Etude in vitro de la stabilité gastro-intestinale et de l’activité biologique de la microcine J25 : impact sur l’équilibre du microbiote colique et activité inhibitrice

contre Salmonella enteritidis

Mémoire

Emilie Reinberg

Maîtrise en microbiologie agroalimentaire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Emilie Reinberg, 2015

iii

Résumé

La microcine J25 (MccJ25), une bactériocine en forme de lasso synthétisée par Escherichia coli et ayant une

activité inhibitrice contre Salmonella, a été produite et purifiée d’un surnageant d’E. coli pTUC202. La stabilité

et l’activité biologique de cette bactériocine au niveau gastro-intestinal, ainsi que son impact sur l’équilibre du

microbiote colique, ont été étudiés à l’aide d’un système de fermentation en continu avec cellules

immobilisées reproduisant les conditions physiologiques et microbiologiques du côlon. L’analyse par qPCR du

microbiote colique n’a révélé aucun effet significatif sur l’équilibre du microbiote de la MccJ25 lorsqu’elle est

ajoutée à 0,4, 2 et 5 μM. Des tests d’activité antibactérienne ont démontré que la MccJ25 reste active contre

Salmonella enteritidis dans les conditions coliques testées. Ces résultats suggèrent un fort potentiel

d’utilisation de la MccJ25 comme alternative aux antibiotiques aussi bien chez l’animal que chez l’humain.

v

Abstract

Microcin J25 (MccJ25) is a lasso-shaped bacteriocin with an antibacterial activity against Salmonella. This

bacteriocin was produced and purified from the supernatant of Escherichia coli pTUC202. Its stability and

biological activity in the gastrointestinal tract as well as its impact on the colonic microbiota equilibrium were

studied using a continuous fermentation system with immobilized fecal microbiota simulating the physiological

and microbiological conditions of the colon. Analysis of colonic microbiota by qPCR revealed no significant

effect of MccJ25 on microbiota equilibrium at concentrations of 0.4, 2 et 5 μM. Antibacterial activity assays

demonstrated that MccJ25 remains active against Salmonella enteritidis in the tested colonic conditions.

These results are highly promising for the use of MccJ25 as an alternative to antibiotics in animals as well as

in humans.

vii

Table des matières

Résumé ............................................................................................................................................................... iii Abstract ............................................................................................................................................................... v Table des matières ............................................................................................................................................. vii Liste des tableaux .............................................................................................................................................. ix Liste des figures ................................................................................................................................................. xi Remerciements ................................................................................................................................................. xiii Avant-propos ..................................................................................................................................................... xv Introduction générale........................................................................................................................................... 1 Chapitre 1 : Revue de littérature ......................................................................................................................... 3

1.1. L’industrie canadienne de la volaille..................................................................................................... 3 1.2. Contamination de la volaille à Salmonella spp. .................................................................................... 4 1.3. Stratégies de contrôle de Salmonella spp. et autres opportunistes de la volaille ................................. 5

1.3.1. Les antibiotiques ........................................................................................................................... 5 1.3.2. Les alternatives aux antibiotiques ............................................................................................... 14

1.3.2.1. Les probiotiques .................................................................................................................. 14 1.3.2.2. Les prébiotiques .................................................................................................................. 17 1.3.2.3 Les huiles essentielles.......................................................................................................... 19 1.3.2.4. Les bactériophages ............................................................................................................. 20 1.3.2.5. Les enzymes ....................................................................................................................... 23 1.3.2.6. Les acides organiques......................................................................................................... 24 1.3.2.7. Les bactériocines ................................................................................................................ 26

1.3.2.7.1. Classification ................................................................................................................ 26 1.3.2.7.1.1. Les bactériocines produites par des bactéries à Gram-positif .............................. 26 1.3.2.7.1.2. Les bactériocines produites par des bactéries à Gram-négatif ............................. 29

1.3.2.7.2. Applications des propriétés anti-infectieuses des bactériocines .................................. 32 1.3.2.7.2.1. Alimentaires .......................................................................................................... 32 1.3.2.7.2.2. Vétérinaires........................................................................................................... 32 1.3.2.7.2.3. Médicales.............................................................................................................. 33

1.3.2.7.3. La microcine J25 .......................................................................................................... 35 1.4. Le microbiote intestinal ...................................................................................................................... 41 1.5. Les modèles de fermentation in vitro simulant le microbiote intestinal ............................................... 50 1.6. Travaux antérieurs et problématique.................................................................................................. 54

1.6.1. Travaux antérieurs en lien avec ce projet ................................................................................... 54 1.6.2. Hypothèse de recherche ............................................................................................................. 54 1.6.3. Objectif général ........................................................................................................................... 54 1.6.4. Objectifs spécifiques ................................................................................................................... 54

Chapitre 2 : Production, purification et étude de l’activité biologique de la microcine J25 ................................ 57 2.1. Résumé .............................................................................................................................................. 58 2.2. Abstract .............................................................................................................................................. 59 2.3. Introduction ........................................................................................................................................ 60 2.4. Matériel et méthodes .......................................................................................................................... 61

viii

2.4.1. Souches bactériennes et conditions de croissance .................................................................... 61 2.4.2. Production de la MccJ25 ............................................................................................................. 62 2.4.3. Purification de la MccJ25 ............................................................................................................ 62 2.4.4. Détermination de la concentration protéique .............................................................................. 62 2.4.5. Évaluation de l’activité antimicrobienne ...................................................................................... 63

2.4.5.1. Méthode de diffusion en gélose ........................................................................................... 63 2.4.5.2. Méthode de microtitration .................................................................................................... 63

2.5. Résultats et discussion ....................................................................................................................... 64 2.6. Conclusion .......................................................................................................................................... 71 2.7. Remerciements .................................................................................................................................. 71

Chapitre 3 : Étude in vitro de l'impact de la microcine J25 sur le microbiote colique et sur Salmonella enteritidis

dans un modèle de fermentation colique ........................................................................................................... 73 3.1. Résumé .............................................................................................................................................. 74 3.2. Abstract .............................................................................................................................................. 75 3.3. Introduction ......................................................................................................................................... 76 3.4. Materials and methods ....................................................................................................................... 77

3.4.1. Bacterial strains and growth conditions ....................................................................................... 77 3.4.2. Production and purification of MccJ25 ........................................................................................ 78 3.4.3. Colonic fermentation model ........................................................................................................ 78

3.4.3.1. Feces collection and immobilization in gel beads ................................................................ 78 3.4.3.2. Fermentation medium .......................................................................................................... 79 3.4.3.3. Fermentation procedures ..................................................................................................... 79

3.4.4. Bacterial enumeration by PMA-qPCR ......................................................................................... 82 3.4.4.1. Treatment with propidium monoazide .................................................................................. 82 3.4.4.2. DNA extraction .................................................................................................................... 82 3.4.4.3. Real-time PCR analysis ....................................................................................................... 82

3.4.5. Bacterial enumeration by plate count .......................................................................................... 85 3.4.6. Metabolite analyses .................................................................................................................... 85 3.4.7. Determination of MccJ25 antibacterial activity ............................................................................ 85

3.4.7.1. Agar diffusion assay ............................................................................................................ 85 3.4.7.2. Microtitration assay .............................................................................................................. 86

3.4.8. Statistical analysis ....................................................................................................................... 87 3.5. Results ............................................................................................................................................... 87

3.5.1. Microbial population analysis during the stabilization period ....................................................... 87 3.5.2. Effect of MccJ25 on colonic microbiota equilibrium ..................................................................... 90 3.5.3. Effect of MccJ25 on the metabolic activity of colonic microbiota ................................................. 93 3.5.4. Inhibitory activity of MccJ25 against Salmonella enteritidis under colonic conditions ................. 95 3.5.5. Stability and biological activity of MccJ25 under colonic conditions ............................................ 97 3.5.6. Determination of the MIC of MccJ25 for Salmonella enteritidis in Macfarlane medium ............ 101

3.6. Discussion ........................................................................................................................................ 101 3.7. Acknowledgements .......................................................................................................................... 105

Conclusion générale ........................................................................................................................................ 107 Références ...................................................................................................................................................... 111

ix

Liste des tableaux

Table 1-1 : Antibiotiques vendus en 2012 au Canada pour usage vétérinaire (Gouvernement du Canada,

2014). ......................................................................................................................................................... 7 Table 1-2 : Classification des antimicrobiens selon leur importance en médecine humaine (Gouvernement du

Canada, 2014). ......................................................................................................................................... 12 Table 1-3 : Bactéries probiotiques avec application possible en alimentation animale (Gaggia et al., 2010). .. 16 Table 1-4 : Mode d’action des prébiotiques (Gaggia et al., 2010). ................................................................... 18 Table 1-5 : Classification des bactériocines. Les bactériocines peuvent être divisées en deux types; celles

produites par des bactéries à Gram-positif et celles produites par des bactéries à Gram-négatif. ........... 31 Table 2-1 : Activité antimicrobienne contre Salmonella enteritidis en milieu LB des différentes fractions en

sortie de colonne Sep-Pak C18. ............................................................................................................... 66 Table 2-2 : Activité antimicrobienne contre Salmonella enteritidis de la MccJ25 au cours des différentes étapes

de purification de la bactériocine. ............................................................................................................. 67 Table 2-3 : Résultats d’une production de MccJ25 à partir d’une culture d’1,5 L de la souche productrice. Les

concentrations sont celles obtenues par la méthode de Lowry. ............................................................... 69 Table 3-1 : Primers used to quantify intestinal microbiota and Salmonella enteritidis by PMA-qPCR. ............. 84 Table 3-2 : Quantification by PMA-qPCR of the bacterial population of the fecal inocula and of the bioreactors

at the end of the stabilization period (day 14). .......................................................................................... 89 Table 3-3 : Results of agar diffusion assays using pure cultures of bacterial strains representing the major

species of the intestinal microbiota. Inhibition zone diameters are expressed in centimeters. The negative

control was 0.1 % peptone water without MccJ25. ................................................................................... 92 Table 3-4 : Concentrations of three organic acids in colonic fermentation broth before and after adding MccJ25

to the bioreactors (B1 and B2). Each value is the mean of replicates R1 (day 23) and R2 (day 27) ±

standard deviation, except those for t2 with 2 μM of MccJ25. Concentrations at t2 and t24 did not differ

significantly from t0, based on the HSU-Dunnett test (P ≤ 0.05). B1 : Bioreactor 1, B2 : Bioreactor 2. t0,

t2, t24 : before, 2 h and 24 h after addition of the bacteriocin. ................................................................. 94

xi

Liste des figures

Figure 1-1 : Structure primaire et secondaire de la MccJ25 (Vincent & Morero, 2009). ................................... 37 Figure 1-2 : Biosynthèse et maturation de la MccJ25 (Vincent & Morero, 2009). ............................................. 38 Figure 1-3 : Mécanisme d’import de la MccJ25 (Duquesne et al., 2007).......................................................... 40 Figure 1-4 : (a) Densités cellulaires bactériennes des différentes parties de l’appareil digestif. (b) Évolution du

microbiote intestinal au cours de la vie d’un homme, facteurs modulant sa composition, principaux

genres bactériens présents. C-section, Caesarean section (Power et al., 2014). .................................... 43 Figure 1-5 : Voies métaboliques de production de l’acétate, du propionate et du butyrate (Den Besten et al.,

2013). Les carbohydrates sont hydrolysés en monosaccharides qui eux-mêmes sont convertis en

phosphoénolpyruvate (PEP) par la voie d’Embden-Meyerhof-Parnas (glycolyse) ou par la voie des

pentoses phosphates. Le PEP est converti à son tour en acides organiques ou en alcools. L’acétate est

produit soit par hydrolyse d’Acétyl-CoA, soit par la voie de Wood-Ljungdahl à partir de CO2. Le

propionate est produit soit par réduction du lactate en propionate (voie de l’acrylate), soit par

décarboxylation du succinate (voie du succinate). Le butyrate est formé par condensation de deux

molécules d’Acétyl-CoA. ........................................................................................................................... 46 Figure 1-6 : Tractus gastro-intestinal de la volaille et son microbiote (Yeoman et al., 2012). .......................... 48 Figure 1-7 : Proportions des différents phyla (a) et familles (b) composant le microbiote caecal de la volaille

(Oakley et al., 2014). ................................................................................................................................ 49 Figure 1-8 : Schéma et caractéristiques d’un système de fermentation colique in vitro en batch, en continu

avec cellules libres et en continu avec cellules immobilisées. (a) Bille de gomme (xanthane et gellane)

immobilisant un microbiote fécal. (b) Photographie prise par microscopie électronique des bactéries

intestinales colonisant la périphérie de la bille (Payne et al., 2012). ........................................................ 53 Figure 2-1 : Résultats des tests d’activité contre Salmonella enteritidis par diffusion en gélose des différentes

étapes de purification de la bactériocine. a : témoin positif, b : fraction 20 % ACN après Sep-Pak et

évaporateur, c : témoin négatif, d : surnageant après centrifugation, e : témoin positif, f : fraction 40 %

ACN après Sep-Pak et évaporateur, g : fraction (30 %) après 1ère lyophilisation, h : témoin négatif, i :

fraction 30 % ACN après Sep-Pak et évaporateur, j : fraction 30 % après RP-HPLC. ............................. 68 Figure 2-2 : Chromatogrammes par HPLC analytique des différentes étapes de purification de la bactériocine.

L’évolution de la purification du peptide est bien visible, les impuretés disparaissent au fil de la

purification. A) chromatogramme du surnageant de culture de la souche productrice, B)

chromatogramme de la fraction à 30 % d’ACN en sortie de Sep-Pak, C) chromatogramme de

l’échantillon en sortie d’HPLC préparative. En (C), nous observons que l’échantillon est pur et ne contient

plus que la bactériocine d’intérêt. ............................................................................................................. 70 Figure 3-1 : Design of the colonic fermentation experiment. B1, B2 : bioreactor 1, bioreactor 2; BC : bead

colonization; R1, R2 : repetition 1, repetition 2. ........................................................................................ 81 Figure 3-2 : Bacterial populations in the bioreactors before (t0) and 4 h after (t4) adding MccJ25, based on

PMA-qPCR. Values with different letters are significantly different (Tukey’s HSD test, P values ≤ 0.05).

Figure 3-2A : addition of 0.4 μM MccJ25 to bioreactor 2. Figure 3-2B : addition of 2 μM MccJ25 to

bioreactor 1. Values are means of replicates R1 (day 23) et R2 (day 27) ± standard deviation. Figures 3-

2C and 3-2D : addition of 5 μM MccJ25 on day 31 to bioreactor 1 (C) and 2 (D)................................... 91

Figure 3-3 : Washout of Salmonella enteritidis from colonic continuous fermentation, as quantified by PMA-

qPCR (A) or by plating on CHROMagar (B). S. enteritidis was added alone at an initial concentration of

xii

107 CFU/mL (white triangle) or with MccJ25 at a concentration of 0.4 μM (square, dashed line) or 2 μ

M (circle). Squares and circles are means of replicates R1 (day 23) et R2 (day 27). For PMA-qPCR, S.

enteritidis alone is the mean of R1/B1 (day 15), R2/B1 (day 19), R1/B2 (day 15), R2/B2 (day 19). For

CHROMagar, S. enteritidis alone is R1/B1 on day 15. Black triangles represent the theoretical washout of

an inert particule added at 107 per mL. Bars indicate standard deviation. B1 : Bioreactor 1, B2 :

Bioreactor 2. ............................................................................................................................................. 96

Figure 3-4 : Inhibition of Salmonella enteritidis by MccJ25 at concentrations of 0 μM (a), 0.4 μM (b), 2 μM

(c), and 5 μM (d) in 0.1 % peptone water (A), sterile Macfarlane broth (B) and fermented Macfarlane

broth taken at the end of the stabilization period (C), as revealed by diffusion from wells in LB agar. ..... 98 Figure 3-5 : Inhibition of Salmonella enteritidis by samples collected during the fermentation from the

bioreactors 0 h (b), 1 h (c), 2 h (d) or 4 h (e) after adding MccJ25 at concentrations of 0.4 μM (A), 2 μ

M (B) and 5 μM (C), as revealed by diffusion from wells in LB agar. The negative control (a) was

fermentation broth sampled on day 14. .................................................................................................. 100

xiii

Remerciements

J’ai découvert le monde de l’agroalimentaire en entrant à l’Université Laval, très bien placée dans le domaine.

Quelle belle découverte! Avoir pu travailler dans un environnement aussi stimulant et novateur que l’INAF est

une chance dont je prends conscience. Je le dois à Ismaïl Fliss, mon directeur de recherche, qui m’a offert

l’opportunité d’apprendre à ses côtés. Je tiens à le remercier pour m’avoir confié un projet de recherche aussi

passionnant et pour les connaissances qu’il m’a transmises.

La réalisation de cette maîtrise n’aurait pu se faire sans le soutien de Benoît Fernandez. Je le remercie très

chaleureusement pour m’avoir guidée tout au long de ce processus, toujours présent, toujours répondant (je

dirais presque à toute heure du jour et de la nuit !), vif et dévoué à sa passion, la microbiologie.

Je tiens à remercier mes collègues de laboratoire pour l’aide apportée lors de la partie expérimentale ; Sabrine

Naïmi, Patricia Savard, Riadh Hammami, Marina Tessier et Nagham Irani. Je voudrais remercier spécialement

Didier Buisson pour sa bonne humeur, son dynamisme et son support en salle de fermentation alors que les

bioréacteurs me faisaient défaut. Merci également à Marine Béguin et à Diane Gagnon pour leur soutien

technique.

Il me faut remercier également Nataniel Therrien, mon conjoint, et mes parents, Olivier et Claudine Reinberg,

pour avoir eu confiance en moi, pour m’avoir supportée, encouragée et réconfortée dans les moments parfois

plus difficiles.

Pour finir, je tiens à remercier mes amies en baccalauréat d’agronomie, Vanessa Duval, Joanie Bédard,

Joanie Pellerin, Marianne Hamon, Marianne Lamontagne et Sarah Boucher, sans lesquelles le temps passé

au pavillon Paul-Comtois n’aurait pu être aussi agréable.

xv

Avant-propos

Ce mémoire de maîtrise s’articule en trois chapitres; une revue de littérature et deux articles scientifiques. La

majeure partie des expérimentations ainsi que la totalité de la rédaction de ce mémoire ont été réalisées par

moi-même. J’ai bénéficié de l’aide du Dr. Riadh Hammami et du Dr. Benoît Fernandez pour l’analyse

statistique et l’interprétation des résultats. Les expérimentations se sont déroulées dans les locaux de

l’Université Laval sous la direction de Pr. Ismaïl Fliss.

Le premier chapitre est une revue de littérature posant la problématique de l’étude. Il débouche sur

l’hypothèse et les objectifs du travail. Cette revue rassemble les connaissances accumulées jusqu’à ce jour

sur l’utilisation des antibiotiques en agriculture animale, leurs alternatives parmi lesquelles l’on trouve les

bactériocines. Elle présente également le rôle clé du microbiote intestinal, considéré comme un organe à part

entière, et les modèles de fermentation in vitro permettant de le simuler.

Le second chapitre, s’intitulant « Production, purification et étude de l’activité biologique de la microcine J25 »

et rédigé en français sous forme d’article scientifique, porte sur la production et la purification de microcine J25

en grandes quantités en vue de son utilisation in vitro dans un modèle de fermentation colique avec cellules

immobilisées, cette dernière présentée au chapitre 3. Dr. Benoît Fernandez, Dr. Riadh Hammami et Sabrine

Naïmi ont participé à la chaîne de production.

Le troisième chapitre est rédigé en anglais, également sous forme d’article scientifique, et s’intitule « In vitro

study of the impact of microcin J25 on colonic microbiota and Salmonella enteritidis using a colonic

fermentation model ». Dans ce chapitre, la stabilité et l’activité biologique de la MccJ25 en environnement

digestif, ainsi que son impact sur Salmonella enteritidis et sur le microbiote colique, ont été testés in vitro en

utilisant un système de fermentation en continu simulant les conditions physiologiques et microbiologiques du

côlon. Dr. Benoît Fernandez m’a guidée tout au long des manipulations en laboratoire.

Le mémoire se clôt avec une conclusion générale incluant les perspectives.

1

Introduction générale

Les antibiotiques sont utilisés dès la deuxième moitié du XXe siècle à grande échelle en agriculture de façon

thérapeutique, prophylactique et/ou comme facteurs de croissance (Gustafson & Bowen, 1997; Gyles, 2008).

L’utilisation massive d’antibiotiques entraîne l’apparition d’un nombre croissant de pathogènes résistants qui

menacent la santé publique (Reardon, 2014). La résistance des bactéries commensales et pathogènes de

l’animal d’élevage est un danger dû au risque réel et déjà observé de propagation de la résistance à des

pathogènes humains (Witte, 1998).

Les antibiotiques ont comme autre effet secondaire indésirable de perturber l’équilibre du microbiote

commensal de l’intestin (Chambers & Gong, 2011). Ils détruisent aussi bien les bactéries pathogènes ciblées

que celles bénéfiques pour l’hôte, ceci dû à leur large spectre d’action (Blaser, 2011). Il est estimé que le

tractus GIT héberge entre 1013 et 1014 microorganismes, avec plus de 1100 espèces bactériennes différentes

(Power, O'Toole, Stanton, Ross, & Fitzgerald, 2014). Les bactéries intestinales sont bénéfiques pour l’hôte en

convertissant les carbohydrates complexes en substrats absorbables, principalement en acides gras à chaîne

courte, source d’énergie, ainsi qu’en produisant des vitamines (Arumugam et al., 2011). Elles agissent comme

ligne de résistance bloquant la colonisation intestinale par des opportunistes (exclusion compétitive) (Le Blay,

Lacroix, Zihler, & Fliss, 2007; Payne, Zihler, Chassard, & Lacroix, 2012). Elles contribuent aussi à

l’établissement de l’immunité intestinale (Den Besten et al., 2013).

Depuis le 1er janvier 2006, l’utilisation des antibiotiques comme facteurs de croissance est bannie de l’Union

Européenne (Castanon, 2007). Leur utilisation à ces fins est encore autorisée au Canada, mais il semblerait

que leur interdiction se fasse dans un avenir proche. Il y a un besoin urgent d’alternatives et parmi celles

envisagées, l’utilisation de bactériocines est l’une des plus prometteuses. Les bactériocines sont des peptides

bactériens antimicrobiens synthétisés par voie ribosomale et actifs à des concentrations nanomolaires (Nes,

2011; Rea, Ross, Cotter, & Hill, 2011). Elles possèdent un spectre d’action généralement plus étroit que celui

des antibiotiques et de ce fait n’altéreraient pas l’équilibre du microbiote intestinal comme il a été démontré

pour la pédiocine PA-1 et la thuricine CD (Le Blay et al., 2007; Rea, Dobson, et al., 2011; Le Blay, Hammami,

Lacroix, & Fliss, 2012). La plupart des bactériocines sont stables à hautes températures et résistantes aux pH

extrêmes (Duquesne, Destoumieux-Garzòn, Peduzzi, & Rebuffat, 2007).

La microcine J25 (MccJ25) est une bactériocine de 2,1 kDa produite par Escherichia coli qui cible

spécifiquement Salmonella, Shigella et E. coli (BACTIBASE) avec une concentration minimale inhibitrice (CMI)

de 0,02 à 0,05 μM (Duquesne et al., 2007). Sa structure en lasso lui confère une résistance exceptionnelle

2

aux températures extrêmes ainsi qu’aux agents dénaturants et protéolytiques (Salomon & Farias, 1992). Les

travaux portant sur la structure, la biosynthèse, les mécanismes d’import et d’export et les modes d’action de

la MccJ25 sont relativement nombreux, toutefois les bactériocines produites par des bactéries à Gram-négatif

restent bien moins étudiées que celles de Gram-positif. L’activité antimicrobienne de la MccJ25 n’a été encore

que très peu testée. Sable et al. ont démontré que la MccJ25 est fortement active contre 12 souches

différentes de E. coli pathogènes, dont O157:H7 (Sable, Pons, Gendron-Gaillard, & Cottenceau, 2000). Ils

appliquèrent la MccJ25 (6,25 μg/mL) à la décontamination de lait écrémé, de jaune d’œuf et d’extrait de

viande contaminés à 103 CFU/mL de E. coli O157:H7 et éliminèrent toute présence du pathogène en 24 h. En

2007, Lopez et al. ont réduit in vivo de façon significative les comptes de Salmonella newport dans le foie et la

rate de souris suite à une injection intra-péritonéale de MccJ25 (Lopez, Vincent, Zenoff, Salomon, & Farias,

2007). Ils ont démontré également ex vivo la stabilité et l’efficacité anti-infectieuse de la MccJ25 dans le sang

humain, le plasma et le sérum. En plus d’une utilisation de la MccJ25 comme agent de conservation des

aliments, la MccJ25 pourrait être administrée oralement à la volaille comme facteur de croissance à la place

ou en complément des antibiotiques. La volaille, dont la consommation de viande est croissante, est en effet

grandement sujette à contamination par Salmonella, cible de la MccJ25.

Cette étude évalue pour la première fois l’activité inhibitrice de la MccJ25 contre Salmonella enteritidis en

conditions intestinales et son impact sur le microbiote colique. Pour ce faire, un système de fermentation en

continu avec cellules immobilisées simulant la partie proximale du côlon a été mis en place. Il a été supposé

que la MccJ25, compte tenu de sa structure particulière en lasso, serait stable dans la partie proximale du

côlon et exercerait un effet inhibiteur contre S. enteritidis en milieu colique sans pour autant affecter l'équilibre

du microbiote.

3

Chapitre 1 : Revue de littérature

1.1. L’industrie canadienne de la volaille

«À l’échelle mondiale, la volaille est la deuxième viande la plus consommée après le porc. En 2008, on

estimait la consommation planétaire à un peu plus de 93 millions de tonnes équivalent-carcasse [l’équivalent-

carcasse étant une unité de mesure permettant de regrouper les données de poids de la viande sous toutes

ses formes, transformée ou non] » (MAPAQ, 2011). Le poulet est la viande préférée des Américains et des

Canadiens. Sa consommation augmente d’année en année. Alors que la consommation de viandes toutes

confondues diminue, celle du poulet croît significativement. Le Canadien moyen consommait 27,8

kilogrammes de poulet dans l’année 1999, il en consommait 34,3 kilogrammes en 2013 (MAPAQ, 2011;

Agriculture et Agroalimentaire Canada, 2013). La consommation de volaille apparente annuelle d’un Américain

atteignait déjà 52,9 kilogrammes en 2009 (MAPAQ, 2011). Il est aujourd’hui conseillé pour la santé de réduire

la consommation de viande rouge, ce qui favorise la consommation de viande blanche (MAPAQ, 2011). La

production avicole du Canada représente une part importante de son économie, tant par le nombre de

personnes qui y travaillent (2660 producteurs de poulet, 527 producteurs de dindons, 1251 producteurs

d'oeufs), que par le revenu généré de 4 milliards de $CAN, soit 7,4 % des recettes monétaires tirées

d'activités agricoles (données 2013). La production du Canada s’élevait à 1,04 milliards de tonnes de viande

de volaille en 2013, dont 60 % produits au Québec et en Ontario. Le marché d’exportation est important. En

2013, le Canada exportait près de 12,6 millions de poussins et de dindonneaux vers 15 pays différents, soit

pour 36 millions de dollars. Les principaux pays destinataires sont les États-Unis (95 %), puis la Chine, le

Japon, les Philippines, Taïwan et le Mexique (Agriculture et Agroalimentaire Canada, 2013). Les produits

transformés représentent également un marché de taille, puisque 182 millions de kilogrammes de chair de

volaille et de sous-produits comestibles (frais, réfrigérés, congelés) pour un montant estimé à plus de 414

millions de dollars ont été exportés vers 75 pays, soit essentiellement aux États-Unis, à Taïwan et aux

Philippines, mais également en Afrique du Sud, au Gabon, à Hong Kong, à Cuba ainsi qu’au Bénin

(Agriculture et Agroalimentaire Canada, 2013). « L'industrie de la transformation de la volaille comprend les

activités d'abattage, d'éviscération et de découpe (transformation primaire), ainsi que les activités de

surtransformation qui incorporent de la valeur ajoutée » (MAPAQ, 2011). L’aviculture canadienne élève et

exporte principalement du poulet et du dindon, mais également du canard, de l’oie, du faisan, de la perdrix, du

pigeonneau, de la caille, de la pintade et même de l’autruche et de l’émeu (Agriculture et Agroalimentaire

Canada, 2013).

4

1.2. Contamination de la volaille à Salmonella spp.

L’élevage d’animaux est un terrain propice aux épizooties. La grande densité de bêtes au m2 favorise la

propagation des contaminants. La volaille est sujette à contamination par de nombreux microorganismes

opportunistes qui nuisent au rendement de l’éleveur et posent un risque à la santé du consommateur. Le

nombre de microorganismes indésirables est significativement plus élevé sur la viande de volaille que sur les

viandes rouges (Gyles, 2008; Kilonzo-Nthenge, Rotich, & Nahashon, 2013). Salmonella, Campylobacter jejuni

et Campylobacter coli sont les principaux contaminants de l’oiseau d’élevage (Gyles, 2008). Les entreprises

avicoles doivent faire face à des enjeux sanitaires de taille pour garantir la salubrité de leurs produits et ainsi

leur productivité et la sécurité du consommateur.

Salmonella, une bactérie à Gram-négatif, est l’une des causes principales de maladies d’origine alimentaire à

travers le monde. A l’échelle mondiale, Salmonella fait 1,3 milliards de victimes par année dont 3 millions

d’entre elles décèdent (Chimalizeni, Kawaza, & Molyneux, 2010; Chambers & Gong, 2011). L’homme se

contamine principalement par ingestion d’aliments d’origine animale contaminés. L’affection, nommée

salmonellose, provoque chez l’homme douleurs abdominales, diarrhée, nausées, vomissements et fièvre,

lorsqu’elle ne dégénère pas en septicémie qui peut entraîner la mort. Les symptômes d’empoisonnement

alimentaire apparaissent 12 à 36h après ingestion du pathogène (Chambers & Gong, 2011) et durent entre 2

et 7 jours (Organisation Mondiale de la Santé, 2013). La mortalité est faible dans les pays développés (<2 %),

mais elle est plus fréquente dans les pays en manque de ressources (18-24 %) (Chimalizeni et al., 2010;

Chambers & Gong, 2011). Ce pathogène est très fréquemment associé à la volaille. La consommation de sa

viande et de ses œufs, crus ou peu cuits, est la cause première de l’infection (Carter, Adams, Woodward, & La

Ragione, 2009; Chambers & Gong, 2011). Salmonella colonise le système gastro-intestinal de la volaille,

principalement le caecum, où elle est capable de se maintenir relativement longtemps, accrochée à

l’épithélium intestinal (Revolledo, Ferreira, & Mead, 2006). Le genre Salmonella possède deux espèces,

enterica et bongori. Salmonella enterica se divise en 6 sous-espèces, enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa),

diarizonae (IIIb), houtenae (IV) et indica (VI). Les sous-espèces se divisent selon leurs propriétés

antigéniques, appelées sérotypes. Il existe 2463 sérotypes de Salmonella. Salmonella enterica subsp. enterica

comprend par exemple les sérotypes enteritidis, typhimurium, typhi et choleraesuis (Brenner, Villar, Angulo,

Tauxe, & Swaminathan, 2000). « La majorité (59 %) des 2463 sérotypes de Salmonella appartient à S.

enterica subsp. I (S. enterica subsp. enterica) » (Popoff & LeMinor, 1997; Brenner et al., 2000). Les animaux à

sang chaud sont généralement contaminés par des sérotypes de S. enterica subsp. enterica, tandis que les

sérotypes de S. enterica subsp. salamae, arizonae, diarizonae, houtenae et indica, ainsi que S. bongori,

« sont habituellement isolés d'animaux à sang froid et de l'environnement, mais rarement des humains »

5

(Brenner et al., 2000). Selon les données des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-

Unis, seulement 360 des 2463 sérotypes de Salmonella ont été isolés de cas humains de salmonellose en

2001 et 50 % de ces malades étaient contaminés par S. typhimurium, S. enteritidis et S. newport (Porwollik et

al., 2004; Chambers & Gong, 2011). S. typhimurium, S. enteritidis, S. heidelberg, S. montevideo, S. saintpaul,

et S. I 4,[5],12:i:- font partie des principaux contaminants de la volaille et du porc et sont également comptés

parmi les 10 sérotypes responsables de la majorité des infections humaines à Salmonella (Foley, Lynne, &

Nayak, 2008; Chambers & Gong, 2011). « La plupart des sérovars de Salmonella, à l'exception de S.

pullorum, S. gallinarum et parfois de S. enteritidis, sont asymptomatiques chez le poulet et la dinde » (Gyles,

2008).

La gestion des cas de personnes atteintes coûte très cher. Les États-Unis font partie des pays ayant calculé

les dépenses engendrées par la gestion des victimes de Salmonella. « Aux États-Unis, 1,4 millions de cas de

salmonellose non-typhique sont recensés chaque année, avec 168000 consultations chez le médecin, 15000

hospitalisations et 580 décès (WHO, 2005), dont le coût total s’élève à 3 milliards $US » (Chambers & Gong,

2011). Au Canada, le coût moyen d’une gastro-entérite due à Salmonella s’élevait à 1089 $CAN entre 2001 et

2002 (Majowicz et al., 2006; Chambers & Gong, 2011).

1.3. Stratégies de contrôle de Salmonella spp. et autres

opportunistes de la volaille

Le contrôle de Salmonella et autres opportunistes de la volaille est un défi que doivent obligatoirement relever

les producteurs agricoles pour garantir l’innocuité de leurs aliments et améliorer le rendement de leur

entreprise.

1.3.1. Les antibiotiques

La pénicilline, premier antibiotique connu, a été découverte par Sir Alexander Fleming en 1928 ce qui lui valut

le Prix Nobel en 1945. Il ouvrait ainsi la voie à la lutte contre les maladies infectieuses. Elle a été le premier

antibiotique utilisé à des fins vétérinaires, à la fin de la Deuxième Guerre Mondiale, pour traiter la mammite

bovine. Peu de temps après, en 1946, Moore et al. observèrent une réelle amélioration de la croissance de

volailles dont la nourriture était additionnée de streptomycine. En 1949, Jukes et ses collaborateurs ont

remarqué qu’une diète additionnée d’auréomycine, un antibiotique, augmentait significativement la prise de

poids de poulets de l’industrie avicole et « réduisait la quantité de nourriture nécessaire pour atteindre le poids

du marché » (Gustafson & Bowen, 1997). De nombreuses études ont suivi, démontrant toutes l’efficacité de

6

divers antibiotiques à améliorer la santé et la performance de divers animaux d’élevage (Gustafson & Bowen,

1997). Les entreprises agricoles ont perçu très rapidement l’intérêt économique de ces composés. En 1951, la

Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis autorisait leur utilisation sans ordonnance comme additif

alimentaire dans la nourriture animale (Castanon, 2007). Ils ne tardèrent pas à être utilisés à grande échelle

en entreprises d’élevage, de façon thérapeutique, prophylactique et/ou comme facteurs de croissance

(Gustafson & Bowen, 1997; Gyles, 2008). Ils sont habituellement administrés dans l’eau et la nourriture de

l’animal (Gyles, 2008). L’antibiotique utilisé de façon thérapeutique se donne à l’animal malade. L’antibiotique

utilisé de façon prophylactique est donné à un élevage entier de bêtes dans le but de prévenir l’apparition de

maladies. Il est plus économique pour le producteur de prévenir la maladie plutôt que de la soigner. L’animal

qui présente des signes cliniques de maladie perd en performance, sans compter les décès résultant des

épizooties qui se propagent rapidement dans un élevage et qui coûtent cher à l’entreprise (Gustafson &

Bowen, 1997). Le zoalène est par exemple distribué aux dindons au Canada comme aliment médicamenté

pendant les sept premières semaines de vie « pour aider à prévenir la coccidiose intestinale » (ACIA). Enfin,

un antibiotique utilisé comme facteur de croissance est donné en faibles quantités à l’ensemble du cheptel de

manière à améliorer la performance de l’animal en favorisant sa croissance et en optimisant son indice de

consommation (Witte, 1998). L’acide arsanilique est par exemple utilisé en aviculture au Canada « pour aider

à stimuler la croissance et à améliorer la conversion alimentaire » (ACIA). Un animal nourri aux antibiotiques

prend 4 à 5 % plus de poids qu’un animal n’ayant pas un régime additionné d’antibiotiques (Witte, 1998). Les

facteurs de croissance favorisent le bien-être, la santé et la croissance de l’animal en éliminant les

microorganismes opportunistes qui l’habitent, qui, lorsqu'ils ne le rendent pas malade, l’usent sans le servir. La

grande majorité des antibiotiques fabriqués dans le monde servent à l’alimentation animale. Au Danemark, en

1994, 24 kilogrammes de vancomycine ont été utilisés en médecine humaine. Parallèlement, 24000

kilogrammes d’avoparcine, similaire à la vancomycine, ont servi d’additif alimentaire en production animale au

Danemark la même année (Witte, 1998). « De 1992 à 1996, l’Australie a importé annuellement en moyenne

582 kg de vancomycine pour usage médical et 62642 kg d’avoparcine pour usage agricole. La vancomycine et

l’avoparcine ont le même mode d’action ; la résistance à l’une peut conférer une résistance à l’autre » (Witte,

1998).

7

Table 1-1 : Antibiotiques vendus en 2012 au Canada pour usage vétérinaire (Gouvernement du Canada,

2014).

8

La surconsommation d’antibiotiques, dans l’agriculture comme dans le milieu médical, entraîne l’apparition

d’un nombre croissant de pathogènes résistants qui menacent la santé publique (Reardon, 2014). La

résistance à un antibiotique s’acquiert suite à des mutations génétiques aléatoires ou par acquisition d’un

gène de résistance. Une simple mutation du gène gyrA crée une résistance aux fluoroquinolones chez

Campylobacter jejuni et Campylobacter coli (Gyles, 2008). « Ces mutations génétiques permettent à la

bactérie de se défendre par modification de la cible de l’antibiotique, détoxification ou expulsion de

l’antibiotique » (Witte, 1998). La bactérie devenue résistante survit, à l’instar de ses congénères. On parle de

pression sélective exercée par l’antibiotique. La survivante se multiplie et transmet le gène de résistance à ses

descendantes, on parle de transfert vertical. Le transfert de gènes de résistance se fait également de façon

horizontale. En effet, il est très fréquent que le gène de résistance soit intégré dans un transposon, lui-même

intégré dans un plasmide, conjugatif ou co-transmissible (Gyles, 2008), capable de se répliquer de façon

autonome. C’est le cas du gène blaTEM-52, gène de résistance aux céphalosporines à large spectre, retrouvé

chez Salmonella résistante isolée de la volaille en Belgique. Le gène blaTEM-52 est porté par le transposon Tn3,

lui-même intégré dans le plasmide IncI1 (Cloeckaert et al., 2007; Gyles, 2008). Le plasmide peut être transféré

d’une cellule donneuse à une cellule receveuse par conjugaison via les pili. « Le transfert horizontal de gènes

entre différentes espèces bactériennes, entre différents genres, familles ou populations bactériennes, montre

que certains plasmides sont capables de traverser les frontières taxonomiques dans diverses niches

écologiques » (Tschäpe, 1994). En revanche, le transfert de plasmides entre bactéries à Gram-positif et

bactéries à Gram-négatif est rare (Tschäpe, 1994). Le plasmide est présent entre 15 et 50 exemplaires dans

la bactérie de manière à assurer que les cellules-filles, lors de la division cellulaire, reçoivent leur lot de

plasmides. Qui plus est, les bactéries ayant perdu les leurs sont tuées (Tschäpe, 1994). Le gène de résistance

à la tétracycline tet(O), par exemple, chez C. jejuni, se trouve sur un plasmide conjugatif (Gyles, 2008). Le

gène de résistance peut être sous forme de cassette, capable d’être intégrée dans un intégron et d’en être

excisée. L’intégron est une structure génétique bactérienne portée par l’ADN chromosomique ou plasmidique.

Il est constitué d’une partie fixe, composée d’un gène codant pour une intégrase et d’un promoteur, ainsi que

d’une partie mobile, les cassettes, pouvant être intégrées ou excisées par l’intégrase et exprimées. Il a par

exemple été démontré que de nombreux gènes de résistance de Salmonella isolée de la volaille sont associés

à des intégrons de classe I (Gyles, 2008). Riano et al. ont mis en évidence chez des isolats de Salmonella de

volailles la présence d’intégrons de classe I portant les gènes de résistance blaTEM-1b, blaCTX-M-9, dfrA16,

aadA2, sul1 et sul2 (Riano et al., 2006; Gyles, 2008). En 2005, Johnson et al. publièrent la séquence du

plasmide IncF de 101-kb de Escherichia coli O2 comportant un intégron de classe I conférant une résistance à

la tétracycline, aux sulfamides, aux métaux lourds, aux aminoglycosides, au triméthoprime et aux bêta-

lactamines (Johnson, Siek, Johnson, & Nolan, 2005; Gyles, 2008). Des bactéries qui ne sont pas sous

pression sélective exercée par l’antibiotique, qui n’ont jamais été en contact avec celui-ci, peuvent acquérir la

9

résistance par transfert horizontal de gènes et la conserver sur le long terme (Tschäpe, 1994). Il a été

démontré que le transfert horizontal du gène blaTEM-52 par exemple était la cause de sa dissémination dans de

nombreux pays d’Europe (Cloeckaert et al., 2007; Gyles, 2008). Les multi-résistances sont fréquentes. Yang

et al. isolèrent par exemple 71 E. coli de foies de volailles provenant de 10 fermes chinoises différentes. Ils

observèrent une résistance à 8 ou plus de 8 antibiotiques chez 80 % de ces isolats (Yang et al., 2004; Gyles,

2008). La résistance persiste même lorsque l’antibiotique n’est plus utilisé (Pakpour, Jabaji, & Chénier, 2012).

La résistance des bactéries commensales (E. coli, Enterococcus spp.) et pathogènes (Salmonella spp.,

Campylobacter spp.) de l’animal d’élevage engendrée par l’utilisation massive d’antibiotiques en milieu

agricole est un danger dû au risque réel et déjà observé de propagation de la résistance à des pathogènes

humains (Witte, 1998). « Parce que les écosystèmes microbiens de l’homme et de l’animal sont

inextricablement liés, la résistance aux antibiotiques traverse aisément les frontières » (Witte, 1998). L’homme

peut être contaminé par des microorganismes résistants en consommant des aliments d’origine animale

contaminés ou par contact direct avec un animal contaminé (Witte, 1998). Les microorganismes pathogènes

et commensaux résistants de l’animal peuvent aussi transmettre leurs gènes de résistance aux pathogènes

humains par transfert horizontal. En 1983, l'Allemagne introduisait la nourseothricine comme facteur de

croissance dans sa production animale. Les entérobactéries résistantes à la nourseothricine étaient alors

pratiquement inexistantes, aussi bien chez l’homme que chez l’animal. En 1985, des E. coli résistantes à cet

antibiotique furent isolées du tractus gastro-intestinal de porcs et de produits carnés. En 1990, des E. coli

résistantes à la nourseothricine ont été retrouvées dans le tractus gastro-intestinal de producteurs porcins, des

membres de leur famille, de citoyens vivant à proximité et de patients souffrant d’infections urinaires. La

résistance à la nourseothricine fut observée en 1987 chez d’autres genres d’entérobactéries tels que Shigella,

un pathogène affectant exclusivement l’homme, n’ayant pourtant pas été en contact avec l’antibiotique

(Tschäpe, 1994; Witte, 1998). Price et al. démontrèrent que les employés d’entreprises avicoles sont 32 fois

plus à risque d’être colonisés par des E. coli résistantes aux antibiotiques que le reste de la population (Price

et al., 2007; Gyles, 2008). E. coli, qui peut être pathogène, a été identifiée comme hautement résistante à la

tétracycline, à la streptomycine et aux sulfamides (Gyles, 2008). Li et al. observèrent en Chine une résistance

à la tétracycline et au triméthoprime/sulfaméthoxazole chez 100 % des 70 E. coli isolées de volailles souffrant

de colibacillose et une résistance au chloramphenicol, à l’ampicilline, à la ciprofloxacine et à l’enrofloxacine

chez 79-83 % des mêmes isolats (Li et al., 2007; Gyles, 2008). Un nombre croissant d’Enterococcus résistants

aux glycopeptides, tels que la vancomycine, se remarque depuis l’utilisation de ces composés antimicrobiens

en industrie animale. Le risque de morbidité et de mortalité augmente chez les patients immunodéprimés

infectés à Enterococcus faecalis puisqu’il y a peu de traitements alternatifs. Des résistances aux

streptogramines, alors potentielles alternatives aux glycopeptides contre E. faecalis, ont également été

10

observées chez l’homme et l’animal (Witte & Klare, 1995; Witte, 1998). Campylobacter est également

hautement résistante à la tétracycline, ainsi qu’aux fluoroquinolones, comme l’ont remarqué Padungton et

Kaneene (Padungton & Kaneene, 2003; Gyles, 2008). L’utilisation des fluoroquinolones en aviculture a

sélectionné des Campylobacter jejuni résistantes à ces antibiotiques, retrouvées par la suite aussi bien dans

les produits carnés que chez des patients infectés à Campylobacter alors qu’aucune résistance de C. jejuni

n’avait été observée chez l’homme auparavant (Gaunt & Piddock, 1996; Witte, 1998). En Corée, 87,9 % et

87,2 % des 594 Campylobacter isolées de volailles crues du supermarché se sont montrées résistantes à la

ciprofloxacine, une fluoroquinolone, et à la tétracycline respectivement (Kang et al., 2006). La résistance aux

fluoroquinolones des Campylobacter est inexistante en Australie et en Suède (Gyles, 2008). Miflin et al.

l’explique par l’absence d’utilisation des fluoroquinolones en Australie dans l’agriculture (Miflin, Templeton, &

Blackall, 2007; Gyles, 2008). Son et al. ont observé une résistance à la tétracycline chez 99,5 % des C. jejuni

et 96,3 % des C. coli isolées de carcasses de volailles de fermes avicoles aux États-Unis (Son, Englen,

Berrang, Fedorka-Cray, & Harrison, 2007). En revanche, cette résistance à la tétracycline n’a été observée par

Thorsteinsdottir et al. que chez 0,3 % des Campylobacter isolées de volailles en Islande (Thorsteinsdottir,

Kristinsson, Fridriksdottir, & Gunnarsson, 2008). Thorsteinsdottir et al. ont mis en évidence que la résistance

de Campylobacter aux antibiotiques en Islande est très faible, la multi-résistance inexistante. Ceci pourrait

s’expliquer par le fait que l’Islande n’utilise pas d’antibiotiques dans sa production avicole. La résistance aux

antibiotiques se propage également chez Salmonella non-typhique et le traitement de la salmonellose

humaine perd dangereusement en efficacité. « Salmonella typhimurium souche DT 104, résistante à

l’ampicilline, à la tétracycline, à la streptomycine, au chloramphenicol et aux sulfonamides, a été identifiée à

plusieurs endroits, dont le Royaume-Uni, l’Europe et les États-Unis » (Witte, 1998). La résistance à la

tétracycline et à la streptomycine est fréquente chez Salmonella. Des Salmonella multi-résistantes sont

régulièrement recensées en aviculture (Gyles, 2008). « Pour Salmonella, la fréquence et le mode de

résistance antimicrobienne dépendent du temps, de la région, du sérovar, de la ferme d’élevage, du type de

poule (pondeuse versus élevée pour sa chair) et de l’agent antimicrobien » (Gyles, 2008). La dinde présente

un plus grand nombre de Salmonella résistantes que le poulet. La fréquence de Salmonella résistantes varie

d’un pays à l’autre. Par exemple, peu de Salmonella enteritidis résistantes à la tétracycline et à l’ampicilline

ont été identifiées aux Pays-Bas, tandis que leur fréquence est élevée au Koweït (Gyles, 2008). La fréquence

de Salmonella résistantes est également plus importante chez les volailles élevées pour leur chair que chez

les volailles pondeuses, ceci dû au fait que les volailles pondeuses reçoivent moins d’antibiotiques dans leur

alimentation pour éviter la présence de résidus dans leurs œufs. « Selon une étude d’Asai et al. (2006), 87,

84, 59 et 44 % des Salmonella japonaises isolées de poulets de chair, contre 32, 14, 0 et 4 % des Salmonella

isolées de poules pondeuses, se sont montrées résistantes à la streptomycine, à la tétracycline, à la

kanamycine et au triméthoprime/sulfonamide respectivement » (Asai et al., 2006; Gyles, 2008). Kilonzo-

11

Nthenge et al. ont évalué la contamination de viandes crues (poulet, dinde, bœuf) aux entérobactéries antibio-

résistantes de 25 commerces de détail du Tennessee (USA) (Kilonzo-Nthenge et al., 2013). Ils ont mis

premièrement en évidence la présence d’entérobactéries sur 237 des 249 échantillons de viande (95,2 %)

avec une majorité de Klebsiella oxytoca (27,4 %), Serratia spp. (14,3 %), E. coli (12,1 %) et Haffnia alvei (11,4

%). Certains pathogènes, tels que Morganella morgani (1,1 %) et Yersinia enterocolitica (0,4 %) par exemple,

furent identifiés en faible nombre. Dans un second temps, ils ont étudié l’antibio-résistance de ces isolats. La

totalité d’entre eux a été démontrée résistante à l’érythromycine (100 %), 89 % à la pénicilline, 65,8 % à

l’ampicilline, 43,8 % à la streptomycine, 28,8 % à la tétracycline, 17,8 % à la kanamycine, 9,6 % à la

gentamycine et 2,7 % au chloramphenicol. L’érythromycine est utilisée « dans les aliments sous forme de

farine ou d'agglomérés servis aux poulets d'élevage […] pour favoriser l'appétit, le gain de poids, la ponte et

l'éclosion des oeufs chez les poulets d'élevage atteints de maladie respiratoire chronique (MRC) » (ACIA). La

pénicilline quant à elle est utilisée en aviculture « pour accélérer la croissance » des volailles (ACIA). Kilonzo-

Nthenge et al. ont observé une résistance à 3 ou plus de 3 antibiotiques et à 5 ou plus de 5 antibiotiques chez

84,9 % et 19,2 % de ces isolats respectivement. Salmonella spp., dont Salmonella choleraesuis, n'a été que

faiblement dénombrée (5,7 %) mais présentant une multi-résistance aux antibiotiques. La viande de dinde et

de poulet montra une proportion significativement plus élevée de bactéries résistantes à la tétracycline, à la

streptomycine, à la kanamycine et à la gentamycine que la viande de bœuf.

12

Table 1-2 : Classification des antimicrobiens selon leur importance en médecine humaine (Gouvernement du

Canada, 2014).

13

Les antibiotiques ont comme autre effet secondaire indésirable de perturber l’équilibre du microbiote

commensal de l’intestin (Chambers & Gong, 2011). Ils détruisent aussi bien les bactéries pathogènes ciblées

que celles bénéfiques pour l’hôte, ceci dû à leur large spectre d’action (Blaser, 2011). Or, le microbiote

intestinal de la volaille possède de multiples fonctions essentielles à la santé de l’hôte. Il agit comme ligne de

résistance en bloquant la colonisation intestinale par des opportunistes (exclusion compétitive). Il contribue à

l’établissement de l’immunité intestinale (Brisbin & Haghighi, 2007). Il stimule la prolifération des cellules

intestinales, influe sur la production de mucus et sur l’architecture mucosale et augmente le poids et la taille de

l’intestin. « Les sections intestinales de poulets conventionnels ont toutes une masse supérieure à celles de

poulets axéniques, lorsque les poulets sont nourris à des concentrations moyennes et élevées de protéines »

(Lan, Verstegen, Tamminga, & Williams, 2005; Gabriel, Lessire, Mallet, & Guillot, 2006; Chambers & Gong,

2011). Le microbiote intestinal transforme par fermentation les sucres non-digestibles en acides gras à chaîne

courte nécessaires au métabolisme de l’hôte. Il a été démontré que les acides gras à chaîne courte inhibent

l’expression des gènes de virulence de Salmonella (Gantois et al., 2006; Chambers & Gong, 2011). Des souris

contrôles, possédant un microbiote intestinal en santé, contaminées à Salmonella enteritidis, présentèrent un

taux de survie de 100 % après 7 jours, ce qui ne fut pas le cas de souris axéniques contaminées elles aussi à

S. enteritidis dont le taux de survie fut de 0 % après 7 jours (Nardi, Vieira, Crocco-Afonso, & Silva, 1990;

Chambers & Gong, 2011). La même étude démontra une contamination à S. enteritidis 4,5 log supérieure

dans le foie et la rate de souris axéniques par rapport à celles ayant un microbiote intestinal sain. Sekirov et al.

ont démontré in vivo que la souris est plus susceptible d’être colonisée par Salmonella typhimurium suite à la

prise d’antibiotiques (Sekirov et al., 2008). Ces études ont mis en évidence l’importance d’un microbiote sain

dans la défense de l’hôte contre les pathogènes entériques. Chez l’enfant, il a été montré que l’absence d’un

microbiote en santé augmente le risque de souffrir d’asthme, de rhume des foins et d’allergies de la peau

(Chen & Blaser, 2007; Blaser, 2011). Helicobacter pylori protège la souris des symptômes de l’asthme (Arnold

et al., 2011). L’altération du microbiote intestinal suite à la prise d’antibiotiques peut perdurer sur le long terme,

jusqu’à ne jamais retrouver sa composition d’antan (Dethlefsen & Relman, 2011).

En 2014, l’Organisation Mondiale de la Santé mettait en garde : « Une ère post-antibiotiques, où de banales

infections et des blessures mineures peuvent tuer, loin d’être une fantaisie apocalyptique, est en fait une

possibilité très réelle du 21e siècle » (World Health Organization, 2014). Certains pays ont déjà pris des

mesures pour réguler, interdire pour certains, l’utilisation des antibiotiques en agriculture. La Suède est le

premier pays en 1986 à interdire tout emploi d’antibiotique comme additif alimentaire. Les antibiotiques

proscrits les premiers sont ceux utilisés à des fins thérapeutiques en médecine humaine (Table 1-2).

L’avoparcine est proscrite comme facteur de croissance au Danemark dès 1995, en Allemagne dès 1996, puis

dans l’Union Européenne dès 1997 (Witte, 1998; Castanon, 2007). La spiramycine est interdite en Finlande

14

depuis 1998, puis dans l’Union Européenne dès 1999 (Castanon, 2007). La virginiamycine est proscrite au

Danemark dès 1998, puis dans l’Union Européenne dès 1999 (Castanon, 2007). L’enrofloxacine, une

fluoroquinolone, est interdite d’utilisation par la FDA depuis 2005 (Nelson, Chiller, Powers, & Angulo, 2007). Le

1er janvier 2006, l’utilisation des antibiotiques comme facteurs de croissance est bannie de l’Union

Européenne (Castanon, 2007). Leur utilisation à ces fins est encore autorisée au Canada, mais il semblerait

que leur interdiction se fasse dans un avenir proche. Il a été montré que les pays ayant banni leur utilisation

ont tout de même réussi à maintenir un bon rendement de production en appliquant des règles strictes

d’hygiène (Wierup, 2001; Castanon, 2007). Des alternatives aux antibiotiques sont toutefois nécessaires pour

améliorer le rendement de la production animale et garantir l’innocuité des aliments tout en préservant

l’efficacité des traitements en médecine humaine.

1.3.2. Les alternatives aux antibiotiques

1.3.2.1. Les probiotiques

La stratégie de plusieurs alternatives aux antibiotiques est de manipuler le microbiote intestinal dans le but de

le maintenir riche et équilibré afin de garder l’animal en santé et d’améliorer sa performance. C’est le cas des

probiotiques, qui se définissent comme « des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en

quantité adéquate, exercent une action bénéfique sur la santé de l’hôte » (FAO/WHO, 2002). Un microbiote

intestinal sain favorise le bien-être et la croissance de l’animal, tout en réduisant les risques d’infection

entérique (Chambers & Gong, 2011). Les probiotiques agissent de façon bénéfique pour l’hôte de multiples

façons : « (1) stimulent le développement d’un microbiote sain — dominé par des bactéries bénéfiques, (2)

réduisent/préviennent la colonisation par des bactéries pathogènes entériques, (3) améliorent l’immunité

mucosale (FAO/WHO, 2002), (4) augmentent la capacité digestive et réduisent le pH intestinal, et (5) aident à

la maturation du tissu intestinal et à maintenir son intégrité (Lan et al., 2005) » (Chambers & Gong, 2011). Ils

entrent en compétition avec les pathogènes entériques pour les nutriments et les sites d’attachement et/ou

produisent des molécules antimicrobiennes (Chambers & Gong, 2011). Nurmi et Rantala ont remarqué déjà ce

phénomène en 1973 lorsqu’ils ont étudié l’impact d’un microbiote sain et équilibré sur la susceptibilité de l’hôte

à être colonisé par Salmonella infantis. De jeunes volailles (1-2 jours) ayant reçu le contenu intestinal de

volailles adultes en santé se sont montrées plus résistantes à l’établissement intestinal de S. infantis (Nurmi &

Rantala, 1973). L’administration de Lactobacillus salivarius et de Streptococcus cristatus à des volailles,

individuellement ou en combinaison, a réduit significativement leur contamination à Salmonella (Zhang, Ma, &

Doyle, 2007). Les probiotiques utilisés en aviculture pour promouvoir la croissance de l’animal peuvent être un

ensemble d’espèces bactériennes définies ou un mélange indéfini de bactéries du système gastro-intestinal.

15

L’utilisation d’un mélange non-défini de cultures bactériennes semble plus efficace (Chambers & Gong, 2011).

Plusieurs produits à base de probiotiques sont déjà commercialisés pour usage en aviculture, tels que

Aviguard, Primalac et Interbac (Chambers & Gong, 2011). Ils agissent en compétitionnant avec le pathogène,

en stimulant la production d’anticorps et/ou en augmentant la production de mucine et la croissance des vili

intestinaux. L’efficacité des probiotiques comme facteurs de croissance a été démontrée dans plusieurs

études (Gaggia, Mattarelli, & Biavati, 2010). En 2003, Kalavathy et al. ont supplémenté une diète de volailles

de 12 souches de Lactobacillus et ont observé que l’additif alimentaire probiotique améliore significativement

le gain de masse corporelle, ainsi que le taux de conversion alimentaire (Kalavathy, Abdullah, Jalaludin, & Ho,

2003). Mountzouris et al. ont évalué l’efficacité d’une diète de volailles additionnée d’un mélange probiotique

de deux souches de Lactobacillus, d’une souche de Bifidobacterium, d’une souche d’Enterococcus et d’une

souche de Pediococcus à promouvoir la croissance de l’oiseau et à moduler son microbiote intestinal

(Mountzouris et al., 2007). Ils l'ont comparée à une diète supplémentée d’un antibiotique, l’avilamycine, et à

une diète contrôle, sans additif alimentaire. Ils ont observé que le traitement aux probiotiques mène à une

augmentation semblable de la masse corporelle des volailles, ainsi qu’à une amélioration semblable de la

conversion alimentaire et de l’indice de consommation que le traitement à l’avilamycine. Qui plus est, ils ont

recensé un plus grand nombre de Bifidobacterium spp., de Lactobacillus spp. et de coques à Gram-positif

dans le microbiote intestinal des volailles traitées aux probiotiques par rapport au traitement antibiotique et au

traitement contrôle. D’autres auteurs ont obtenu des résultats contradictoires sur l’efficacité des probiotiques à

promouvoir la croissance animale (Gaggia et al., 2010). L’efficacité du traitement aux probiotiques est variable.

Cette efficacité dépend beaucoup de la survie du microorganisme probiotique qui doit atteindre vivant le

caecum de l’animal pour agir. « En pratique, les cultures probiotiques doivent avoir les caractéristiques

suivantes pour agir positivement sur la performance animale : (1) la capacité de coloniser l’intestin, (2) un taux

de croissance élevé et de faibles besoins en nutriments, (3) la capacité de réprimer les pathogènes entériques

(Salmonella dans ce cas), (4) culture facile dans des conditions commerciales, et (5) la capacité de survivre au

processus de fabrication de l’aliment et dans l’aliment tout en maintenant son activité » (Chambers & Gong,

2011). Il arrive fréquemment dans la pratique que le probiotique n’arrive pas à agir tel qu’il était censé.

16

Table 1-3 : Bactéries probiotiques avec application possible en alimentation animale (Gaggia et al., 2010).

17

1.3.2.2. Les prébiotiques

Les prébiotiques sont définis pour la première fois en 1995 par Gibson et al. comme « des ingrédients

alimentaires non-digestibles qui ont une action bénéfique sur l’hôte en stimulant de façon sélective la

croissance et/ou l’activité d’une ou d’un nombre limité de bactéries du côlon » (Gibson & Roberfroid, 1995).

Gibson donne une nouvelle définition du prébiotique en 2010 : « un ingrédient, dont la fermentation de façon

sélective entraîne des changements spécifiques de la composition et/ou de l’activité du microbiote gastro-

intestinal, dont en résultent des bénéfices pour la santé de l’hôte » (Gibson et al., 2010). Les prébiotiques sont

pour la plupart des oligosaccharides solubles non-digestibles composés de sucres simples tels que le

fructose, le xylose, le glucose, le galactose et le mannose (Chambers & Gong, 2011). Le mannose est le

monosaccharide le plus communément utilisé comme additif alimentaire (Van Immerseel, Cauwerts, Devriese,

Haesebrouck, & Ducatelle, 2002). Les prébiotiques sont plus faciles d’application que les probiotiques. Ils sont

meilleur marché, peuvent être facilement incorporés dans la nourriture animale et restent stable. Il n’y a pas la

difficulté, présente avec les probiotiques, de les maintenir en vie puisqu’ils ne sont pas vivants (Chambers &

Gong, 2011). Pour qu’un ingrédient alimentaire puisse porter l’appellation de « prébiotique », il doit répondre à

3 critères : « (1) le substrat ne doit pas être hydrolysé ni absorbé dans l’estomac ou l’intestin grêle, (2) il doit

être sélectif des bactéries commensales bénéfiques du gros intestin telles que les Bifidobacterium, (3) la

fermentation du substrat doit induire des effets luminaux et systémiques bénéfiques chez l’hôte » (Gaggia et

al., 2010).

18

Table 1-4 : Mode d’action des prébiotiques (Gaggia et al., 2010).

19

Les prébiotiques stimulent principalement la croissance des Lactobacillus et des Bifidobacterium (Chambers &

Gong, 2011). L’efficacité des prébiotiques comme facteurs de croissance est très variable. Les études se

contredisent. Yusrizal et Chen ont testé chez la volaille une diète additionnée de fructosane de chicorée. Il en

a résulté une augmentation significative de la masse corporelle de l’animal, une amélioration de la conversion

alimentaire et une diminution du taux de cholestérol sérique (Yusrizal & Chen, 2003a; Gaggia et al., 2010). Le

fructosane de chicorée a stimulé la croissance des Lactobacillus du système gastro-intestinal, tandis qu’il a

inhibé celle des bactéries pathogènes Campylobacter et Salmonella (Yusrizal & Chen, 2003b; Gaggia et al.,

2010). Jung et al. ont obtenu des résultats contradictoires. Ils ont évalué l’efficacité des galacto-

oligosaccharides comme facteurs de croissance chez la volaille et n'ont observé aucun effet sur la masse

corporelle de l’animal, sur le taux de conversion alimentaire, ni sur l’indice de consommation (Jung, Houde,

Baurhoo, Zhao, & Lee, 2008). En revanche, les galacto-oligosaccharides ont augmenté significativement les

comptes de Bifidobacterium. Plusieurs études ont démontré l’efficacité des fructo-oligosaccharides et des

mannan-oligosaccharides à réduire la contamination des volailles à Salmonella (Chambers & Gong, 2011).

Des résultats positifs ont été obtenus encourageant l’utilisation du lactose et de ses dérivés (lactulose,

lactosucrose) comme prébiotiques également pour le contrôle de Salmonella chez la volaille (Van Immerseel

et al., 2002). « La variabilité des réponses aux prébiotiques peut s’expliquer par des variations dans la qualité

du prébiotique et dans les doses requises, des âges variés de volailles ou par des différences dans le niveau

d’hygiène des fermes d’élevage » (Chambers & Gong, 2011). Il est possible de combiner des probiotiques

avec des prébiotiques et ainsi d’augmenter l’efficacité du traitement. On parle alors de symbiotiques

(Chambers & Gong, 2011).

1.3.2.3 Les huiles essentielles

Les huiles essentielles sont des huiles végétales aromatiques ayant des propriétés antimicrobiennes. Elles

sont reconnues sécuritaires par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis (Chambers & Gong,

2011). Elles peuvent être composées de phénols (tels que le thymol, le carvacrol et l’eugénol), de terpènes,

d’alcaloïdes (tels que la capsaïcine), de lectines, d’aldéhydes, de polypeptides et de polyacétylènes (Thacker,

2013). Il en existe environ 3000 sortes différentes (Thacker, 2013). Ce sont les huiles phénoliques qui ont

l’activité antibactérienne la plus importante (Chambers & Gong, 2011). Le mécanisme d’action antimicrobien

des huiles essentielles n’est pas résolu, mais il est supposé qu’elles utilisent leurs propriétés hydrophobes

pour désintégrer la membrane cellulaire des bactéries (Thacker, 2013). Leur efficacité comme facteurs de

croissance en production animale n’a été encore que peu étudiée et les résultats obtenus divergent. Li et al.

ont comparé sur le porc l’effet d’une diète contrôle, avec celui d’une diète additionnée d’antibiotiques et celui

d’une diète supplémentée de thymol et de cinnamaldéhyde. Ils ont observé une augmentation semblable de la

20

masse corporelle de l’animal, ainsi qu’une amélioration semblable de la conversion alimentaire, chez les porcs

ayant reçu la diète additionnée d’antibiotiques et chez ceux ayant reçu la diète additionnée d’huiles

essentielles, par rapport à ceux ayant reçu la diète contrôle et ce de façon significative (Li et al., 2012).

Timbermont et al. ont démontré in vitro que l’acide laurique, le thymol et le cinnamaldéhyde inhibent

significativement la croissance de Clostridium perfringens, même à de faibles concentrations de

l’antimicrobien (Timbermont et al., 2010). Ils ont administré ensuite in vivo à des oiseaux inoculés à C.

perfringens une diète additionnée d’un ou de plusieurs des additifs étudiés (acide butyrique, triglycérides à

chaîne moyenne, thymol, cinnamaldéhyde, huile essentielle d’eucalyptus). Il en a résulté que ces différents

additifs alimentaires, administrés seuls ou en combinaison, ont diminué significativement le nombre de

volailles présentant des lésions intestinales dues à l’entérite nécrotique. Les huiles essentielles, de par leur

hydrophobicité, sont rapidement absorbées au niveau de l’estomac et de l’intestin grêle proximal (duodénum,

jéjunum), ce qui cause problème, puisqu’elles ne peuvent se rendre à l’iléon et au côlon et ainsi exercer leur

activité antimicrobienne. Il a aussi été montré qu’elles peuvent être adsorbées à la surface des particules

alimentaires, ce qui à nouveau réduit leur activité. L’encapsulation est une solution intéressante pour parer à

ces problèmes et permettre aux huiles essentielles d’atteindre leur site d’action (Chambers & Gong, 2011).

Wang et al. ont encapsulé avec succès du carvacrol dans des microcapsules d’alginate de calcium (Wang,

Gong, Huang, Yu, & Xue, 2009). Ils ont démontré ensuite in vitro que le carvacrol encapsulé conserve son

activité antimicrobienne contre E. coli K88 en milieu de culture et en système gastro-intestinal simulé. Han et

al. ont encapsulé quant à eux un extrait d’eucalyptus mélangé à de l’acide caprylique et à de l’acide caprique

(triglycérides à chaîne moyenne) dans des microcapsules d’huile de palme. Les porcs ayant reçu les

microcapsules ont présenté la même performance que ceux ayant reçu de l’oxyde de zinc (nutraceutique) et

que ceux ayant reçu des antibiotiques (Han, Hwang, & Thacker, 2011; Thacker, 2013). A contrario, d’autres

études ne remarquent aucun effet bénéfique des huiles essentielles sur l’animal (Thacker, 2013).

1.3.2.4. Les bactériophages

Les bactériophages sont des virus qui infectent les bactéries (Garcia, Martinez, Obeso, & Rodriguez, 2008). Ils

sont ubiquitaires et sont l’entité la plus abondante sur terre (O'Flaherty, Ross, & Coffey, 2009). Les

bactériophages détruisent la moitié de la population totale bactérienne toutes les 48 heures (Hendrix, 2002).

Les bactériophages sont constitués, comme tout virus, d’un génome (ADN ou ARN, simple ou double brin(s))

entouré d’une capside protéique. Il faut distinguer les bactériophages virulents des bactériophages tempérés.

Les bactériophages virulents se servent de la bactérie pour se multiplier et terminent automatiquement leur

cycle par une lyse cellulaire de l’hôte qui libèrera les nouveaux virions. On parle d’infection lytique. Les phages

tempérés, pour leur part, intègrent leur acide nucléique dans le chromosome bactérien et celui-ci persistera

21

dans l’ADN bactérien. Il se réplique et s’exprime avec le reste du matériel génétique bactérien. Le génome

viral intégré se nomme prophage et la bactérie porteuse du prophage s’appelle lysogène. Celle-ci pourra le

transmettre à sa descendance (Griffiths, Miller, Suzuki, Lewontin, & Gelbart, 2002). Les bactériophages

lytiques possèdent plusieurs propriétés qui les rendent prometteurs comme agents de biocontrôle alimentaire.

Leur potentiel anti-infectieux est reconnu. Ils ont une activité très spécifique et de ce fait n’altèrent pas le

microbiote commensal gastro-intestinal (Chambers & Gong, 2011). Ils sont non-toxiques pour les cellules

humaines et animales et tuent rapidement la bactérie cible (Garcia et al., 2008; Coffey et al., 2011; Spricigo,

Bardina, Cortès, & Llagostera, 2013). Ils ont une efficacité démontrée contre les biofilms (Siringan, Connerton,

Payne, & Connerton, 2011) et ils peuvent être utilisés comme moyen de détection de pathogènes. En outre, ils

sont une source d’enzymes hydrolysant les peptidoglycanes des bactéries (endolysines) (Garcia et al., 2008;

Oliveira, Azeredo, Lavigne, & Kluskens, 2012). Les bactériophages ne peuvent se répliquer que tant que la

bactérie cible est présente, ce qui limite leur multiplication (Atterbury et al., 2007). Enfin, la résistance des

bactéries contre les bactériophages est un événement rare (Carlton, Noordman, Biswas, de Meester, &

Loessner, 2005; Guenther, Huwyler, Richard, & Loessner, 2009). Néanmoins quand elle advient, comme cela

a été le cas dans l’étude de Greer où 20 à 65 % des Brochothrix thermosphacta se sont montrées résistantes

chez le porc au traitement phagique (Greer & Dilts, 2002; Guenther et al., 2009), le problème peut toujours

être contourné en utilisant un cocktail de phages ou plusieurs phages en rotation (Guenther et al., 2009). La

FDA a approuvé l’utilisation dans l’alimentation de deux produits à base de bactériophages inhibiteurs de

Listeria : ListexTM P100 de EBI Food Safety pour le contrôle de la viande et du fromage (2006) et LMP 102 de

Intralytix Inc. pour le contrôle de la volaille et du prêt-à-manger (Garcia et al., 2008).

Les autorisations pour traiter par les phages l’animal vivant destiné à l’alimentation n’ont pas été encore

obtenues (Chambers & Gong, 2011), mais il existe déjà de nombreuses études ayant porté sur le sujet. Les

cibles bactériennes des phages sont nombreuses, mais nous ne nous arrêterons ici qu’à Campylobacter et à

Salmonella, les deux principaux contaminants de la volaille. Wagenaar et al. ont expérimenté l’utilisation des

phages comme moyen de prévention et de traitement de la campylobactériose chez le poulet de chair. Ils ont

observé une réduction significative de C. jejuni dans le groupe de prévention comme dans le groupe

thérapeutique en comparaison avec les groupes contrôle. La réduction a été maximale immédiatement après

l’introduction du phage, pour diminuer par la suite mais tout en restant néanmoins supérieure à celle des

groupes contrôle (Wagenaar, Van Bergen, Mueller, Wassenaar, & Carlton, 2005). Loc Carrillo et al. ont

travaillé également sur la décontamination du poulet de chair contaminé à C. jejuni. Ils ont administré

oralement deux phages lytiques à large spectre, CP8 et CP34, à des poulets contaminés et ont observé une

réduction significative du nombre de cellules pathogènes (Loc Carrillo et al., 2005). En 2009, le phage de

groupe II, CP220, a été administré à des oiseaux contaminés à C. jejuni et à C. coli. Des réductions

22

significatives des deux espèces bactériennes ont été observées dans les fèces (El-Shibiny et al., 2009).

Fiorentin et al. ont réduit efficacement le nombre d’unités formatrices de colonies de Salmonella enteritidis

PT4 contaminant des poulets de chair par administration orale d’un cocktail de phages (Fiorentin, Vieira, &

Barioni, 2005). Toro et al. ont observé une réduction significative du nombre de Salmonella typhimurium dans

l’iléon et dans le caecum de poulets contaminés suite à l’administration orale d’un cocktail de phages, seul et

en combinaison avec des probiotiques (exclusion compétitive) (Toro et al., 2005). Atterbury et al. ont démontré

l’efficacité inhibitrice significative de phages sur Salmonella enteritidis et typhimurium colonisant le caecum de

poulets de chair, mais ils n'ont pas obtenu de résultats concluants pour Salmonella sérotype hadar (Atterbury

et al., 2007). Wall et al. ont diminué de 99,0 % à 99,9 % la colonisation intestinale à Salmonella typhimurium

de petits cochons suite à l’administration d’un cocktail de phages. Ils ont réduit ensuite significativement chez

des porcs à poids de marché la concentration de Salmonella caecale de 95 % et la concentration de

Salmonella iléale de 90 % (Wall, Zhang, Rostagno, & Ebner, 2010). Un cocktail de trois bactériophages

UAB_Phi20, UAB_Phi78, et UAB_Phi87 a été testé pour réduire la concentration caecale de Salmonella

typhimurium chez la poule Leghorn. Le traitement a été efficace, lorsque administré un jour avant l’infection,

puis régulièrement au fil du temps (Bardina, Spricigo, Cortes, & Llagostera, 2012). L’efficacité antibactérienne

des bactériophages dans l’industrie alimentaire dépend de plusieurs paramètres intrinsèques et extrinsèques

(Guenther et al., 2009). Par exemple, la concentration de phages est un facteur à prendre en compte lors d’un

processus de décontamination alimentaire. Plus celle-ci est importante, plus la réduction bactérienne sera

significative, du fait que l’on augmente la probabilité de rencontre d’un phage et d’une cible (Carlton et al.,

2005; Atterbury et al., 2007; Guenther et al., 2009; Hudson et al., 2013; Hungaro, Mendonca, Gouvea, Vanetti,

& Pinto, 2013).

Du matériel génétique peut être transmis d’une bactérie donneuse à une bactérie receveuse par

transformation, conjugaison ou transduction. La transduction se fait par l’intermédiaire de bactériophages dits

transducteurs. Les phages tempérés peuvent empaqueter accidentellement des gènes bactériens de la

bactérie donneuse lors de leur excision, les transférer et les intégrer chez une bactérie réceptrice. Il est

possible qu’il y ait recombinaison entre le génome d’un phage tempéré et le génome d’un phage lytique

(Chambers & Gong, 2011). Le transfert de matériel génétique (gènes de résistance ou de virulence) par

transduction entre bactéries est une menace pour la santé publique associée à l’utilisation de bactériophages.

Le prophage peut aussi exprimer des gènes codant des facteurs augmentant la pathogénicité ou la virulence

de l’hôte. Dans plusieurs cas, le prophage s’est avéré coder des toxines ou des régulateurs nécessaires à la

virulence de la bactérie hôte (Boyd, 2005; Carlton et al., 2005). « Certains prophages ont montré contribuer à

la virulence de S. typhimurium » (Figueroa-Bossi & Bossi, 1999; Chambers & Gong, 2011). Qui plus est, la

bactérie lysogène est protégée de l’attaque d’un autre phage ou « surinfection », ce qui peut être critique si

23

celle-ci est le pathogène cible (Griffiths et al., 2002). L’utilisation de leurs endolysines, plutôt que du phage lui-

même, pourrait être une solution au problème (Chambers & Gong, 2011). Il reste encore du chemin à

parcourir avant l’utilisation des bactériophages chez l’animal vivant comme alternative aux antibiotiques, mais

le potentiel est bien présent.

1.3.2.5. Les enzymes

Les enzymes sont des protéines catalytiques, capables d’accélérer des réactions chimiques. Elles peuvent

couper les liaisons chimiques de substrats et ainsi libérer différents produits. Elles sont obtenues à partir de

bactéries, de champignons et de levures (Kiarie, Romero, & Nyachoti, 2013). La phytase est l’enzyme la plus

commercialisée, puis suivent les carbohydrases parmi lesquelles se classent les xylanases et les cellulases

(Kiarie et al., 2013). Les enzymes exogènes utilisées pour promouvoir la croissance animale ont plusieurs

modes d’action; dégrader les composés alimentaires qui ne peuvent être dégradés par les enzymes

endogènes de l’animal, inactiver les facteurs anti-nutritionnels tels que les acides phytiques et pallier à une

quantité éventuellement insuffisante d’enzymes endogènes (telles les amylases, protéases, lipases) (Kiarie et

al., 2013; Thacker, 2013). Les polysaccharides non-amylacés (PNA) sont ce qu’on appelle des fibres

alimentaires. Ils composent les parois cellulaires des végétaux et se caractérisent par le fait qu’ils sont non-

digestibles pour le mammifère. On retrouve parmi eux la cellulose, l’hémicellulose, les pectines, les xylanes,

les β-glucanes et les α-galactosides (raffinose, stachyose et verbascose) (Thacker, 2013). Les PNA réduisent

la valeur nutritionnelle des aliments, tout d’abord parce qu’ils ne peuvent être digérés par les enzymes

endogènes de l’animal, il y a ainsi perte énergétique, ensuite en formant une cage (cage effect) autour de

nutriments digestibles (amidon, graisses, protéines), ceux-ci se trouvant alors inaccessibles à l’hôte et enfin en

augmentant la viscosité intestinale ce qui a un effet néfaste sur la croissance (Thacker, 2013). Les enzymes

ajoutées en supplément dans les diètes animales augmentent l’accessibilité aux nutriments, car elles sont

capables de dégrader les PNA. Les « cages » formées par les PNA peuvent alors être dissoutes, les

nutriments libérés et la viscosité intestinale réduite (Kiarie et al., 2013). La xylanase, β-glucanase, β-

mannanase, α-galactosidase, et pectinase sont des enzymes dégradant les PNA (Kiarie et al., 2013). En

outre, les enzymes modulent le microbiote intestinal de plusieurs façons (Kiarie et al., 2013; Thacker, 2013). Il

a été démontré que la diète influe grandement sur la composition du microbiote intestinal, or les enzymes

modifient la digestibilité de la diète, ils augmentent la disponibilité en nutriments. Les pressions sélectives sur

le microbiote intestinal sont inévitablement modifiées (Kiarie et al., 2013). Les enzymes modifient également la

composition du microbiote intestinal en libérant des oligosaccharides à chaîne courte, lors de la dégradation

des PNA, qui agissent comme prébiotiques. De nombreuses études ont mis en évidence chez le porc qu’une

diète additionnée d’enzymes dégradant les PNA augmente l’abondance et l’activité métabolique (production

24

d’acides gras à chaîne courte) de certains groupes microbiens, tels que les Lactobacillus (Kiarie et al., 2013).

Les sucres libérés de la dégradation des PNA stimulent la croissance des Lactobacillus qui eux-mêmes

produisent de l’acide lactique (Thacker, 2013). L’accumulation d’acide lactique dans le tractus gastro-intestinal

inhibe la croissance de coliformes, tels que E. coli (Thacker, 2013). Courtin et al. ont donné des

arabinoxylooligosaccharides, produits de la dégradation du son de blé par une endoxylanase, à des volailles

et ont observé une augmentation significative de la population de Bifidobacterium dans le caecum, ainsi

qu’une amélioration du taux de conversion alimentaire, également observée chez les volailles ayant reçu la

xylanase dans leur alimentation (Courtin et al., 2008; Kiarie et al., 2013). Plusieurs études ont mis en évidence

une amélioration de la performance suite à l’introduction d’enzymes dans l’alimentation. Dans l’étude de

Amerah et al., l’ajout de xylanase dans la diète a amélioré significativement le gain de masse corporelle, ainsi

que l’efficacité alimentaire des poulets de chair (Amerah, Mathis, & Hofacre, 2012). Nian et al. ont observé

également chez des volailles ayant reçu une diète additionnée de xylanase une amélioration significative de la

performance (Nian, Guo, Ru, Li, & Peron, 2011). Un changement de la composition du microbiote intestinal de

volailles suite à l’ajout d’enzymes dans leur alimentation a également été obtenu dans l’étude de Torok et al.

(Torok, Ophel-Keller, Loo, & Hughes, 2008). Ils ont observé également une amélioration de la performance

des animaux ayant reçu les enzymes, qu’ils ont pu corréler avec la différence de composition du microbiote de

l’iléon et du caecum. « La présence d’espèces bactériennes bénéfiques spécifiques et/ou l’absence d’espèces

bactériennes nuisibles spécifiques peut contribuer à améliorer la performance des volailles » (Torok et al.,

2008). L’application des enzymes exogènes en agriculture animale comme facteurs de croissance donne des

résultats positifs chez la volaille, en revanche, les résultats chez le porc sont variables (Thacker, 2013). Ceci

pourrait s’expliquer par le fait que chez le porc l’enzyme est exposée plus longtemps au pH acide de l’estomac

que chez la volaille (Thacker, 2013). L’enzyme peut être partiellement ou totalement dénaturée par l’acidité de

l’estomac (pH de 2-3.5) avant d’atteindre son site d’action. Pour pallier au problème, il est possible aujourd’hui

de synthétiser des enzymes résistantes aux pH gastriques, à la pepsine et à la trypsine, et thermostables

(Thacker, 2013). Une amélioration du gain de poids de 16,4 % et une amélioration de l’efficacité alimentaire de

17,7 % ont été obtenues en ajoutant une β-mannanase génétiquement modifiée dans la diète de porcs.

L’amélioration du gain de poids et de l’efficacité alimentaire n’était que de 3,4 et 3,9 % respectivement chez

les porcs ayant reçu une β-mannanase non-modifiée, produite de façon traditionnelle (Pettey, Carter, Senne,

& Shriver, 2002; Lv et al., 2013; Thacker, 2013).

1.3.2.6. Les acides organiques

Les acides organiques ont une activité bactériostatique et bactéricide. Ils peuvent pénétrer à l’intérieur de la

bactérie lorsqu’ils sont sous forme indissociée, puis une fois à l’intérieur de la bactérie, ils se dissocient et font

25

ainsi décroître le pH intracellulaire ce qui a pour cause de stopper les réactions enzymatiques et ainsi la

prolifération bactérienne (Plumed-Ferrer & Von Wright, 2009; Thewis, 2010). Des acides organiques sont

ajoutés à l’eau et à la nourriture de l’animal d’élevage dans le but de réduire la contamination à Salmonella.

OptimizerTM est un supplément alimentaire développé par l’Université de l’Arkansas à base d’acides

organiques et de minéraux (acide lactique, acide acétique, acide propionique, acide caprylique, protéinate de

cuivre, protéinate de zinc) (Pacific Vet Group). Il est destiné chez la volaille à favoriser la consommation d’eau.

Il a démontré son efficacité à augmenter la masse corporelle d’oiseaux d’élevage (Pixley et al., 2010), ainsi

qu’à réduire la contamination à Salmonella typhimurium (Menconi et al., 2013). Menconi et al. ont testé

également un nouveau mélange d’acides organiques composé d’acide citrique, acétique et propionique et ont

observé la même efficacité qu’OptimizerTM à réduire la contamination à Salmonella typhimurium du jabot et du

caecum de poulets de chair (Menconi et al., 2013). Byrd et al. ont observé qu’en ajoutant de l’acide lactique ou

de l’acide formique à l’eau à boire de volailles, il était possible de réduire significativement la contamination à

Salmonella et à Campylobacter des jabots et des carcasses (Byrd et al., 2001). Les réductions n'ont pas été

significatives avec ajout d’acide acétique. Les triglycérides à chaîne moyenne ont montré avoir une activité

inhibitrice contre Salmonella et E. coli et améliorer la performance des porcs (Thacker, 2013). Les acides gras

à chaîne moyenne (acide laurique, caprique, caproïque et caprylique), de 6 à 12 carbones, sont plus efficaces

contre Salmonella que les acides gras à chaîne courte (acide butyrique, acétique et propionique), de 1 à 6

carbones (Thewis, 2010). L’utilisation d’acides organiques comme additifs alimentaires offre néanmoins des

résultats variables. Le mode d’administration, le type d’acide organique administré, sa concentration, le niveau

de stress de l’animal sont des facteurs qui influencent l'efficacité du traitement (Thewis, 2010). Certaines

études ne donnent pas les résultats escomptés, certaines d’entre elles montrent même que les acides

organiques peuvent favoriser la virulence de Salmonella ou générer des Salmonella résistantes aux acides

(Thewis, 2010). Il est possible d’améliorer l’efficacité du traitement en encapsulant les acides organiques de

manière à éviter leur absorption dans la partie supérieure du tractus gastro-intestinal. On retrouve sur le

marché par exemple des billes de silice contenant de l’acide formique et propionique, (Thewis, 2010).

L’alimentation des animaux par bouillie liquide fermentée utilise également les propriétés acidifiantes des

acides organiques. La bouillie liquide est un type d’alimentation qui est composé d’un tiers de nourriture solide

et de deux tiers d’eau (Plumed-Ferrer & Von Wright, 2009). La fermentation peut être spontanée ou induite.

Elle a lieu spontanément lorsque les bactéries endogènes fermentent les sucres présents en acide lactique et

en acide acétique (Plumed-Ferrer & Von Wright, 2009). Elle peut être induite en ajoutant dans la bouillie des

cultures de bactéries lactiques (Lactobacillus plantarum généralement) (Plumed-Ferrer & Von Wright, 2009).

La bouillie liquide fermentée se caractérise par une population nombreuse de bactéries lactiques, une

concentration élevée d’acides organiques, un faible pH et une faible présence ou absence totale

26

d’Enterobacteriaceae (Plumed-Ferrer & Von Wright, 2009). En effet, la présence d’acides abaisse le pH, ce

qui rend le milieu hostile aux Enterobacteriaceae (Plumed-Ferrer & Von Wright, 2009). Plumed-Ferrer et al.

jugent la fermentation induite préférable à la fermentation spontanée. Il a été démontré qu’elle est bénéfique

pour la santé de l’animal. Elle peut en outre améliorer la croissance, l’efficacité alimentaire et la digestibilité.

Elle influe sur le tractus gastro-intestinal en abaissant le pH, en augmentant la concentration d’acide lactique

et d’acides gras volatiles, en réduisant la présence d’Enterobacteriaceae et en modifiant le ratio vili/cryptes

(Plumed-Ferrer & Von Wright, 2009). Néanmoins, des études supplémentaires à l’échelle de la ferme sont

nécessaires, puisque la plupart ont été réalisées jusqu’à présent en laboratoire. Il est également difficile de

déterminer la cause exacte des changements physiologiques, microbiologiques et morphologiques observés

du tractus gastro-intestinal (bactéries lactiques ajoutées dans la bouillie, acides organiques produits présents

dans la bouillie, microbiote endogène de l’animal ou la combinaison de ces différents facteurs) (Plumed-Ferrer

& Von Wright, 2009).

1.3.2.7. Les bactériocines

Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par des bactéries possédant un système qui les

protège de l’action antimicrobienne de leurs propres bactériocines (Rea, Ross, et al., 2011). Certaines d’entre

elles subissent une modification post-traductionnelle. Elles forment une famille hétérogène en terme de

structure, masse moléculaire, machinerie d’export, modes d’action, cibles microbiennes et cellulaires et

immunité de la souche productrice (Hammami, Fernandez, Lacroix, & Fliss, 2013). La plupart des

bactériocines sont stables à hautes températures et résistantes aux pH extrêmes (Duquesne et al., 2007).

Elles se distinguent des antibiotiques par différents critères. Elles sont actives à des concentrations

nanomolaires, possèdent un spectre d’action généralement plus étroit que celui des antibiotiques et leur

synthèse n’est pas enzymatique mais ribosomique (Nes, 2011). Il existe différentes façons de classifier les

bactériocines, les auteurs ne s’accordent pas tous sur ce point. Les bactériocines peuvent être divisées en

deux types; celles produites par des bactéries à Gram-positif et celles produites par des bactéries à Gram-

négatif (Table 1-5) (Nes, 2011).

1.3.2.7.1. Classification

1.3.2.7.1.1. Les bactériocines produites par des bactéries à Gram-positif

Les bactériocines de classe I sont modifiées suite à leur traduction au ribosome, ce qui les distingue des

bactériocines de classe II. Qui plus est, elles possèdent des acides aminés inhabituels. Les bactériocines de

27

classe I se divisent en 3 sous-groupes : les lantibiotiques (classe Ia), les labyrinthopeptines (classe Ib) et les

sactibiotiques (classe Ic). Les lantibiotiques sont de petits peptides de moins de 5 kDa, constitués de 19 à 28

acides aminés, qui subissent de nombreuses modifications post-traductionnelles. Ils possèdent des acides

aminés inhabituels : la lanthionine, la β-méthyllanthionine, la déhydrobutyrine et la déhydroalanine (Rea,

Ross, et al., 2011). La nisine est produite par Lactococcus lactis. Elle est le premier lantibiotique à avoir été

décrit dans la littérature et le plus étudié à ce jour (Kuipers, Rink, & Moll, 2011). Les lantibiotiques ont

plusieurs modes d’action. Certains d’entre eux augmentent la perméabilité membranaire en formant des pores

dans la membrane cellulaire de la bactérie cible, via liaison au récepteur transmembranaire Lipide II. Il en

résulte une dissipation du potentiel de membrane, ainsi que l’efflux de ions intracellulaires (Rea, Ross, et al.,

2011). D’autres inhibent la biosynthèse de la paroi cellulaire (Rea, Ross, et al., 2011). Les labyrinthopeptines

ont été découverts récemment, ils sont alors encore peu connus. Ils possèdent de façon caractéristique un

acide aminé inhabituel, la labionine. Actinomadura namibiensis DSM 6313 est la seule souche connue à ce

jour produisant des labyrinthopeptines (A1 et A2). Il a été démontré qu’ils possèdent d’excellentes propriétés

antivirales et anti-allodyniques (Krawczyk et al., 2013). La subtilosine A et la thuricine CD font partie des

sactibiotiques qui se caractérisent par la présence de liens souffre-α-carbone. La subtilosine A, produite par

Bacillus subtilus, est un peptide cyclique, de taille inférieure à celle des peptides cycliques de la sous-classe

IId et subissant, contrairement à ces derniers, de nombreuses modifications post-traductionnelles (Rea, Ross,

et al., 2011). La thuricine CD, quant à elle, produite par Bacillus thuringiensis 6431, est active contre

Clostridium difficile et se compose de deux peptides (Trnα et Trnβ) (Rea, Ross, et al., 2011).

Les bactériocines de la classe II ne sont pas modifiées suite à leur traduction au ribosome. Elles sont de petite

taille (<10 kDa) et résistantes à la chaleur. Elles causent la mort de la bactérie cible en induisant pour la

plupart la perméabilisation de la membrane cellulaire, ce qui a pour conséquence l’efflux hors de la cellule de

ions et d’ATP (Cotter, Hill, & Ross, 2005). Cette classe de bactériocines a été divisée en quatre sous-classes;

Pediocin-like (IIa), à deux composantes non-modifiées (IIb), circulaires (IIc), linéaires non-pediocin-like à une

composante (IId) (Cotter et al., 2005; Nissen-Meyer, Rogne, Oppegård, Haugen, & Kristiansen, 2009; Rea,

Ross, et al., 2011). Les Pediocin-like possèdent un spectre d’activité étroit et ciblent spécifiquement Listeria

monocytogenes. On dénombre 28 bactériocines différentes dans cette sous-classe (Rea, Ross, et al., 2011).

Elles varient en taille entre 37 (sakacine G) et 55 (acidocine A) acides aminés standards (Rea, Ross, et al.,

2011) et possèdent un à deux ponts disulfures (Cotter et al., 2005). Leur région N-terminale hydrophile,

cationique, appelée aussi « pediocin box », est très conservée, avec pour motif YGNGVXCXXXXVXV (où X

peut être n’importe quel acide aminé) (Cotter et al., 2005). La région N-terminale conservée est supposée être

responsable de la liaison non-spécifique de la bactériocine à la surface cellulaire, tandis que la région C-

terminale, moins conservée, déterminerait la spécificité de la cible (Rea, Ross, et al., 2011). Il existe 26

28

bactériocines à deux composantes non-modifiées (Nissen-Meyer et al., 2009). Elles sont généralement

produites par des bactéries lactiques, mais la brochocine-C produite par Brochothrix campestris fait exception.

Comme leur nom l’indique, elles sont constituées de deux peptides allant chacun de <40 acides aminés

(plantaricine S et lactococcine G par exemple) à >50 acides animés (brochocine-C, sakacine T, gassericine T

et lactacine F par exemple) (Rea, Ross, et al., 2011). Pour qu’il y ait activité antimicrobienne, il y a besoin que

les deux peptides de la bactériocine soient présents et interagissent. Les deux peptides possèdent une

séquence d’acides aminés conservée GXXXG. Il a été démontré que les deux peptides interagissent via leurs

motifs GXXXG (Rea, Ross, et al., 2011). Les bactériocines de la classe IIc ont une structure circulaire suite à

la liaison des extrémités N et C-terminale et mesurent entre 3,4 et 7,2 kDa (Nissen-Meyer et al., 2009). Elles

sont cationiques, relativement hydrophobes (Nissen-Meyer et al., 2009), résistantes à la chaleur et aux

protéases, et actives contre Listeria (Rea, Ross, et al., 2011). Cette sous-classe comprend seulement huit

bactériocines, dont six d’entre elles sont produites par des bactéries lactiques (gassericine A, reutericine 6,

enterocine AS-48, enterocine 4, carnocycline A et lactocyclicine Q), la cirularine A et la butyrivibriocine AR10

sont produites par Clostridium beijerinckii et Butryrivibrio fibrisolvens respectivement (Rea, Ross, et al., 2011).

Enfin, la sous-classe IId regroupe des bactériocines très diverses, produites par des bactéries à Gram-positif,

non-modifiées, ne pouvant entrer dans aucune des sous-classes précédentes. Elles ne ressemblent en rien à

la pédiocine, sont linéaires et constituées que d’un seul peptide. Cette sous-classe comprend 31

bactériocines, dont la lactococcine A, la première du groupe à avoir été isolée et caractérisée. Elles sont

principalement produites par des bactéries lactiques, mais certaines ont été isolées de Staphylococcus et de

Weissella sp. (Rea, Ross, et al., 2011).

Les bactériolysines sont de grandes protéines thermolabiles. Elles ont la particularité de lyser leur cible en

hydrolysant leur paroi cellulaire. À ce jour, cinq bactériolysines produites par des bactéries lactiques ont été

caractérisées génétiquement : l’helvéticine J produite par Lactobacillus helveticus, la zoocine A produite par

Streptococcus zooepidermicus, l’entérolysine A produite par Enterococcus faecalis, la millericine B produite

par Streptococcus milleri et la linocine M18 produite par Brevibacterium linens (Rea, Ross, et al., 2011). Il

existe également des bactériolysines produites par des bactéries qui ne sont pas lactiques, telles que la

lysostaphine (Rea, Ross, et al., 2011). Le domaine catalytique de la protéine se trouve à l’extrémité N-

terminale, il ressemble à celui des endopeptidases, tandis que l’extrémité C-terminale servirait à la

reconnaissance de la cible. Les gènes codant la bactériolysine ne sont pas toujours associés à des gènes

d’immunité protégeant la bactérie productrice de sa propre production. En revanche, la paroi cellulaire de cette

dernière peut être modifiée afin de résister à l’hydrolyse (Cotter et al., 2005).

29

1.3.2.7.1.2. Les bactériocines produites par des bactéries à Gram-négatif

Les bactéries à Gram-négatif produisant des bactériocines sont principalement des Enterobacteriaceae. Les

bactériocines produites par les Enterobacteriaceae se divisent en deux familles qui se distinguent

essentiellement par leur taille; les colicines, de 30 à 80 kDa, et les microcines, de 1 à 10 kDa. Les colicines et

les microcines sont libérées en conditions de stress par la bactérie, la plupart du temps E. coli (Rebuffat,

2011).

Les colicines sont des protéines de haut poids moléculaire (30-80 kDa) produites en conditions de stress par

des souches de E. coli possédant un plasmide colicinogénique (Rebuffat, 2011). Tous les gènes codant les

colicines se trouvent être localisés sur un plasmide (Duquesne et al., 2007). L’export des colicines se fait par

lyse de la bactérie productrice. L’opéron colicinogénique se compose d’un gène codant la colicine (cxa), d’un

gène codant une protéine immunitaire (cxi ou imX) et d’un gène codant une protéine de lyse (bacteriocin

release protein, BRP) nécessaire à la sécrétion de la bactériocine (Rebuffat, 2011). Les colicines ont divers

modes d’action antimicrobienne. Elles peuvent (1) former des canaux voltage-dépendant dans la membrane

interne de la bactérie cible, (2) avoir une activité nucléasique dans le cytoplasme, (3) dégrader les

peptidoglycanes de la paroi cellulaire (Rebuffat, 2011). Elles possèdent trois domaines fonctionnels : le

domaine central permet à la colicine de se lier au récepteur de la membrane externe de la cellule cible,

l’extrémité N-terminale sert à la translocation de la colicine au travers de la membrane externe de la cellule

cible et l’extrémité C-terminale est le domaine catalytique (Duquesne et al., 2007). Les colicines détournent à

leurs fins des récepteurs dont l’utilité première est l’import dans la cellule de nutriments essentiels, tels que la

vitamine B12 (cobalamine). Les récepteurs empruntés par les colicines sont principalement les sidérophores

FhuA, FepA, Cir et Fiu, le récepteur de la cobalamine BtuB et le récepteur de nucléosides Tsx (Rebuffat,

2011).

Les microcines sont des peptides hydrophobes de faible poids moléculaire (1-10 kDa), très résistantes aux

conditions extrêmes (pH, température, protéases), produites pour la plupart par E. coli et actives à des

concentrations nanomolaires (Rebuffat, 2011). Les gènes codant les microcines sont généralement

plasmidiques, toutefois certaines d’entre elles sont codées par des gènes chromosomiques. Un stress

environnemental, tel qu’une carence en nutriments ou en oxygène, stimule la production de microcines. La

synthèse de microcines est activée lorsque la bactérie entre en phase stationnaire (Severinov, Semenova, &

Kazakov, 2011). L’expression de la MccE492 est stimulée en absence de glucose, ainsi que lorsque le

glucose est remplacé par du glycérol (Duquesne et al., 2007). De la même manière, un manque d’azote dans

le milieu stimule l’expression de la MccB17 (Duquesne et al., 2007). La disponibilité en fer peut aussi être un

30

facteur régulant l’expression des microcines. En présence de fer, la production de MccJ25 chute de 95 %. Elle

est rétablie en présence d’agents chélateurs qui se complexent au fer (Duquesne et al., 2007). Il est difficile de

faire une classification des microcines, car elles sont extrêmement diverses. Il est néanmoins possible de

diviser les microcines en deux classes, I et II. La classe II se sous-divise en classe IIa et IIb. Les microcines de

classe I ont une masse moléculaire inférieure à 5 kDa et subissent de nombreuses modifications post-

traductionnelles (MccJ25, MccB17 et MccC7-C51) (Severinov et al., 2011). Les microcines de classe II ont

une masse moléculaire entre 5 et 10 kDa. La classe IIa comprend les microcines codées par des gènes

plasmidiques, ne subissant pas de modifications post-traductionnelles et possédant des ponts disulfures

(MccL, MccV et Mcc24). La classe IIb comprend les microcines codées par des gènes chromosomiques ayant

acquis un sidérophore à l’extrémité C-terminale lors de leur modification post-traductionnelle (MccE492,

MccM, MccH47, MccI47 et MccG47) (Rebuffat, 2011). Tout comme les colicines, les microcines se fixent à la

bactérie cible via ses récepteurs membranaires servant à l’import des nutriments essentiels. Ces récepteurs

se trouvent être les sidérophores FhuA, FepA, Cir et Fiu, ainsi que la porine OmpF (Rebuffat, 2011). Certaines

protéines de la membrane interne de la cible, telles que SdaC et SbmA, aident la microcine à traverser cette

membrane et à pénétrer dans le cytoplasme (Rebuffat, 2011). Les microcines divergent grandement entre

elles en nombre de gènes, structure, biosynthèse et mécanisme de translocation pour pénétrer dans la cellule

cible, mais également dans leurs modes d’action. Les microcines de classe I inhibent les enzymes vitales

intracellulaires de la cible. La MccB17 cible l’ADN gyrase, tandis que la MccJ25 inhibe l’ARN polymérase, en

plus d’interagir avec un composant de la chaîne respiratoire et ainsi de bloquer la respiration cellulaire. La

microcine C7-C51, quant à elle, est clivée à l’intérieur de la cellule cible générant un homologue de l’aspartyl

adénylate qui inhibe l’aspartyl-ARNt synthétase, ceci ayant pour effet de bloquer la traduction (Rebuffat,

2011). Les microcines de classe II agissent sur la membrane interne des bactéries à Gram-négatif. MccE492

et MccV forment des pores dans la membrane, tandis que la MccH47 cible le canal à protons Fo (domaine

membranaire) de l’ATP synthase (Rebuffat, 2011).

31

Groupe Caractéristique(s) Exemples

Gram-positif

Classe I (modifiées)

a) Les lantibiotiques Acide aminé lanthionine Nisine, lacticine 3147

b) Les labyrinthopeptines Acide aminé labionine A1 et A2

c) Les sactibiotiques Liens souffre-α-carbone Subtilosine A, thuricine CD

Classe II (non-modifiées)

a) Pediocin-like Motif YGNGV conservé, actifs contre Listeria Pédiocine PA-1

b) À 2 composantes non-modifiées

2 peptides Abp118, lactococcine G

c) Circulaires Cycliques Entérocine AS-48

d) Linéaires non-pediocin-like à une composante

Linéaires non-pediocin-like à 1 peptide Lactococcine A, lacticine Q

Les bactériolysines Larges, thermolabiles, lytiques Lysostaphine, entérolysine A

Gram-négatif

Les colicines 30-80 kDa, protéine de lyse co-exprimée Colicine E1, colicine M

Les microcines 1-10 kDa, résistantes aux protéases, T° et pH extrêmes MccJ25, MccB17, MccV

Table 1-5 : Classification des bactériocines. Les bactériocines peuvent être divisées en deux types; celles

produites par des bactéries à Gram-positif et celles produites par des bactéries à Gram-négatif.

32

1.3.2.7.2. Applications des propriétés anti-infectieuses des

bactériocines

1.3.2.7.2.1. Alimentaires

Les bactériocines servent en industrie alimentaire à la préservation et à la biosécurité des aliments. Elles ont

un potentiel de bio-préservation de la viande, des produits laitiers, du poisson, des boissons alcoolisées, des

salades, des aliments appertisés, des produits à base d’œufs, des légumes fermentés et des produits de

boulangerie que l’on peut combiner ou non avec d’autres méthodes de conservation. Elles peuvent être

également utilisées dans les emballages alimentaires (Cotter et al., 2005). La nisine (Nisaplin, Danisco) et la

pédiocine PA-1 (ALTA 2431, Quest) sont aujourd’hui déjà commercialisées comme additif alimentaire (Cotter

et al., 2005). La nisine est reconnue sécuritaire par la FDA (American Food and Drug Administration). Elle est

utilisée pour la préservation du lait, de la viande, des produits végétaux ainsi que pour la préservation des

produits de la mer (Le Blay et al., 2012). On ajoute dans l’aliment la bactériocine purifiée, semi-purifiée ou la

souche productrice de la bactériocine (Cotter et al., 2005). Plusieurs études in vitro ont été réalisées pour

évaluer le potentiel anti-infectieux de bactériocines telles que la nisine de Lactococcus lactis spp. et la

divergicine M35 de Carnobacterium divergens contre Listeria monocytogenes (Chung, Dickson, & Crouse,

1989; Tahiri et al., 2004; Naghmouchi et al., 2006; Dabour, Zihler, Kheadr, Lacroix, & Fliss, 2009).

1.3.2.7.2.2. Vétérinaires

L’utilisation de bactériocines ou de souches productrices de bactériocines intéresse grandement le milieu

vétérinaire dans la lutte contre certaines maladies. La mammite bovine est une infection intra-mammaire

bactérienne très coûteuse pour l’industrie laitière. Elle est causée la plupart du temps par Staphylococcus

aureus, Streptococcus uberis et Streptococcus dysgalactiae. La nisine est déjà utilisée et commercialisée avec

succès pour la prévention et le traitement de cette maladie (Wipe Out® Dairy Wipes, Immucell, Portland, ME,

USA). D’autres bactériocines potentielles ont été caractérisées et présentent de bons résultats. C’est le cas de

la lacticine 3147, de la morricine 269 et de la kurstacine 287 qui sont efficaces contre S. aureus, alors que ce

dernier est résistant aux antibiotiques commerciaux (Hammami et al., 2013). La lactococcose est une maladie

du poisson qui engendre de grosses pertes économiques dans les milieux de la pêche et de l’aquaculture. Elle

est causée par le pathogène Lactococcus garvieae. Les souches bactériennes L. lactis TW34 et L. garvieae

DCC43 produisent respectivement la TW34 et la garvicine ML qui ont démontré in vitro une activité inhibitrice

significative contre L. garvieae et qui pourraient ainsi devenir un moyen de lutte efficace contre ce pathogène

(Sequeiros, Vallejo, Marguet, & Olivera, 2010; Borrero et al., 2011; Hammami et al., 2013).

33

1.3.2.7.2.3. Médicales

Au niveau médical, plusieurs études ont mis en évidence in vitro et in vivo avec succès l’efficacité

thérapeutique des bactériocines dans le traitement d’infections nosocomiales, systémiques, cutanées, orales,

respiratoires, gastro-intestinales et uro-génitales humaines (Hammami et al., 2013).

La résistance aux antibiotiques des microorganismes pathogènes nosocomiaux (entérocoques,

pneumocoques, S. aureus par exemple) est de plus en plus fréquente. Leur menace pour la santé publique

est réelle. Or, de très nombreuses études ont mis en évidence avec succès le potentiel anti-infectieux de

certaines bactériocines contre ces bactéries pathogènes d’origine communautaire. Pour n’en citer que

quelques-unes, la lacticine 3147 présente in vivo une activité inhibitrice significative contre S. aureus chez la

souris (Piper, Casey, Hill, Cotter, & Ross, 2012; Hammami et al., 2013), tandis que deux bactériocines

Pediocin-like, E 50-52 et B 602, produites respectivement par Enterococcus faecium NRRL B-30746 et

Paenibacillus polymyxa NRRL B-30509, ont montré une activité antimicrobienne significative contre plusieurs

espèces bactériennes nosocomiales multi-résistantes aussi bien à Gram-positif que négatif (Svetoch et al.,

2009; Hammami et al., 2013).

Legionella pneumophila est l’un des pathogènes responsables de la pneumonie, une infection respiratoire

pouvant être mortelle. Elle infecte l’homme par inhalation d’aérosols contaminés. La bactériocine warnericine

RK, produite par Staphylococcus warneri RK, est la première bactériocine découverte ayant une activité anti-

infectieuse significative contre Legionella. D’autres bactériocines actives contre des pathogènes responsables

de pneumonies ont été caractérisées (Hammami et al., 2013). Knoetze et al. ont étudié le peptide ST4SA

produit par Enterococcus mundtii ST4SA. Ils ont mis en évidence une forte activité inhibitrice du peptide contre

Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus et

Streptococcus pneumoniae, des pathogènes causant l’otite. Le peptide ST4SA pourrait ainsi servir à traiter

l’otite (Knoetze, Todorov, & Dicks, 2008; Hammami et al., 2013). Carroll et al. ont démontré in vitro que la

lacticine 3147 pouvait être un outil efficace de lutte contre la tuberculose. En effet, elle s’est montrée très

active contre Mycobacterium tuberculosis H37Ra, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC 19698

et Mycobacterium kansasii CIT11/06 même à de faibles concentrations (Carroll et al., 2010; Hammami et al.,

2013). Enfin, la compagnie AOP Orphan Pharmaceuticals AG a développé un traitement de la fibrose kystique

basé sur le lantibiotique duramycine sous le nom de Moli1901 (Hammami et al., 2013).

De nombreuses infections de la peau, telles les impétigos, furoncles et abcès sous-cutanés, sont causées par

des staphylocoques. Les staphylocoques sont aussi responsables de la maladie de Ritter, du syndrome de

34

choc toxique ainsi que du NTED (Neonatal toxic shock syndrome-like Exanthematous disease). Une autre

maladie de la peau, l’acné, est causée quant à elle par Propionibacterium acnes et Staphylococcus

epidermidis (Hammami et al., 2013). De nombreuses bactériocines ont montré une activité anti-

staphylocoques significative. C’est le cas de l’épidermicine NI01, produite par S. epidermidis 224, une souche

isolée de la peau humaine, qui présente une activité anti-infectieuse contre S. epidermidis, Staphylococcus

saprophyticus, Staphylococcus hominis, S. warneri, E. faecium, VRE, MRSA et S. aureus 1195 (Sandiford &

Upton, 2012; Hammami et al., 2013). Une lotion contre l’acné contenant la bactérie E. faecalis SL-5 produisant

la bactériocine ESL5 a été testée avec succès. En effet, ESL5 inhibe efficacement P. acnes, Bacillus cereus,

Bacillus subtilis, L. monocytogenes et S. aureus (Kang et al., 2009; Hammami et al., 2013).

On retrouve parmi les infections de la cavité orale les caries dentaires, les parodontopathies telles que les

gingivites ou encore les halitoses (mauvaise haleine) (Hammami et al., 2013). Streptococcus mutans BCS3-L1

est prometteuse pour la prévention et le traitement des caries dentaires. En effet, cette souche, mutée pour ne

plus produire d’acide lactique à l’origine de la carie, produit en revanche un lantibiotique, la mutacine 1140, qui

cible S. mutans et lui donne un avantage sélectif dans la colonisation de la cavité orale (Hillman et al., 1998;

Hillman et al., 2000). En 2007, ils ont ajouté des modifications génétiques à S. mutans BCS3-L1 (appelée

alors A2JM) pour permettre son élimination rapide en cas d’effets secondaires indésirables et gagner en

stabilité génétique (Hillman, Mo, McDonell, Cvitkovitch, & Hillman, 2007; Hammami et al., 2013). Les

chercheurs travaillant sur S. mutans BCS3-L1 ont également développé un rince-bouche maintenant la santé

buccale breveté sous le nom de ProBiora3 (Oragenics) contenant trois souches probiotiques (Streptococcus

uberis KJ2, Streptococcus oralis KJ3 et Streptococcus rattus JH145). ProBiora3TM a été testé chez le rat ainsi

que chez l’homme et s’est montré sans danger pour la santé et efficace comme agent anti-infectieux (Hillman,

McDonell, Hillman, Zahradnik, & Soni, 2009; Zahradnik et al., 2009; Hammami et al., 2013). Il obtient en 2008

la désignation GRAS (Generally Recognized As Safe) par la Food and Drug Administration des Etats-Unis

(Oragenics). La mauvaise haleine est due aux produits du métabolisme des micro-organismes buccaux (acide

valérique, acide butyrique et putrescine). Deux lantibiotiques, la salivaricine A et la salivaricine B, produits par

Streptococcus salivarius, ont démontré une activité inhibitrice significative contre les bactéries responsables

de l’halitose : Micrococcus luteus I1, Streptococcus anginosis T29, Eubacterium saburreum ATCC 33271 et

Micromonas micros ATCC 33270 (Burton, Chilcott, Moore, Speiser, & Tagg, 2006; Hammami et al., 2013).

Le tractus gastro-intestinal (GI) abrite un microbiote très riche et divers. Celle-ci est essentielle à la santé de

l’hôte. Elle participe à la maturation du système immunitaire ainsi qu’à la défense de l’hôte contre les

pathogènes entériques, tels que Clostridium difficile, Listeria monocytogenes et Salmonella. La lacticine 3147

produite par L. lactis ainsi que la thuricine CD produite par Bacillus thuringiensis DPC 6431 ont montré une

35

activité antimicrobienne significative contre C. difficile (Rea et al., 2007; Rea et al., 2010). Néanmoins, la

thuricine CD est préférable comme agent thérapeutique car elle possède un spectre d’action restreint et n’a

ainsi que peu d’impact sur la composition du microbiote commensal, ce qui n’est pas le cas de la lacticine

3147, ni des antibiotiques vancomycine et métronidazole (Rea, Dobson, et al., 2011; Hammami et al., 2013).

Parmi les bactériocines actives contre L. monocytogenes, on trouve la piscicoline 126, la carnobactériocine

BM1, la carnocycline A, l’avicine A, Abp118, la pédiocine PA-1 et l’entérocine CRL35 (Hammami et al., 2013).

Abp118 est intéressante car elle peut être produite in situ par sa souche productrice probiotique Lactobacillus

salivarius UCC118 et conserver son activité antibactérienne. Corr et al. ont inoculé Lb. salivarius UCC118 à

des souris et ont démontré l’activité inhibitrice in vivo du probiotique contre L. monocytogenes via la production

de Abp118 (Corr et al., 2007). Ils ont montré également que le mutant stable de Lb. salivarius UCC118, qui ne

produit plus Abp118, ne confère plus à l’hôte de protection contre Listeria et que la souris hôte n’est plus non

plus protégée lorsque Listeria exprime abpIM, un gène de résistance à Abp118 codant la protéine immunitaire

AbpIM. Salmonella est inhibée par la microcine J25 ainsi que par la microcine C7 et les colicines 1b et E1

(Hammami et al., 2013). La microcine C7 et les colicines 1b et E1 produites par E. coli H22 ont montré une

activité anti-infectieuse significative contre Enterobacter agglomerans, E. coli, Klebsiella pneumoniae,

Morganella morganii, Salmonella enterica, Shigella flexeneri et Yersinia enterocolitica (Cursino et al., 2006;

Hammami et al., 2013).

Les bactériocines peuvent également être appliquées aux traitements des infections uro-génitales. C’est le cas

de la lactocine 160 qui pourrait servir à la prévention et au traitement de la vaginose bactérienne. La lactocine

160 est produite par une bactérie du microbiote commensal vaginal, Lactobacillus rhamnosus 160. Elle inhibe

spécifiquement Gardnerella vaginalis et Prevotella bivia, causant la vaginose, sans altérer le microbiote

naturel du vagin composé principalement de Lactobacillus (Turovskiy, Ludescher, Aroutcheva, Faro, &

Chikindas, 2009; Hammami et al., 2013). Qui plus est, la lactocine 160 n’irrite pas le tissu épithélial vaginal et

n’a pas d’activité hémolytique (Dover, Aroutcheva, Faro, & Chikindas, 2007; Hammami et al., 2013).

Pour une revue complète et détaillée des applications des propriétés anti-infectieuses des bactériocines, voir

Hammami et al. (Hammami et al., 2013).

1.3.2.7.3. La microcine J25

La microcine J25 (MccJ25) est une bactériocine en forme de lasso faisant partie de la classe I des microcines

produite naturellement par la souche fécale Escherichia coli AY25 (Salomon & Farias, 1992; Rebuffat, 2011).

Elle possède un spectre d’activité restreint et cible particulièrement Salmonella, Shigella et E. coli

36

(BACTIBASE) avec une concentration minimale inhibitrice (CMI) de 0,02 à 0,05 μM (Duquesne et al., 2007).

Le précurseur de la MccJ25 est constitué de 58 acides aminés ; 37 acides aminés composent le peptide-

leader, clivé avant export, et 21 acides aminés composent la MccJ25 mature (Figure 1-1). Sa masse

moléculaire est de 2,1 kDa (Duquesne et al., 2007). Les gènes associés à la MccJ25 se trouvent sur le

plasmide de type sauvage pTUC100 de 60 kb (Salomon & Farias, 1992). Ils sont au nombre de quatre et

organisés en deux opérons transcrits en sens contraire. Le gène mcjA code le précurseur de la MccJ25, les

gènes mcjB et mcjC codent des enzymes impliquées dans la maturation de McjA, tandis que mcjD code un

transporteur ABC permettant la sécrétion de la MccJ25 mature (Figure 1-2) (Duquesne et al., 2007). McjB est

une protéase ATP-dépendante clivant le peptide-leader, tandis que McjC est une amidotransférase catalysant

la cyclisation Gly1 - Glu8 de la MccJ25 (Hammami et al., 2015). McjB et McjC suffisent à elles seules à la

maturation de la MccJ25 (Vincent & Morero, 2009). Le transporteur ABC McjD, en exportant la MccJ25 hors

de la cellule, est également impliqué dans la défense immunitaire de la bactérie productrice puisqu’ainsi il

empêche une accumulation intracellulaire de la protéine antimicrobienne (Severinov et al., 2011). McjB et

McjC sont probablement associées au domaine cytoplasmique de McjD (Vincent & Morero, 2009). mcjA est un

opéron à lui seul avec son promoteur PmcjA, tandis que l’autre opéron comprend mcjB, C et D sous le

promoteur PmcB. La MccJ25 est constituée de 33,1 % de G+C (Duquesne et al., 2007). L’expression des gènes

de la MccJ25 est induite lorsque la bactérie subit un stress environnemental et entre en phase stationnaire.

L’expression de mcjA est stimulée lorsqu’il y a carence en carbone et en phosphate inorganique, mais elle ne

l’est pas lorsque l’azote se trouve en quantités limitées (Vincent & Morero, 2009). La MccJ25 possède deux

groupes chargés. L’histidine en position 5 est chargée positivement, tandis que le groupe carboxyle en C-

terminal de Cys21 est chargé négativement (Hammami et al., 2015). La MccJ25 de 21 résidus a une structure

tridimensionnelle en lasso. La liaison peptidique de la Gly1 en N-terminal au Glu8 forme un petit anneau. La

« queue » en C-terminal, Tyr9 - Gly21 (Vincent & Morero, 2009), est retenue à l’intérieur de l’anneau par des

interactions non-covalentes et par l’encombrement stérique créé par les deux acides aminés aromatiques

Phe19 et Tyr20. La structure en lasso de la MccJ25 lui confère une résistance exceptionnelle aux températures

extrêmes ainsi qu’aux agents dénaturants et protéolytiques (Salomon & Farias, 1992; Duquesne et al., 2007).

37

Figure 1-1 : Structure primaire et secondaire de la MccJ25 (Vincent & Morero, 2009).

38

Figure 1-2 : Biosynthèse et maturation de la MccJ25 (Vincent & Morero, 2009).

39

La MccJ25 utilise le récepteur transmembranaire sidérophore FhuA, ainsi que le complexe Ton et la protéine

SbmA, pour son import dans la cellule cible (Figure 1-3). FhuA est un récepteur ferrichrome de la membrane

externe de la bactérie qui reconnaît la microcine. La translocation de la MccJ25 au travers de la membrane

externe nécessite le complexe TonB/ExbB/ExbD de la membrane interne. Le système Ton transfère l’énergie

nécessaire à l’activation de FhuA de la membrane interne à la membrane externe. TonB énergisé par la force

proto-motrice de la membrane plasmique interagit avec FhuA qui, une fois activé, change de conformation,

ouvre son canal, et permet l’entrée de la MccJ25 dans l’espace périplasmique. La translocation de la MccJ25

au travers de la membrane plasmique est réalisée par la protéine transmembranaire SbmA de la membrane

interne (Vincent & Morero, 2009). Le principal mécanisme d’action de la MccJ25 est le blocage de la

transcription par obstruction du canal secondaire de l'ARN polymérase. Néanmoins, la MccJ25 présente des

modes d’action alternatifs. Il a été découvert chez S. typhimurium et E. coli que la MccJ25 cible la chaîne

respiratoire (Vincent, Delgado, Farias, & Salomon, 2004; Vincent & Morero, 2009). Chez S. newport, la

MccJ25 perméabilise la membrane cytoplasmique provoquant une dissipation du potentiel de membrane

(Rintoul, de Arcuri, Salomon, Farias, & Morero, 2001). Les propriétés avantageuses de la MccJ25 en font une

protéine antimicrobienne pleine de potentiel applicable à l’industrie pharmaceutique et alimentaire (Hammami

et al., 2015).

40

Figure 1-3 : Mécanisme d’import de la MccJ25 (Duquesne et al., 2007).

41

1.4. Le microbiote intestinal

Le tractus gastro-intestinal héberge un écosystème microbien riche et complexe qui contribue à la santé de

l’hôte (Le Blay et al., 2007). Il est estimé que le tractus GIT héberge entre 1013 et 1014 microorganismes, avec

plus de 1100 espèces bactériennes différentes (Power et al., 2014). Le microbiote intestinal, considéré comme

un organe à part entière, possède 150 fois plus de gènes que le génome humain (Power et al., 2014). La

densité et la composition microbienne varient d’un bout à l’autre de l’appareil digestif (Figure 1-4). Le côlon

abrite le microbiote le plus dense et divers avec 1011-1012 bactéries par gramme de contenu (1 à 2 kg du poids

humain) car c’est au niveau côlon que le temps de rétention du digesta est le plus long, qu’il y a la plus grande

disponibilité en nutriments et que le pH est le plus favorable (Payne et al., 2012; Power et al., 2014). Le rôle

premier du microbiote intestinal est de digérer ce que l’hôte n’est pas capable de digérer par lui-même,

comme les fibres alimentaires. Les bactéries intestinales sont bénéfiques pour l’hôte en convertissant les

carbohydrates complexes en substrats absorbables, principalement en acides gras à chaîne courte, source

d’énergie, ainsi qu’en produisant des vitamines (Arumugam et al., 2011). « The microbiota act as a metabolic

organ » (Den Besten et al., 2013). Les bactéries commensales intestinales forment également une ligne de

résistance qui bloque la colonisation par des pathogènes entériques, en entrant en compétition pour les

nutriments et les sites d’attachement à la muqueuse intestinale ou encore en produisant des composés

antimicrobiens (Le Blay et al., 2007; Payne et al., 2012). Elles contribuent aussi à l’établissement de

l’immunité intestinale (Den Besten et al., 2013). Les phyla dominants du microbiote intestinal ne sont pas

spécifiques à l’individu, ils se retrouvent en mêmes proportions dans la majorité de la population, mais les

proportions des genres à l’intérieur de ces phyla varient entre individus (Jeffery, Claesson, O'Toole, &

Shanahan, 2012). La composition du microbiote intestinal est influencée par de nombreux facteurs, tels que le

génotype de l’hôte, sa physiologie, son régime alimentaire et la prise de médicaments (antibiotiques) (Figure

1-4) (Den Besten et al., 2013). Les changements de composition suite à un changement de diète sont

réversibles (Jeffery et al., 2012). La composition du microbiote intestinal de l’enfant est différente de celle de

l’adulte, qui elle-même diffère de celle de la personne âgée (Cinquin, Le Blay, Fliss, & Lacroix, 2004;

Arumugam et al., 2011; Claesson et al., 2012). L’enfant naît avec un système GIT axénique, mais qui est très

rapidement colonisé à la naissance par des bactéries provenant de la mère et de l’environnement (Den Besten

et al., 2013). Il a été observé qu’un enfant né par césarienne n’a pas le même microbiote intestinal initial qu’un

enfant né par voie basse (Dominguez-Bello et al., 2010). La composition du microbiote intestinal de l’enfant né

par voie basse ressemble à celle du microbiote vaginal de la mère, dominée par Lactobacillus, Prevotella et

Sneathia spp. Les bactéries colonisant le tractus gastro-intestinal de l’enfant né par césarienne sont celles

retrouvées à la surface de la peau de sa génitrice, Staphylococcus, Corynebacterium et Propionibacterium spp

(Figure 1-4) (Dominguez-Bello et al., 2010). De plus, un enfant nourri au lait maternel n’a pas le même

42

microbiote intestinal qu’un enfant nourri au lait en poudre (Power et al., 2014). La composition du microbiote

intestinal est instable aux extrêmes de la vie, tandis qu’elle se trouve relativement stable tout au long de la vie

d’adulte (Figure 1-4) (Power et al., 2014). Chez l’enfant, elle se stabilise entre 3 et 4 ans (Den Besten et al.,

2013). La composition microbienne intestinale d’un homme sain diffère de celle d’un homme malade (Jeffery

et al., 2012). Des corrélations ont été établies chez l’adulte entre des changements de composition du

microbiote intestinal et plusieurs maladies, telles que la maladie inflammatoire chronique de l’intestin, le

syndrome du côlon irritable, l’obésité et le cancer colorectal (Ley, Turnbaugh, Klein, & Gordon, 2006; Yang &

Pei, 2006; Jeffery et al., 2012). Les fonctions métaboliques du microbiote sont très conservées entre individus,

malgré sa variabilité de composition (Oakley et al., 2014). Le microbiote colique de l’adulte est composé

principalement des deux phyla Firmicutes (46-58 % du total bactérien) et Bacteroidetes (10-30 %). Les

Actinobacteria (4,4-4,8 %) et les Proteobacteria (0,1-0,2 %) sont également présentes mais en plus faible

nombre. Clostridium, Blautia, Lactobacillus, Ruminococcus, Streptococcus et Faecalibacterium font partie des

Firmicutes. Les genres Bacteroides et Prevotella représentent les Bacteroidetes. Chez les Actinobacteria, l’on

retrouve les Bifidobacterium. Enfin, E. coli est le genre dominant des Proteobacteria. La plupart des bactéries

du côlon sont anaérobies stricts, comme c’est le cas des Clostridium, des Bacteroides et des Bifidobacterium

(Arumugam et al., 2011; Payne et al., 2012).

43

Figure 1-4 : (a) Densités cellulaires bactériennes des différentes parties de l’appareil digestif. (b) Évolution du

microbiote intestinal au cours de la vie d’un homme, facteurs modulant sa composition, principaux genres

bactériens présents. C-section, Caesarean section (Power et al., 2014).

44

Il a été proposé de diviser le microbiote intestinal en entérotypes bien distincts qui ne sont pas reliés à la

nationalité, au sexe, à l’âge ni au BMI, mais qui varient en proportions entre individus (Jeffery et al., 2012).

Selon cette catégorisation du microbiote intestinal, il existe trois entérotypes qui composent notre écosystème

microbien intestinal (Figure 1-4). L’entérotype 1 comprend les Bacteroides (Bacteroidetes). Ces bactéries ont

un très large potentiel saccharolytique. L’entérotype 2 est principalement constitué de Prevotella

(Bacteroidetes), mais aussi de Desulfovibrio (Proteobacteria), tandis que l’entérotype 3 est riche en

Ruminococcus (Firmicutes) et dans une moindre mesure en Akkermansia (Verrucomicrobia). Les entérotypes

2 et 3 comprennent des bactéries capables de dégrader les mucines, des glycoprotéines des muqueuses

intestinales (Arumugam et al., 2011). Cette division en entérotypes est controversée, certains préfèrent la

notion de gradients plutôt que celle de groupes distincts comme les entérotypes (Jeffery et al., 2012). D’autres

proposent de grouper les genres bactériens selon leur fréquence d’association, ce sont les groupes de co-

abondance, les CAGs (Claesson et al., 2012; Jeffery et al., 2012).

Les bactéries du microbiote intestinal transforment par fermentation les fibres alimentaires (polysaccharides

non-amylacés d’origine végétale) en acides gras à chaîne courte (AGCC) nécessaires au métabolisme de

l’hôte. Les acides gras à chaîne courte sont des acides organiques saturés aliphatiques composés de 1 à 6

carbones dont l’acétate, le propionate et le butyrate sont les principaux représentants (Den Besten et al.,

2013). L’acétate, le propionate et le butyrate sont produits dans le côlon en proportions 60:20:20 (Den Besten

et al., 2013). La majeure partie des AGCC produits (95 %) est absorbée par les colonocytes, les 5 % restants

partent dans les fèces (Den Besten et al., 2013). C’est au niveau du côlon proximal qu’il y a la plus grande

disponibilité de substrats, ce qui en fait le principal site de fermentation (Den Besten et al., 2013). Le côlon

proximal abrite principalement les fermenteurs primaires, des bactéries saccharolytiques telles que les

Bacteroidetes. Les fermenteurs secondaires se trouvent dans le côlon distal, ce sont pour la plupart des

bactéries protéolytiques (Den Besten et al., 2013). Les Bacteroidetes produisent surtout de l’acétate et du

propionate tandis que les Firmicutes produisent avant tout du butyrate (Den Besten et al., 2013). Les

Bacteroidetes libèrent également des gaz (H2) qui sont utilisés par d’autres bactéries de l’écosystème

microbien. L’hôte et le microbiote travaillent en symbiose, l’hôte fournit aux bactéries intestinales le CO2 dont

elles ont besoin sous forme d’HCO3- en échange d’AGCC anioniques (Den Besten et al., 2013). La production

d’AGCC abaisse le pH intestinal. La concentration d’AGCC diminue du côlon proximal au côlon distal, en

raison de la diminution de disponibilité des fibres alimentaires, ce qui fait augmenter le pH du caecum au

rectum (Den Besten et al., 2013). Le changement de pH module la composition du microbiote. L’acidité du

côlon proximal a le bénéfice d’inhiber la croissance de pathogènes (Enterobacteriaceae par exemple). Les

AGCC sont absorbés par les colonocytes de l’hôte, gagnent la circulation sanguine et rejoignent ainsi divers

organes du corps où ils servent de substrats et de régulateurs. Ils répondent à 10 % de la demande

45

quotidienne en énergie de l’homme. Les AGCC régulent le métabolisme des lipides, du glucose et du

cholestérol (Den Besten et al., 2013). Ils traversent la membrane apicale des colonocytes soit par diffusion

passive sous leur forme indissociée (peu fréquent), soit par transport actif sous leur forme dissociée anionique

(fréquent) qui utilise différents transporteurs (des transporteurs d’acides monocarboxyliques entre autres). Les

AGCC qui ne sont pas consommés par le colonocyte comme source d’énergie quittent la cellule par la

membrane baso-latérale pour rejoindre la circulation sanguine, par transport actif uniquement (Den Besten et

al., 2013). Le butyrate est consommé essentiellement par les colonocytes. Les colonocytes tirent leur énergie

à 60-70 % de l’oxydation des AGCC (Den Besten et al., 2013). L’acétate, quant à lui, alimente principalement

le foie (70 % de l’acétate produit est consommé par le foie). L’acétate est un substrat de la synthèse du

cholestérol et des acides gras à chaîne longue et un co-substrat de la synthèse de la glutamine et du

glutamate (Den Besten et al., 2013). Le propionate est utilisé comme substrat de la gluconéogenèse

hépatique (synthèse du glucose) (Den Besten et al., 2013). Des études cliniques ont démontré que

l’administration d’AGCC aide au traitement de la colite ulcéreuse, de la maladie de Crohn et de la diarrhée

associée aux antibiotiques (Den Besten et al., 2013).

46

Figure 1-5 : Voies métaboliques de production de l’acétate, du propionate et du butyrate (Den Besten et al.,

2013). Les carbohydrates sont hydrolysés en monosaccharides qui eux-mêmes sont convertis en

phosphoénolpyruvate (PEP) par la voie d’Embden-Meyerhof-Parnas (glycolyse) ou par la voie des pentoses

phosphates. Le PEP est converti à son tour en acides organiques ou en alcools. L’acétate est produit soit par

hydrolyse d’Acétyl-CoA, soit par la voie de Wood-Ljungdahl à partir de CO2. Le propionate est produit soit par

réduction du lactate en propionate (voie de l’acrylate), soit par décarboxylation du succinate (voie du

succinate). Le butyrate est formé par condensation de deux molécules d’Acétyl-CoA.

47

Le microbiote de la volaille est très semblable à celui des mammifères, aussi bien au niveau taxonomique que

fonctionnel (Oakley et al., 2014; Waite & Taylor, 2014). Les Firmicutes (phylum) dominent la totalité de

l’appareil digestif de l’oiseau (Figure 1-6) (Yeoman et al., 2012). Le jabot comprend 109 cellules bactériennes

par gramme, appartenant principalement au genre Lactobacillus (Oakley et al., 2014). Lactobacillus est

également majoritaire dans le proventricule et le gésier. La densité microbienne dans le proventricule et le

gésier est relativement faible (108/g) en raison de la présence inhibitrice de sucs gastriques composés entre

autres de pepsine, une protéase, et d’acide hydrochlorique (Oakley et al., 2014). Le petit intestin est colonisé

par un plus grand nombre d’espèces bactériennes (109-1011/g), principalement Lactobacillus, Enterococcus et

Clostridium (Oakley et al., 2014). Enfin, le caecum abrite le microbiote le plus riche et divers du système GIT

(plus de 1011 cellules bactériennes/g) avec les Firmicutes, Bacteroidetes et Proteobacteria comme phyla

dominants (Figure 1-7). Le caecum a le plus long temps de rétention du digesta (12-20h). C’est le principal site

de fermentation des sucres (Oakley et al., 2014). Le tractus gastro-intestinal du poussin ne peut être colonisé

à la naissance par des bactéries provenant de sa mère, contrairement à ce que l’on observe chez l’homme,

puisque son œuf éclot dans un couvoir à distance des volailles adultes. Les bactéries se trouvant dans son

environnement (litière) servent généralement d’inoculum (Oakley et al., 2014).

48

Figure 1-6 : Tractus gastro-intestinal de la volaille et son microbiote (Yeoman et al., 2012).

49

Figure 1-7 : Proportions des différents phyla (a) et familles (b) composant le microbiote caecal de la volaille

(Oakley et al., 2014).

50

1.5. Les modèles de fermentation in vitro simulant le

microbiote intestinal

Pour étudier le comportement du microbiote intestinal, différents systèmes sont offerts. Il y a les modèles

cellulaires épithéliaux intestinaux in vitro, les expérimentations in vivo sur l’homme ou l’animal ou encore les

systèmes de fermentation in vitro. Ces derniers ont l’avantage de ne pas être avoir de contraintes éthiques,

contrairement à l’étude in vivo (Payne et al., 2012). Le système de fermentation peut être en batch ou en

continu, en continu à un seul chemostat simulant le côlon proximal ou à plusieurs chemostats simulant les

différentes parties du côlon (proximal, transverse et distal), à cellules bactériennes libres ou immobilisées

(provenant d’un échantillon fécal).

Le modèle de fermentation en batch n’est composé que d’un seul chemostat fermé contenant un milieu de

culture et un microbiote provenant d’un échantillon fécal, le tout en anaérobie, sans contrôle de pH. Suite au

remplissage premier du bioréacteur, il n’y a pas d’apport supplémentaire de nutriments, ni d’évacuation du

milieu usé. Ce système a comme avantages d’être facile à mettre en place et bon marché. En revanche, la

fermentation ne peut être que de quelques heures, la croissance bactérienne s’arrête due à l’épuisement des

nutriments et à l’accumulation de produits toxiques (Figure 1-8) (Payne et al., 2012).

Un modèle de fermentation en continu peut être composé d’un ou de trois chemostats reliés en série simulant

les trois parties du côlon. C’est un système ouvert avec entrée continue de milieu de culture propre dans le

chemostat et élimination continue des déchets. Les différents paramètres (pH, température, temps de

rétention, anaérobiose et débit) sont contrôlés (Figure 1-8) (Payne et al., 2012). L’inoculum fécal peut être

introduit sous forme liquide dans le bioréacteur. Les cellules bactériennes se trouvent alors libres dans le

milieu, mais également sujettes au lavage. Les bactéries les moins compétitives sont évacuées du bioréacteur

avant d’avoir eu le temps de se multiplier. Ceci limite la durée de la fermentation à moins de 4 semaines

(Payne et al., 2012). Pour éviter le lavage de l’inoculum bactérien, la solution fécale peut être encapsulée dans

des billes de gommes, on parle d’immobilisation. Les bactéries colonisent la bille, principalement à sa

périphérie, là où la nourriture est le plus accessible. Il y a relargage spontané de cellules dans le milieu

lorsque la densité cellulaire devient suffisamment importante à la surface de la bille (Figure 1-8).

L’immobilisation permet de préserver la diversité microbienne présente dans les fèces, d’éviter la perte par

lavage de certaines espèces bactériennes lors de fermentations à long terme, de réduire la contamination et

l’attaque phagique et de protéger les cellules du stress mécanique causé par l’agitateur du bioréacteur

(Cinquin et al., 2004). Elle permet également une inoculation continue et uniforme du milieu de culture

(Cinquin et al., 2004). Une fermentation avec cellules immobilisées peut alors durer jusqu’à 2 mois et demi

51

(Payne et al., 2012). Les exemples d’application de ce système de fermentation en continu sont nombreux.

Cinquin et al. ont été les premiers à simuler le microbiote colique, en l’occurrence celui de l’enfant, par un

modèle de fermentation continue à un seul chemostat avec cellules immobilisées dans des billes de gomme

(xanthane et gellane). En faisant varier les taux de dilution et le pH, ils ont pu représenter successivement

dans le même chemostat la partie proximale, transverse et distale du côlon. Ils ont réussi à maintenir stable

sur 7,5 semaines dans le bioréacteur un microbiote riche et diversifié reproduisant fidèlement celui de fèces

d’enfant (Cinquin et al., 2004). Cinquin et al. ont mis au point quelques années plus tard un système de

fermentation en continu à trois chemostats simulant le côlon de l’enfant. Les trois chemostats ont été reliés en

série, le premier simulant le côlon proximal et contenant les billes de gomme, le second le côlon transverse et

le dernier le côlon distal (Figure 1-8). Ils ont testé également l’effet d’un fructo-oligosaccharide, un prébiotique,

sur le microbiote intestinal (Cinquin, Le Blay, Fliss, & Lacroix, 2006). Cleusix et al. ont évalué l’impact d’une

souche probiotique Lactobacillus reuteri ATCC 55730 et de son composé antimicrobien, la reuterine, sur le

microbiote intestinal, ainsi que sa production in situ de reuterine en présence de glycérol, dans un système de

fermentation en continu simulant le côlon proximal adulte avec cellules immobilisées (Cleusix, Lacroix,

Vollenweider, & Le Blay, 2008). Le Blay et al. ont testé l’effet de deux concentrations d’amoxicilline sur la

composition et le métabolisme du microbiote intestinal de l’enfant, ainsi que sur Salmonella typhimurium, par

un modèle de fermentation continue colique à un seul chemostat. Ils ont simulé une infection stable à S.

typhimurium grâce à l’immobilisation du pathogène, en plus de l’immobilisation du microbiote fécal de l’enfant

(Le Blay, Rytka, Zihler, & Lacroix, 2009). Zihler et al. ont mis en place un système de fermentation en continu

avec cellules immobilisées à trois chemostats, simulant les trois parties du côlon, pour étudier l’impact de deux

souches probiotiques bactériocinogéniques E. coli L1000 et B. thermophilum RBL67 sur la croissance de

Salmonella typhimurium et sur la composition et l’activité métabolique du microbiote intestinal de l’enfant. Ils

ont stimulé B. thermophilum RBL67 en ajoutant de l’inuline, un prébiotique (Zihler et al., 2010). Le Blay et al.

ont utilisé un système de fermentation en continu à un seul chemostat avec cellules immobilisées pour simuler

quant à eux l’iléon terminal et évaluer l’efficacité inhibitrice de la pédiocine PA-1 en conditions iléaques contre

Listeria ivanovii (Le Blay et al., 2012). Fernandez et al. ont simulé également l’iléon terminal par une

fermentation en continu de 32 jours avec cellules immobilisées dans le but d’étudier la survie de Pediococcus

acidilactici, son activité métabolique et son impact sur Listeria monocytogenes, en conditions iléaques

(Fernandez, Savard, & Fliss).

Les fermentations continues en bioréacteurs ont comme principale limite de ne pas simuler les fonctions

digestives de l’hôte. Les systèmes digestifs artificiels suppléent partiellement au problème. Le TIM-1, par

exemple, simule les fonctions digestives de l’estomac et de l’intestin grêle telles que la sécrétion biliaire et les

mouvements péristaltiques, tandis que le TIM-2 simule celles du côlon proximal telles que l’absorption d’eau et

52

de métabolites (Payne et al., 2012). Le TIM-1 et le TIM-2 peuvent être couplés et former un système digestif

artificiel complet. Néanmoins, il reste que les réponses immunitaires et neuroendocriniennes ne sont pas

représentées (Payne et al., 2012).

Les ratios des populations bactériennes dans le système de fermentation diffèrent parfois de ce qui est

observé in vivo. Cependant, le principal objectif de ce modèle de fermentation in vitro n’est pas de reproduire

les ratios bactériens tels qu’ils sont in vivo, mais bien de cultiver dans un environnement contrôlé un

microbiote intestinal complexe et de le maintenir stable dans le temps à une fin expérimentale (Payne et al.,

2012).

53

Figure 1-8 : Schéma et caractéristiques d’un système de fermentation colique in vitro en batch, en continu

avec cellules libres et en continu avec cellules immobilisées. (a) Bille de gomme (xanthane et gellane)

immobilisant un microbiote fécal. (b) Photographie prise par microscopie électronique des bactéries

intestinales colonisant la périphérie de la bille (Payne et al., 2012).

54

1.6. Travaux antérieurs et problématique

1.6.1. Travaux antérieurs en lien avec ce projet

Les études portant sur la structure, la biosynthèse, les mécanismes d’import et d’export et les modes d’action

de la MccJ25 sont relativement nombreuses (voir 1.3.2.7.3). Les travaux ayant évalué son activité

antimicrobienne in vitro et in vivo se font plus rares. Sable et al. ont démontré que la MccJ25 est fortement

active contre 12 souches différentes de E. coli pathogènes, dont O157:H7 (Sable et al., 2000). En 2007,

Lopez et al. ont inoculé Salmonella newport à des souris et ont réussi in vivo à réduire significativement les

comptes du pathogène suite à un traitement intra-péritonéal à la MccJ25 (Lopez et al., 2007). Ils ont démontré

également ex vivo la stabilité et l’efficacité anti-infectieuse de la MccJ25 dans le sang humain, le plasma et le

sérum. De plus, ils n'ont observé aucune activité hémolytique de la bactériocine. Ils ont enfin démontré qu’une

concentration de 0,1 μM de MccJ25 est plus active dans le sang humain et le sérum que 1 et 130 μM

d’ampicilline. L’activité inhibitrice de la MccJ25 au niveau digestif n’a jamais été étudiée. De plus, son impact

sur le microbiote intestinal n’a jamais été évalué jusqu’à présent.

1.6.2. Hypothèse de recherche

Il est posé comme hypothèse que la MccJ25, compte tenu de sa structure particulière en lasso et de son

spectre d’activité restreint, serait stable dans la partie proximale du côlon et exercerait un effet inhibiteur sur

Salmonella enteritidis en milieu colique sans pour autant affecter l'équilibre du microbiote.

1.6.3. Objectif général

L’objectif général de ce mémoire est d’étudier, à l’aide d’un modèle in vitro, la stabilité et l’activité biologique

de la MccJ25 au niveau digestif. Il vise également à évaluer l’impact de la MccJ25 sur l’équilibre du microbiote

intestinal et sur Salmonella enteritidis dans les conditions physiologiques du côlon.

1.6.4. Objectifs spécifiques

Objectif 1 : Produire et purifier la MccJ25 à partir d’une culture de la souche recombinante E. coli K-12

MC4100 pTUC202.

55

Objectif 2 : Etudier la stabilité et l’activité inhibitrice, contre Salmonella enteritidis, de la MccJ25 dans les

conditions physiologiques du tube digestif.

Objectif 3 : Evaluer l’impact de la MccJ25 sur l’équilibre et l’activité métabolique du microbiote colique à l’aide

d’un système de fermentation en continu avec cellules immobilisées simulant la partie proximale du côlon

humain adulte.

57

Chapitre 2 : Production, purification et étude de

l’activité biologique de la microcine J25

Emilie Reinberg, Sabrine Naïmi, Benoît Fernandez, Riadh Hammami and Ismaïl Fliss

Institut sur la Nutrition et les Aliments Fonctionnels (INAF), Université Laval, Québec, Québec, Canada

58

2.1. Résumé

La microcine J25 (MccJ25) est une bactériocine de 2,1 kDa ayant une structure particulière en lasso,

synthétisée par Escherichia coli. Elle possède un spectre d’activité restreint dirigé contre Salmonella et est

active à des concentrations nanomolaires. Ce travail avait pour but de produire et de purifier la MccJ25, ainsi

que d’évaluer in vitro en milieu Luria-Bertani son activité antimicrobienne contre Salmonella enteritidis. La

souche productrice E. coli K-12 MC4100 pTUC202 a été cultivée dans un milieu minimal M63 à 37°C. La

culture obtenue a été centrifugée et la MccJ25 a été purifiée du surnageant de culture par chromatographie de

phase inverse (colonne Sep-Pak C18 et RP-HPLC préparative), avant d’être lyophilisée. La concentration

protéique a été déterminée par la méthode de Lowry et par HPLC. L’activité biologique de la MccJ25 contre S.

enteritidis a été évaluée par des tests d’activité antibactérienne par diffusion en gélose et par microtitration. À

partir d’1,5 L de surnageant d’une culture de E. coli K-12 MC4100 pTUC202, une quantité de 13,6 mL de

MccJ25 pure a été obtenue à une concentration de 3,32 mg/mL pour une production totale de 45,16 mg de

MccJ25. L’activité inhibitrice spécifique contre S. enteritidis a augmenté considérablement, de 16384 à

1048576 AU/mL, au cours de la purification. La concentration minimale inhibitrice de la MccJ25 pour S.

enteritidis a été évaluée à 0,02 μM.

59

2.2. Abstract

Microcin J25 (MccJ25) is a lasso-shaped bacteriocin of 2.1 kDa synthesized by Escherichia coli. It has a

narrow spectrum of antimicrobial activity against Salmonella at nanomolar concentrations. The aim of this work

was to produce, to purify MccJ25 and to evaluate in vitro its inhibitory activity in Luria-Bertani broth against

Salmonella enteritidis. The producing strain E. coli K-12 MC4100 pTUC202 was grown in M63 minimal

medium at 37°C. Grown culture was centrifuged and MccJ25 was extracted from the culture supernatant by

reverse-phase chromatography (Sep-Pak C18 cartridge and preparative RP-HPLC) before being lyophilized.

Protein concentration was determined by the Lowry method and HPLC. MccJ25 biological activity against S.

enteritidis was evaluated using the agar well-diffusion assay and microtitration method. From 1.5 L of E. coli K-

12 MC4100 pTUC202 culture supernatant, a volume of 13.6 mL of pure MccJ25 was obtained with a

concentration of 3.32 mg/mL for a MccJ25 total production of 45.16 mg. The specific inhibitory activity against

S. enteritidis increased significantly from 16384 to 1048576 AU/mL during purification. Minimal inhibitory

concentration of MccJ25 for S. enteritidis was estimated at 0.02 μM.

60

2.3. Introduction

Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par des bactéries, synthétisés pour la plupart par

voie ribosomique et actifs à des concentrations nanomolaires (Nes, 2011). Les bactéries productrices

possèdent un système immunitaire les protégeant de leur propre production (Rea, Ross, et al., 2011). La

plupart des bactériocines sont stables à hautes températures et résistantes aux pH extrêmes (Duquesne et al.,

2007). Elles forment une famille hétérogène en terme de structure, masse moléculaire, machinerie d’export,

modes d’action, cibles microbiennes et cellulaires et immunité de la souche productrice (Hammami et al.,

2013).

La microcine J25 (MccJ25) est une bactériocine faisant partie de la classe I des microcines produite par

Escherichia coli, une bactérie à Gram-négatif. Elle possède un spectre d’activité restreint et cible

particulièrement Salmonella, Shigella et E. coli (BACTIBASE) avec une concentration minimale inhibitrice

(CMI) de 0,02 à 0,05 μM (Duquesne et al., 2007). Le précurseur de la MccJ25 est constitué de 58 acides

aminés ; 37 acides aminés composent le peptide-leader, clivé avant export, et 21 acides aminés composent la

MccJ25 mature. Sa masse moléculaire est de 2,1 kDa (Duquesne et al., 2007). Les gènes associés à la

MccJ25 sont plasmidiques et sont au nombre de quatre. Ils sont organisés en deux opérons transcrits en sens

contraire. Le gène mcjA code le précurseur de la MccJ25, les gènes mcjB et mcjC codent des enzymes

impliquées dans la maturation de McjA, tandis que mcjD code un transporteur ABC permettant la sécrétion de

la MccJ25 mature (Duquesne et al., 2007). Le transporteur ABC McjD, en exportant la MccJ25 hors de la

cellule, est également impliqué dans la défense immunitaire de la bactérie productrice puisqu’ainsi il empêche

une accumulation intracellulaire de la protéine antimicrobienne (Severinov et al., 2011). L’expression des

gènes de la MccJ25 est induite lorsque la bactérie subit un stress environnemental et entre en phase

stationnaire (Vincent & Morero, 2009). La MccJ25 de 21 résidus a une structure tridimensionnelle en lasso. La

liaison peptidique de la Gly1 en N-terminal au Glu8 forme un petit anneau. La « queue » en C-terminal, Tyr9 -

Gly21 (Vincent & Morero, 2009), est retenue à l’intérieur de l’anneau par des interactions non-covalentes et par

l’encombrement stérique créé par les deux acides aminés aromatiques Phe19 et Tyr20 (Duquesne et al., 2007).

La structure en lasso de la MccJ25 lui confère une résistance exceptionnelle aux températures extrêmes ainsi

qu’aux agents dénaturants et protéolytiques (Duquesne et al., 2007). Le principal mécanisme d’action de la

MccJ25 est le blocage de la transcription par obstruction du canal secondaire de l'ARN polymérase.

Néanmoins, la MccJ25 présente des modes d’action alternatifs. Il a été découvert chez S. typhimurium et E.

coli que la MccJ25 cible la chaîne respiratoire (Vincent et al., 2004; Vincent & Morero, 2009). Chez S. newport,

la MccJ25 perméabilise la membrane cytoplasmique provoquant une dissipation du potentiel de membrane

(Rintoul et al., 2001). Les propriétés avantageuses de la MccJ25 en font une protéine antimicrobienne

61

applicable à l’industrie pharmaceutique et alimentaire (Hammami et al., 2015). Elle serait une alternative

intéressante aux antibiotiques.

La MccJ25 est naturellement produite par la souche fécale E. coli AY25. Cette souche possède le plasmide de

type sauvage à faible nombre de copies pTUC100 (60 kb) codant la bactériocine (Salomon & Farias, 1992). La

quantité de MccJ25 produite naturellement par E. coli AY25 pTUC100 est faible. Pour obtenir de plus grandes

quantités de MccJ25 à des fins d’application, la MccJ25 est produite à partir d’une souche de E. coli K-12

MC4100 (F- araD139 Δ(argF-lac)205 λ- flbB5301 ptsF25 relA1 rpsL150 deoC1) possédant le plasmide

pTUC202, un plasmide recombinant à grand nombre de copies dérivé du plasmide pTUC100 (Solbiati,

Ciaccio, Farias, & Salomon, 1996; Blond et al., 1999). La souche productrice est inoculée dans un milieu

minimum, le M9 ou le M63. Après croissance de la souche et centrifugation, le surnageant de culture subit

plusieurs chromatographies pour purifier le peptide. Blond et al. font référence en matière de production et de

purification de la MccJ25 (Blond et al., 1999). Ils appliquèrent le surnageant de culture à une colonne

préparative C8, puis éluèrent la MccJ25 avec un mélange de méthanol et d’eau (80:20). L’éluat fut ensuite

purifié par chromatographie liquide haute performance en phase inverse sur une colonne semi-préparative

C18 avec comme éluant un mélange eau et méthanol/0,05 % CF3COOH (61:39).

L’objectif premier de ce travail était de produire et de purifier en grandes quantités la MccJ25 en vue de son

utilisation in vitro dans un modèle de fermentation colique avec cellules immobilisées. Le second objectif était

d’évaluer son activité biologique antibactérienne contre Salmonella enteritidis.

2.4. Matériel et méthodes

2.4.1. Souches bactériennes et conditions de croissance

La MccJ25 a été produite par la souche E. coli K-12 MC4100 possédant le plasmide pTUC202 (Laboratoire de

chimie et de biochimie des substances naturelles, Museum national d’histoire naturelle, Paris, France) portant

le système génétique de biosynthèse du peptide antimicrobien et conférant une résistance au chloramphénicol

(Cm). La souche a été cultivée dans un bouillon de culture Luria-Bertani (LB Broth, Miller (Luria-Bertani); BD

Difco, Sparks, MD, USA) contenant 34 μg/mL de chloramphenicol incubé à 37°C en aérobie avec repiquage

aux 24 h. Salmonella enterica subsp. enterica enteritidis (Museum National d’Histoire Naturelle, Paris) a été

utilisée comme souche sensible à la MccJ25 lors des tests d’activité antibactérienne. Salmonella a été cultivée

dans un bouillon de culture Luria-Bertani (Difco) sans Cm incubé à 37°C en aérobie avec repiquage aux 24 h.

Les souches ont été préalablement repiquées 3 fois (1 %, v/v) avant leur utilisation.

62

2.4.2. Production de la MccJ25

La souche E. coli K-12 MC4100 pTUC202, cultivée préalablement dans du milieu LB, a servi à inoculer à 2 %

1,5 L de milieu M63. Le milieu M63 (Miller, 1972) est un milieu minimum composé de KH2PO4 ((3 g/L),

K2HPO4 (3 g/L), (NH4)2PO4 (2 g/L), acides casaminiques (1g/L), solution de MgSO4 filtrée (20 %), solution de

glucose filtrée (20 %), solution de thiamine filtrée (1 g/L). La culture a été incubée une nuit à 37°C sous une

agitation de 150 rpm. La culture a été ensuite centrifugée à 8 000 g pendant 20 minutes à 4°C. Le surnageant

contenant la MccJ25 a été récupéré.

2.4.3. Purification de la MccJ25

La MccJ25 a été extraite du surnageant de la culture en M63 de E. coli MC4100 pTUC 202 selon la méthode

de Blond et al. du Laboratoire de chimie et de biochimie des substances naturelles du Museum national

d’histoire naturelle de Paris (Blond et al., 1999). Brièvement, le surnageant a été appliqué à une cartouche de

phase inverse C18 (Sep-Pak C18 35 cc, Waters) auparavant conditionnée avec 200 mL de méthanol, 200 mL

d’acétonitrile pure (ACN) et enfin 200 mL d’H2O ultra-pure additionnée de 0,1 % d’acide formique (CH2O2).

Après chargement du surnageant, la cartouche a été rincée avec 200 mL d’H2O/0,1 % CH2O2, puis l’élution de

la MccJ25 a été réalisée en faisant varier de 10 % à 40 % la teneur en ACN de la phase mobile (H20/0,1 %

CH2O2/ACN). Les éluats ont été récupérés. La colonne a été lavée à l’ACN pure (100 %). L’ACN de l’éluat à

30 % d’ACN, celui contenant la MccJ25 (fraction active), a été évaporé en utilisant un évaporateur rotatif sous

vide à 120 rpm dont le bain était réglé à 40°C. La fraction récupérée ne contenant plus d’ACN a été

lyophilisée, puis solubilisée dans de l’eau ultra-pure. Elle a ensuite été analysée de façon préparative par

chromatographie liquide haute performance en phase inverse (RP-HPLC, Beckman Coulter System Gold

Preparative HPLC system) sur une colonne C18, 5 μm, 250 x 4,6 mm (Luna, Phenomenex) avec comme

éluant un mélange filtré d’eau ultra-pure/0,1 % CH2O2 et d’ACN/0,1 % CH2O2, un débit de 10 mL/min et une

absorbance mesurée à 214 nm. La fraction correspondant au pic de la MccJ25 identifié par comparaison avec

le chromatogramme du peptide pur (pic à 47,69 % d’ACN, Amp : 1,8 AU, 18 minutes) a été récupérée. Elle a

subi une seconde étape de purification par RP-HPLC, puis l’échantillon a été lyophilisé, solubilisé dans de

l’eau ultra-pure et enfin stocké à -20°C.

2.4.4. Détermination de la concentration protéique

À chaque étape de purification, la concentration de MccJ25 de l’échantillon a été déterminée par la méthode

de Lowry (Lowry, Rosebrough, Farr, & Randall, 1951). La MccJ25 a également été quantifiée par

63

chromatographie liquide haute performance de façon analytique (Agilent HP 1100 HPLC system). Il a fallu

préalablement établir une courbe standard de la MccJ25 par HPLC. Des quantités connues de MccJ25, 100

μg, 50 μg, 20 μg, 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,1 μg, 0,05 μg et 0,025 μg, ont été injectées à

l’HPLC, puis lues à une absorbance de 280 nm et de 230 nm. Le gradient a été mis au point comme suit : 0 %

solvant B, 100 % solvant A à 50 % solvant A et 50 % solvant B avec un débit de 1mL/min, le solvant B étant

de l’eau ultra-pure/0,1 % CH2O2 et le solvant B de l’ACN/0,1 % CH2O2. L’aire du pic pour chaque quantité de

MccJ25 a été calculée par intégration. Ceci a permis de tracer la courbe étalon de l’aire des pics en fonction

des quantités de MccJ25. Une fois la courbe standard obtenue, les échantillons en sortie des différentes

étapes de purification de la MccJ25 ont été injectés à leur tour dans l’HPLC. Le gradient utilisé fut le même

que celui utilisé pour l’obtention de la courbe standard. L’aire de chaque pic de MccJ25 a été relevée. En se

servant de l’équation de la courbe standard qui est une relation y = ax + b, il a ainsi été possible de quantifier

la MccJ25 produite et purifiée.

2.4.5. Évaluation de l’activité antimicrobienne

À chaque étape de purification, l’activité antimicrobienne de l’échantillon, auparavant filtré avec un filtre à

seringue en acétate de cellulose ayant un seuil de rétention de 0,2 μm (VWR, Mississauga, ON, Canada), a

été testée par deux méthodes : la méthode par diffusion en gélose (Wolf & Gibbons, 1996) et la méthode par

microtitration (Daba, Lacroix, Huang, Simard, & Lemieux, 1994).

2.4.5.1. Méthode de diffusion en gélose

Brièvement, la température d’un milieu LB supplémenté de 0,75 % (w/v) d’agar a été abaissée à 47°C, puis la

gélose a été inoculée à 1 % (v/v) d’une culture overnight de la souche cible, Salmonella enteritidis, et coulée

(25 mL) à température pièce dans une boîte de Pétri stérile. Une fois la gélose solidifiée, des puits de 7 mm de

diamètre ont été creusés dans la gélose avec la partie non-effilée d’une pipette sérologique de 5 mL en verre.

Les puits ont été remplis de 80 μL de l’échantillon à tester, puis les boîtes de Pétri ont été incubées 18 h à

37°C en aérobie. Le lendemain, les diamètres d’inhibition ont été mesurés.

2.4.5.2. Méthode de microtitration

Une dilution au demi en série d’une concentration connue de l’échantillon à tester a été réalisée dans les puits

d’une microplaque en polystyrène de 96 puits (Becton, Dickinson & Company, USA) contenant un milieu de

culture LB. Chaque puits a été inoculé d’une culture overnight de Salmonella enteritidis diluée à 1/1000 pour

64

obtenir une concentration de 5.104 UFC/mL. La microplaque a été incubée 18 h à 37°C en aérobie, puis la

densité optique a été mesurée à 595nm avec un spectrophotomètre (Molecular Devices ThermoMax

Microplate Reader, OPTI-Resources, Québec, QC, Canada). En connaissant la concentration initiale de

l’échantillon testé (celle du premier puits avant dilutions), il a été possible de déterminer la Concentration

Minimale Inhibitrice (CMI) correspondant à la plus faible concentration de bactériocine pour laquelle une

inhibition totale de la souche cible est observée (son absorbance est semblable à celle d’un milieu non-

inoculé). L’activité en AU/mL a été calculée par la formule 2n(1000/125) où 2 est le facteur de dilution, n le

nombre de puits d’inhibition (où aucune croissance visible) et 125 le volume en μl de substance testée.

2.5. Résultats et discussion

Les différents éluats en sortie de colonne Sep-Pak C18 ont été soumis à des tests d’activité par diffusion en

gélose et par microtitration de manière à identifier la fraction contenant la MccJ25. Les résultats sont

présentés à la Table 2-1. Il a été observé que l’éluat à 30 % d’ACN constitue la fraction la plus active et donc

celle contenant la MccJ25. Ce résultat est cohérent avec celui obtenu par Destoumieux-Garzon et al.

(Destoumieux-Garzon et al., 2005).

Les résultats des tests d’activité antibactérienne effectués tout au long de processus de purification de la

MccJ25 sont présentés à la Table 2-2 et à la Figure 2-1. L’activité inhibitrice a augmenté considérablement, de

16384 à 1048576 AU/mL, au cours de la purification puisque le produit final est plus pur. Suite à la dernière

lyophilisation, nous avons obtenu une concentration de 5,9122 mg/mL de MccJ25 (par la méthode de Lowry),

équivalant à 2805 μM. Cette concentration du peptide a servi dans les tests d’activité par microtitration. Nous

avions ainsi une concentration de MccJ25 de 1402,5 μM dans le premier puits de la microplaque avant

dilutions de la substance antimicrobienne. Sachant cela, nous avons pu déterminer la CMI de la MccJ25. La

CMI de la MccJ25 a été évaluée en milieu LB à 0,02 μM pour Salmonella enteritidis, ce qui est proche de la

CMI obtenue par Destoumieux-Garzon et al. de 0,04 μM de MccJ25 également pour S. enteritidis, en milieu

pauvre (1 % de bactotryptone et 0,5 % de NaCl) quant à eux (Destoumieux-Garzon et al., 2005). Les CMI sont

dans une certaine mesure variables d’une étude à l’autre car la MccJ25 obtenue peut ne pas être totalement

pure, tout comme il peut y avoir des erreurs de quantification du peptide avant les tests d’activité

antimicrobienne (Duquesne et al., 2007). Les protocoles expérimentaux diffèrent toujours d’une étude à

l’autre, d’où la variabilité de résultat.

À partir de 1,5 L de surnageant de la souche productrice, un volume de 13,6 mL de MccJ25 pure a été obtenu.

Les étapes de purification de la MccJ25 ont permis d’augmenter la concentration protéique de 0,1598 à

65

3,3203 mg/mL. La concentration totale de MccJ25 obtenue pour 1,5 L de milieu de culture a donc été de 45,16

mg. Les résultats sont présentés à la Table 2-3.

Les quantifications de la MccJ25 par la méthode de Lowry réalisées au cours de ce travail ne sont

probablement pas optimales. En effet, dans la méthode de Lowry, des ions de cuivre se complexent avec les

atomes d’azote des liaisons peptidiques de la protéine à quantifier. Le complexe formé présente une couleur

bleue quantifiable au spectrophotomètre. La composition en acides aminés de la protéine à quantifier influe

directement sur la coloration finale observable, or pour réaliser la courbe étalon, nous avons utilisé l’albumine

de sérum bovin qui possède 583 acides aminés, alors que la MccJ25 ne possède que 21 acides aminés, ce

qui a probablement dû amener de l’erreur. Il aurait fallu utiliser pour le standard une protéine d’une structure

plus semblable à la bactériocine.

66

Diffusion en gélose Microtitration

Échantillon Diamètre d’inhibition (cm) Nb de puits d’inhibition AU/mL

Surnageant avant Sep-Pak 1,85 11 16384

Surnageant après Sep-Pak 0 0 8

0 % ACN 0 0 8

10 % ACN 0 1 16

20 % ACN 0,9 2 32

30 % ACN 2,15 15 262144

40 % ACN 1,2 4 128

100 % ACN 0 1 16

Table 2-1 : Activité antimicrobienne contre Salmonella enteritidis en milieu LB des différentes fractions en

sortie de colonne Sep-Pak C18.

67

Diffusion en gélose Microtitration

Échantillon Diamètre d’inhibition (cm) Nb de puits d’inhibition Activité inhibitrice

(AU/mL)

Témoin négatif 0 0 0

Témoin positif 1,4 10 8192

Surnageant après centrifugation 1,6 11 16384

Fraction 20 % ACN après Sep-Pak et évaporateur

0 1 16

Fraction 30 % ACN après Sep-Pak et évaporateur

2,1 14 131072

Fraction 40 % ACN après Sep-Pak et évaporateur

1,4 6 512

Fraction (30 %) après 1ère lyophilisation

1,9 16 524288

Fraction (30 %) après RP-HPLC

2 17 1048576

Table 2-2 : Activité antimicrobienne contre Salmonella enteritidis de la MccJ25 au cours des différentes étapes

de purification de la bactériocine.

68

Figure 2-1 : Résultats des tests d’activité contre Salmonella enteritidis par diffusion en gélose des différentes

étapes de purification de la bactériocine. a : témoin positif, b : fraction 20 % ACN après Sep-Pak et

évaporateur, c : témoin négatif, d : surnageant après centrifugation, e : témoin positif, f : fraction 40 % ACN

après Sep-Pak et évaporateur, g : fraction (30 %) après 1ère lyophilisation, h : témoin négatif, i : fraction 30 %

ACN après Sep-Pak et évaporateur, j : fraction 30 % après RP-HPLC.

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

69

Échantillon Volume

(mL) [Protéine] (mg/mL)

Protéine totale (mg)

Activité inhibitrice (AU/mL)

Activité spécifique (AU/mg)

Coefficient de

purification

Surnageant après centrifugation

1500 0,16 239,69 16384 102533 1,0

Fraction après Sep-Pak et évaporateur

117,8 0,42 49,33 131072 313007 3,1

Fraction après RP-HPLC

13,6 3,32 45,16 1048576 315811 3,1

Table 2-3 : Résultats d’une production de MccJ25 à partir d’une culture d’1,5 L de la souche productrice. Les

concentrations sont celles obtenues par la méthode de Lowry.

70

Figure 2-2 : Chromatogrammes par HPLC analytique des différentes étapes de purification de la bactériocine.

L’évolution de la purification du peptide est bien visible, les impuretés disparaissent au fil de la purification. A)

chromatogramme du surnageant de culture de la souche productrice, B) chromatogramme de la fraction à 30

% d’ACN en sortie de Sep-Pak, C) chromatogramme de l’échantillon en sortie d’HPLC préparative. En (C),

nous observons que l’échantillon est pur et ne contient plus que la bactériocine d’intérêt.

71

2.6. Conclusion

À partir d’1,5 L de surnageant d’une culture de E. coli K-12 MC4100 pTUC202, une quantité de 13,6 mL de

MccJ25 pure a été obtenue à une concentration de 3,32 mg/mL. La concentration finale totale de la production

fut ainsi de 45,16 mg de MccJ25. L’éluat en sortie de colonne Sep-Pak C18 composé de 30 % d’ACN a été

identifié comme celui contenant le peptide actif. L’activité inhibitrice contre Salmonella enteritidis a augmenté

considérablement, de 16384 à 1048576 AU/mL, au cours de la purification. Nous avons évalué à 0,02 μM la

concentration minimale inhibitrice (CMI) de la MccJ25 pour S. enteritidis par des tests d’activité

antibactérienne par microtitration. Produire la MccJ25 en aussi grande quantité avec un haut degré de pureté

nous a permis de réaliser l’étude in vitro ayant pour objectif d’évaluer l’impact de la MccJ25 sur S. enteritidis et

sur le microbiote intestinal.

2.7. Remerciements

Ce travail a été financé par le Conseil de Recherche en Sciences Naturelles et en Génie du Canada (CRSNG)

et le Fonds de recherche du Québec - Nature et Technologies (FQRNT).

73

Chapitre 3 : Étude in vitro de l'impact de la

microcine J25 sur le microbiote colique et sur

Salmonella enteritidis dans un modèle de

fermentation colique

In vitro study of the impact of microcin J25 on

colonic microbiota and Salmonella enteritidis using

a colonic fermentation model

Emilie Reinberg, Sabrine Naïmi, Benoît Fernandez, Riadh Hammami and Ismaïl Fliss

Institute of Nutrition and Functional Foods (INAF), Université Laval, Québec, Québec, Canada

74

3.1. Résumé

La microcine J25 (MccJ25) est une bactériocine de 2,1 kDa en forme de lasso synthétisée par Escherichia coli

et capable d’inhiber Salmonella à une concentration aussi faible que 0,04 μM. Dans le but d’évaluer son

potentiel d’utilisation comme alternative aux antibiotiques, nous avons, lors de ce travail, étudié l’impact de la

MccJ25 sur Salmonella enteritidis et sur le microbiote intestinal dans un système de fermentation en continu

reproduisant les conditions physiologiques et microbiologiques du côlon humain adulte. Le bioréacteur

contenait un microbiote fécal immobilisé dans des billes de gel (xanthane et gellane) et du milieu de

Macfarlane comme milieu de croissance. S. enteritidis et la MccJ25 aux concentrations de 0,4, 2 et 5 μM ont

été ajoutées dans le bioréacteur. Les espèces bactériennes ont été quantifiées par la technique de réaction en

chaîne de la polymérase en temps réel couplée à un traitement au propidium monoazide (PMA-qPCR), ainsi

que par dénombrement sur gélose. La MccJ25 à 0,4, 2 et 5 μM n’a montré aucun effet significatif sur la

composition ni sur l’activité métabolique du microbiote colique. Des tests d’activité contre des cultures pures

des espèces intestinales ont confirmé l’absence d’inhibition, sauf pour Escherichia coli. Les échantillons

prélevés lors de la fermentation ont inhibé S. enteritidis sur gélose LB de façon significative, indiquant que la

MccJ25 ne semble pas interagir négativement avec les composants du milieu de Macfarlane et qu’elle

conserve sa stabilité dans les conditions coliques testées. Bien que la MccJ25 ait démontré une activité

inhibitrice contre S. enteritidis en milieu LB à 0,4, 2 et 5 μM, aucune inhibition de Salmonella n’a été observée

dans le bioréacteur lors de la fermentation aux mêmes concentrations. Il a été observé que la concentration

minimale inhibitrice (CMI) varie selon le milieu de croissance. La CMI a été estimée à 0,04 et à 2 μM en milieu

LB et Macfarlane respectivement, ce qui représente une différence de 50 μM.

75

3.2. Abstract

Microcin J25 (MccJ25), a lasso peptide of mass 2.1 kDa produced by Escherichia coli, can inhibit Salmonella

species at concentrations as low as 0.04 μM. The aim of the present work was to study the impact of MccJ25

on intestinal bacteria and Salmonella enteritidis using a continuous fermentation system simulating the

physiological and microbiological conditions encountered in the human adult colon. Macfarlane broth was fed

to a bioreactor containing fecal bacteria immobilized in gel (gellan and xanthan) beads. S. enteritidis and

MccJ25 at concentrations of 0.4, 2 and 5 μM were added in the reactor. Bacterial species were enumerated

using a propidium-monoazide-coupled quantitative polymerase chain reaction (PMA-qPCR) and a plating

method. MccJ25 had no significant effect on the composition and metabolic activity of the colonic microbiota.

Using pure cultures, this result was confirmed for the principal bacterial species encountered in the gut but not

for Escherichia coli. Samples collected during the fermentation did not lose their S. enteritidis inhibitory activity

on LB agar plates, suggesting that Macfarlane medium does not contain any component which may negatively

interact with MccJ25 and that MccJ25 is stable under colonic conditions. Although MccJ25 at 0.4, 2 and 5 μM

was inhibitory against S. enteritidis in LB broth, it did not inhibit Salmonella in the reactor during the

fermentation at the same concentrations. A variation of the minimal inhibitory concentration (MIC) was

observed across culture media. MIC was estimated at 0.04 and 2 μM in LB and Macfarlane broth respectively,

which represents a 50-fold difference.

76

3.3. Introduction

During the latter half of the twentieth century, antibiotics were used extensively in agriculture as growth

promoters and for livestock disease prevention and treatment (Gustafson & Bowen, 1997; Gyles, 2008).

Massive use of antibiotics in animal husbandry led to the emergence of antibiotic-multiresistant bacteria, which

may infect humans through the food chain (Witte, 1998; Reardon, 2014).

Another adverse side effect of antibiotic use is the disruption of the intestinal microbiota equilibrium (Chambers

& Gong, 2011). Because of their broad spectrum of activity, antibiotics kill both targeted pathogens and

bacteria that are beneficial to the host (Blaser, 2011). The digestive tract of the adult human is colonised by an

estimated 1013 to 1014 microbial cells including more than 1100 bacterial species belonging mostly to the phyla

Firmicutes and Bacteroidetes (Power et al., 2014). Intestinal bacteria provide benefits to the host by converting

indigestible carbohydrates into absorbable nutrients such as short-chain fatty acids and by producing vitamins

(Arumugam et al., 2011). Another important role of a healthy intestinal microbial ecosystem is to provide a

barrier (competitive exclusion) that resists invasion by enteric pathogens (Le Blay et al., 2007; Payne et al.,

2012). In addition, intestinal bacteria are believed to play a role in the development of immunity and in

preventing the development of allergies (Den Besten et al., 2013).

Antibiotic use as growth promoters in livestock was banned in the European Union as of January 1, 2006

(Castanon, 2007). This use is still allowed in Canada, but withdrawal appears imminent. Alternatives to

antibiotics are needed and bacteriocins appear to be the most promising candidates. Bacteriocins are small

heat-stable peptides produced by bacteria and lethal to bacteria closely related to the producing strain. They

differ from antibiotics because they are ribosomally synthesized, have a narrow spectrum of inhibitory activity

and target bacteria at nanomolar concentrations (Nes, 2011).

Bacteriocins produced by Gram-negative bacteria have been studied much less than those obtained from

Gram-positive bacteria. Microcin J25 (MccJ25), a bacteriocin with a molecular mass of 2.1 kDa and a lasso

structure, is produced by Escherichia coli (Duquesne et al., 2007). With a minimal inhibitory concentration

(MIC) in the 0.02-0.05 μM range (Duquesne et al., 2007), its narrow spectrum of antimicrobial activity targets

specifically Salmonella, Shigella and E. coli (BACTIBASE). The structure, biosynthesis and modes of release

and action of MccJ25 are relatively well documented in the literature. However, few studies of its in vivo and in

vitro inhibitory activity are available. It has been demonstrated that MccJ25 at a concentration of 6.25 μg/mL is

strongly active against 12 different strains of diarrheagenic E. coli, among them O157:H7, based on complete

lethality in sterile skim milk, egg yolk and meat extract contaminated with 103 CFU/mL (Sable et al., 2000).

77

Significant decreases in Salmonella newport counts in the spleen and liver of mice treated with MccJ25 and

the stability and antimicrobial activity of this bacteriocin in human whole blood, plasma and serum have also

been reported (Lopez et al., 2007). MccJ25 has been found highly resistant to heat, pH extremes and

proteases (Salomon & Farias, 1992), which distinguishes it from bacteriocins produced by Gram-positive

bacteria (e.g. pediocin PA-1) and makes it a good candidate as an alternative to antibiotics.

We describe here the first known study of the inhibitory activity of MccJ25 against Salmonella enteritidis in a

gastrointestinal environment and its impact on the intestinal microbiota. For this purpose, we used a

continuous fermentation system with immobilized bacteria simulating the microbiota of the adult human colon.

Our hypothesis is that MccJ25, considering its lasso structure, is stable in the proximal portion of the colon and

could inhibit S. enteritidis under colonic conditions without disrupting the microbiota equilibrium.

3.4. Materials and methods

3.4.1. Bacterial strains and growth conditions

MccJ25 was produced by E. coli K-12 MC4100 harboring pTUC202 (Laboratoire de Chimie et de Biochimie

des Substances Naturelles, Museum National d’Histoire Naturelle, Paris, France), a recombinant plasmid

carrying the MccJ25 genetic system and a gene that confers resistance to chloramphenicol (Cm). The strain

was grown routinely under aerobic conditions for 24 h at 37°C in Luria-Bertani (LB) broth (Miller (Luria-

Bertani); BD Difco, Sparks, MD, USA) containing chloramphenicol (34 μg/mL). Salmonella enterica subsp.

enterica enteritidis (Museum National d’Histoire Naturelle, Paris), used as an MccJ25-sensitive model for colon

infection, was grown under aerobic conditions for 24 h at 37°C in LB broth without Cm. Bacteroides

thetaiotaomicron ATCC 29741 and Blautia coccoides DSM 935 were grown routinely for 48 h in an anaerobic

chamber (Forma scientific anaerobic system Model 1025; Forma Scientific, Marietta, OH, USA) in Brain Heart

Infusion (BHI) broth (Difco Laboratories) supplemented with 0.05 % L-cysteine-HCl (Sigma, Oakville, ON,

Canada). Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 and Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 were grown

aerobically for 24 h in De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) broth (Oxoid, Nepean, ON, Canada) supplemented with

0.05 % L-cysteine-HCl. Escherichia coli ATCC 25922 and Enterococcus faecalis ATCC 27275 were grown

routinely for 24 h under aerobic conditions in respectively LB and BHI medium. Clostridium leptum ATCC

29065 was grown under anaerobic conditions for 24-48 h in modified chopped meat medium with 10mM

maltose (ATCC 2751). All of these strains were incubated at 37°C. They were kept frozen at -80°C before

culturing and were sub-cultured at least three times before use.

78

3.4.2. Production and purification of MccJ25

The protocol used to produce and purify the bacteriocin has been described previously (Blond et al., 1999).

Minimal medium M63 (Miller, 1972) composed of KH2PO4 ((3 g/L), K2HPO4 (3 g/L), (NH4)2PO4 (2 g/L),

casamino acids (1g/L), filtered MgSO4 solution (20 %), filtered glucose solution (20 %), filtered thiamine

solution (1 g/L) was inoculated (2 % v/v in 1.5 L) with LB broth culture of E. coli K-12 MC4100 pTUC202.

Overnight culture grown at 37°C with rotary shaking at 150 rpm was centrifuged at 8,000 xg for 20 minutes at

4°C. The culture supernatant containing MccJ25 was loaded into a Sep-Pak C18 35 cc cartridge (Waters),

washed previously with 200 mL methanol, 200 mL pure acetonitrile and 200 mL ultra-pure water/0.1 % formic

acid. MccJ25 was eluted with acetonitrile:water (30:70) containing 0.1 % formic acid. The recovered eluate

containing MccJ25, after a passage through a rotary evaporator to eliminate acetonitrile, was further purified

by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC, Beckman Coulter System Gold

Preparative HPLC system) on a preparative C18 column (5 μm, 250 4.6 mm, Luna, Phenomenex) at a flow

rate of 10 mL/min and measuring absorbance at 214 nm. Elution was performed with a 20-100 % linear

gradient of filtered acetonitrile/0.1 % formic acid. The fraction corresponding to the MccJ25 peak identified by

comparison with the chromatogram of the pure peptide (peak at 47.69 % acetonitrile, Amp : 1.8 AU, 18 min)

was recovered.

3.4.3. Colonic fermentation model

3.4.3.1. Feces collection and immobilization in gel beads

A protocol described previously was used (Fernandez et al.). Briefly, 20 g of fecal sample provided by a

healthy adult who had not taken any antibiotic for at least 3 months prior was suspended in 80 mL of 0.1 %

peptone water (Difco Laboratories) containing 0.05 % L-cysteine-HCl (Sigma) at 37 °C. The suspension was

homogenized for 5 min at 200 rpm using a Stomacher (Seward model 400, Norfolk, UK). The liquid portion

was centrifuged for 1 min at 700 xg to remove large particles, and 20 mL of the supernatant was used to

inoculate at 2 % a gum solution containing gellan (2.5 % w/v), xanthan (0.25 % w/v) and sodium citrate (0.2 %

w/v), according to a method described previously (Cinquin et al., 2004). Gel beads were formed by pouring the

inoculated gum solution into rapidly stirred canola oil in a flask kept on ice and allowing to settle for 5 min

before removing the canola oil. A 0.1 M CaCl2 solution was then added to harden the beads. After agitating for

30 min, the beads were washed with a 0.27 M KCl/0.03 M CaCl2 solution and sieved. Beads of a diameter

between 1 and 2 mm were recovered and transferred to a stirred bioreactor (BIOSTAT® Q plus, Sartorius AG,

79

Goettingen, Germany) containing 250 mL of fresh Macfarlane broth and about 75 g of gel beads. The entire

process, from defecation to loading of the bioreactor, was carried out aseptically within 2 hours.

3.4.3.2. Fermentation medium

Macfarlane medium supplemented with 0.2 g/L MnCl2 was fed to the reactors to simulate normal colon

contents (Macfarlane, Macfarlane, & Gibson, 1998). The medium was autoclaved for 25 min at 121°C before

adding 5 % L-cysteine-HCl (16 mL/L) and a vitamin solution (0.5 mL/L) described by Gibson et Wang (in

mg/L) : pyridoxine-HCl 20, 4-aminobenzoic acid 10, nicotinic acid 10, biotin 4, folic acid 4, cyanocobalamine 1,

thiamine 8, riboflavine 10, menadione 2, phyloquinone 0.005, pantothenate 20 (Gibson & Wang, 1994). L-

cysteine-HCl and vitamin solution were filtered through 0.2 μm cellulose acetate membrane in syringe filters

(VWR, Mississauga, ON, Canada).

3.4.3.3. Fermentation procedures

The fermentation was continuous, anaerobic and carried out under aseptic conditions. Two single-stage

bioreactors (B1 and B2) were fed in parallel to test several concentrations of MccJ25. The fermentation

procedure described first by Cinquin et al. (Cinquin et al., 2004) and more recently by Fernandez et al.

(Fernandez et al.) was followed. Nitrogen and carbon dioxide were bubbled into the culture broth. The pH was

kept at 6.2 by automatic addition of 5 N NaOH, the temperature was controlled at 37°C and the bioreactor

contents were stirred at 100 rpm. To allow bead colonization by the immobilized microbiota, the fermentation

was carried out in the fed-batch mode for the first two days with total replacement of the culture medium every

12 hours. From day 3, sterile Macfarlane medium kept in a stirred feedstock flask on ice was fed continuously

using peristaltic pumps (model 120U, Watson-Marlow, Falmouth, Cornwall, UK) to maintain a flow rate of 0.35

mL/min and a mean retention time of 12 h. The effluent from the fermentation vessels was collected. The

microbiota was considered stable when the standard deviation of the bacterial counts on three consecutive

days was less than 0.5 log. This occurred generally by day 14, at which point the bioreactors were challenged

with Salmonella enteritidis and MccJ25 every four days. After each challenge, samples were collected at 0, 1,

2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 and 72 h for bacterial enumeration and organic acid quantification. The experimental

design is shown in Figure 3-1.

Salmonella enteritidis was added alone on days 15 and 19. Ten mL of 24 h culture (0.3 x 109 CFU/mL) were

centrifuged at 4,000 xg for 10 min and the pellet was re-suspended in 10 mL of 0.1 % peptone water, 8 mL of

which were added to each reactor to obtain a concentration of 107 CFU of S. enteritidis per mL of culture broth.

80

Two samples were collected, one before and the other 5 min after adding the pathogen (0 h). On days 23, 27

and 31, MccJ25 was added with S. enteritidis at concentrations of 0.4, 2 and 5 μM, that is, 10, 50 and 125

times the minimal inhibitory concentration (MIC) of MccJ25 for S. enteritidis in LB broth (0.04 μM)

(Destoumieux-Garzon et al., 2005).

81

Figure 3-1 : Design of the colonic fermentation experiment. B1, B2 : bioreactor 1, bioreactor 2; BC : bead

colonization; R1, R2 : repetition 1, repetition 2.

82

3.4.4. Bacterial enumeration by PMA-qPCR

The major bacterial species constituting the intestinal microbiota and S. enteritidis were quantified using

quantitative polymerase chain reaction coupled with propidium monoazide (PMA-qPCR).

3.4.4.1. Treatment with propidium monoazide

Samples collected from the reactors were treated with propidium monoazide (PMA dye, Biotium, Inc.,

Hayward, CA, USA) to distinguish live cells from dead cells during qPCR. The protocol has been described

previously (Fernandez et al.). PMA (1 mg) was dissolved in 91 μl of 20% dimethylsulfoxide to obtain a 20 mM

stock solution, which was kept in the dark at -20°C. A 2.5 μl volume of this solution was added to each 1 mL

sample collected from the reactors to obtain a PMA concentration of 50 μM. Samples were kept for 5 min in

the dark with occasional vortex mixing, then placed for 5 min on ice 20 cm below a 500 W halogen lamp.

Samples were then frozen and kept at -80°C.

3.4.4.2. DNA extraction

DNA was extracted from fermentation samples using the Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega,

Madison, WI, USA). Samples were thawed and centrifuged for 10 min at 12,000 xg and the pellets were

washed twice in Tris-EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) and centrifuged for 5 min at 13,000 xg.

These pellets were re-suspended in 200 μl of Tris-EDTA buffer containing 40 mg/mL of lysozyme (Sigma), 5

μg/mL of proteinase K (Sigma) and 200 U/mL of mutanolysin (Sigma), and the mixtures were incubated for 1 h

at 37°C with vortex mixing every 15 min. The Promega kit instructions were followed hereafter.

3.4.4.3. Real-time PCR analysis

The quantitative polymerase chain reactions were performed in MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction

Plates with Barcode (Life Technologies Inc., Burlington, ON, Canada) on an ABI 7500 Real-Time PCR System

(Applied Biosystems, Streetsville, ON, Canada). Each sample was analyzed in duplicate. Extracted DNA was

diluted 1/10 (v/v) in DNase-free water (Invitrogen) and placed in the microplate wells (5 μl of diluted extract per

well). Each well also contained 12.5 μl of Fast SYBR® Green Master Mix (Applied Biosystems, Burlington, ON,

Canada), 1 μl of each primer (forward and reverse) (Sigma) and 5.5 μl of DNase-free water. The primers used

in this study are shown in Table 3-1. They were prepared to obtain a final concentration of 5 μM, except for

Lactobacillus, in which case they were prepared at 10 μM. An amplification program described previously was

83

used (Fernandez et al.). Standard curves were produced for the intestinal species Bacteroides

thetaiotaomicron ATCC 29741, Blautia coccoides DSM 935, Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703,

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 27275 and

Clostridium leptum ATCC 29065, as well as for the total flora and Salmonella enteritidis, following the protocol

established previously (Fernandez et al.).

84

Bacterial species Gene Primer sequence 5’-3’ Reference

All bacteria 16S F : TCCTACGGGAGGCAGCAGT (Hopkins, Macfarlane, Furrie,

Fite, & Macfarlane, 2005) R : GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT

Bifidobacterium spp.

16S F : TCGCGTC(C/T)GGTGTGAAAG (Rinttila, Kassinen, Malinen,

Krogius, & Palva, 2004) R : CCACATCCAGC(A/G)TCCAC

Escherichia coli 16S F : CATGCCGCGTGTATGAAGAA

(Huijsdens et al., 2002) R : CGGGTAACGTCAATGAGCAAA

Enterococcus spp.

16S F : CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT

(Rinttila et al., 2004) R : ACTCGTTGTACTTCCCATTGT

Lactobacillus spp. 16S F : AGCAGTAGGGAATCTTCCA (Vanhoutte, Huys, Brandt, &

Swings, 2004) R : CATTYCACCGCTACACATG

Clostridium leptum subgroup

16S F : GCACAAGCAGTGGAGT

(Kanno et al., 2009) R : CTTCCTCCGTTTTGTCAA

Blautia coccoides group

16S F : AAATCACGGTACCTGACTAA

(Matsuki et al., 2002) R : CTTTGAGTTCATTCTTGCGAA

Bacteroidetes 16S F : GGTGTCGGCTTAAGTGCCAT

(Rinttila et al., 2004) R : CGGA(C/T)GTAAGGGCCGTGC

Salmonella ttrA F : GTCGCAGGAACACCCGATT (Martin, Raurich, Garriga, &

Aymerich, 2013) R : TTGCTGCCGAAGCTATTTAGC

Table 3-1 : Primers used to quantify intestinal microbiota and Salmonella enteritidis by PMA-qPCR.

85

3.4.5. Bacterial enumeration by plate count

Salmonella enteritidis in the fermentation samples was also quantified on selective CHROMagarTM medium

(CHROMagar, Alere, Ottawa, ON, Canada). Samples were diluted tenfold in 0.1 % peptone water for plating.

Each dilution was analyzed in duplicate. Plates were incubated aerobically for 18 to 24 h at 37°C. Bacterial

counts were expressed as log10 CFU/mL. The detection limit was near 4 log CFU/mL.

3.4.6. Metabolite analyses

Concentrations of acetate, propionate and butyrate were determined using high-performance liquid

chromatography (HPLC) with a Waters chromatograph (Waters Corp., Milford, Massachusetts, USA) equipped

with a differential refractometer detector model L-7490, 600E controller, column oven, and air-cooled 717 Plus

autosampler (Hitachi, Foster City California, USA). An ICSep ION-300 column (Transgenomic, Omaha,

Nebraska, USA) was used with 8.5 mM H2SO4 as the mobile phase at a flow rate of 0.4 mL/min. The sample

injection volume was 25 μl. The column temperature was kept constant at 40°C. Samples collected from the

reactors were centrifuged (10 min, 10,000 xg, 37°C) and the supernatants were kept frozen at -80°C until

analysis. As described previously (Fernandez et al.), defrosted supernatants were diluted 1:5 in the mobile

phase (0.0065 N H2SO4) and filtered through 0.45 μm nylon syringe filters (Silicycle Inc, Quebec, Canada).

The filtrate was collected directly in vials and sealed immediately. Samples were analyzed in triplicate.

Metabolite concentrations were expressed in mmol/L (mM).

3.4.7. Determination of MccJ25 antibacterial activity

An agar-well diffusion assay (Wolf & Gibbons, 1996) and a microtitration assay (Daba et al., 1994) were used

to study the antibacterial activity of MccJ25 at 0.4, 2 and 5 μM in 0.1 % peptone water, sterile Macfarlane

medium or fermented Macfarlane medium taken from the reactors at the end of the stabilization period (day

14) and heated for 10 min at 100°C, as well as the activity of samples taken during the fermentation at 0, 1, 2

and 4 h (after challenge with S. enteritidis and MccJ25) on days 27 (bioreactors 1 and 2) and 31 (bioreactor 2).

3.4.7.1. Agar diffusion assay

LB broth (Difco) containing 0.75 % (w/v) Bacto Agar (Difco) cooled to 47°C and inoculated at 1 % (v/v) with an

overnight culture of S. enteritidis was distributed (25 mL each) to sterile Petri plates. Wells 7 mm in diameter

were cut in the solidified agar using the wide end of a sterilized 5 mL glass serological pipet. Wells were filled

86

with 80 μL of the tested liquid and the plates were incubated aerobically for 18 h at 37°C. The resulting

inhibition zone diameters were measured and expressed in cm. Samples to which MccJ25 was added were

vortex-mixed occasionally during a 10-minute period at room temperature and then centrifuged for 10 min at

10,000 xg. The recovered supernatants were filtered through 0.2 μm cellulose acetate membrane in syringe

filters (VWR, Mississauga, ON, Canada) directly into the agar wells. Fermentation broth samples were treated

the same way without adding MccJ25. The negative controls were 0.1 % peptone water, sterile Macfarlane

medium and fermented Macfarlane medium of day 14.

Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741, Blautia coccoides DSM 935, Bifidobacterium adolescentis ATCC

15703, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC

27275 and Clostridium leptum ATCC 29065 were also used as test organisms. For the media and culture

conditions, see section 3.4.1. L-cysteine-HCl was added at the same time as the target strain (T ≈ 47°C) to

obtain a final concentration of 0.05 %.

3.4.7.2. Microtitration assay

Samples were two-fold serially diluted in LB broth in a 96-well polystyrene microtitration plate (Becton,

Dickinson & Company, USA). Each well was inoculated with an overnight culture of S. enteritidis diluted

1/1000 to obtain a final concentration of 5x104 CFU/mL. The microtitration plate was incubated for 18 h at

37°C under aerobic conditions and absorbance was measured at 595 nm using a spectrophotometer

(Molecular Devices ThermoMax Microplate Reader, OPTI-Resources, Quebec, QC, Canada). Bacteriocin

activity was calculated in arbitrary units (AU) per mL as 2n(1000/125) where 2 is the dilution factor, n is the

number of wells showing inhibition of S. enteritidis (absorbance < 0.1) and 125 is the volume in μl of the tested

liquid.

The microplate titration assay was also used to assess the minimal inhibitory concentration (MIC) of MccJ25

for S. enteritidis in sterile Macfarlane broth. The first well contained the bacteriocin at a concentration of 250

μM. Each well was inoculated with 5.104 CFU/mL of S. enteritidis and the microplate was incubated for 18 h at

37°C under aerobic conditions. After incubation, S. enteritidis was quantified for each well on LB agar plates

as described in 3.4.5. Plates were aerobically incubated for 14 h at 37°C. The procedure was carried out with

LB broth as well.

87

3.4.8. Statistical analysis

Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). Statistical analyses were carried out using

the SAS v9.3 MIXED procedure (SAS Institute, 2003) with time as a repeated factor. Bacterial counts were

converted into log colony-forming units per mL and data were subjected to ANOVA using the SAS GLM

procedure. A probability of P ≤ 0.05 was required for declaration of statistical significance (Tukey’s honestly

significant difference HSD). The HSU-Dunnett test in JMP version 10 for Windows (SAS Institute) was used for

the statistical analysis of short-chain fatty acid concentrations.

3.5. Results

3.5.1. Microbial population analysis during the stabilization period

The fecal bacterial populations at inoculation and at the end of the stabilization period (day 14) as determined

using PMA-qPCR are shown for each bioreactor in Table 3-2. Bioreactor 1 at inoculation contained a

measured total of 10.31 log10 CFU/g of feces with a majority of Bacteroidetes (10.37 log10 CFU/g) and

Firmicutes (Clostridium leptum subgroup = 9.16 log10 CFU/g). Counts of Blautia coccoides and Bifidobacterium

were 8.83 and 8.71 log10 CFU/g respectively, while Enterobacteriaceae, Lactobacillus spp. and Enterococcus

were found at concentrations of 7.27, 6.06 and 5.27 log10 CFU/g respectively. At the end of the stabilization

period (day 14), bioreactor 1 contained a measured total of 10.13 log10 CFU/mL, with Bacteroidetes, Blautia

coccoides, Bifidobacterium, Clostridium leptum subgroup, Enterobacteriaceae, Lactobacillus spp. and

Enterococcus at respectively 9.75, 9.13, 8.74, 8.57, 8.07, 7.2 and 6.97 log10 CFU/mL. In bioreactor 2 at

inoculation, Bacteroidetes and the Clostridium leptum subgroup were dominant at respectively 11 and 9.04

log10 CFU/g, while Blautia coccoides, Bifidobacterium, Enterobacteriaceae, Lactobacillus spp. and

Enterococcus were enumerated at respectively 8.96, 8.41, 6.92, 5.68 and 4.38 log10 CFU/g. The total fecal

bacterial count was 10.36 log10 CFU/g. On day 14, the measured total bacterial population of bioreactor 2 was

9.5 log10 CFU/mL, while Bacteroidetes, Blautia coccoides, Enterobacteriaceae, Clostridium leptum subgroup,

Bifidobacterium, Lactobacillus spp. and Enterococcus counts were respectively 9.93, 8.38, 7.63, 7.31, 6.78,

6.64 and 5.93 log10 CFU/mL. Bacterial counts of the fecal samples thus differed from those measured at the

end of the stabilization period. This phenomenon has been observed and described previously (Cleusix et al.,

2008; Le Blay et al., 2012). Bacterial counts in the two reactors were similar except for Bifidobacterium, which

were nearly a hundred times more numerous at the end of the stabilization period in bioreactor 1 (8.74 log10

CFU/mL) than in bioreactor 2 (6.78 log10 CFU/mL). The composition of the microbiota obtained during this

fermentation was similar to that described in the literature for both in vivo and in vitro studies (Fernandez et al.;

88

Franks et al., 1998; Harmsen, Elfferich, Schut, & Welling, 1999; Hayashi, Takahashi, Nishi, Sakamoto, &

Benno, 2005; Cleusix et al., 2008).

89

Bacterial species

Feces (log10 CFU/g)

End of the stabilization period (log10 CFU/mL)

Bioreactor 1 Bioreactor 2 Bioreactor 1 Bioreactor 2

All bacteria 10.31 10.36 10.13 9.5

Bacteroidetes 10.37 11.0 9.75 9.93

Clostridium leptum 9.16 9.04 8.57 7.31

Bifidobacterium spp. 8.71 8.41 8.74 6.78

Blautia coccoides 8.83 8.96 9.13 8.38

Lactobacillus spp. 6.06 5.68 7.2 6.64

Enterobacteriaceae 7.27 6.92 8.07 7.63

Enterococcus spp. 5.27 4.38 6.97 5.93

Table 3-2 : Quantification by PMA-qPCR of the bacterial population of the fecal inocula and of the bioreactors

at the end of the stabilization period (day 14).

90

3.5.2. Effect of MccJ25 on colonic microbiota equilibrium

Figure 3-2 shows the bacterial composition of both reactors before (t0) and after (t4) adding MccJ25. Means of

two replicates were compared using Tukey’s HSD test. Bacterial counts did not differ significantly (P values ≤

0.05). PMA-qPCR results showed that MccJ25 at 0.4, 2 et 5 μM had no significant impact on colonic

microbiota. Similar results were obtained at 1, 2, 6, 12, 24, 48 and 72 h (data not shown).

To confirm previous results obtained during colonic fermentation, we tested different pure strains representing

the major species of the intestinal microbiota. Agar well diffusion tests did not show any significant inhibition in

the presence of MccJ25, except for Enterobacteriaceae, which appeared slightly sensitive to 2 and 5 μM of

MccJ25 (Table 3-3).

91

Figure 3-2 : Bacterial populations in the bioreactors before (t0) and 4 h after (t4) adding MccJ25, based on

PMA-qPCR. Values with different letters are significantly different (Tukey’s HSD test, P values ≤ 0.05). Figure

3-2A : addition of 0.4 μM MccJ25 to bioreactor 2. Figure 3-2B : addition of 2 μM MccJ25 to bioreactor 1.

Values are means of replicates R1 (day 23) et R2 (day 27) ± standard deviation. Figures 3-2C and 3-2D :

addition of 5 μM MccJ25 on day 31 to bioreactor 1 (C) and 2 (D).

A

B

C

D

92

Bacterial species Control

(cm)

0.4 μM MccJ25

(cm)

2 μM MccJ25

(cm)

5 μM MccJ25

(cm)

Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741

0 0 0 0

Clostridium leptum ATCC 29065 0 0 0 0

Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703

0 0 0 0

Blautia coccoides DSM 935 0 0 0 0

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356

0 0 0 0

Escherichia coli ATCC 25922 0 0 0.9 1.1

Enterococcus faecalis ATCC 27275 0 0 0 0

Table 3-3 : Results of agar diffusion assays using pure cultures of bacterial strains representing the major

species of the intestinal microbiota. Inhibition zone diameters are expressed in centimeters. The negative

control was 0.1 % peptone water without MccJ25.

93

3.5.3. Effect of MccJ25 on the metabolic activity of colonic microbiota

Concentrations of three organic acids were determined using high-performance liquid chromatography and

expressed in mmol/L (mM). At the end of the stabilization period (day 14) in bioreactor 1, acetic acid was the

most abundant (46.47 mM), followed by butyric acid (25.96 mM) and propionic acid (11.25 mM). Table 3-4

shows organic acid concentrations before (t0) and after (t2, t24) adding MccJ25. Means of two replicates were

compared using the HSU-Dunnett test. The concentrations of these short-chain fatty acids did not differ

significantly (P ≤ 0.05) following addition of MccJ25. The presence of MccJ25 thus did not appear to have any

effect on the metabolism of the intestinal microbiota.

94

Short-chain fatty acid 0.4 μM MccJ25 (B2) 2 μM MccJ25 (B1)

t0 t2 t24 t0 t2 t24

Acetic acid (mM) 51.5 ± 2.4 50.6 ± 4.6 52.1 ± 2.0 36.8 ± 2.3 35.0 ± 0 37.3 ± 6.2

Butyric acid (mM) 40.9 ± 7.5 40.2 ± 5.5 41.5 ± 0.8 42.7 ± 3.3 45.7 ± 0 36.5 ± 7.4

Propionic acid (mM) 16.5 ± 1.2 16.2 ± 0.7 16.1 ± 0.4 8.6 ± 1.5 9.1 ± 0 6.7 ± 0.9

Table 3-4 : Concentrations of three organic acids in colonic fermentation broth before and after adding MccJ25

to the bioreactors (B1 and B2). Each value is the mean of replicates R1 (day 23) and R2 (day 27) ± standard

deviation, except those for t2 with 2 μM of MccJ25. Concentrations at t2 and t24 did not differ significantly from

t0, based on the HSU-Dunnett test (P ≤ 0.05). B1 : Bioreactor 1, B2 : Bioreactor 2. t0, t2, t24 : before, 2 h and

24 h after addition of the bacteriocin.

95

3.5.4. Inhibitory activity of MccJ25 against Salmonella enteritidis under

colonic conditions

Figure 3-3 shows the effect of MccJ25 at 0.4 and 2 μM on Salmonella enteritidis viable counts under colonic

fermentation conditions. PMA-qPCR data are shown in Figure 3-3A, while CFU on CHROMagarTM are shown

in Figure 3-3B. Counts of S. enteritidis added alone at an initial concentration of 7 log CFU/mL dropped by

2.03 and 2.59 log cycles in 24 h, as quantified by PMA-qPCR and plating respectively. Theoretical washout

would have reduced the counts by 0.79 log CFU/mL over the same period of time. Based on Tukey’s HSD test

comparing counts in the presence and absence of MccJ25, no significant inhibition of Salmonella was

observed (P ≤ 0.05), whether PMA-qPCR or plating on CHROMagarTM medium was used.

96

Figure 3-3 : Washout of Salmonella enteritidis from colonic continuous fermentation, as quantified by PMA-

qPCR (A) or by plating on CHROMagar (B). S. enteritidis was added alone at an initial concentration of 107

CFU/mL (white triangle) or with MccJ25 at a concentration of 0.4 μM (square, dashed line) or 2 μM (circle).

Squares and circles are means of replicates R1 (day 23) et R2 (day 27). For PMA-qPCR, S. enteritidis alone is

the mean of R1/B1 (day 15), R2/B1 (day 19), R1/B2 (day 15), R2/B2 (day 19). For CHROMagar, S. enteritidis

alone is R1/B1 on day 15. Black triangles represent the theoretical washout of an inert particule added at 107

per mL. Bars indicate standard deviation. B1 : Bioreactor 1, B2 : Bioreactor 2.

A

B

97

3.5.5. Stability and biological activity of MccJ25 under colonic conditions

In a first experiment, pure MccJ25 was tested at different concentrations in 0.1 % peptone water, sterile

Macfarlane or fermented Macfarlane broth for activity against Salmonella enteritidis using the agar well-

diffusion assay and microtitration method. MccJ25 inhibited Salmonella in a dose-dependent manner with

inhibition zone diameters of about 1.2, 1.5 and 1.7 cm respectively at concentrations of 0.4, 2 and 5 μM (Fig.

3-4) whether in peptone water or in sterile or fermented Macfarlane broth. MccJ25 at 0.4 μM had 64 AU/mL of

inhibitory activity in the three different media. At 2 μM, the activity was 512 AU/mL in peptone water and in

sterile Macfarlane broth and 256 AU/mL in fermented Macfarlane broth. At 5 μM, the activity was 1024 AU/mL

in sterile and fermented Macfarlane broth and 512 AU/mL in peptone water. These values corresponded to a

difference of a single well in the two-fold dilution series.

98

Figure 3-4 : Inhibition of Salmonella enteritidis by MccJ25 at concentrations of 0 μM (a), 0.4 μM (b), 2 μM (c),

and 5 μM (d) in 0.1 % peptone water (A), sterile Macfarlane broth (B) and fermented Macfarlane broth taken at

the end of the stabilization period (C), as revealed by diffusion from wells in LB agar.

a b

c d

a

c

b

d

a b

c d

A

B

C

99

In a second experiment, we tested bioreactors contents for inhibition of Salmonella enteritidis at 0, 1, 2 and 4 h

after adding MccJ25 at 0.4, 2 or 5 μM using same methods as above. Significant dose-dependent inhibition

was observed at 1, 2 and 4 h (Fig. 3-5). Samples taken after adding 0.4 μM of MccJ25 contained 32 AU/mL

while those taken after adding 2 μM contained 256, 64 and 128 AU/mL respectively after 1, 2 and 4h. Samples

taken after adding 5 μM of MccJ25 was 256 AU/mL at all time points. The agar diffusion assay showed no

inhibition at t0, inhibition zone diameters of 1.1, 1.4 and 1.5 cm for 1h and 2 h samples and 0.9, 1.2 and 1.3

cm for 4 h samples at MccJ25 concentrations of respectively 0.4, 2 and 5 μM.

100

Figure 3-5 : Inhibition of Salmonella enteritidis by samples collected during the fermentation from the

bioreactors 0 h (b), 1 h (c), 2 h (d) or 4 h (e) after adding MccJ25 at concentrations of 0.4 μM (A), 2 μM (B)

and 5 μM (C), as revealed by diffusion from wells in LB agar. The negative control (a) was fermentation broth

sampled on day 14.

a

b

a a

b b c

c

c

d d

d

e e

e

A B C

101

3.5.6. Determination of the MIC of MccJ25 for Salmonella enteritidis in

Macfarlane medium

The microplate titration assay was used to compare the minimal inhibitory concentration (MIC) of MccJ25 for

S. enteritidis in Macfarlane broth to that in LB broth. The MIC was estimated at 0.03–0.06 μM in LB broth and

2 μM (50 times higher) in Macfarlane broth.

3.6. Discussion

Massive use of antibiotics in animal husbandry has led to the emergence of antibiotic-multiresistant bacteria

that can infect humans through the food chain. This has led the European Union to ban the use of antibiotics

as growth promoters in livestock, and several other countries including Canada are expect to follow suit. This

has increased the urgency of the search for alternative solutions. Among the possible alternatives, the use of

natural antimicrobials such as bacteriocins is considered promising. However, very few studies have focused

on the inhibitory activity of bacteriocins under gastrointestinal tract conditions or have addressed even

indirectly their impact on colonic microbiota. Such information is essential, especially since recent studies have

demonstrated clearly that changes in the composition and metabolic activities of this bacterial population may

be associated with intestinal disorders such as obesity or inflammatory bowel disease (Fiocchi, 1998; Ley,

2010). It has been shown that E. coli and Bacteroides fragilis isolated from the intestine of healthy individuals

are very sensitive to the Shigella flexneri bacteriocin (Padilla, Lobos, & Hubert, 2004). A rat study (Bernbom et

al., 2006) showed that the use of a nisin-producing Lactococcus lactis strain or of purified nisin increases fecal

Bifidobacterium counts while decreasing enterococci and streptococci counts within the colon. Various authors

(Le Blay et al., 2007; Bernbom et al., 2009; Dabour et al., 2009; Le Blay et al., 2012) have found that pediocin

PA-1 does not appear to have any significant impact on the composition of the intestinal microbiota. Similar

results have been reported for the bacteriocin thuricin CD (Rea, Dobson, et al., 2011) and for lacticin-3147-

producing L. lactis DPC6520 (Dobson et al., 2011). In a study using mice, feeding the bacteriocin Abp118

producer Lactobacillus salivarius UCC118 had no significant effect on the proportions of the major phyla

comprising the intestinal microbiota but did lead to a decrease of Spirochaetes and Firmicutes (Riboulet-

Bisson et al., 2012). In view of the fragmentary results provided by these studies and their dependence on the

bacterial strain tested, we conclude that the impact of bacteriocins on the colonic ecosystem remains poorly

understood. Furthermore, bacteriocins of Gram-negative bacteria are a much more recent research topic and

their impact on the composition and the overall metabolic profile of the colonic microbiota is not known.

102

Of the bacteriocins active against Gram-negative bacteria, one of the most studied is MccJ25. Produced by

bacteria of the family Enterobacteriaceae, this lasso peptide of mass 2.1 kDa inhibits Salmonella spp. at

concentrations as low as 0.04 μM (Destoumieux-Garzon et al., 2005). The aim of the present work was to

study its anti-Salmonella activity under gastrointestinal tract conditions and to evaluate the impact of oral

administration on the human intestinal microbiota. To achieve this, we carried out a continuous culture of

immobilized fecal microbiota in a bioreactor simulating the physiological and microbiological conditions

encountered in the colon, according to a procedure described previously (Cinquin et al., 2004). The bacterial

counts stabilized within 14 days, albeit with a profile differing from that of the initial fecal sample. Similar results

have been observed and described previously (Cleusix et al., 2008; Le Blay et al., 2012). Bacteroidetes and

Clostridium leptum counts tended to decrease throughout the stabilization period, while counts of

Lactobacillus, E. coli and Enterococcus increased. The profile obtained after stabilization was consistent with

published results, thus confirming the accuracy of the colonic fermentation model (Fernandez et al.; Franks et

al., 1998; Harmsen et al., 1999; Hayashi et al., 2005; Cleusix et al., 2008). The dominant organisms were

Bacteroidetes, Clostridium leptum and Blautia coccoides, while Enterobacteriaceae, Lactobacillus and

Enterococcus were a minority. Using propidium monoazide allows to distinguish live cells from dead cells

during qPCR. PMA-qPCR indicated higher counts of Salmonella than were obtained as colony-forming units

on CHROMagarTM medium, most likely because PMA-qPCR allows quantification of both viable, cultivable and

non-cultivable microorganisms unlike the culture medium which could only detect the viable and cultivable

ones.

Bacteriocins differ from antibiotics in having a narrow spectrum of activity (Nes, 2011). MccJ25 is known to be

active against Salmonella, Shigella and E. coli (BACTIBASE). As expected, MccJ25 at concentrations of 0.4, 2

and 5 μM did not alter the composition of the colonic microbiota. This has been observed previously for many

other bacteriocins. In our study, Enterobacteriaceae were found slightly sensitive at 2 and 5 μM, as shown by

the agar diffusion assay. This result is not unexpected since the antimicrobial activity of bacteriocins is directed

against bacteria closely related to the producer strain (Nes, 2011). MccJ25 has been found strongly active

against 12 strains of diarrheagenic E. coli, among them O157:H7 (Sable et al., 2000). In the present study, E.

coli was sensitive but less so than Salmonella enteritidis, as noted previously (Vincent et al., 2004). Inhibition

zone diameters of E. coli and Salmonella were respectively 0.9 and 1.5 cm at 2 μM of MccJ25 and 1.1 and 1.7

cm at 5 μM of MccJ25. Acetate was the main organic acid detected in the fermentation broth, as observed

previously (Den Besten et al., 2013), and no significant change in organic acid concentrations was observed.

This is consistent with counts of Bacteroidetes (acetate and propionate producers) and Firmicutes (butyrate

producers), which were not affected by MccJ25. MccJ25 seems to have no significant effect on the metabolic

activity of the intestinal microbiota. Nevertheless, a large-scale metabolome analysis would be necessary to

103

attest it. Nowadays, some methods exist based on gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), liquid

chromatography mass spectrometry (LC-MS), NMR, Fourier-transform ion cyclotron resonance mass

spectrometry, capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS) and CE with time-of-flight mass

spectrometry (CE-TOFMS) able to detect near 200 metabolites (Matsumoto et al., 2012).

Treating mice with MccJ25 has been found to decrease counts of Salmonella newport in the spleen and liver

(Lopez et al., 2007). Our study is the first test of the effect of MccJ25 on Salmonella in a gastrointestinal

environment. Concentrations of MccJ25 (0.4, 2 and 5 μM) added in the reactors were based on the MIC of

0.04 μM in LB broth. While MccJ25 was strongly inhibitory against S. enteritidis in LB broth, no inhibition of

Salmonella was detected in the reactors during fermentation. We hypothesized that the MIC may be different

between LB and Macfarlane media. More precisely, we assumed that higher MccJ25 concentrations (higher

MIC values) are needed in a more complex medium such as Macfarlane than in simple LB medium in order to

inhibit Salmonella. We therefore compared microplate titrations in Macfarlane broth and LB broth. Our results

showed that the MIC was 50 times higher in Macfarlane broth (2 μM) than in LB broth (0.04 μM), leading to an

estimated minimal bactericidal concentration (MBC) in Macfarlane broth of 250 μM (MBC = 125 x MIC). This

finding suggests that the concentrations of MccJ25 in the colonic fermentation model (0.4, 2 and 5 μM) were

too low to inhibit Salmonella.

Variation in antimicrobial activity across different media is already reported in the literature. The causes of this

variation, however, are not clearly elucidated. Wesolowski et al. observed a different inhibitory effect from a

mixture of a peptide-morpholino oligonucleotide conjugate and a cell-penetrating peptide against Enterococcus

faecalis depending on the growth medium, TSB or BHI (Wesolowski, Alonso, & Altman, 2013). They also

reported a 10-fold lower viability of E. coli SM105 in LB than in BHI broth, without clearly understanding the

mechanism behind this phenomenon. We found in the literature several reports of antimicrobial activity

alteration possibly due to an interaction between the antimicrobial agent and components of the culture

medium (carbohydrates, peptides, minerals, cations, DNA). In a study performed in 1999 (Schwab, Gilligan,

Jaynes, & Henke, 1999), two cationic synthetic peptides, D2A21 and D4E1, presented a higher activity against

Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa in modified RPMI medium than in TSB, NB, MHB and

adjMHB medium. The decrease of activity in TSB, NB, MHB and adjMHB medium could be due to D2A21 and

D4E1 binding to certain complex carbohydrates or proteins of the medium. As they observed a decrease of

activity of both peptides in cation adjusted-MHB, they also suggested an interference of cations, as reported in

1997 with MSI-78 (MacDonald, York, Jones, & Zasloff, 1997). More recently, MICs of cationic nylon-3

polymers against E. coli using LB, BHI and a chemically defined complete medium (EZRDM) were measured

(Choi, Chakraborty, Liu, Gellman, & Weisshaar, 2014). A strong reduction of MIC values in EZRDM, compared

104

to LB and BHI broths, has been observed. The difference of MIC between media was believed to be due to the

formation of electrostatic complexes between the cationic polymers and the polyanionic peptides present in LB

and BHI. These polyanionic peptides are generated by the digestion of proteins, such as peptone or tryptone.

Formation of complexes would decrease the antibacterial activity by diminishing binding of the antimicrobial to

the anionic lipopolysaccharide (LPS) layer of E. coli (Choi et al., 2014). In the same way, activity of the cationic

homopolymer ε-polylysine, a food preservative, against E. coli decreased from 50 μg/mL to 1 μg/mL from

nutrient buffer (with peptone) to Davis medium (chemically defined medium with casamino acids) (Shima,

Matsuoka, Iwamoto, & Sakai, 1984; Choi et al., 2014). Alternatively, other studies have explained the

witnessed variation in MIC values across media by invoking a competition between the antimicrobial and

medium components for transport into the targeted cell. Brandi et al. demonstrated that GE81112, an

antibacterial tetrapeptide, has MICs against E. coli and Bacillus subtilis 4-fold lower in minimal medium than in

rich medium. This could be due to competition during uptake with incompletely hydrolyzated oligopeptides

present in the complete medium (Brandi et al., 2006).

In agar diffusion and microtitration tests, similar inhibitory activity against S. enteritidis was observed for

MccJ25 in 0.1 % peptone water, sterile Macfarlane broth, fermented Macfarlane broth, and fermentation broth

sampled after adding the bacteriocin to the bioreactor. These data suggest that despite its complexity,

Macfarlane medium does not contain any components that interact with MccJ25 and negatively affect its

stability and biological activity, in contrast with the results of Schwab and Choi. Variation in MIC values

between LB and Macfarlane medium could be due to a protective effect of Macfarlane medium on Salmonella

against MccJ25. We could as well consider the possibility that Salmonella is less stressed in Macfarlane rich

medium, and thus higher concentrations of MccJ25 would be needed to affect its viability. Finally, a

competition between MccJ25 and iron could be present in Macfarlane medium for the transporter and outer

membrane receptor FhuA of Salmonella (UniProt). A similar competition phenomenon has been described in

the literature, as mentioned above (Brandi et al., 2006). When we tested antibacterial activity of Macfarlane

medium supplemented with MccJ25 with agar diffusion and microtitration plates, we saw a significant inhibition

of Salmonella. This could be explained by a low and rapidly depleted amount of iron in the well. MccJ25 would

have rapidly no more competition for FhuA. By contrast, the reactors worked under continuous fermentation

conditions with a continuous supply of sterile Macfarlane medium, thus maintaining a stable level of iron which

effectively competes with MccJ25. Further studies are planned to elucidate this variation in MIC values

between LB and Macfarlane medium.

In conclusion, MccJ25 may be considered to have potential as an alternative to antibiotics since it does not

appear to affect the composition or the metabolic activity of the colon bacterial population, as demonstrated

105

using an in vitro model of the colon based on continuous fermentation and confirmed by agar diffusion assays.

However, in order to be effective in gastrointestinal applications, the concentration of MccJ25 used would have

to be at least 50 times greater than those tested in this study. Further in vitro studies should be done using

higher concentrations of MccJ25 in order to evaluate more fully its impact on S. enteritidis under colonic

conditions. Poultry, whose consumption is increasing from year to year, is strongly susceptible to Salmonella

infections (Gyles, 2008; MAPAQ, 2011). A potential application of MccJ25 could be as growth promoter in

poultry administered instead of or in combination with antibiotics in the feed or drinking water. In the light of our

results, we could assume that MccJ25 has no effect on chicken gut microbiota since chicken and human

microbiota are similar in composition and activity (Oakley et al., 2014; Waite & Taylor, 2014). However, in vivo

tests should be done to evaluate antimicrobial efficiency of MccJ25 against Salmonella in chickens.

3.7. Acknowledgements

This work was supported by the National Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) and

the « Fonds de recherche du Québec - Nature et Technologies » (FQRNT).

107

Conclusion générale

Dès la 2e moitié du XXe siècle, les antibiotiques sont utilisés à grande échelle en élevage à des fins

thérapeutiques, prophylactiques et/ou comme facteurs de croissance (Gustafson & Bowen, 1997; Gyles,

2008). Ils servent à stimuler la croissance et à améliorer la conversion alimentaire (ACIA). Cette utilisation

massive a entraîné l'apparition d'un nombre croissant de pathogènes résistants qui menacent l’agriculture

mais également la santé publique. Les antibiotiques ont comme autre effet secondaire indésirable de perturber

l’équilibre du microbiote commensal de l’intestin (Chambers & Gong, 2011). À cause de leur large spectre

d’action, ces antibiotiques s’attaquent aussi bien aux bactéries pathogènes ciblées qu’à celles bénéfiques pour

l’hôte (Blaser, 2011). Or, le microbiote intestinal est aujourd’hui reconnu comme étant essentiel à la santé, au

bien-être et au développement de l’hôte. En 2014, l’Organisation Mondiale de la Santé mettait en garde sur les

effets négatifs associés aux antibiotiques : « A post-antibiotic era - in which common infections and minor

injuries can kill - far from being an apocalyptic fantasy, is instead a very real possibility for the 21st century »

(World Health Organization, 2014). Par conséquent, la recherche s’active de plus en plus pour trouver des

alternatives aux antibiotiques. Ces dernières se doivent de préserver l’équilibre du microbiote commensal

intestinal, tout en ciblant spécifiquement et efficacement le pathogène opportuniste. Une des alternatives

proposées réfère à l’utilisation des bactériocines, des peptides produits par plusieurs espèces bactériennes

ayant une activité inhibitrice contre des bactéries proches phylogénétiquement de la souche productrice.

Les bactériocines possèdent plusieurs propriétés qui en font de bonnes candidates. Elles sont actives à des

concentrations nanomolaires, possèdent un spectre d’action généralement plus étroit que celui des

antibiotiques et la plupart d’entre elles sont stables à hautes températures et résistantes aux pH extrêmes

(Nes, 2011). Le potentiel antimicrobien des bactériocines a surtout été démontré dans des matrices

alimentaires comme le lait, les produits laitiers, les produits carnés et les végétaux. À ce jour, très peu de

travaux se sont intéressés au potentiel des bactériocines comme alternative aux antibiotiques chez l’humain

ou l’animal. De plus, les quelques travaux rapportés dans la littérature ont porté sur des bactériocines de

bactéries à Gram-positif. Des travaux récents ont montré que la pédiocine PA-1 (Le Blay et al., 2007; Le Blay

et al., 2012) et la thuricine CD (Rea, Dobson, et al., 2011) n’avaient pas d’impact sur la composition du

microbiote intestinal, tout en ayant une activité inhibitrice significative contre Listeria monocytogenes et

Clostridium difficile respectivement. Dans ce travail de maîtrise, nous nous sommes intéressés à la MccJ25,

l’une des bactériocines de Gram-négatif les plus étudiées. L’activité antimicrobienne de la MccJ25 contre

Salmonella spp. et Escherichia coli a été rapportée à quelques reprises in vitro (Sable et al., 2000; Vincent et

al., 2004) et in vivo (Lopez et al., 2007), mais jamais dans les conditions physiologiques du tube digestif. Ce

108

travail de maîtrise étudiait pour la première fois la stabilité et l’activité biologique contre Salmonella enteritidis

de la MccJ25 dans les conditions du tractus digestif, ainsi que son impact sur le microbiote intestinal.

Dans le premier chapitre de ce mémoire, nous avons produit et purifié en grandes quantités la MccJ25 et

évalué son activité biologique contre Salmonella enteritidis en milieu de culture LB. Cette étape de production

demeure une étape cruciale pour la réalisation d’études à grande échelle avec les bactérocines. À partir d’1,5

L de surnageant d’une culture de E. coli K-12 MC4100 pTUC202, 45,16 mg de MccJ25 pure ont été obtenus.

Au cours de la purification du peptide, l’activité inhibitrice contre Salmonella enteritidis a augmenté

considérablement, de 16384 à 1048576 AU/mL. Nous avons évalué à 0,02 μM la concentration minimale

inhibitrice (CMI) de la MccJ25 pour S. enteritidis en milieu LB, ce qui concorde avec le résultat de 0,04 μM

obtenu par Destoumieux-Garzon et al. (Destoumieux-Garzon et al., 2005) et se trouve compris dans la

fourchette de valeurs de 0,02 à 0,05 μM donnée par Duquesne et al. (Duquesne et al., 2007).

Dans un second temps, l’impact sur S. enteritidis et sur le microbiote intestinal de la MccJ25 purifiée a été

étudié in vitro à l'aide d'un système de fermentation en continu avec microbiote fécal immobilisé permettant de

reproduire les conditions physiologiques et microbiologiques du côlon humain adulte. La MccJ25 a été ajoutée

dans les bioréacteurs à trois concentrations différentes (0,4, 2 et 5 μM) en présence de Salmonella enteritidis.

Les bioréacteurs contenaient un milieu de Macfarlane simulant le contenu colique. Les espèces majoritaires

du microbiote intestinal et S. enteritidis ont été quantifiées par PMA-qPCR. Cette technique de biologie

moléculaire offre l’avantage de quantifier les bactéries non-cultivables, contrairement à la méthode de

dénombrement sur gélose, et de ne quantifier que les cellules vivantes, contrairement à la qPCR traditionnelle.

La MccJ25 à 0,4, 2 et 5 μM ne montra aucun effet significatif sur la composition du microbiote colique, ni sur

son activité métabolique. Des tests d’activité par diffusion en gélose contre les espèces majoritaires du

microbiote intestinal confirmèrent l’absence d’inhibition, à l’exception des Enterobacteriaceae qui se

montrèrent légèrement sensibles à 2 et 5 μM de MccJ25. Ces résultats étaient attendus compte tenu du

spectre d’action étroit de la MccJ25, dirigé essentiellement contre des bactéries proches phylogénétiquement

de la souche productrice, en l’occurrence Escherichia coli (Nes, 2011). Ces résultats concordent avec ceux

obtenus par Le Blay et al. (Le Blay et al., 2007; Le Blay et al., 2012) et Rea et al. (Rea, Dobson, et al., 2011)

pour la pédiocine PA-1 et la thuricine CD respectivement. Bien que la MccJ25 ait démontré une activité

inhibitrice significative contre S. enteritidis en milieu LB à 0,4, 2 et 5 μM, aucune réduction des comptes de

Salmonella n’a été observée dans les bioréacteurs lors de la fermentation aux mêmes concentrations. Il a été

observé que la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la MccJ25 contre S. enteritidis varie selon le milieu

de croissance de la souche. En effet, nous avons estimé la CMI à 0,04 et 2 μM en milieu LB et Macfarlane

respectivement, ce qui représente une différence de 50 μM. Les concentrations de MccJ25 ajoutées dans les

109

bioréacteurs lors de cette expérience n’étaient probablement pas suffisantes d’un facteur 50 pour observer un

effet inhibiteur sur S. enteritidis en conditions intestinales. Des concentrations de 20, 100 et 250 μM de

MccJ25 seraient nécessaires pour observer un effet inhibiteur dans les conditions coliques. Des échantillons

prélevés des bioréacteurs lors de la fermentation aux jours 27 et 31, ainsi que des milieux de Macfarlane

(stérile et fermenté) supplémentés en MccJ25 avant les tests d’activité, ont inhibé S. enteritidis sur gélose LB

de façon significative, indiquant que la MccJ25 ne semble pas avoir d’interaction avec les composants du

milieu de Macfarlane et qu’elle conserve sa stabilité dans les conditions coliques testées. Plusieurs

hypothèses sont à envisager pour tenter d’expliquer la différence de CMIs entre milieux. Il est possible que le

milieu de Macfarlane exerce un effet protecteur sur Salmonella contre la MccJ25. D’une autre façon,

Salmonella pourrait être moins stressée en milieu riche, de ce fait plus forte, plus à l’aise, ce qui expliquerait

les concentrations plus élevées de MccJ25 nécessaires pour l’atteindre dans le milieu de Macfarlane. Enfin, il

pourrait exister une compétition entre la MccJ25 et le fer présent dans le milieu de Macfarlane pour le

récepteur transmembranaire FhuA permettant l’import dans la bactérie cible. Ce phénomène de compétition

entre un composant du milieu de culture et un antimicrobien, qui affecte l’activité inhibitrice de ce dernier, a

déjà été décrit dans la littérature (Brandi et al., 2006). Si le milieu de Macfarlane supplémenté en MccJ25 a

montré une inhibition significative de S. enteritidis lors des tests d’activité par diffusion en gélose, ceci pourrait

être dû à une quantité de fer trop faible et rapidement épuisée dans le puits de la gélose. Au contraire, les

bioréacteurs bénéficiaient d’un apport continu de milieu de Macfarlane neuf et ainsi de fer, d’où l’absence

d’inhibition. Des études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre le phénomène qui réduit l’activité

inhibitrice de la MccJ25 dans le milieu de Macfarlane.

À la lumière de ces résultats, nous avons démontré que la MccJ25 n’a pas d’impact négatif sur la composition

ni sur l’activité métabolique du microbiote intestinal, qu’elle reste stable en conditions coliques, toutefois que

sa CMI est supérieure en milieu intestinal qu’en milieu LB. D’autres études demeurent nécessaires pour

démontrer son activité dans les conditions réelles du côlon. En ce sens, les concentrations à ajouter doivent

tenir compte d’un phénomène encore indéterminé qui défavoriserait l’interaction entre la MccJ25 et le

microorganisme cible, en l’occurrence Salmonella. Des concentrations 50 fois supérieures à la valeur de la

CMI déterminée dans les milieux de culture synthétiques doivent être utilisées pour pouvoir observer une

activité inhibitrice significative. Une fois que l’effet inhibiteur de la MccJ25 contre S. enteritidis sera démontré

in vitro dans le modèle de côlon, des études in vivo chez les animaux d’élevage tels que la volaille pourront

être alors entreprises pour valider le potentiel de cette bactériocine comme alternative aux antibiotiques.

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