrosylhémoglobine résulte de
l’interaction du NO avec la deoxy-hémoglobine et représente un réservoir important du NO
sous sa forme bioactive dans le sang [266, 267]. L’autre forme de stockage bioactif du NO est
la formation de S-nitrosothiols (RSNO) avec des protéines plasmatiques contenant un
groupement thiol.
Les études menées notamment sur différentes NO-aspirines ont montré que la
libération du NO se faisait beaucoup plus lentement et en plus petite quantité qu’avec les
donneurs d’oxyde nitrique classiques tel que le SNP. En effet, la NO-aspirine NCX 4125,
bien que biologiquement active, n’entraînait aucun effet significatif sur la pression sanguine
de rats anesthésiés lorqu’elle était administrée à forte dose (166mg/kg) alors qu’une dose
équimolaire de SNP déclenchait en 5 minutes une forte hypotension pouvant conduire à la
mort des animaux [358]. L’étude de Carini et coll. chez l’homme a permis de montrer qu’une
dose unique de NCX 4016 de 1,6g prise oralement, entraînait une augmentation des RSNO
(forme bioactive du NO) de 2,7 fois par rapport à la concentration basale, avec une
concentration maximale en RSNO de 350 nM [361]. Aux RSNO s’ajoutent le NO sous la
forme de nitrosylhémoglobine et celui généré par une rétroconversion des nitrites, ces deux
formes étant également des formes actives du NO dans l’organisme. Cependant, la dose
relativement élevée de NCX 4016 ingérée par les volontaires sains est bien tolérée et la
70
quantité de NO bioactif retrouvée dans leur organisme n’est pas très élevé par rapport à la
dose de NO-aspirine absorbée.
Cette libération lente avait été montrée également in vivo dans des modèles animaux.
La libération de NO à partir du NO-aspirine NCX 4016 administré oralement à des rats, bien
que détectable après 1h, montre un pic de libération maximal entre 4 et 10 heures après
administration du NO-AINS [362]. De la même façon, Carini et coll. ont montré un pic
maximal de nitrosylhemoglobine (HbFe (II) NO) entre 4 et 6 heures après administration de
NCX 4016. D’autre part, la cinétique de formation de nitrosylhemoglobine in vitro dans le
sang de rats à partir NCX 4016 est quasi superposable à celle observée avec l’isosorbide-5-
mononitrate, un donneur de NO connu pour sa libération lente [363].
La cinétique d’apparition de métabolites des parties AINS est en général superposable
à celle de l’apparition du NO in vivo, confirmant l’hypothèse d’un catabolisme lent de ces
molécules [364]. L’étude menée avec la NO-aspirine NCX 4016 chez des volontaires sains
humains confirme également la libération lente du NO par les NO-AINS chez l’homme [361].
1.5.2.3 A quel niveau la dégradation des NO-AINS se fait elle dans
l’organisme ?
Au jour d’aujourd’hui, les études menées avec la NO-aspirine NCX 4016 laissent à
penser que l’assimilation des NO-AINS administrés oralement à lieu dans la partie supérieure
de l’intestin. En effet, Carini et coll ont montré que la NCX 4016 était stable en milieu
gastrique [364]. Le même groupe a également montré qu’in vivo, le pic de
nitrosylhemoglobine observé après administration orale de NCX 4016 était obtenu après 4 à
6h alors qu’il est obtenu après 2h lorsque la même molécule est administrée par injection
71
intraperitonéale [363]. L’absorption ne se faisant quasiment pas dans l’estomac, elle se fait
donc très probablement dans l’intestin.
Une fois passés dans le sang, les NO-AINS sont probablement hydrolysés en AINS et
espaceur-NO en majeure partie par un premier passage dans le foie [365], l’autre partie étant
hydrolysée par les estérases contenues dans le sang. Dans un second temps, et de façon
progressive, le NO va se détacher de l’espaceur et en partie se lier à la déoxy-hémoglobine ou
à d’autres protéines contenant un ou plusieurs groupements thiols pour constituer le réservoir
bioactif du NO dans l’organisme. Il sera alors transporté par le sang jusqu’aux sites d’intérêt
comme par exemple la muqueuse de l’estomac où il pourra jouer son rôle gastroprotecteur.
Une autre partie du NO sera transformée en nitrates et nitrites, éliminés ensuite dans l’urine.
L’AINS quant à lui sera transporté également de façon systémique dans le sang et aura accès
ainsi aux sites où il pourra exercer ses effets, avant d’être détoxifié par le foie.
1.5.2.4 La faible concentration de NO libérée, garante d’un effet
bénéfique sans induction de la carcinogenèse
Du fait d’une libération lente et en faible quantité, le NO résultant des NO-AINS
semble atteindre une concentration assez élevée pour exercer ses effets biologiques
bénéfiques mais ne semble pas être assez élevé pour engendrer des effets délétères tels que
des altérations irréversibles de l’ADN ou des mutations trop importantes pour être réparées.
1.5.3 Le NO-AINS ont moins d’effets secondaires que les AINS
classiques
La première raison pour laquelle les NO-AINS ont étés sythétisés était l’utilisation du
potentiel cytoprotecteur du NO pour diminuer les effets secondaires délétères des AINS. Le
72
bienfondé de cette stratégie depuis lors à été démontré de nombreuses fois, que ce soit après
prise ponctuelle d’une forte dose de NO-AINS ou en utilisation à long terme.
Ainsi, l’administration d’une dose unique de NO-naproxène [366], NO-aspirine [359,
367], NO-diclofenac [368, 369] , NO-indométhacine [370] ou de NO-kétoprofène [368] ne
provoquait aucune ulcération dans l’estomac de modèles animaux, alors qu’à dose
équimolaire, leurs molécules d’origine respectives entraînaient des lésions de la muqueuse
gastrique. Par aileurs, aucune lésion intestinale n’a été constatée après injection de NO-
indométhacine [371] ou le NO-flurbiprofène [372, 373] chez le rat, alors qu’une dose
similaire d’indométhacine ou de flurbiprofène induisait des dommages visibles. Des résultats
similaires ont étés obtenus après administration de plusieurs doses à plus long terme :
contrairement aux AINS classiques, des doses équivalentes de NO-flurbiprofène, de NO-
naproxène et de NO-diclofenac n’induisaient pas de lésion gastrointestinale chez les animaux
testés [368, 374, 375].
Autre fait notable, les NO-AINS semblaient également exercer un effet neutre ou
positif sur les dommages infligés à la muqueuse gastrique par des agents externes et entraîner
la guérison de lésions préexistantes, ce qui n’était pas le cas des AINS [376-379].
Enfin, les NO-AINS ont moins d’effets secondaires sur les reins. Le NO-flurbiprofène
notamment ne présente pas de toxicité rénale et améliore la réparation du rein après réduction
de sa masse par voie chirurgicale [380]. Quant au NO-flurbiprofène, il permet de limiter
l’hypertension, dommageable pour les reins [381].
Cette absence d’effets secondaires est due à l’action du NO. Les NO-AINS sont en
mesure d’inhiber la production de prostaglandines tout en maintenant intact le flux sanguin de
la muqueuse gastrique via l’effet vasodilatateur du NO. De plus, le NO exerce un effet d’anti-
adhésion des neutrophiles, tout comme les prostaglandines [382]. Enfin, l’autre mécanisme
73
proposé pour expliquer l’effet protecteur du NO dans les NO-AINS est l’inhibition de
l’apoptose des cellules des muqueuses gastrointestinales via l’inactivation des caspases par S-
nitrosylation [367, 383].
1.5.4 Les NO-AINS ont conservé, voire augmenté, leur potentiel
anti-inflammatoire
Non seulement les NO-AINS entraînent moins d’effets secondaires mais ils ont
également conservé les propriétés inhérentes à leur partie AINS.
1.5.4.1 Activité anti-inflammatoire
De nombreuses études menées chez le rat ont démontré que, tout comme leur molécule
d’origine, les NO-AINS ont une activité anti-inflammatoire. Le potentiel des NO-AINS dans
ce domaine est souvent équivalent à celui de l’AINS d’origine et même supérieur. Ainsi, le
NO-diclofenac, le NO-naproxène et la NO-indomethacine ont montré une activité anti-
inflammatoire équivalente respectivement à celle du diclofenac, du naproxene et de
l’indomethacine dans le modèle de l’œdème induit par injection de carragénine dans la patte
arrière de rats [366, 370, 384]. Quant au NO-paracetamol (NO-acetaminophen) et à la NO-
aspirine, ils se sont révélés plus efficaces que le paracétamol et l’aspirine pour diminuer
l’œdème dans ce même modèle [385, 386].
Dans un modèle de colites intestinales chez le rat, la NO-mesalamine s’est avérée
significativement plus efficace pour diminuer la sévérité de la colite que la mesalamine [387].
Les NO-AINS semblent également plus actifs que les AINS classiques, voire même
que les inhibiteurs spécifiques de COX-2 contre les inflammations du système nerveux central
[388].
74
1.5.4.2 NO-AINS et douleur
De nombreux NO-AINS présentent une activité anti-nociceptive et analgésique accrue
par rapport à leur molécule d’origine. C’est le cas du NO-naproxène, dans le modèle de
l’arthrite induite par l’adjuvant de Freund chez le rat, dont l’activité anti-nociceptive était
détectable à une concentration deux fois inférieure à celle du naproxène [389]. Dans deux
modèles différents de nociception, celui de l’induction des contractions abdominales par
l’acide acétique chez la souris et de l’hyperalgésie à la stimulation mécanique après injection
intraplantaire de carragénine chez le rat, la NO-aspirine et le NO-paracétamol (NO-
acetaminophen) étaient plus efficaces que leurs molécules parentes pour diminuer de façon
dose dépendante à la fois l’hyperalgésie et les contractions abdominales chez les animaux
stimulés [385, 386].
La greffe du NO sur un AINS n’altère donc pas ses propriétés intrinsèques.
1.5.5 NO-AINS et potentiel anti-tumoral
1.5.5.1 Les NO-AINS ont un potentiel anti-tumoral supérieur à celui des AINS
classiques.
Plusieurs études menées avec différents NO-AINS sur des cellules tumorales de colon
ont démontré que les NO-AINS avaient une activité antiproliférative et/ou pro-apoptotique
et/ou cytotoxique largement plus élevée que celle de l’AINS dont ils étaient issus. Ainsi, la
NO-aspirine NCX 4040 est de près de 2500 fois plus active que l’aspirine, le NO-ibuprofène
NCX 2210 est 20 fois plus efficace que l’ibuprofène et le NO-sulindac NCX 1102 est 20 fois
plus efficace que le sulindac pour inhiber la croissance de cellules tumorales HT-29 après 48h
75
d’incubation [390]. Cette supériorité à été confirmée dans le colon par d’autres auteurs [391,
392] et à été démontrée, à l’aide de ces molécules ainsi que d’autres, sur des lignées tumorales
d’autres tissus comme le pancréas, la prostate, la langue ou le poumon [393].
Des résultats similaires ont été observés in vivo : la NO-aspirine NCX 4016 réduisait
le nombre de foyers de cryptes aberrants plus efficacement que l’aspirine dans un modèle
d’adénocarcinome du colon chimio-induit [394] et la NO-aspirine NCX 4040 diminuait le
nombre de tumeurs gastrointestinales dans le modèle de souris Min [395].
1.5.5.2 Mécanismes impliqués dans le potentiel anti-tumoral des NO-AINS
Les mécanismes d’action conférant leur potentiel anti-tumoral aux NO-AINS ne sont
que partiellement connus. Plusieurs voies semblent impliquées et l’activité anti-tumorale des
NO-AINS peut très bien être la résultante de plusieurs d’entre elles dans un modèle donné
(figure 10).
• La voie des COX. Il a été montré que les NO-AINS étaient capables d’inhiber
l’activité de COX-1 et COX-2 et d’inhiber l’expression de prostaglandines de façon
équivalente à celle de leur AINS d’origine [368, 396]. Ceci n’est pas étonnant lorsque
l’on tient compte du fait que les AINS classiques sont des inhibiteurs des COX et que le
NO lui-même pourrait inhiber les cyclooxygénases [397, 398]. Cependant, les NO-AINS
sont capables d’exercer un effet anti-tumoral sans inhiber l’activité des COX [394, 399].
• La voie de l’iNOS. Certains NO-AINS ont une activité anti-inflammatoire accrue par
rapport aux AINS dont ils sont issus et souvent, l’inhibition de COX-2 va de paire avec
celle de l’iNOS. Or, il semblerait qu’il y ait une relation entre COX-2 et iNOS, une
inhibition de l’activité d’iNOS entraînant une inhibition de l’activité de COX-2 [400].
Ainsi, étant donné que les NO-AINS inhibent l’activité et l’expression d’iNOS [401, 402]
76
ils pourraient très bien passer par cette voie pour inhiber l’activité de COX-2. De plus,
iNOS est impliquée dans la tumorigenèse de plusieurs types de cancers et notamment
celui du colon [403, 404]. L’inhibition d’iNOS est corrélée avec une diminution du
nombre de tumeurs et d’adénomes du colon dans des rats AOM et dans les souris Min
[403, 405]. L’inhibition d’iNOS par les NO-AINS contribue à leur potentiel anti-tumoral.
• Autres voies : NF-κκκκB et Wnt/ ββββ-caténine. Deux études menées sur la NO-aspirine
NCX 4040 ont montré que cette molécule était capable d’inhiber la voie Wnt/β-caténine
en rompant la liaison entre la beta-catenine et le T cell factor 4 (TCF4) dans le noyau des
cellules. De même, NCX 4040 inhibe la voie de signalisation du NF-κB en empêchant
celui-ci de se lier à l’ADN dans le noyau [406, 407]. Or, comme il a été vu plus haut, ces
voies de signalisation sont souvent dérégulées dans les cancers. Les NO-AINS peuvent
donc exercer leur potentiel anti-tumoral en inhibant une voie activée de façon aberrante.
77
Figure 10: Les différentes voies d’action possibles des NO-AINS pour exercer leur effet anti-
tumoral.
78
1.5.6 Quels sont les avantages des NO-AINS par rapport aux
inhibiteurs spécifiques de COX-2 tels que les Coxibs ?
Les AINS présentent des propriétés anti-inflammatoires et anti-tumorales très utiles
pour le traitement d’un grand nombre de pathologies mais leur grand inconvénient reste leurs
effets secondaires notamment sur le tractus gastro-intestinal. De nouvelles molécules ont alors
été développées, fondées sur les propriétés anti-COX des AINS : les inhibiteurs COX-2
spécifiques. Contrairement aux AINS qui inhibent à la fois COX-1 et COX-2, ces nouvelles
molécules conservent un potentiel anti-tumoral et anti-inflammatoire, via une inhibition de
COX-2 tout en préservant COX-1, enzyme qui permet la production constitutive des
prostaglandines importantes pour la protection des muqueuses de l’appareil digestif et des
reins. Les inhibiteurs spécifiques de COX-2 appelés Coxibs comprennent le Celecoxib et le
Rofecoxib. La diminution des effets secondaires sur le tractus digestif de ces deux molécules
a été confirmée par deux études à long terme en double aveugle : VIGOR [408] pour le
Rofecoxib et CLASS pour le Celecoxib [409]. Les deux études ont montré que ces inhibiteurs
spécifiques de COX-2 diminuaient d’au moins 50% les perforations, les obstructions et les
saignements du tractus gastro-intestinal par rapport aux AINS. Une des études a également
révélé que ces inhibiteurs spécifiques de COX-2 entraînaient une augmentation d’infarctus du
myocarde et que la gastroprotection se faisait au dépend de la cardioprotection [410]. En effet,
ces nouvelles molécules n’ont pas d’effet anti-agrégant des plaquettes sanguines comme l’ont
certains AINS et présentent donc un risque pour les patients ayant des troubles
cardiovasculaires. Ces derniers sont alors obligés de prendre également de l’aspirine, perdant
ainsi les effets bénéfiques des coxibs sur l’appareil gastrointestinal.
79
En revanche, les NO-AINS sont à la fois des molécules sûres pour le tractus digestif
touten conservant les propriétés de leur partie AINS telle que la propriété anti-agrégante
plaquettaire. Le meilleur exemple est celui de la NO-aspirine, NCX 4016, qui présente à la
fois un fort potentiel cardioprotecteur [411] et un effet anti-tumoral sur des lignées
d’adénocarcinome du colon [391]. Une étude en double aveugle contre placebo, en groupe
parallèle de volontaires sains à démontré que cette même molécule n’avait pas d’effets nocifs
sur l’estomac et le duodénum [412].
Enfin, une étude comparant le celecoxib au diclofenac plus oméprazole chez 287
patients arthritiques à montré que les effets secondaires générés par le celecoxib étaient
équivalents à ceux du diclofenac plus oméprazole [413]. Ainsi, dans certains cas, les
inhibiteurs spécifiques de COX-2 présentent de grande similarités d’effets avec les AINS
classiques et n’apportent pas les bénéfices escomptés [414].
Les NO-AINS constituent donc une alternative intéressante à la fois aux AINS et aux
inhibiteurs spécifiques de COX-2.
80
1.6 Objectifs de la thèse
Le travail effectué au cours de cette thèse était fondé sur des observations montrant
que COX-2 était surexprimé dans les cancers de vessie et de prostate, comme cela avait déjà
été démontré dans le cas du cancer du colon. Or, de nombreux résultats positifs, en terme
d’effet antiprolifératif et induction de l’apoptose, ont étés obtenus avec différents NO-AINS
in vitro sur des lignées tumorales de colon et in vivo dans un modèle d’adénocarcinome du
colon chez le rat [394].
Il semblait donc intéressant d’étudier le potentiel antiproliferatif et pro-apoptotique de cette
nouvelle classe de molécules sur des lignées tumorales de vessie et de prostate.
La première étape a consisté à choisir les lignées cellulaires à étudier.
Pour étudier les effets des molécules sur le cancer de la vessie, nous avons choisi
trois lignées tumorales épithéliales humaines T24, 647V et 1207. Toutes trois sont des lignées
humaines issues de carcinomes transitionnels invasifs de vessie mais ont des degrés
d’agressivité différents (plus le grade est élevé, plus la tumeur est agressive).
− 647V est représentative d’un carcinome de grade 2.
− 1207, est issue d’une TCC de grade 3.
− T24, peu différenciée, est représentative d’un carcinome de grade 3. C’est la plus
agressive des trois lignées vésicales utilisées dans cette étude.
81
Pour étudier les effets des molécules sur le cancer de la prostate, nous avons choisi
trois lignées épithéliales prostatiques humaines PC3, LNCaP et PNT1A, qui représentent
chacune des stades différents du développement du cancer de prostate.
− PC3 est une lignée tumorale androgéno-indépendante issue d’une métastase osseuse.
− LNCaP est une lignée tumorale androgéno-dépendante issue d’une métastase
ganglionnaire.
− PNT1A est une lignées épithéliales humaine normale immortalisée par l’antigène T du
virus SV40.
Les différents objectifs de l’étude ont ensuite étés définis comme suit :
• Sélectionner le NO-AINS le plus actif parmi 8 molécules à tester.
• Déterminer si le NO-AINS choisi a un effet antiprolifératif sur les lignées cellulaires.
• Déterminer si le NO-AINS choisi modifie le cycle cellulaire des lignées et dans quelle
mesure.
• Déterminer si le NO-AINS choisi est capable d’induire l’apoptose dans les lignées
cellulaires.
• Déterminer si le NO-AINS choisi est plus actif que sa molécule d’origine.
• Déterminer si le NO-AINS choisi exerce un effet différent selon le degré de
transformation des lignées cellulaires.
• Approcher les mécanismes d’actions permettant les effets de ces molécules.
82
2 PRESENTATION DES ARTICLES
83
Evaluation of the anti-tumoral potential of different Nitric Oxide-
donating Non Steroidal Anti-inflammatory Drugs (NO-NSAIDs)
on human urological tumor cell lines.
Huguenin S., Vacherot F., Fleury-Feith J., Riffaud J.P., Chopin D.K., Bolla M. and Jaurand
M.C. Cancer Lett. 2005 Feb 10; 218(2):163-70.
Cet article, qui est en fait le troisième dans l’ordre des publications, rend compte de
l’étude préliminaire qui a consisté à tester l’effet cytotoxique de plusieurs NO-AINS sur les
lignées tumorales épithéliales humaines de vessie (T24, 647V, 1207, de prostate ( LNCaP et
PC3) et sur la lignée épithéliale prostatique humaine normale immortalisée PNT1A.
Le but de cette étude est de sélectionner le dérivé nitré le plus actif sur les lignées cellulaires
utilisées et d’analyser son mode d’action plus en détail par la suite.
Ici, nous comparons le potentiel cytotoxique de 8 dérivés nitrés (un issu de
l’indomethacine (NCX 530), un du piroxicam (NCX 1301), un de l’ibuprofène (NCX 2210),
deux du flurbiprofène (NCX 2216 et HCT 1026), deux du sulindac (NCX 1102 et NCX 1105)
et un de l’aspirine (NCX 2219)) et d’un donneur d’oxyde nitrique classique, le nitroprusside
de sodium (SNP). Le nombre de cellules vivantes en fonction du temps est mesuré grâce au
MTT.
Nous montrons que ce sont les dérivés nitrés du sulindac qui exercent l’activité
cytotoxique la plus élevée sur la majorité des lignées et que leur potentiel est même supérieur
à celui du SNP pour au moins 4 des 6 lignées étudiées. Nous avons choisi le NCX 1102 pour
la poursuite de notre projet (le NCX 1105 aurait été sélectionné si son activité avait été
largement supérieure à celle de NCX 1102, ce qui n’a pas été le cas).
84
Cet article comprend également de façon succincte quelques résultats sur l’effet du
NCX 1102 sur le cycle cellulaire et sa capacité à induire l’apoptose. Ces résultats seront
largement développés dans les deux articles suivants.
Enfin, nous comparons le potentiel cytotoxique d’un nouveau dérivé de l’aspirine,
NCX 4040, avec celui du NCX 1102. Au moment où la société NicOx nous a demandé de
tester NCX 4040, notre étude menée avec NCX 1102 était terminée. Cela explique pourquoi
la suite de l’étude préliminaire s’est faite avec NCX 1102 et non pas NCX 4040, malgré son
potentiel cytotoxique bien supérieur au dérivé nitré du sulindac.
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Antiproliferative effect of nitrosulindac (NCX 1102), a new nitric
oxide-donating non steroidal anti-inflammatory drug, on human
bladder carcinoma cell lines.
Huguenin S., Vacherot F., Kheuang L., Fleury-Feith J. , Jaurand M.C., Bolla M., Riffaud J.P.
and Chopin D.K. Mol. Cancer Ther. 2004 ; 3(3) : 291-298.
Cet article traite des effets du dérivé nitré du sulindac, NCX 1102, sur les cellules
épithéliales tumorales humaines de vessie.
Nous montrons que NCX 1102 exerce un effet cytotoxique dose dépendant sur les
trois lignées cellulaires, avec une concentration inhibitrice de 50% de la viabilité (IC 50%)
après 24h de 24.4 µM pour T24, 35.9 µM pour 647V et 37.9 µM pour 1207. D’autre part,
contrairement aux lignées tumorales, l’incubation de NCX 1102 n’engendre pas de cellules
mortes dans les cultures primaires d’urothélium humain normal, suggérant une action
cytotoxique préférentielle du NO-AINS sur les lignées tumorales.
NCX 1102 exerce également un effet dose dépendant sur la prolifération des trois
lignées tumorales, avec une concentration inhibitrice de 50% de l’incorporation de thymidine
tritiée (IG 50%) après 24 h de 10 µM pour 1207, 13.3 µM pour T24 et 18.8 µM pour 647V.
Cet effet sur la prolifération cellulaire s’accompagne d’une perturbation du cycle
cellulaire qui va dépendre de la lignée et de la concentration de NCX 1102 utilisée.
L’accumulation de cellules en phase G2-M dés 15µM pour les lignées 1207 et 647V est
confirmée par la présence de cellules en mitose détectées par microscopie optique.
NCX 1102 engendre également un changement dans la morphologie cellulaire qui se
traduit par l’apparition de cellules multinuclées dans les trois lignées et est capable d’induire
l’apoptose de manière significative dans les lignées T24 et 647V.
104
Globalement, le NCX 1102 a un effet cytotoxique, antiprolifératif et pro-apoptotique
accru sur T24, la plus agressive des trois lignées utilisées alors qu’au contraire, il semble
n’avoir aucun effet cytotoxique sur l’urothélium normal. De plus 647V, la lignée la moins
agressive des trois lignées tumorales, est moins sensible à son effet cytotoxique et
antiprolifératif.
Enfin, aux mêmes concentrations que celles utilisées pour NCX 1102, l’AINS
d’origine (le sulindac) n’a aucun effet cytotoxique ni antiproliferatif, ne perturbe pas le cycle
cellulaire et n’induit pas d’apoptose.
Cet article montre clairement:
� que le NCX 1102 est largement plus actif que le sulindac.
� que le NCX 1102 a un effet anti-tumoral sélectif en étant plus actif sur les cellules
tumorales les plus agressives.
NCX 1102 semble donc être un bon candidat pour servir de base à de nouvelles stratégies
thérapeutiques dans le cadre du cancer de la vessie.
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Nitrosulindac (NCX 1102): a new Nitric Oxide-donating Non
Steroidal Anti-inflammatory Drug (NO-NSAID), inhibits
proliferation and induces apoptosis in human prostatic epithelial
cell lines.
Huguenin S., Fleury-Feith J., Kheuang L., Jaurand M.C., Bolla M., Riffaud J.P., Chopin D.K.
and Vacherot F. Prostate. 2004 Oct 1; 61(2):132-41.
Cet article traite des effets du dérivé nitré du sulindac, NCX 1102, sur deux lignées de
cellules épithéliales tumorales humaines de prostate (LNCaP et PC3) et une lignée humaine
épithéliale normale immortalisée (PNT1A).
Nous montrons que NCX 1102 exerce un effet cytotoxique dose dépendant sur les
trois lignées cellulaires, avec une IC 50% de la viabilité après 24h de 9.2 µM pour LNCaP, 31.3
µM pour PC3 et 31.9 µM pour PNT1A.
NCX 1102 exerce également un effet dose dépendant sur la prolifération des lignées
tumorales, avec une IG 50% après 24 h de 4.6 µM pour LNCaP, 12 µM pour PC3. La
prolifération de la lignée normale immortalisée PNT1A ne semble pas affectée par NCX 102
dans les limites des concentrations utilisées dans cette étude.
L’effet du NCX 1102 sur la prolifération s’accompagne d’une perturbation du cycle
cellulaire qui va dépendre de la lignée et de la concentration utilisée.
Le NCX 1102 conduit à l’apparition de cellules multinuclées dans les lignées PC3 et
PNT1A et est capable d’induire l’apoptose de manière significative dans les trois lignées
utilisées.
114
Le NCX 1102 a un effet antitproliferatif et pro-apoptotique plus élevé sur les lignées
tumorales PC3 et LNCaP que sur la lignée normale immortalisée PNT1A. D’autre part, la
lignée androgéno-dépendante LNCaP est de loin la plus sensible à NCX 1102.
Le sulindac exerce un léger effet cytotoxique sur la lignée LNCaP mais n’agit ni sur la
proliferation ni sur le cycle cellulaire et n’induit pas d’apoptose à des concentrations
équivalentes à celles utilisées pour NCX 1102.
Enfin, nous montrons que l’effet antiprolifératif du NCX 1102 n’est pas lié à
l’inhibition de l’ornithine décarboxylase (ODC) par la partie NO de NCX 1102.
Cet article montre clairement:
� que le NCX 1102 est largement plus actif que le sulindac
� que le NCX 1102 a un effet anti-tumoral sélectif en étant plus actif sur les cellules
tumorales, particulièrement sur la lignées androgéno-dépendante LNCaP.
NCX 1102 semble donc être un bon candidat pour servir de base à de nouvelles stratégies
thérapeutiques dans le cadre du cancer de la prostate.
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3 RESULTATS COMPLEMENTAIRES
126
3.1 L’effet cytotoxique du NCX 1102 sur les lignées épithéliales
tumorales humaines de vessie n’est pas affecté par un excès de
putrescine.
Comme pour l’expérience d’adjonction de putrescine menée sur les lignées PNT1A,
LNCaP et PC3 dans l’article Huguenin et coll. Prostate 2004, il était intéressant de voir si
l’effet du NCX 1102 sur les lignées T24, 647V et 1207 était lié à l’inhibition de l’ornithine
décarboxylase (voie arginine-polyamines, cGMP indépendante). Les graphiques représentés
dans la figure 11 montrent clairement que l’adjonction de putrescine dans le milieu de culture
ne modifie pas le potentiel cytotoxique du NCX 1102. La voie arginine-polyamine ne semble
pas impliquée dans l’effet cytotoxique du NCX 1102
Figure 11: Effet cytotoxique du NCX 1102 en absence ou en présence de putrescine.
Le nombre de cellules vivantes est évalué par le test MTT et le pourcentage calculé par rapport au nombre de
cellules non traitées. P : putrescine. N+P : NCX 1102 à 15µM + Putrescine.
T24
0
20
40
60
80
100
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0 24 48 72 96
Temps (heures)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es P 750µM
P 3mM
NCX1102 15µM
N+P 750µM
N+P 1,5mM
N+P 3mM
647V
0
20
40
60
80
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0 24 48 72 96
Temps (heures)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es P 750µM
P 3mM
NCX1102 15µM
N+P 750µM
N+P 1,5mM
N+P 3mM
1207
0
20
40
60
80
100
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0 24 48 72 96
Temps (heures)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es P 750µM
P 3mM
NCX1102 15µM
N+P 750µM
N+P 1,5mM
N+P 3mM
127
3.2 Mise à part pour PNT1A, l’effet antiprolifératif du NCX 1102
sur les lignées de vessie et de prostate n’est pas affecté par un excès
de putrescine.
Pour compléter les expériences menées sur la cytotoxicité, l’effet de l’adjonction de
putrescine sur la propriété purement antiproliférative du NCX 1102 a été examinée.
Les résultats sont représentés dans la figure 12. Tout comme pour la cytotoxicité, l’effet
antiprolifératif du NCX 1102 ne semble pas lié à une inhibition de l’ODC dans la plupart des
lignées. Par contre, l’effet antiprolifératif du NCX1102 semble être inhibé dans PNT1A où le
taux de cellules incorporant la thymidine augmente jusqu’à équivalence avec celui de cellules
non traitées. L’effet antiprolifératif du NCX 1102 semble donc lié à la voie de l’arginine-
polyamines dans la lignée PNT1A mais passe par une ou des voie(s) différente(s) dans toutes
les autres lignées.
Figure 12: Effet antiprolifératif du NCX 1102 en absence ou en présence de putrescine.
Le nombre de cellules en prolifération est évalué par incorporation de thymidine tritiée et le pourcentage calculé
par rapport à la prolifération des cellules non traitées. P : putrescine. NCX 1102 seul est a 15µM. N+P : NCX
1102 à 15µM + Putrescine. A : lignées vésicales. B : lignées prostatiques.
Lignées de vessie
020406080
100120140160
T24 647V 1207C
% p
ar r
app
ort a
u co
ntrô
le
P 150µM
P 3mM
NCX 1102
N+P 150µM
N+P 750µM
N+P 1,5mM
Lignées de prostate
0
20
40
60
80
100
120
PC3 LNCaP PNT1A
% p
ar r
app
ort a
u co
ntrô
le
P 150µM
P 3mM
NCX 1102
N+P 150µM
N+P 750µM
N+P 1,5mM
A B
128
3.3 L’effet cytotoxique du NCX 1102 sur les lignées de vessie et de
prostate n’est affecté ni par l’adjonction d’un inhibiteur de la
guanylyl cyclase (ODQ) ni par celle d’un inhibiteur de la cGMP
phosphodiestérase 5 (Zaprinast).
La voie des polyamines ne semblant pas impliquée dans l’effet cytotoxique du NCX
1102, la voie alternative cGMP-dépendante a donc été examinée. Deux inhibiteurs, l’ODQ,
inhibant la guanylyl cyclase (enzyme permettant la synthèse du cGMP à partir du GTP), et le
zaprinast, inhibant la cGMP phosphodiestérase 5 (enzyme rendant le cGMP inactif en le
transformant en 5’GMP) ont étés utilisés pour mettre en évidence une éventuelle implication
du cGMP dans l’effet du NCX 1102. Théoriquement, si NCX 1102 agit par l’intermédiaire de
la voie cGMP-dépendante, l’ODQ devrait inhiber son effet en supprimant la production de
cGMP par la guanylyl cyclase. Au contraire, le zaprinast, induisant une accumulation de
cGMP (empêchant sa dégradation), devrait augmenter l’effet du NCX 1102 (voir figure 8A).
L’absence d’influence de ces deux inhibiteurs sur l’effet cytotoxique du NCX 1102 est
illustrée dans la figure 13 pour l’ODQ et la figure 14 pour le zaprinast. Par ailleurs, la
cytotoxicité envers les lignées T24, 1207 et PNT1A semble accrue lorsque l’ODQ est ajouté
au NCX 1102.
Le zaprinast quant à lui ne semble pas avoir de toxicité sur les différentes lignées
testéées.
129
Figure 13 : Cytotoxicité du NCX 1102 sur les six lignées cellulaires en présence ou en
absence d’ODQ.
Le NCX 1102 seul est utilisé à 15µM. N+O 1X : NCX 1102 à 15µM en présence de 15µM d’ODQ. N+O 5X:
NCX 1102 à 15µM en présence de 75µM d’ODQ. La viabilité cellulaire a été évaluée avec la technique au MTT.
Figure 14 : Cytotoxicité du NCX 1102 sur les six lignées cellulaires en présence ou en
absence de zaprinast.
Le NCX 1102 seul est utilisé à 15µM. N+Z 2X : NCX 1102 à 15µM en présence de 30µM de zaprinast. N+Z
5X: NCX 1102 à 15µM en présence de 75µM de zaprinast. La viabilité cellulaire a été évaluée avec le MTT.
T24
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
van
tes
NCX 1102
N+Z 2X
N+Z 10X
647V
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
N+Z 2X
N+Z 10X
1207
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
esNCX 1102
N+Z 2X
N+Z 10X
PC3
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
N+Z 2X
N+Z 10X
LNCaP
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
N+Z 2X
N+Z 10X
PNT1A
0
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40
60
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100
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0 1 2 3 4
Temps (Jours)
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e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
N+Z 2X
N+Z 10X
T24
0
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40
60
80
100
120
0 1 2 3 4
Temps (jours)
% d
e ce
llule
s vi
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es
NCX 1102
N+O 1X
N+O 5X
647V
0
20
40
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100
120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
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llule
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es
NCX 1102
N+O 1X
N+O 5X
1207
0
20
40
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0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
N+O 1X
N+O 5X
PNT1A
0
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40
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80
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0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
N+O 1X
N+O 5X
LNCaP
0
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0 1 2 3 4
Temps (Jours)
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e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
N+O 1X
N+O 5X
PC3
0
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40
60
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0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
N+O 1X
N+O 5X
130
3.4 L’effet antiprolifératif du NCX 1102 sur les lignées de vessie et de prostate n’est affecté
par ni l’adjonction d’un inhibiteur de la guanylyl cyclase (ODQ) ni par celle d’un
inhibiteur de la cGMP phosphodiestérase 5 (Zaprinast).
L’ODQ semble contrebalancer l’effet antiprolifératif de NCX 1102 dans la lignée
PNT1A où la prolifération des cellules en présence de zaprinast est équivalente à celle des
cellules non traitées. Pour les autres lignées, l’effet antiprolifératif du NCX 1102 n’est ni
inhibé par l’ODQ ni amplifié par le zaprinast (figure 15).
On trouve également un effet antiprolifératif propre à l’ODQ, lorsqu’il est incubé seul
avec les lignées T24, 1207, PC3 et LNCaP, ainsi qu’un effet antiprolifératif accru de cette
molécule en présence de NCX 1102 sur les lignées T24, 1207 et PC3. Le zaprinast ne semble
présenter aucune toxicité lorsqu’il est administré seul aux cellules de prostate mais il exerce
un effet antiprolifératif notable sur les lignées de vessie, particulièrement sur T24.
131
Figure 15 : Effet antiprolifératif du NCX 1102 en absence ou en présence d’ODQ ou de
zaprinast.
Le nombre de cellules en prolifération est évalué par incorporation de thymidine tritiée et le pourcentage calculé
par rapport à la prolifération des cellules non traitées. Le NCX 1102 seul est utilisé à 15µM. A : Effet de l’ODQ
sur l’effet antiprolifératif de NCX 1102 dans les lignées de vessie. B : Effet de l’ODQ sur l’effet antiprolifératif
de NCX 1102 dans les lignées de prostate. L’ODQ seul est utilisé à 75µM. N+O 1X : NCX 1102 à 15µM en
présence de 15µM d’ODQ. N+O 5X: NCX 1102 à 15µM en présence de 75µM d’ODQ, sauf pour LNCaP où
N+O 1X correspond à NCX 1102 à 7µM et ODQ à 7µM et N+O 5X correspond à NCX 1102 à 7µM et ODQ à
35µM. C : Effet du zaprinast sur l’effet antiprolifératif de NCX 1102 dans les lignées de vessie. D : Effet du
zaprinast sur l’effet antiprolifératif de NCX 1102 dans les lignées de prostate. Le zaprinast seul est utilisé à
300µM. N+Z 30, 150 et 300 correspond à une concentration en NCX 1102 à 15µM et une concentration en
zaprinast respectivement de 30, 150 et 300µM. Pour LNCaP, N+Z 30, 150 et 300 correspond à une concentration
en NCX 1102 de 7µM et des concentrations en zaprinast de 15, 75 et 150µM respectivement.
Lignées de vessie
0
20
40
60
80
100
120
T24 647V 1207
% p
ar r
appo
rt a
u co
ntrô
le
NCX 1102
Z
Z+N 30
Z+N 150
Z+N 300
Lignées de prostate
0
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PC3 LNCaP PNT1A
% p
ar r
appo
rt a
u co
ntrô
le
NCX 1102
Z
Z+N 30
Z+N 150
Z+N 300
Lignées de prostate
0
20
40
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80
100
120
140
PC3 LNCaP PNT1A
% p
ar r
appo
rt a
u co
ntrô
le
NCX 1102
ODQ 75µM
N+O 1X
N+O 5X
Lignées de vessie
0
20
40
60
80
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T24 647V 1207
% p
ar r
appo
rt a
u co
ntrô
le
NCX 1102
ODQ 75µM
N+O 1X
N+O 5X
C D
B A
132
3.5 Le sulindac exerce un effet cytotoxique dose dépendant sur les
lignées cellulaires de vessie et de prostate testées
Le sulindac exerce un effet cytotoxique sur toutes les lignées, de façon dose
dépendante (Figure 16).
Figure 16 : Effet cytotoxique du sulindac sur les six lignées cellulaires.
La viabilité cellulaire a été évaluée par la technique au MTT après 24h d’incubation avec différentes doses de
sulindac.
T24
0
50
100
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Sulindac (µM)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
647V
0
50
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350 400 450 500 550 600 650
Sulindac (µM)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
1207
0
50
100
300 500 700 900 1100 1300
Sulindac (µM)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
PC3
0
50
100
600 800 1000 1200 1400
Sulindac (µM)%
de
cellu
les
viva
ntes
LNCaP
0
50
100
200 250 300 350 400 450 500
Sulindac (µM)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
PNT1A
0
50
100
500 700 900 1100 1300 1500 1700
Sulindac (µM)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
133
3.6 La combinaison de sulindac et de SNP n’entraîne aucun effet
synergique de cytotoxicité sur les lignées de vessie et de prostate
testées
Au contraire du NCX 1102 et à concentration équivalente, le mélange sulindac/SNP,
le sulindac ou le SNP seuls n’exercent pas d’effet cytotoxique sur les lignées testées (figure
17).
Figure 17 : Comparaison de l’effet cytotoxique du NCX 1102, du sulindac, du SNP et d’un
mélange sulindac/SNP sur les six lignées cellulaires.
La viabilité cellulaire des différentes lignées a été mesurée par la technique du MTT en présence de NCX 1102 à
10µM, de sulindac à 10µM, de SNP à 10µM et d’un mélange sulindac/SNP à 10µM pour chacune des deux
molécules.
T24
0
20
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0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
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es
NCX 1102
SNP
Sulindac
SNP+Sulindac
647V
0
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120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
SNP
Sulindac
SNP+Sulindac
1207
0204060
80100120140
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
SNP
Sulindac
SNP+Sulindac
PC3
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
SNP
Sulindac
SNP+Sulindac
LNCaP
020406080
100120140
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
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llule
s vi
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es
NCX 1102
SNP
Sulindac
SNP+Sulindac
PNT1A
0
20
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60
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120
0 1 2 3 4
Temps (Jours)
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
NCX 1102
SNP
Sulindac
SNP+Sulindac
134
3.7 Aucune libération de nitrate ni de nitrites n’est détectée après
incubation du NCX 1102 en présence des différentes lignées de
vessie et de prostate
La présence de nitrites a été mesurée grâce au test colorimétrique avec le réactif de
Griess, avec ou sans traitement préalable des échantillons avec la nitrate réductase (réduisant
les nitrates en nitrites). La réaction de Griess était positive uniquement pour la gamme de
nitrites et pour la gamme de nitrates traitée avec la nitrate réductase. Le NCX 1102 ne semble
pas libérer de nitrates ni de nitrites aux concentrations utilisées, que ce soit en présence ou en
absence de n’importe laquelle des lignées cellulaires (figure 18).
Figure 18: Suivi de la libération de nitrates et/ou de nitrites par le NCX 1102 .
Le réactif de Griess ne détectant que les nitrites, les échantillons de NCX 1102 (concentrations de 5, 15, 30, 50
et 100µM) incubé en présence des six différentes lignées cellules (courbes T24, 647V, 1207, PC3, LNCaP,
PNT1A) , le NCX 1102 incubé dans le milieu de culture sans cellules (courbe NCX traité) et une gamme de
nitrates avec les concentrations de 5, 15, 30 40 et 50µM (courbe KNO3 traité) ont étés traités au préalable par la
nitrate réductase pour transformer les nitrates en nitrites. Une gamme de nitrate (courbe KNO3 nt) à été utilisée
comme témoin négatif de la réduction de nitrates en nitrites par la nitrate réductase. La gamme de nitrites
0
100
200
300
400
500
600
0 50 100 150
Nitrites ou Nitrates ou NCX 1102(µM)
Den
sité
opt
ique
NCX TraitéT24647V1207PC3LNCaPPNT1ANCX ntKNO3 traitéKNO3 ntKNO2
135
(courbe KNO2) à servi de témoin positif pour le dosage par le réactif de Griess et de courbe étalon. La gamme
de NCX 1102 non traités (NCX nt) par la nitrate réductase a servi à montrer que le NCX 1102 ne libérait pas
spontanément de nitrites.
136
4 DISCUSSION
137
4.1 Le NCX 1102 (NO-sulindac) est la molécule la plus
active parmi les NO-AINS testés
La comparaison du potentiel cytotoxique des différents dérivés nitrés d’AINS
classiques (aspirine, ibuprofène, flurbiprofène, piroxicam, indométhacine et sulindac) a
permis de montrer que ce sont les dérivés du sulindac (NCX 1102 et NCX 1105) qui sont les
plus actifs sur les lignées vésicales et prostatiques. Ces résultats confortent les données déjà
obtenues sur le potentiel chémopréventif et anti-tumoral du sulindac. En effet, le sulindac a
été le premier AINS à diminuer le nombre et la taille des polypes de patients atteint de
polypose adénomateuse familiale du colon [41, 43, 44] et il inhibe également la tumorigenèse
colorectale in vivo chez les rongeurs [49, 415]. Il est par ailleurs capable de diminuer de 79%
le risque relatif de développement du cancer de l’œsophage dans un modèle
d’endobrachyoesophage (œsophage de Barett) chez le rat [118] et son intérêt dans la
chémoprévention du cancer du poumon à été établie in vivo [416] et in vitro [417]. D’autre
part, le sulindac et/ou ses dérives tel que le sulfone (Exisulind) ou sulfide de sulindac se sont
révélés être des molécules exerçant un effet antiproliferatif et/ou pro-apoptotique dans
plusieurs types de cancers tel que celui du foie [418, 419], du sein [420] ou du carcinome
squameux oral [421]. Ces effets antiproliferatifs et pro-apoptotiques ont aussi étés démontrés
sur le cancer de la vessie [422, 423] et de la prostate [424, 425], mettant en exergue l’intérêt
potentiel du sulindac et de ses dérivés dans le domaine des cancers urogénitaux.
Des deux dérivés nitrés du sulindac testés au cours de cette étape de sélection, c’est le
NO-sulindac NCX 1102 qui a été choisi pour la poursuite de notre étude.
138
4.2 Le NCX 1102 a un potentiel anti-tumoral* supérieur
à celui du sulindac
Les résultats obtenus au cours de ce travail ont montré que l’action cytotoxique du
NO-sulindac était due à la combinaison d’une activité antiproliférative avec une induction de
la mort cellulaire, au moins partiellement par apoptose. Au contraire, le sulindac ne montrait
aucun effet notable mis à part une légère cytotoxicité (survie de 80% des cellules après72h)
sur la lignée prostatique LNCaP et une légère induction de l’apoptose (de 4% pour le contrôle
à 5,3% après 48h à une concentration plus élevée que celle utilisée pour NCX 1102) dans la
lignée vésicale T24. L’absence apparente d’activité du sulindac est uniquement liée au fait
que les concentrations utilisées dans notre étude sont largement inférieures aux concentrations
actives de cette même molécule. Le tableau 1, dans lequel sont comparées les IC50%
(concentration d’une molécule pour laquelle le pourcentage de cellules vivantes est de 50% au
bout d’un temps donné) du sulindac avec celles du NCX 1102, illustre bien l’activité anti-
tumorale accrue du dérivé nitré par rapport à son AINS d’origine, observée tout au long de
l’étude. Cette supériorité du potentiel anti-tumoral des NO-AINS par rapport à celui des AINS
dont ils sont issus, a été démontrée par d’autres auteurs sur des lignées tumorales du colon
[390, 392], du pancréas, de prostate et de la langue [393], non seulement pour NCX 1102
mais aussi pour d’autres NO-AINS.
* : pour simplifier la discussion, le terme « potentiel anti-tumoral », généralement utilisé pour décrire
l’effet d’une molécule sur des tumeurs in vivo, a été choisi ici pour désigner la combinaison des effets
cytotoxique, anti-prolifératif et pro-apoptotique du NCX 1102 sur les lignées cellulaires.
139
Tableau 1: Comparaison des IC50% obtenues au bout de 24h d’incubation avec le NCX 1102
et sa molécule d’origine, le sulindac.
IC50% 24h
Lignée
cellulaire NCX 1102 Sulindac
Ratio
Sulindac/NCX 1102
T24 24.4µM 1340µM 55
1207 37.9µM 1760µM 46
647V 35.9µM 550µM 15
PC3 31.3µM 1375µM 44
LNCaP 9.2µM 355µM 39
PNT1A 31.9µM 1075µM 34
Un autre élément montrant l’intérêt potentiel des NO-AINS (et particulièrement du
NCX 1102) dans le traitement des tumeurs de vessie et de prostate, est que les IC50% après
48h obtenues avec NCX 1102 sur les lignées de vessie et de prostate sont dans une large
mesure inférieures à celles généralement retrouvées pour cette molécule sur d’autres lignées
tumorales humaines dans la littérature (voir tableau 2), dénotant une activité cytotoxique
accrue sur les lignées issues de tumeurs urogénitales.
140
Tableau 2: Récapitulatif des IC50% après 48h du NCX 1102 dans la littérature.
(a) : Huguenin et coll. Prostate publié en ligne le 16 Mars 2004. (b) : Huguenin et coll. Mol.
Cancer Ther. 2004 ; 3(3) : 291-298.
Organe Lignée cellulaire NCX 1102 IC50% 48h Auteur
Colon HT-29 33 µM Williams, 2001 [390]
Colon HT-29 28 µM Kashfi, 2002 [393]
Poumon A549 65 µM Kashfi, 2002 [393]
Langue SCC-25 35 µM Kashfi, 2002 [393]
Pancréas MIA PaCa-2 65 µM Kashfi, 2002 [393]
Prostate LNCaP 92 µM Kashfi, 2002 [393]
Prostate LNCaP 4.6 µM Huguenin, 2004 (a)
Prostate PC3 23.4 µM Huguenin, 2004 (a)
Prostate PNT1A 16.7 µM Huguenin, 2004 (a)
Vessie T24 19.4 µM Huguenin, 2004 (b)
Vessie 647V 23.1 µM Huguenin, 2004 (b)
Vessie 1207 14.5 µM Huguenin, 2004 (b)
Enfin, il est à noter que l’IC50% obtenue dans cette étude sur la lignée LNCaP est très
inférieure à celle décrite par Kashfi et coll. [393] (voir tableau 2). Cette différence peut être
expliquée par le fait que cet auteur a utilisé la technique d’exclusion du bleu trypan pour
mesurer la viabilité cellulaire, méthode beaucoup moins sensible que la technique du MTT
utilisée ici [426].
141
4.3 Quels sont les effets du NCX 1102 sur les lignées
testées?
4.3.1 NCX 1102 exerce un effet antiprolifératif sur les lignées
cellulaires
L’effet antiprolifératif du NCX 1102 à déjà été observé dans d’autres études sur
différents types de cellules tumorales [390, 392, 393]. Le présent travail a permis de montrer
que le NCX 1102 est également capable d’inhiber la prolifération des cellules de vessie et de
prostate de façon dose dépendante. Cependant, l’incorporation de la thymidine tritiée n’est
pas affectée par le NCX 1102, même à fortes concentrations, pour la lignée PNT1A. La
synthèse d’ADN n’est donc pas altérée par le NCX 1102 dans cette lignée.
Les concentrations inhibant de 50% l’incorporation de thymidine tritiée (IG50%) dans
les différentes lignées sont représentées dans le tableau 3.
Tableau 3 : Concentrations en NCX 1102 capables d’inhiber l’incorporation de thymidine
tritiée de 50% (IG50%) dans les lignées cellulaires.
Lignée cellulaire IG50% 24h
T24 13.3µM
1207 10µM
647V 18.8µM
PC3 12µM
LNCaP 4.6µM
PNT1A > 45µM
142
Les résultats obtenus au cours de cette étude ont mis en évidence que l’effet
antiprolifératif du NCX 1102 découle de plusieurs processus: arrêt de la synthèse d’ADN (ci-
dessus), modification de la répartition des cellules dans les différents stades du cycle
cellulaire, apparition de cellules multinucléées et blocage de la mitose. Ce sont ces trois
derniers aspects qui sont abordés ci-après.
4.3.1.1 Effets sur le cycle cellulaire
L’effet du NCX 1102 sur le cycle diffère en fonction de la lignée cellulaire et de la
concentration en NCX 1102 utilisée (voir tableau 4). Etant donné que le sulindac seul n’a
aucun effet sur la prolifération ni sur le cycle cellulaire, c’est très probablement la partie NO
du NCX 1102 qui est responsable des modifications observées.
A une concentration de NCX 1102 proche de l’IG50%, la différence de profil de
répartition des cellules dans le cycle cellulaire peut s’expliquer par le statut de la protéine
p53 dans les lignées.
Pour une concentration en NCX 1102 proche de l’IG50% respective de chaque lignée,
le NCX 1102 induit une accumulation de cellules dans la phase G2-M de toutes les lignées
sauf deux. En effet, la lignée LNCaP présente une accumulation de cellules dans la phase G0-
G1. La lignée T24 quant à elle, présente un profil équivalent à celui du témoin, révélant une
absence d’effet du NCX 1102 à une concentration de 15µM sur le cycle cellulaire de cette
lignée.
Ces différences de profil en fonction de la lignée cellulaire peuvent être expliquées par
le statut du gène TP53 dans les différentes lignées. Ce gène code pour une protéine supresseur
143
de tumeur appelée p53. La protéine p53 exerce un contrôle sur la progression du cycle
cellulaire en réponse à des dommages de l’ADN. Elle empêche notamment le passage des
cellules de la phase G0-G1 à la phase S (phase de synthèse de l’ADN) en permettant
l’activation du gène p21 WAF CIP1. L’expression de la protéine p21 induit l’arrêt du cycle en
inhibant les complexes cycline/CDK. Le blocage du cycle permet alors à différentes enzymes
de réparation de l’ADN de jouer leur rôle dans le maintien de l’intégrité du matériel génétique
de la cellule. Si les lésions infligées à l’ADN ne sont pas réparables, p53 induit l’apoptose de
la cellule.
Le gène de TP53 ne présente pas de mutation dans la lignée LNCaP. Or, il a été
montré que le NO était capable d’entraîner la surexpression et l’accumulation de la protéine
p53 dans les cellules [298, 427]. De ce fait, le NO issu du NCX 1102 pourrait induire un
blocage de la transition G1-S via la surexpression de p53, ce qui expliquerait l’accumulation
des cellules LNCaP en phase G0-G1.
En revanche, le gène de TP53 est inactivé par mutation dans les lignées PC3 et 1207 et
par l’insertion de l’antigène T du virus SV40 dans PNT1A. Cette inactivation entraîne une
perte du contrôle de la transition G1-S, en conséquence de quoi les cellules franchissent
inopinément le passage de G1 vers S. Par ailleurs, on constate une accumulation des cellules
en phase G2-M, ce qui témoigne d’un blocage du passage de G2-M vers la phase G1. Ces
observations expliquent la diminution du nombre de cellules en G0-G1 dans ces trois lignées
et particulièrement dans la lignée PNT1A.
Aucune donnée portant sur le statut de TP53 n’a pu être trouvée dans la littérature
concernant la lignée 647V, mais on sait qu’environ 50% des cancers de vessie présentent un
gène TP53 muté [428, 429]. On peut donc formuler l’hypothèse que TP53 est également muté
dans cette lignée, étant donné que le profil de répartition des cellules dans les différentes
144
phases du cycle cellulaire de la lignée 647V est similaire à celui des lignées présentant une
mutation de ce gène.
Tableau 4 : Effets notables du NCX 1102 sur le profil de répartition des cellules dans les
phases du cycle cellulaire en fonction de la concentration du NCX 1102.
Les accumulations des cellules dans les phases du cycle sont exprimées par rapport au profil
obtenu avec des cellules non traitées. Le statut du gène TP53 est spécifié pour chacune des
lignées.
Lignée
cellulaire Statut de TP53
Profil du cycle
Faible concentration en
NCX 1102
Profil du cycle
Forte concentration en NCX 1102
T24 Inactivé par mutation Identique aux cellules non
traitées Accumulation en G2-M
1207 Inactivé par mutation Accumulation en G2-M Accumulation en S
Accumulation en G2-M
647V Non déterminé Accumulation en G2-M Accumulation en G2-M
PC3 Inactivé par mutation Accumulation en G2-M Accumulation en G2-M
LNCaP Sauvage Accumulation en G0-G1 Accumulation en G2-M
PNT1A Inactivé par insertion antigène T
du virus SV40 Accumulation en G2-M Accumulation en G2-M
145
La différence de profil de répartition des cellules dans le cycle cellulaire en fonction
de la concentration en NCX 1102 peut s’expliquer par le fait que le NO a des effets variables
en fonction de sa concentration.
L’augmentation de la concentration de NCX 1102 se traduit par une modification du
profil de répartition des cellules dans les différentes phases du cycle pour les lignées LNCaP,
T24 et 1207 alors que les lignées PC3, PNT1A et 647V présentent un profil similaire à celui
obtenu avec la concentration plus faible en NCX 1102, c'est-à-dire proche de l’IG50%.
Les modifications suivantes ont été mises en évidence :
� la lignée LNCaP présente une nette diminution du nombre de cellules en phase G0-G1
et une accumulation de cellules en phase G2-M. Ce profil, indiquant un déficit de
régulation au niveau du point de contrôle G1-S, ressemble à celui d’une lignée présentant
TP53 muté. Or, il semblerait que les RNOS formés à partir de donneurs de NO exogènes,
à fortes concentrations, soient capables d’induire des modifications conformationnelle et
fonctionnelles de la protéine p53 [92]. En effet, le radical peroxynitrite (ONOO-) issu de
la réaction du NO avec du peroxyde semble inhiber la liaison spécifique de p53 à l’ADN
via la nitrosation de résidus tyrosine et diminuant ainsi son potentiel de transcription et
perturbant par conséquent l’expression de p21 WAF1 impliquée dans le contrôle et le
blocage du point G1-S du cycle cellulaire [430].
� la lignée T24, comportant elle aussi le gène TP53 muté, présente une diminution
du nombre de cellules en G0-G1 reflétant une perte de contrôle dans la transition G1-S et
une accumulation de cellules en phase G2-M. Pour cette lignée, la différence entre les
profils obtenus avec les deux concentrations en NCX 1102 pourrait résider dans le fait
que le NO n’exercerait un contrôle sur le cycle cellulaire de T24 qu’à partir d’une
concentration donnée.
146
Or, un effet antiprolifératif net sur cette lignée est observé à la concentration IG50% en
NCX 1102, celle-là même pour laquelle aucun effet n’est décelé au niveau du cycle
cellulaire (voir tableau 5). Un effet direct du NO sur la synthèse de l’ADN pourrait alors
expliquer que l’incorporation de thymidine tritiée soit diminuée sans qu’il y ait un effet
visible sur le cycle en lui-même. En effet, le NO est capable d’inhiber la synthèse de
l’ADN dans différents modèles [321, 322, 337]. Le mécanisme impliqué serait une
inhibition directe de la ribonucléotide reductase [335-337], soit par oxydoréduction du
noyau fer de l’hème de la protéine soit par nitrosylation de groupements thiols.
� la lignée 1207 présente, pour une forte concentration en NCX 1102, une accumulation
de cellules en phase S avec une diminution légère du nombre de cellules en phase G2-M,
suggérant un blocage de la transition S/G2-M. Aucune explication de ce résultat n’a pu
être trouvé.
La différence de profils obtenus en fonction de la concentration en NCX 1102 pourrait
donc s’expliquer par cette propriété, décrite par plusieurs auteurs et inhérente au NO
d’exercer un contrôle différent du cycle cellulaire, selon sa concentration et la nature du
donneur [258, 431, 432].
Il se pourrait que l’action du NCX 1102 sur le cycle cellulaire soit également lignée
spécifique : tout comme dans la présente étude, NCX 1102 induit l’accumulation de cellules
en G2-M dans une lignée tumorale pancréatique [393], alors qu’au contraire, il induit une
accumulation en G0-G1 dans des lignées tumorales humaines de colon HT-29 [390, 392] qui
ont un gène TP53 muté [433]. D’autres facteurs que p53 et restant à être identifiés, entrent
donc en ligne de compte pour expliquer l’effet lignée-spécifique du NCX 1102 sur le cycle
cellulaire.
147
4.3.1.2 Blocage en mitose et cellules multinucléées
L’accumulation de cellules en phase G2-M est confirmée pour toutes les lignées, sauf
pour la lignée T24, par l’observation en microscopie optique. Cette méthode a permis de
préciser que les cellules étaient en fait arrêtées en mitose. L’action de NCX 1102 sur le cycle
cellulaire serait donc accompagnée d’un effet de blocage de la mitose. De plus, NCX 1102
entraîne également l’apparition de cellules multinucléées dans la plupart des lignées, résultat
possible d’une endoréplication ou d’une inhibition de la cytokinèse.
Ces données évoquent une possible action de NCX 1102 sur le cytosquelette. Plusieurs
études ont montré que le NO pouvait moduler les fonctions du cytosquelette. Vila-Petroff et
coll. ont montré que la production de NO réduisait la réponse des myofilaments au calcium
dans les myocytes cardiaques et que le mécanisme mettait en jeu la voie du cGMP [434].
D’autres auteurs ont établi que le NO entraînait la réorganisation des microtubules et la
rétraction axonale dans les neurones sensoriels de poulet [435]. Enfin, les structures de la
tubuline et de l’actine sont susceptibles d’être modifiées par S-nitrosylation [436]. Le
mécanisme d’action du NCX 1102 sur le cytosquelette reste cependant à préciser.
4.3.2 NCX 1102 induit la mort cellulaire
NCX 1102 induit la mort cellulaire par apoptose de façon statistiquement significative
dans toutes les lignées sauf dans la lignée 1207. Ce résultat confirme les observations faites
par d’autres auteurs quant au potentiel pro-apoptotique du NCX 1102 sur d’autres types de
cellules tumorales [390, 393]. L’apoptose induite par le NCX 1102 a lieu dans les lignées
cellulaires possédant un gène TP53 soit muté, soit non muté, ce qui est compatible avec
l’implication d’un mécanisme d’induction de l’apoptose p53 indépendant.
148
Par ailleurs, le NCX 1102 induit également un type de mort cellulaire non apoptotique.
Cette constatation découle principalement des observations suivantes :
� la lignée PNT1A est sensible à l’effet cytotoxique du NCX 1102 alors
qu’apparemment sa prolifération, évaluée au moyen de l’incorporation de thymidine
tritiée, n’est pas affectée par le NO-AINS. D’autre part, le pourcentage d’apoptose induite
après 24h dans cette lignée est moins élevé que pour les deux autres lignées prostatiques.
L’effet cytotoxique du NCX 1102 sur PNT1A ne peut donc s’expliquer que par une mort
cellulaire non apoptotique.
� les lignées 1207 et 647V ne présentent pas ou très peu d’apoptose induite par NCX
1102 après 24h alors que l’on observe un large pic en sub-G0-G1 lors de l’analyse du
cycle cellulaire par cytométrie en flux.
L’hypothèse d’une mort cellulaire non apoptotique induite par NCX 1102 a été
discutée par Lavagna et coll. après avoir constaté que le NO-AINS induisait la mort de
cellules tumorales de colon de façon caspase 3 indépendante [392], mais aucun mécanisme
n’a été proposé.
Il est possible que cette mort cellulaire non apoptotique soit une forme de nécrose,
conséquence de l’accumulation des cellules dans la phase G2-M et notamment du blocage en
mitose. Cette hypothèse reste cependant à être vérifiée.
149
4.4 Quelle partie du NCX 1102 est impliquée dans son
activité anti-tumorale ?
Les NO-AINS sont composés de trois parties distinctes : une partie AINS classique, un
espaceur et un groupement NO2 (voir figure 9A). Plusieurs hypothèses sont envisagées ci-
dessous pour expliquer quelle partie du NO-AINS est impliquée dans son effet anti-tumoral
(voir figure 19).
4.4.1 L’activité anti-tumorale du NCX 1102 est-elle due à sa partie
AINS, à savoir le sulindac ?
Cette hypothèse est la moins probable car :
� de fortes concentrations et de longs temps d’incubation ont été nécessaires pour
observer les faibles effets cytotoxiques et pro-apoptotiques du sulindac alors que les
effets du NCX 1102 étaient visibles dès 24h à des concentrations très inférieures à celles
du sulindac.
� le sulindac n’a montré aucun effet sur le cycle cellulaire ni sur la prolifération des
lignées cellulaires.
� les IC50% du sulindac sont largement plus élevées que celles du NCX 1102. Aux
concentrations de NCX 1102 utilisées, la partie « sulindac » du NO-AINS se trouve donc
forcément à une concentration très inférieure à sa concentration active.
L’attribution de l’activité du NCX 1102 à sa seule partie sulindac est donc peu
probable.
150
4.4.2 L’activité du NCX 1102 est-elle due à la partie sulindac-
espaceur ?
Deux arguments viennent étayer cette hypothèse :
� les auteurs d’une étude menée sur la NO-aspirine NCX 4040 ont montré que la partie
aspirine-espaceur (NCX 4040 dénitré voir figure 9C ) pouvait exercer un effet inhibiteur
notable (50% de l’effet du NCX 4040) sur l’induction de la NO synthase inductible
(iNOS) ou encore réduire notablement l’interaction du facteur NF-�B avec l’ADN dans
des cellules tumorales du colon [406]. Ces effets sont certes moins importants que ceux
obtenus avec NCX 4040, mais largement plus marqués que ceux de l’aspirine seule à
concentration équivalente.
� la nature de l’espaceur semble jouer un rôle dans l’activité des NO-AINS : les NO-
AINS ayant un espaceur aromatique sont plus actifs que ceux ayant un espaceur
aliphatique [356, 357].
Au moins un élément vient cependant à l’encontre de cette hypothèse : la première
étape du catabolisme des NO-AINS semble être le clivage de la liaison ester entre la partie
AINS et l’espaceur. La libération du NO intervenant à priori dans une seconde étape [364].
Mis à part la grande probabilité qu’il s’agisse d’une estérase, la ou les enzyme(s) contribuant
à dégrader les NO-AINS n’ont pas encore été identifiées.
Il peut cependant être envisagé que parmi toutes les enzymes contenues dans les
fluides biologiques ou les cellules, certaines soient capable de couper la liaison entre le NO2
et l’espaceur sans rompre la fonction ester reliant l’AINS à l’espaceur.
Dans le cadre de cette hypothèse, le rôle exact de l’espaceur dans l’augmentation de
l’activité de l’AINS-espaceur par rapport à l’AINS seul reste à être défini. On peut envisager
que l’espaceur facilite la liaison de l’AINS avec sa cible, soit par un phénomène
151
conformationnel, soit par un type particulier de liaisons chimiques, cette dernière
considération pouvant expliquer l’avantage d’un espaceur aromatique sur un espaceur
aliphatique, par exemple.
Des travaux sont en cours pour évaluer la contribution des espaceurs dans l’activité
des NO-AINS (voir la discussion de l’article de Kashfi et coll. [393]).
4.4.3 L’activité du NCX 1102 est-elle due au NO ?
Plusieurs éléments vont dans le sens de cette hypothèse :
� le NCX 1102 est nettement plus cytotoxique que le sulindac seul (avec une IC50% de
15 à 55 fois supérieure à celle du sulindac)
� contrairement au sulindac, le NCX 1102 exerce un effet cytotoxique, antiprolifératif,
pro-apoptotique et perturbateur du cycle cellulaire sur les lignées cellulaires. Tous ces
effets ont été décrits en réponse à une production de NO dans différents types cellulaires
(voir introduction, paragraphe 1.4.4.2 Effet anti-tumoral du NO).
� bien que cela n’ait pas été testé dans le présent travail, on sait que l’utilisation de
molécule piégeant le NO tel que l’oxyhémoglobine ou le bleu de méthylène acide
diminuent les effets des NO-AINS [437, 438]
� plusieurs études montrent clairement une libération de NO ou de ses métabolites
nitrates et/ou nitrites à partir de différents NO-AINS [358, 361, 368]
� la dénitration des NO-AINS diminue leurs effets. Ainsi le NCX 4040 dénitré est
beaucoup moins actif pour inhiber l’induction de l’iNOS ou réduire l’interaction du
facteur NF-�B avec l’ADN que le NCX 4040 [406]. De plus, le NCX 4040 dénitré inhibe
beaucoup plus faiblement (15% par rapport au contrôle) l’activité transcriptionnelle
152
TCF4-dépendante dans la lignée tumorale de colon SW480 que le NCX 4040 (70% par
rapport au contrôle) [407].
Il est à noter que les résultats du présent travail ont montré que le NCX 1102 est plus
cytotoxique que le nitroprusside de sodium (SNP), donneur de NO utilisé comme référence,
laissant penser à un rôle éventuel de la partie « sulindac » du NCX 1102. Or cette hypothèse,
comme il a été discuté plus haut, est très peu probable. Par ailleurs, la supériorité du NCX
1102 sur le SNP n’est pas nécessairement en opposition avec un rôle prépondérant du NO
dans l’activité anti-tumorale du NCX 1102. En effet, les effets du NO sont souvent fonction
de la nature du donneur de NO utilisé [261, 358] et les NO-AINS semblent libérer le NO de
façon beaucoup plus lente et moins massive que le SNP [358].
Autre élément en faveur du rôle du NO dans l’activité des NO-AINS, l’influence de la
position du groupement NO2 (isomérie positionnelle) sur l’effet de ces molécules. En effet, il
a été montré que la position du NO2 sur l’espaceur aromatique du NCX 4040 modulait son
activité, notamment au niveau de son action cytotoxique [407].
Cependant, dans cette étude, aucune libération de NO, ni sous forme de nitrates, ni
sous forme de nitrites n’a pu être détecté à partir du NCX 1102 mis en présence des
différentes lignées après une durée d’incubation de 24h (voir figure 18). Ce résultat n’est pas
concluant car il semblerait que la technique utilisée (Dosage de nitrites par réactif de Griess)
ne soit pas très sensible (détection de 0.43µM à 65µM de nitrites). Sachant que le NO est
capable d’exercer des effets physiologiques à très faibles concentrations, il est tout à fait
possible que la quantité de NO libérée par le NCX 1102, bien que biologiquement active, ne
soit pas détectable par la réaction de Griess. Il serait donc nécessaire de refaire le dosage avec
une technique plus sensible tel que le dosage par chemoluminescence à l’ozone capable de
détecter des concentrations en nitrites et nitrates de l’ordre du nanogramme [439].
153
4.4.4 L’activité du NCX 1102 est-elle la résultante d’une synergie
entre le NO et la partie AINS ?
Cette hypothèse écoule du fait que le NCX 1102 est à la fois plus cytotoxique que le
sulindac et que le donneur de NO de référence, le SNP. Comme l’action du sulindac seule
n’est pas envisageable, une synergie entre NO et sulindac pourrait expliquer cette supériorité
du NO-sulindac sur son AINS d’origine et sur le SNP. Malheureusement, les résultats obtenus
en combinant le SNP avec du sulindac (voir figure 17) aux mêmes concentrations que le
NCX 1102 démontrent qu’il n’y a aucune coopération entre le SNP et le sulindac.
Au vu de ces différentes hypothèses, il est probable que la plus grande part de
l’activité anti-tumorale du NCX 1102 soit liée à l’action du NO. L’implication, bien que
minime, de la partie sulindac dans les effets du NCX 1102, via un mécanisme de
potentialisation par l’espaceur, n’est cependant pas à écarter et reste à être démontrée plus
clairement.
154
Figure 19 : Différentes hypothèses sur la ou les parties impliquées dans l’effet anti-tumoral
du NCX 1102.
A : la partie AINS, ici, le sulindac. B : la partie AINS potentialisée par l’espaceur. C : le NO
issu du groupement NO2. D : une synergie entre la partie AINS et le NO libéré par le
groupement NO2.
155
4.5 Quels sont les mécanismes impliqués dans l’action
anti-tumorale du NCX 1102 ?
Partant de l’hypothèse que c’est probablement la partie NO du NO-AINS qui joue le
plus grand rôle dans l’activité de la molécule, deux voies les plus communes de l’activité
antiproliférative du NO ont étés explorées : la voie dépendante du cGMP et la voie des
polyamines (cGMP indépendante). La voie des polyamines est impliquée dans l’effet
antiprolifératif d’un autre NO-AINS, le dérivé de l’aspirine NCX 4016 sur des cellules
musculaires lisses de l’aorte de rat [320].
Les résultas de la présente étude (voir Huguenin et coll. Prostate publié en ligne le 16
Mars 2004 et les figures 11, 12, 13 14 et 15) montrent qu’aucune de ces deux voies ne semble
impliquée dans l’effet antiprolifératif du NCX 1102 pour la majorité des lignées. Seule la
lignée prostatique PNT1A fait exception : il semblerait que les deux voies, cGMP dépendante
et la voie de l’arginine soient impliquées dans le faible effet antiprolifératif du NCX 1102 sur
cette lignée.
Plusieurs autres voies, impliquant le NO et/ou la partie sulindac + espaceur pourraient
expliquer les effets du NCX 1102 (voir figure 20).
4.5.1 L’inhibition de COX-2
Il a été montré que COX-2 était surexprimé dans les cancers de vessie [168, 170] et de
prostate [174, 177]. Les lignées cellulaires de prostate LNCaP et PC3 surexpriment COX-2
par rapport à des cellules épithéliales prostatiques normales [440] et des inhibiteurs
156
spécifiques de COX-2 sont capables d’induire l’apoptose dans ces deux lignées [180, 440,
441], tout comme le NCX 1102.
La lignée T24 exprime elle aussi COX-2 [170, 442]. En revanche, aucune donnée n’a
pu être trouvée concernant l’expression de COX-2 dans les lignées de vessie 647V et 1207.
Etant donné que le tissu prostatique normal n’exprime pas ou très peu COX-2, il est
permis de penser que la lignée PNT1A, issue de cellules normales immortalisées n’exprime
pas COX-2. Or cette lignée bien que moins sensible à l’activité anti-tumorale du NCX 1102
que les 5 autres lignées testées ne subit pas moins certain de ses effets, montrant ainsi
l’existence d’autres voies d’action du NCX 1102 en dehors de l’inhibition de COX-2. Cette
constatation est appuyée par l’étude de Kashfi et coll. qui ont montré que le NCX 1102
exerçait un effet anti-tumoral sur une lignée de carcinome pancréatique n’exprimant pas
COX-2 [393] et qu’un dérivé nitré de l’aspirine, contrairement à l’aspirine elle-même,
n’inhibait pas l’activité de COX-1 et COX-2 dans un modèle de carcinome du colon chez le
rat [394]. D’autre part, des études ont montré que certains AINS classiques étaient capable
d’exercer leur activité pro-apoptotique et antiproliférative dans des lignées n’exprimant pas
COX-2 [126, 144]. Il existe donc des mécanismes COX-2 indépendants par lesquels à la fois
les AINS et les NO-AINS agiraient sur les cellules tumorales.
4.5.2 L’inhibition d’iNOS
Des études menées avec plusieurs NO-AINS ont montré que cette classe de molécules
exerce un effet inhibiteur avéré sur l’iNOS : le NO-flurbiprofène était capable d’inhiber
l’expression de l’iNOS ainsi que son activité [401, 402] et la NO-aspirine NCX 4040
diminuait l’expression protéique de l’iNOS induite par des cytokines dans des cellules
tumorales de colon [406]. D’autre part, l’inhibition d’iNOS est corrélée avec une diminution
157
du nombre de tumeurs et d’adénomes du colon dans des rats AOM [403] et dans les souris
Min [405].
Or, l’iNOS est surexprimée dans les cancers de vessie et de prostate et semble jouer un
rôle dans le développement de ces pathologies [443-446]. De plus, la lignée T24 présente une
activité basale d’iNOS, en l’absence de stimulation externe, comme par exemple celle
résultant de l’action des cytokines [447].
NCX 1102 pourrait donc exercer son potentiel anti-tumoral en inhibant iNOS dans les
lignées de vessie et de prostate utilisées dans cette étude. L’expression de l’iNOS dans la
plupart de ces lignées, ainsi que l’effet inhibiteur du NCX 1102 sur son activité restent
néanmoins à être caractérisés.
4.5.3 NF-�B
Il est intéressant de noter qu’à la fois le sulindac et le NO sont capables d’inhiber
l’activation du facteur de transcription NF-�B [131, 448], même si leurs modes d’action sont
quelque peu différents : le sulindac inhibe l’activité de l’IKK� kinase, enzyme indispensable
pour activer le NF-�B, alors que le NO augmente l’expression et stabilise l’inhibiteur du NF-
�B, I�B� et/ou inhibe la liaison NF-�B/ADN par nitrosation de la sous unité p50 [449].
Par ailleurs, le sulindac n’est pas la seule molécule capable d’inhiber le NF- �B,
certains NO-AINS ont également cette propriété : une étude menée avec la NO-aspirine NCX
4040 a montré que cette molécule inhibait la liaison entre le NF-�B et l’ADN dans des
cellules tumorales de colon [406].
La voie de l’inhibition de l’activation du NF-�B ou l’inhibition de sa liaison avec
l’ADN pourrait donc être utilisée par le NCX 1102 pour exercer son effet anti-tumoral
puisqu’il combine à la fois le sulindac et le NO.
158
4.5.4 Voie de la �-caténine/TCF
La capacité du sulindac à dégrader la �-caténine, à inhiber sa localisation nucléaire et à
empêcher la transcription de gènes via la voie de la �-caténine/TCF a été montrée in vitro et
in vivo [450, 451] dans le cadre du cancer du colon.
Une étude utilisant la NO-aspirine NCX 4040 a montré qu’au moins un membre de la
classe des NO-AINS était capables d’inhiber la formation du complexe �-caténine/TCF-4
dans le noyau de cellules tumorales de colon [407]. De même les auteurs ont pu montrer que
la partie NO du NCX 4040 était essentielle pour inhiber la transcription de gènes par le
complexe �-caténine/TCF-4. Cet effet a également été retrouvé dans une moindre mesure
pour un donneur de NO exogène S-nitroso-N-acetyl-D,L-penicillamine (SNAP), indiquant
que le NO est lui aussi capable d’inhiber cette voie de signalisation.
Par conséquent, le NCX 1102 pourrait également utiliser cette voie pour exercer son
effet anti-tumoral
Toutes ces voies pourraient expliquer au moins en partie l’effet anti-tumoral du NCX
1102, d’autant plus qu’elles sont toutes plus ou moins interconnectées comme le laissent
entendre les résultats obtenus par Williams et coll. [406]. Ces auteurs ont montré que la NO-
aspirine NCX 4040 inhibait les voies du NF-�B, �-caténine/TCF et l’iNOS, tout en
augmentant l’expression de COX-2 dans des cellules tumorales de colon .
Le NO-AINS semblent donc capables d’agir directement sur plusieurs voies de
signalisation impliquées dans la carcinogenèse, le développement ou la progression des
cancers de prostate et de vessie.
159
Les mécanismes impliqués dans l’effet anti-tumoral du NCX 1102 restent à être
déterminés de façon plus précise. Les différentes perspectives seront développées dans la
partie conclusion de ce travail.
Figure 20 : Différents mécanismes possibles pouvant expliquer l’effet anti-tumoral du NCX
1102 sur les lignées de vessie et de prostate utilisées dans cette étude.
160
4.6 Le NCX 1102 exerce des effets différents selon le
degré de transformation tumorale de la lignée cellulaire
Les principaux effets du NCX 1102 sur les lignées étudiées dans cette étude sont
présentés dans le tableau comparatif ci-dessous (tableau 5). Il en ressort que l’activité du
NCX 1102 est sélective, agissant en fonction du degré d’agressivité des lignées.
Tableau 5 : Récapitulatif des différents effets du NCX 1102 sur les lignées cellulaires
utilisées dans cette étude.
Degré d’agressivité Lignée
cellulaire
IC 50%
µM
(24h)
IG 50%
µM
(24h)
Effet sur le
cycle cellulaire
( environ
IG50%, 24h)
Présence de
cellules
multinucléées
Présence
de cellules
bloquées
en mitose
%
Apoptose
(24h)
Grade 3
Peu différencié T24 24.4 13.3 aucun Oui Non 13.4
Grade 3 1207 37.9 10 Accumulation
en G2-M Oui Oui
Non
significatif
Grade 2 647V 35.9 18.8 Accumulation
en G2-M Oui Oui 2.1
Androgéno-
indépendant PC3 31.3 12
Accumulation
en G2-M Oui Oui 14.7
Androgéno-
dépendant LNCaP 9.2 4.6
Accumulation
en G0-G1 Non Oui 12.8
Cellules normales
immortalisées PNT1A 31.9 > 45
Accumulation
en G2-M Oui Oui 8.1
161
4.6.1 Cas des lignées de vessie
On constate en effet que la lignée tumorale la moins agressive, 647V, est globalement
moins sensible à l’effet antiprolifératif et pro-apoptotique du NCX 1102 que les deux autres
lignées. Par ailleurs, la cytotoxicité du NCX 1102 a été examinée non seulement sur les trois
lignées T24, 647V et 1207 mais également sur des cultures primaires d’urothélium normal
obtenus à partir d’explants. L’analyse microscopique a permis de constater que, même à forte
concentration en NCX 1102, la viabilité de l’urothélium normal ne semblait pas être affectée
par le NO-AINS, alors qu’à concentrations équivalentes, les lignées tumorales présentaient
une grande quantité de cellules en suspension dans le milieu de culture
Au contraire, le NCX 1102 induit fortement l’apoptose dans la lignée la plus
agressive, T24, qui est par ailleurs la plus sensible des trois lignées à l’effet cytotoxique du
NO-AINS.
Ainsi, deux types de réponses différentes au NCX 1102 sont été obtenus, pour une
concentration proche de l’IG50% :
� arrêt en G2-M avec une apoptose faible ou nulle pour 647V et 1207
� apoptose sans arrêt du cycle cellulaire pour T24
4.6.2 Cas des lignées de prostate
La même constatation concernant l’effet différentiel du NCX 1102 a été faite sur les
lignées épithéliales prostatiques. En effet, c’est la lignée normale immortalisée PNT1A qui est
de loin la moins sensible aux effets du NO-AINS : aucune inhibition de la synthèse de l’ADN
n’est constatée aux concentrations de NCX 1102 utilisées au cours de l’étude et l’induction de
l’apoptose dans les cellules de PNT1A est significativement inférieure statistiquement à celle
constatée dans les deux lignées tumorales.
162
Contrairement aux lignées vésicales où c’est la lignée tumorale la plus agressive qui
semblait être plus sensible au NCX 1102, c’est la lignée androgéno-dépendante LNCaP qui
est à la fois la lignée la plus sensible au NO-AINS, mais également la plus sensible des six
lignées utilisées dans cette étude. Cette constatation est intéressante dans la perspective d’une
application thérapeutique non hormonale du cancer de prostate androgéno-dépendant, lequel
présente un risque élevé de devenir androgéno-indépendant après des traitements hormonaux.
4.6.3 Comment expliquer l’effet sélectif du NCX 1102 sur les lignées
tumorales par rapport aux cellules normales ?
Plusieurs hypothèses pourraient expliquer l’effet différentiel du NCX 1102 :
� la surexpression de COX-2 dans les cellules tumorales de vessie et de prostate par
rapport à celle de leurs tissus sains respectifs. Cette hypothèse est appuyée par une étude
sur le celecoxib, un inhibiteur spécifique de COX-2, capable d’exercer un effet
antiprolifératif sur une lignée humaine de cholangiocarcinome surexprimant COX-2 mais
n’exerçant pas d’effet significatif sur une lignée de cholangiocarcinome déficiente en
COX-2 [452].
� la surexpression d’iNOS dans les cellules tumorales par rapport aux tissus sains [443,
446]. D’ailleurs, la lignée T24 présente une iNOS active même sans stimulation avec des
cytokines, contrairement à l’urothélium normal [447].
� la vitesse de prolifération peu élevée du tissu urothélial [453] et prostatique normal par
rapport à celle des lignées tumorales. En effet, le NCX 1102 a des effets sur la
prolifération et particulièrement sur le cycle cellulaire; il est permis de penser qu’il
pourrait être plus actif sur les cellules qui se multiplient rapidement.
163
4.7 Applications thérapeutiques du NCX 1102
Après avoir montré que le NCX 1102 exerçait une activité anti-tumorale sur les
cancers de vessie et de prostate, et dans l’éventualité de bons résultats in vivo, il semblait
intéressant de discuter des différentes applications possibles de ce nouveau composé (et
finalement des NO-AINS en général) dans la prise en charge des cancers urologiques et de ses
avantages par rapport aux inhibiteurs spécifiques de COX-2 déjà existants.
4.7.1 Agent de chimiothérapie, seul ou en combinaison avec d’autres
molécules anticancéreuses.
Le NCX 1102 diminue la prolifération des cellules tumorales et induit leur apoptose.
Bien qu’il n’y ait pas encore de données scientifiques sur le potentiel des NO-AINS pour la
chimiothérapie des cancers, une possible utilisation de ces molécules seules ou en
combinaison avec des agents connus pourrait être envisagée dans le futur. Des études avec des
dérivés d’AINS ont déjà été menées : l’exisulind, dérivé du sulindac à permis, en combinaison
avec le docetaxel (un taxane semi-synthétique utilisé pour traiter les patients atteints du cancer
du poumon non à petites cellules) d’augmenter la survie de rats athymiques porteurs de
tumeurs pulmonaires induites par inoculation orthotopique d’une lignée de cancer du poumon
non à petites cellules et d’inhiber de façon synergique la prolifération de ces mêmes cellules
in vitro [454, 455]. De même, un essai clinique de phaseI/II a été mené avec cette même
combinaison exisulind/docetaxel sur des patients atteints de cancer de la prostate en
échappement hormonal [456]. De plus, l’exisulind seul diminuait l’expression du PSA dans
des patients qui présentaient une élévation de leur taux de PSA après prostatectomie radicale,
164
même chez ceux présentant un fort risque de développer des métastase. L’exisulind
prolongeait également le temps de doublement du taux de PSA chez les patients à haut risque
par rapport au placebo et était très bien toléré par les malades [457]. Enfin, plusieurs AINS
dont le sulindac et le sulindac sulfone étaient capable d’augmenter l’effet cytotoxique de
plusieurs agents de chimiothérapie in vitro sur des lignées tumorales du poumon de leucémie
[458].
Or les NO-AINS présentent un potentiel anti-tumoral plus grand que les AINS
classiques tout en étant moins toxiques pour le système gastrointestinal, faisant d’eux de bons
candidats pour cette application thérapeutique.
4.7.2 Adjuvant à la BCG thérapie dans le traitement des tumeurs
superficielles de vessie
Le traitement le plus efficace à l’heure actuelle contre les tumeurs superficielles de
vessie est l’immunothérapie intravésicale par instillation du Bacille de Calmette-Guérin
(BCG). Malheureusement, ce traitement présente des effets secondaires et notamment des
forts phénomènes inflammatoires. La combinaison du NCX 1102 avec la BCG-thérapie
pourrait être très intéressante car cette molécule exerce une activité anti-tumorale avérée sur
les lignées de vessie et qu’elle a de fortes chances d’avoir conservé son activité anti-
inflammatoire inhérente à sa partie AINS, comme c’est le cas pour d’autres NO-AINS [366,
370, 459].
Ainsi, le NCX 1102 pourrait diminuer les effets secondaires inflammatoires liés au
traitement par le BCG et améliorer l’élimination des cellules tumorales via son potentiel anti-
tumoral.
165
D’autres part, des effets bénéfiques de la part de certains AINS ont été démontrés.
Ainsi l’indomethacine, en diminuant la production de PGE2 augmente notablement l’activité
cytotoxique-BCG induite de macrophages de souris dirigée contre les cellules tumorales de
vessie murines ainsi que la production d’IFN-γ et de TNF-α par ces mêmes macrophages
[460]. De plus, l’indomethacine abolit l’inhibition PGE2-dépendante de la prolifération de
cellules tueuses activées par des lymphokines (cellues LAK), augmentant ainsi leur
cytotoxicité contre les cellules tumorales de vessie chez l’homme [461].
Ces résultats laissent à penser que les AINS, et à plus forte raison les NO-AINS
pourraient augmenter l’efficacité des immunothérapies contre le cancer de vessie en agissant
sur la voie COX dépendante.
4.7.3 Adjuvant pour augmenter la sensibilité des cellules tumorales
à la radiothérapie.
Plusieurs études montrent que l’inhibition de COX-2 dans les cellules tumorales
permet d’augmenter leur sensibilité aux traitements par radiothérapie, sans augmenter la
sensibilité des tissus sains adjacents [462-465]. Un des mécanismes impliqué dans cet effet
serait l’inhibition de la production de PGE2 , entraînant entre autre une perméabilisation donc
une fragilisation des vaisseaux néoformés dans les tumeurs [466].
L’augmentation de la sensibilité des tumeurs aux traitements de radiothérapie ou
même à l’hyperthermie a aussi été constatée pour les AINS classiques. Le sulindac et
l’ibuprofène augmentent le délai de croissance de xénogreffes de lignées tumorales
prostatiques androgéno-indépendantes PC3 et DU145 chez la souris en combinaison avec une
radiothépie ou une hyperthermie [467]. L’aspirine, en combinaison avec la radiothérapie
166
entraîne l’apoptose et exerce un effet antiprolifératif sur une lignée de cancer cervical humain
[468].
Les NO-AINS pourraient donc eux aussi être utilisés pour augmenter de façon
synergique l’effet anti-tumoral de la radiothérapie.
4.7.4 Agent de chémoprévention des cancers de vessie et de prostate
Finalement, le NCX 1102 pourrait être utilisé comme agent de chémoprévention pour
inhiber la carcinogenèse et le développement des cancers de vessie et de prostate. En effet, les
AINS ont montré un potentiel chémopréventif dans plusieurs types de cancers et en particulier
celui du colon [43, 469] où la surexpression de COX-2 induit le développement et la
progression tumorale [470].
Or, comme il l’a déjà été abordé dans l’introduction, COX-2 semble être impliquée
dans le développement des lésions néoplasiques de la vessie telles que les carcinomes in situ
(CIS) et les carcinomes transitionnels et plusieurs études ont montré une action
chémopréventive des AINS sur le cancer de vessie, à la fois in vitro et/ou in vivo [471, 472],
incluant le sulindac [203, 473].
De même, COX-2 est surexprimée dans le cancer de prostate ainsi que dans les
néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), supposées être des lésions précurseurs du
cancer prostatique. COX-2 semble également impliquée dans la progression de cette
pathologie. Comme dans le cas du cancer de vessie, des études montrent que les AINS
pourraient inhiber l’initiation et le développement du cancer de prostate [216, 218].
Les NO-AINS, plus actifs et moins toxiques que les AINS classiques pourraient donc
servir à inhiber, entre autre, COX-2 dans les lésions initiatrices des cancers de vessie et de
prostate, empêchant ainsi la maladie de se développer.
167
La seule donnée actuelle concernant un effet chémopréventif de la part d’un NO-
AINS, mais très encourageante, a été obtenue avec un dérivé nitré de l’aspirine. Cette
molécule était capable de réduire le nombre de foyers de cryptes aberrantes dans un modèle
de cancer du colon chémoinduit chez le rat [394], et ce plus efficacement que sa molécule
d’origine, l’aspirine.
Il semble donc intéressant de pouvoir tester le potentiel chémopréventif du NCX 1102.
168
5 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
169
Cette étude a permis de montrer que le NCX 1102 était capable d’empêcher la division
des cellules tumorales de vessie et de prostate et d’induire leur mort tout en ayant un effet
moins marqué sur les cellules normales des deux tissus.
Le NCX 1102 est donc un candidat intéressant comme adjuvant de thérapies déjà
existantes, pour le développement de nouveaux traitements et/ou de la chémoprévention des
cancers de vessie et de prostate.
Son activité particulièrement marquée sur la lignée androgéno-dépendante LNCaP
peut par ailleurs être à la base d’un nouveau traitement des cancers androgéno-dépendants,
avec l’avantage de ne pas faire intervenir d’hormones et par là d’éviter l’échappement
hormonal. Le potentiel anti-tumoral sélectif du NCX 1102 mérite donc d’être étudié in vivo.
Différents modèles peuvent être utilisés pour étudier les effets du NCX 1102 in vivo
sur les tumeurs de vessie :
Des instillations intra-vésicale de NCX 1102 (ou autre NO-AINS) dans le modèle de
xénogreffe de cellules tumorales dans les souris à syndrome d’immuno-déficience sévère
combiné (SCID) peuvent être envisagés [474]. Ce modèle consiste à dilater la vessie des
souris SCID avec du tampon pour induire des ruptures superficielles dans l’urothélium. Des
cellules de TCC sont alors inoculées dans la vessie de la souris et vont aller se loger dans les
interstices préalablement formés, évoluant ensuite en tumeurs transitionnelles de vessie. Ce
modèle permet d’évaluer l’effet du NCX 1102 sur la formation des tumeurs (nombre, taille,
analyse immunohistochimique pour déterminer le taux de cellules en prolifération ou le taux
de cellules en apoptose…)
Un autre modèle utilisable est celui du TCC canin. Le TCC canin a de grandes
similarités avec les TCC invasifs humains. En effet il y a une bonne corrélation entre la
forme humaine et canine pour l’expression de COX-2, pour les caractéristiques
170
histopathologiques, l’évolution biologique (formation de métastases) et la réponse à la
chimiothérapie [475, 476].
Pour étudier l’effet du NCX 1102 sur les tumeurs de prostate, un modèle de
xénogreffe à partir de différentes lignées tumorales prostatiques pourra être utilisé. Le NCX
1102 sera alors administré soit oralement soit par injection intra-péritonéale. L’effet du NCX
1102 sur la taille des tumeurs et le nombre d’éventuelles métastases (en fonction des lignées
cellulaires utilisées) pourra être mesuré. Des analyses immunohistochimiques des tumeurs
pourront être réalisées pour établir le taux de prolifération ou d’apoptose induit par NCX
1102.
Cette étude devra s’accompagner de vérifications quant à l’absence d’effets
secondaires du NCX 1102, notamment la gastrotoxicité. La libération de NO ou des dérivés
métaboliques du sulindac pourra également être mesurée.
Des recherches supplémentaires devront également être menées pour déterminer les
mécanismes impliqués dans l’effet anti-tumoral du NCX 1102 , notamment les voies
suivantes :
� voie COX. Il s’agira de re-caractériser l’expression de COX-1 et COX-2 au niveau
protéique et ARNm dans les lignées étudiées et d’étudier l’éventuelle inhibition de
l’activité de COX-2 par essai enzymatique. La production de PGE2 peut également être
mesurée par test ELISA.
� voie iNOS. Il s’agira de vérifier l’induction d’iNOS dans les cellules testées en
utilisant le LPS ou d’autres molécules. S’il y a effectivement induction d’iNOS, un
171
dosage de la production de nitrates ou de nitrites en absence ou en présence du NCX
1102 pourra être effectué pour déterminer son influence sur l’activité d’iNOS.
� inhibition du NF-�B. L’activité de liaison du NF-�B à l’ADN pourra être évaluée en
absence ou en présence du NCX 1102 pour évaluer son influence sur NF-�B.
� inhibition de la voie WNT et particulièrement la �-caténine. De même, en absence ou
en présence du NCX 1102, la liaison entre la �-caténine et le TCF ainsi que la
localisation de la �-caténine pourront être analysées.
Enfin, en périphérie des travaux menés sur NCX 1102, il a été montré qu’un nouvel
NO-AINS dérivé de l’aspirine, NCX 4040, avait une activité cytotoxique encore plus élevée
que celle du NCX 1102. Ce résultat est parfaitement en accord avec d’autres études réalisées
sur d’autres types de lignées tumorales et qui ont montré que le NCX 4040 est plus
cytotoxique et exerce un effet pro-apoptotique, antiprolifératif et perturbateur du cycle
cellulaire plus élevés que le NCX 1102 ou d’autres NO-AINS [390, 393].
Il semble donc intéressant d’envisager l’étude du potentiel pro-apoptotique et les effets
de ce nouvel NO-AINS sur les même lignées de vessie et de prostate.
Ainsi, l’étude du potentiel anti-tumoral des NO-AINS ne fait que commencer.
172
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198
7 ANNEXES
199
FORMULES CHIMIQUES
H
CO2(CH2)4ONO2F
S
O
NCX 1102
H
F
S
O
COOH
sulindac
SO
H
F O
ON
OON
+
O
H Cl
NCX 1105
NO-SULINDAC
NS
OO
OH
N N
O
HN
+
OO
OH
NCX 1301
NO-PIROXICAM
N
O
Cl
O
O
O
N+
OO
O
NCX 530
NO-INDOMETHACINE
NO-IBUPROFENE
O
O
O
O
O ON
+
O
OMe
NCX 2210
200
OCOCH3
OH
O
aspirine
OCOCH3
O
O
O
O(CH2)4ONO2
MeO
NCX 2219
OCOCH3
O
O ONO2
NCX 4040
F
O
OH
Flurbiprofène
O
OF
O
O(CH2)4ONO2
OMe
NCX 2216
HCT 1026
F
O
OONO2
NO-ASPIRINE NO-FLURBIPROFENE
201
Les Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens (AINS) sont connus pour leurs propriétés anti-
inflammatoires, anti-pyrétiques et analgésiques. Plus récemment, des propriétés anti-tumorales de
ces composés ont été mises en évidence dans différents types de cancers. Un des mécanismes
d’action de ces agents a été attribué à leur capacité à inhiber la cyclooxygénase 2 (COX-2). Cette
enzyme est surexprimée dans les carcinomes de vessie et de prostate, et semble impliquée dans la
tumorigenèse et le développement de ces pathologies. Les AINS, présentent donc un intérêt
potentiel dans la lutte contre les cancers urologiques.
Cependant, les effets secondaires des AINS, notamment au niveau gastro-intestinal, limitent
leur utilisation. Grâce aux propriétés gastroprotectrices de l’oxyde nitrique, une nouvelle classe de
molécules a été développée: celle des anti-inflammatoires non stéroïdiens donneurs d’oxyde
nitrique (NO-AINS). De nombreuses études ont montré que ces nouveaux composés, formés d’un
AINS classique sur lequel est greffé un groupement donneur de NO, étaient beaucoup moins
toxiques que leur molécule d’origine tout en préservant, voire en augmentant, leurs propriétés
intrinsèques.
L'objectif du présent travail a été d’identifier les dérivés nitrés les plus actifs parmi plusieurs
NO-AINS issus d’AINS différents et de déterminer si ces nouvelles molécules étaient capables
d’induire la mort cellulaire et d’inhiber la multiplication des cellules tumorales de vessie et de
prostate, mettant en exergue l’intérêt potentiel des NO-AINS comme agent thérapeutiques dans les
cancers urologiques.
La première étape du travail a permis de sélectionner le NO-sulindac (NCX 1102)
comme étant le composé le plus cytotoxique sur les lignées testées. Une étude plus
approfondie des effets du NCX 1102 sur les lignées cellulaires a ensuite été effectuée. Les
résultats ont montré que cette molécule était largement plus active que sa molécule d’origine,
le sulindac. Le NCX 1102 s’est montré capable d’induire la mort cellulaire, notamment par
apoptose, et d’exercer un effet antiprolifératif sur les cellules, via une action sur le cycle
cellulaire entraînant une perturbation de la répartition des cellules dans les différentes phases
du cycle. D’autre part, le NCX 1102 semble exercer son effet antiprolifératif de façon plus
prononcée sur les lignées tumorales que sur les cellules épithéliales normales et son effet
cytotoxique est largement plus important sur les lignées tumorales de vessie que sur
l’urothélium normal. Autre fait notable, de toutes les lignées testées, c’est la lignée
androgéno-dépendante, LNCaP, qui est de loin la plus sensible à l’effet antitumoral du NCX
1102.
202
Mots clés : Anti-Inflammatoire Non Stéroïdien (AINS), Apoptose, Cancer, Cycle cellulaire,
Oxyde nitrique (NO), Proliferation cellulaire, Prostate, Vessie.
