REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULIARE MINISTERE DE
LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE
MENTOURI DE CONSTANTINE FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE CHIMIE
en cotutelle avec UNIVERSITE LOUIS PASTEUR STRASBOURG FACULTE DE
PHARMACIE N dordre : Srie : THESE Prsente pour obtenir le Doctorat
en Sciences de LUNIVERSITE LOUIS PASTEUR Discipline : Sciences
PharmaceutiquesSpcialit : Pharmacognosie Etde LUNIVERSITE MENTOURI
DE CONSTANTINE Discipline : Chimie OrganiqueSpcialit : Phytochimie
par Mehdi CHAABI Mehdi CHAABI Mehdi CHAABI Mehdi CHAABI Diplm de
Magistre en Pharmacochimie Etude phytochimique et biologique
despces vgtales africaines :Euphorbia stenoclada Baill.
(Euphorbiaceae),Anogeissus leiocarpus Guill. & Perr.
(Combretaceae), Limoniastrum feei (Girard) Batt. (Plumbaginaceae).
A soutenir publiquement le 03 juin 2008 devant le jury : JURY
PrsidenteMmeF. BENAYACHEProfesseurUniversit Mentouri, Constantine
Directeur de thse MmeA. LOBSTEINProfesseurUniversit Louis Pasteur
deStrasbourg Co-directeurde thse M.S. BENAYACHEProfesseurUniversit
Mentouri, Constantine ExaminateurM. M. HIBERTProfesseurUniversit
Louis Pasteur deStrasbourg ExaminateurMme Z.
MERAIHIProfesseurUniversit Mentouri, Constantine ExaminateurM. M.
BENKHALEDProfesseurUniversit El-Hadj Lakhdar, Batna 2 ') - '-~V -
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;~ '- - -~ '-=,- 4->- 4--- ~ -~ ************;V ,-'~- '- ~- ,~ ,-
;=;- ~-= ' -- ************',-- - -( _-=- 3 DDICACES DDICACES
DDICACES DDICACES A mes trs chers parentsA ma trs chre femme A mes
frres et sursA tous ceux qui me sont chers 4 Remerciements
Deprimeabord,jetiensexprimermaprofondereconnaissanceetmesvifs
remerciements mes professeurs Annelise LOBSTEIN et Samir BENAYACHE
pour
avoirencadrpatiemmentcetravail,pourleursprcieusesremarquesconstructiveset
leur suivi pour mener terme ce travail. Je ne pourrais remercier
jamais assez Monsieur le professeur Marcel HIBERT qui ma ouvert ses
bras pour maccueillir dans lUMR 7175 dont il a la direction. Il a
bien voulu
mefairelhonneurdesigerdanslejury,malgrtoutessesresponsabilitsetses
nombreusesoccupations.Jeleremercietrsvivementetlepriedetrouvericiun
tmoignage de mes sentiments respectueux. Je remercie
chaleureusement Madame le professeurFadila BENAYACHE, pour avoir
accept de prendre part au jury de soutenance, tout le plaisir est
pour moi ; je la remercie aussi pour sa grande gentillesse et sa
disponibilit. Mes vifs remerciements aussi Madame le
professeurZahia MERAIHI qui est lune
desprofesseursquejaimeetquejerespectebeaucoup
;ledestinavouluencoreune fois quelle mefasse lhonneur dtre prsente
dans le jury de ma thse,aprscelui de mon Magister et aprs mavoir
encadr pour le mmoire de D.E.S. de Biochimie.
JesuisgalementtrshonorqueMonsieurMohamedBENKHALEDaitacceptde
jugeretdesigerdanslejurydemathse.Quiltrouveiciletmoignagedema
reconnaissance et de ma respectueuse gratitude. 5 Mes remerciements
vont galement toutes les personnes qui ont contribu, de prs ou de
loin, la ralisation de ce travail, et notamment : Madame le Docteur
Nelly FROSSARD,pour la collaboration fructueuse, assiste de Madame
le Docteur Vronique FREUND-MICHEL. Madame le Docteur Claire
LUGNIER, pour mavoir bien accueilli dans son laboratoire et appris
avec rigueur les tests dinhibition de phosphodiestrases. Merci
galement Hlne Justiniano pour son aide technique fort apprcie.
Monsieur le Professeur Robert ANTON
pourl'accueilchaleureuxquevousmaveztoujoursrservauLaboratoirede
Pharmacognosie. Veuillez trouver ici l'expression de ma profonde
gratitude. Messieurs Bernard KUBALLA et Bernard WENIGER pour votre
simplicit, votre bonne humeur et votre disponibilit : mes sincres
remerciements. Cyril ANTHEAUME
pourtagentillesse,tagrandecomptencedansledomainedelaRMNetta
contribution llucidation structurale des composs isols.
Enfin,jenevoudraispasoubliertousmescollguesetlesstagiairesquejaictoyau
LaboratoiredePharmacognosiedelUniversitLouisPasteurdeStrasbourgainsiquau
Laboratoire VAREN de lUniversit Mentouri de Constantine, notamment
Saliou,Catherine, Martine, lHaj et bien dautres encore 6
ABREVIATIONS AcOEt : Actate dthyle AlCl3 : Chlorure daluminium APCI
: Ionisation Chimique Pression Atmosphrique BuOH : butanol CCM :
Chromatographie sur Couche Mince CI50 : Concentration Inhibitrice
50 CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance CMLBH :
Cellules Musculaires Lisses Bronchiques Humaines COSY : COrrelated
SpectroscopY CPT ou TFC: Contenu en Phnols Totaux d : doublet dd :
doublet ddoubl ddd : doublet de doublet de doubletDEPT :
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (ppm) :
Dplacement chimique en partie par million DPPH :radical
1,1-Diphnyl-2 picrylhydrazyl EC1 : concentration defficacit voisine
de 1mM de Fe2+ ESI : Electrospray (ionisation par
lectronbulisation) EtOH : Ethanol GAE : quivalent en acide gallique
HCl : Acide chlorhydrique HMBC : Heteronuclear Multiple Bond
Correlation HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence OH :
Radical hydroxyl IL-1 : Interleukine-1bta IR : Infra-rouge J (Hz) :
Constante de couplage en Hertz Jmod : J-modulated spin-echo m :
multiplet NBT : Bleu de nitrottrazoliumNEU : 2 -
aminothyldiphnylborate de sodium 1 % dans le mthanol NOESY :
Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy 7 RL(O) /(N): Radica(l)ux
libre(s)(oxygn)/azot RMN : Rsonance Magntique Nuclaire ROESY :
Rotating overhauser effect correlation SpectroscopY RSA : Relation
Structure-activit s : singulet SM : Spectromtrie de masse SRSA :
Superoxyde Radical Scavenging Activityt : triplet test LB : Test
Liebermann-Burchard TFA : Acide trifluoroactique TPTZ :
2,4,6-tris(2-pyridyl)-1,3,5-s-triazineTOCSY : Total Correlated
Spectroscopy Trd : triplet de doublet UV : Ultraviolet : longueur
donde O2- : anion superoxyde 8 Sommaire Introduction gnrale1
Chapitre 1 : Etude ethnopharmacologique dEuphorbia stenoclada
Baill. (Euphorbiaceae)3 1.Introduction4 2.Prsentation de la plante6
3.Classification botanique7 4.Bilan bibliographique sur le genre
Euphorbia8 4.1. Activits pharmacologiques8 4.2. Etudes
phytochimiques 9 5.Lasthme11 5.1. Gnralits11 5.2. Le remodelage
bronchique : caractristiques histopathologiquesdans lasthme 12 5.3.
Causes et facteurs de risque145.4. Les allergnes 15 5.4.1. Les
pneumoallergnes 15 5.4.2. Les trophoallergnes15 5.4.3. Les
allergnes mdicamenteux15 5.4.4. Les allergnes professionnels16
5.4.5. La pollution atmosphrique 16 5.4.6. Le tabagisme16 5.4.7.
Les virus16 5.4.8. Autres facteurs favorisants16 5.5. Mdicaments
antiasthmatiques 17 5.5.1. Le mdicament de contrle17 5.5.2. Le
mdicament de secours17 6.Matriel et mthodes18 6.1. Extraction et
isolement18 6.2. Traitement des cellules et test de prolifration
cellulaire21 6.3. Activit antiradicalaire (test au DPPH)22 6.3.1.
Principe du test 22 6.3.2. Protocole 23 6.4. Dosage des polyphnols
totaux24 6.4.1. Principe24 6.4.2. Protocole 24 6.4.3. Courbe talon
de lacide gallique24 6.5. Statistiques25 7.Rsultats26 7.1. Effet
anti-prolifratif de lextrait ES et fractionnement bioguid26 7.2.
Identification des constituants de la fraction E31 7.2.1.
Identification du constituant prsent dans la sous-fraction FE531
7.2.2. Identification du constituant prsent dans la sous-fraction
FE132 7.2.3. Identification de lhyproside33 7.3. Identification du
compos majoritaire prsent dans la fraction FA 35 9 7.4. Etude de
relation structure/activit 36 7.5. Analyse dun infus de parties
ariennes dE. stenoclada37 7.6. Activit antiradicalaire et teneur en
polyphnols totaux dE. stenoclada38 7.6.1. La teneur en polyphnols
totaux38 7.6.2. Activit antiradicalaire 39 7.6.3. Corrlation entre
la teneur en polyphnols totaux et lactivitanti-radicalaire39
8.Discussion40 Rfrences44 publication 1 : Anti-proliferative effect
of Euphorbia stenoclada in human airway smooth muscle cells in
culture51 Chapitre 2 : Etude phytochimique dAnogeissus leiocarpus
Guill. & Perr. (Combrtaceae)57 1. I ntroduction 58 2. Les
triterpnes : Structure et identification59 2.1 Dfinition 59 2.2
Structure59 2.2.1 Aglycone 59 2.2.2. Les sucres 60 2.2.3. Proprits
physiques 61 2.3. Elucidation structurale 63 2.3.1. Mthode
classique63 2.3.2. Mthode moderne63 2.3.2.1. RMN du 1H64 2.3.2.2.
RMN du 13C64 2.3.2.3. RMN deux dimensions65 3.Description de la
plante67 4.Classification 67 5.Etude bibliographique dAnogeissus
leiocarpus68 5.1. Etudes phytochimiques antrieures sur le genre
Anogeissus68 5.2. tudes biologiques antrieures sur le genre
Anogeissus70 5.3. Utilisations traditionnelles70 6. Matriel et
mthodes71 6.1. Extraction et isolement 71 6.2. Conditions
chromatographiques utilises en CLHP analytique et prparative 72
7.Profils chromatographiques74 8.1Identification des triterpnes77
8.1.1. Elucidation structurale du compos ALec1A 77 8.1.2.
Elucidation structurale du compos Alec1B87 8.1.3. Elucidation
structurale du compos ALec2C 98 8.1.4. Elucidation structurale du
compos ALec2D 106 8.1.5. Elucidation structurale du compos ALec2E
114 8.2.Identification des drivs ellagiques124 8.2.1. Elucidation
structuraledu compos Alec3-1 124 8.2.2. Elucidation structurale du
compos Alec3-2128 8.2.3. Elucidation structurale du compos
Alec3-3131 9.Discussion134 Rfrences136 Publication 2 : Triterpenes
and polyphenols from Anogeissus leiocarpus10 (Combretaceae)141
Chapitre3
:Fractionnementbioguiddactifsanti-oxydantsdeLimoniastrumfeei
(Girard) Batt. (Plumbaginaceae)145 Introduction146 1.Le stress
oxydant148 1.1. Historique148 1.2. Les radicaux libres (RL)149 1.3.
Principaux radicaux libres oxygns et leur origine149 1.3.1. Lanion
superoxyde (O2-) 149 1.3.2. Le radical hydroxyle (OH)150 1.3.3. Le
peroxyde dhydrogne (H2O2)151 1.3.4. Loxygne singulet (O)151 1.3.5.
Les radicaux peroxyles et alcoxyles 152 1.3.6. Le monoxyde dazote
et le dioxyde dazote153 1.3.7. Lanion peroxynitrite (OONO-)153 1.4.
Rles des Radicaux libres oxygns (RLO) dans la physiologie154 1.5.
Dtection des espces ractives loxygne et lazote155 1.5.1. Rsonance
Paramagntique Electronique (RPE)155 1.5.2. Les sondes
fluorescentes156 1.5.3. Les composs chimioluminescents156 1.5.4.
Les mthodes enzymatiques156 1.6. Gense des radicaux libres157
1.6.1. Source endogne157 1.6.2. Source exogne 160 1.7. Les moyens
de dfense contre les radicaux libres162 1.7.1. Les moyens de dfense
endognes162 1.7.2. Les moyens de dfense exognes164 2. La famille
des Plumbaginaceae168 2.1. Phytochimie de la famille des
Plombaginaces168 2.2. Exemples de composs identifis dans la famille
des Plombaginaces169 2.3. Etudes pharmacologiques du genres
Limonium 170 2.4. Caractristiques de lespce tudie : Limoniastrum
feei170 2.5. Taxonomie 171 3. Matriels et mthodes172 3.1. Le
matriel vgtal 172 3.2. Evaluation de lactivit anti-oxydante172
3.2.1. Essai au DPPH172 3.2.2. Essai FRAP (Ferric Reducing Ability
of Plasma)172 3.3.3. Essai du radical superoxyde (O2-) (systme
xanthine/xanthine oxydase) 175 3.3.4. Dosage des polyphnols177 3.4.
Conditions de Chromatographie liquide haute performance (CLHP)177
3.4.1. CLHP analytique177 3.4.2. CLHP semi-prparative177 4.
Rsultats et discussion179 4.1. Schma gnral dextraction de
Limoniastrum feei180 4.2. Rendements dextraction180 4.3. Analyse
par CLHP analytique des extraits obtenus180 4.4. Activits
anti-oxydantes des extraits 182 4.4.1. Activit antiradicalaire
(test du radical DPPH)182 4.4.2. Activit anti-oxydante de l'extrait
AcOEt des feuilles de L. feei183 11 4.5. Corrlation entre lactivit
antiradicalaire et la teneur en polyphnols totaux183 4.6.
Fractionnement de l'extrait AcOEt de feuilles de L. feei185 4.7.
Rsultats de lessai au DPPH des fractions issues de lextrait AcOEt
(F)185 4.8. Analyse par CLHP analytique (280 nm) des deux fractions
slectionnes186 4.9. Purification de la fraction active 80-196 par
CLHP semi-prparative187 5.Identification des produits purs isols188
5.1. Identification du compos 1188 5.2. Identification du compos
2190 5.3. Identification du compos 3.1196 5.4. Identification du
compos 3.2 201 5.5. Identification du compos 4207 5.6.
Identification du compos 5214 5.7. Identification du compos 6217 6.
Comparaison de lactivit anti-radicalaire (tests DPPH, FRAP et SRSA)
des polyphnols isols221 Rfrences223 Publication 3 : Activity-Guided
isolation of antioxidant principles fromLimoniastrum feei
(Zeitschrift Fr Naturforschung C)230 Rsum250 12 Introduction gnrale
Historiquement,leshommesonttoujourspuisdanslaNaturedequoisenourrir,se
vtiretsesoigner.Surterre,quatrepersonnessurcinqseserventdesplantespourconjurer
leursmaux
;quatrefemmessurcinq,enparticulierdanslespaysmergents,nedisposent
daucun autre type de remde pour leurs enfants. En Afrique, en Asie
et en Amrique latine, nombreux sont les pays qui font appel la
mdecine traditionnelle pour rpondre certains de leurs besoins au
niveau des soins de sant primaire. En Afrique, jusqu 80% de la
population a recours la mdecine traditionnelle pour se
soigner.Quand elle nest pas unchoix, la phytothrapie est donc une
ncessit. Lesplantesproduisentdj70%denosmdicaments.Djenviron170 000
molculesbioactivesonttidentifiespartirdeplantes
:digitaline,quinine,morphine,
colchicine,artmisininePourtant,moinsdelamoitidesplantesaujourdhuiontt
tudies pour leurs proprits thrapeutiques.
Cesten2002quelOrganisationMondialedelaSantamisenplacesapremire
stratgie globale en matire de mdecine traditionnelle. Cette
stratgie a pour
but-daiderlespayslaborerdespolitiquesnationalesdvaluationetde
rglementation des pratiques de la mdecine
traditionnelle,-dencouragerlutilisationdeproduitstraditionnelsdontlinnocuit,lefficacitet
la qualit auront t rigoureusement
contrles,-deveillercequelerecoursauxmdicamentsessentielsbasedeplantessoit
disponible et abordable, -de promouvoir lusage thrapeutique
judicieux de la mdecine traditionnelle, -de rassembler de la
documentation sur les mdicaments et remdes traditionnels. Dans les
pays industrialiss, cest sous forme dethrapies complmentaires que
les plantes sont aujourdhui surtout utilises. En Europe et en
Amrique du Nord, plus de 50% de
lapopulationaeurecoursaumoinsunefoisdescomplmentsalimentairesbasede
plantes. Cest encore beaucoup plus au Canada et en Allemagne, par
exemple. 13 Le premier chapitre de ce mmoire sinscrit dans le cadre
dune collaboration scientifiqueentre lUniversit Louis Pasteur de
Strasbourg et lUniversit dAntananarivo de Madagascar. Il sagit en
effet de valider les usages traditionnels de plantes malgaches,
dans le but de les introduire dans une pharmacope nationale en
cours dlaboration. Notre travail sest focalis sur une espce
endmique, Euphorbia stenoclada Baill. (Euphorbiaceae) utilise en
mdecine traditionnelle pour traiter les affections
broncho-pulmonaires. Aprs avoir vrifi lactivit dune prparation
traditionnelle sur un modle cellulaire (inhibition de la
prolifration de cellules musculaires lisses bronchiques), nous
avons isol par fractionnement guid ses constituants actifs.
Lesecondchapitreestconsacrltudephytochimiquedelcorcedunarbredes
savanesafricaines,AnogeissusleiocarpusGuill.&Perr.(Combretaceae).Nousyavons
identifi des triterpnesolanoliquesainsi que des polyphnols drivs de
lacideellagique.
Laprsencedanslescombretacesdetriterpnesdetypeolanoliqueatdiscutesurun
plan chimiotaxonomique. Enfin, une troisime partie expose les
rsultats de ltude phytochimique et pharmacologique dune plante
endmique algrienne semi-dsertique Limoniastrum feei (Girard) Batt.
(Plumbaginaceae). Cette espce a t slectionne sur des critres
cologiques : elle subit en effet un stress oxydant important
(stress hydrique, irradiation UV, tempratures leves, etc.)
susceptible dorienter ses voies mtaboliques vers la synthse de
constituants naturellement pourvus de proprits anti-oxydantes. Un
fractionnement bioguid nous a permis disoler et didentifier ces
anti-oxydants naturels. Ce travail a t initi par le Professeur
Samir Benayache de lUniversit Mentouri de Constantine,
phytochimiste spcialiste de la Flore des dayas, au sud de lAlgrie.
14 Chapitre 1 Etude ethnopharmacologiquedEuphorbia stenoclada
Baill. (Euphorbiaceae) 15 6.Introduction
Lasthmeestunemaladiechroniquedespoumonscaractrisepardesproblmes
respiratoiresetdessymptmescommelessoufflement,lesifflement,lacontractiondela
poitrineetlatoux.Lessymptmesdelasthmevarientenfonctiondelgeetsasvrit
diffredunindividulautre.Selonle GlobalBurdenofAsthmaReport ,
(www.medicalnewstoday.com/articles/70770.php),lasthmeaffecteenviron300millionsde
personnes dans le monde et 100 millions de nouveaux cas sajouteront
en 2025.Durant plusieurs dcennies, le traitement de lasthme a t
considrablement amlior, surtout cause de ladisponibilit de
plusieurs classes de mdicaments ayant des mcanismes daction
diffrents (pour revue, voir Chu et Drazen, 2005).
EnAfrique,lescarencesderessourcesconomiquesetlemanquedaccsauxsoins
entraventlagestionefficacedelasthme
;ainsi,laprvalencedecettemaladieaaugment
dunefaonmarquantedanslesderniresannes.Lurbanisationcontinuelleet
loccidentalisationdumodedevieenAfriquecontribueraitaugmenterlenombre
dasthmatiques durant la prochaine dcennie (engnral, lasthme est
plus rpandu en zones urbaines quen zones rurales)
(www.medicalnewstoday.com/articles/70770.php).Le
GlobalBurdenofAsthmaReport estimequeprsde50millionsdafricains
sontasthmatiques.Deplus,danscertainspaysdAfrique,lathrapieparlesagonistes-
inhalsetlesglucorticostrodesnesontpasinclusdanslalistedesmdicamentsessentiels,
mme sils sont actuellement recommands par lOrganisation Mondiale de
la Sant (OMS).
Anotreconnaissance,aucunetudepidmiologiquesurlasthmeMadagascarna
tpublie.Lesmaladiesinfectieusessonttroitementliesauxconditionsdevie,la
salubritdelenvironnementetlapauvretengnral,ellesreprsententtoujoursune
proportionmajeure de la mortalit dans toutes les tranches dge
(Rivire et al., 2005). Dans la rgion nord de Madagascar les
infections respiratoires aigus touchent 12,6% des personnes
consultes dans les centres de sant de base, ce qui constitue la
deuxime maladie infectieuse dpiste aprs le paludisme (30 40 %)
(Rivire et al.,
2005).Lespatientsmalgachessetournentverslamdecinetraditionnelleetsesoignentpar
les plantes utilises pour leurs vertus anti-asthmatiques. Cette
mdecine traditionnelle s'appuie
essentiellementsurlesconnaissancesempiriquesdestradipraticienslocauxainsiquesurla
richessedelabiodiversitdelafloretropicalemalgache.Lesenqutesethnobotaniques
effectuesdanslargionnord-ouestdeMadagascarontmontrque12%desplantes
16 inventories sont utilises pour le traitement de maladies qui
touchent le systme respiratoire (lasthme, la bronchite, la toux, la
coqueluche et lhmoptysie) (Ratsimiala et al., 2005).Citons par
exemple Euphorbia hirta, une espce trs rpandue dans toutes les
rgions tropicales et subtropicales du monde. Cette petite plante
herbace est reconnue pour ses effets expectorants (en Inde),
antispasmodiques (en Afrique quatoriale, dans les Antilles
franaises,
enInde,enRpubliquedominicaine,Trinidad)etantitussifs(enAustralie).Elleestaussi
rputepourseseffetssdatifsdelappareilrespiratoire,parfoisutiliseassociedes
sdatifs bronchiques tels que Gridelia robusta, dans des prparations
pour inhalation (Lanhers et al., 2005).
NousnoussommesintresssuneautreEuphorbe,endmiqueMadagascar :
Euphorbiastenoclada.IlsagitnonpascommeE.hirtaduneherbacemaisdunarbuste
dont les parties ariennes sont utilises par la population locale en
infus pour le traitement de lasthme et de bronchites aigus (Lin et
al., 2002).
Notreobjectifatdessayerdevaliderscientifiquementlesusagestraditionnels
antiasthmatiques des parties ariennes dEuphorbia stenoclada :
-Enutilisantunmodlecellulaire,nousavonsisolparfractionnementbioguidles
constituantsparticipantlactivitmiseenvidencedansunextraitserapprochantde
lusage traditionnel (extrait aqueux).
-NousavonsparailleursmontrquEuphorbiastenocladarenfermedesconstituantsanti-oxydantssusceptiblesderduirelestressoxydatifauquelsontsoumislespersonnes
atteintes dasthme. 17 7.Prsentation de la plante Le genre Euphorbia
est le plus rpandu de la famille des euphorbiaces et comprend 2000
espces caractrises par la production dun latex laiteux (Jassbi,
2002). Euphorbia stenoclada Baill. est un arbuste xrophyte de 1,8
4,6 mtres de hauteur. Il a plusieursnomsvernaculaires
commeEuphorbearborescente,etestdsignparles malgaches par Famata ou
Famatse. Il sagit dune espce endmique Madagascar et a t rcolte dans
la rgion de Tular, situe au Sud-Est de Madagascar.
Elleatslectionnesurdescritresethnopharmacologiquescarelleestutiliseparla
populationlocaleeninfuspourletraitementdasthmeetdebronchitesaigus.(Linetal.,
2002). Figure 1. Carte gographique de Madagascar (Source :
http://www.abcmadagascar-voyages.com/pageID_4119428.html) 18 3.
Classification botanique Embranchement : Spermaphyte
S/embranchement : Angiospermes (Magnoliophyta) Classe :
Dicotyldones (Magnoliopsidae) Sous classe : Rosidae Famille :
Euphorbiaceae Sous-famille : Euphorbioideae Tribu : Euphorbieae
Sous-tribu : Euphorbiinae Genre : Euphorbia Espce : stenoclada
Baill. Figure 2. Arbuste dE. stenoclada (source :
http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Euphorbia_stenoclada.jpg 19
4. Bilan bibliographique sur le genre Euphorbia 4.1. Activits
pharmacologiques Legenre Euphorbia a fait lobjet de nombreux
travaux scientifiques mettant en vidence
desactivitsvaries.(cf.Tableau1).Lamajoritdentreellesconcernentsurtoutdeseffets
anti-prolifratifs(anti-tumoral,apoptotique,cytotoxique)etantimicrobienne(anti-virale,
antibactrienne, anti-fongique). Tableau 1 : Activits biologiques du
genre Euphorbia Nom de lespceActivitsRfrences E.lagascae E.
fusiformis E. peplus antibactrienneDuarteet al., 2007 Natarajan et
al., 2005 Cateni et al., 2003 E. lagascae E. chamaesyce E. peplus
anti-tumorale Pusztai et al. 2007 Duarteet al., 2006 Tanaka et al.,
2006 Ogbourne et al., 2004 E.fischeriana E. cheiradenia E. kansui
apoptotiqueLuo et Wang, 2006 Amirghofran et al., 2006 Yu et al.,
2005 E. decipiens E. decipiens anti-uraseLodhi et al., 2006 Ahmad
et al., 2003 E. tirucallianti-arthriteBani et al., 2007 E.
cornigera E. cactus E. ebracteolata E. characias cytotoxiqueBaloch
et al., 2006 Al-Fatimi et al., 2005 Shi et al., 2005a Magan et al.,
2004 E. hirtaantimicrobienneSudhakar et al., 2006 E. hirta E.
kansui anti-allergiqueSingh et al., 2006 Nunomura et al., 2006 E.
milii E. pulcherrima molluscicideSermsart et al., 2005 Singh et
Singh, 2005 E. kansui E. jolkini anti-cancreuseMiyata et al., 2006
Kuo et al., 2006 E. peplusanti-inflammatoireCorea et al., 2005 E.
paraliasantidiarrhiqueAtta et al., 2005 E.
royleanaimmunosuppressiveBani et al., 2005 E. thymifolia E. jolkini
E. segetalis anti-viraleYang et al., 2005 Cheng et al., 2004
Madureira et al., 2003 E. decipiensanti-nociceptiveAhmad et al.,
2005 E. hirtaanti-plasmodialeTona et al., 2004 Lespce E. stenoclada
slectionne na, quant elle, pas t tudie auparavant. 20 4.2. Etudes
phytochimiques Diffrentes classes du mtabolisme secondaire ont t
identifies dans ce genre : terpnes, flavonodes, (Singla et Pathak,
1990). Ces rsultats sont consigns dans le tableau 2. Tableau 2 :
Etudes phytochimiques antrieures du genre EuphorbiaClasse
phytochimique Nom de lespce Constituants identifisRfrences
Diterpnes E. decipiens E. teheranica E. cheiradenia E.
marschalliana E. heteradena E. guyoniana
15-O-acetyl-3-O-propionyl-5-O-butanoyl-7-O-nicotinoylmyrsinol (1)
15-O-acetyl-3,5-O-dibutanoyl-7-O-nicotinoylmyrsinol (2)
4,12-dideoxy(4a)phorbol-13-hexadecanoate
24-methylenecycloartane-3,28-diol Rechinger, 1964 Haba, 2007
Triterpnesetstrodes E. decipiens E. petiolata E. falcata E. lanata
E. tinctoria E. myrsinites acetate damyrine, lupeol,acetate de
lupeol, ginnone, ambreine, lupone Cycloartenol,
24-methylenecycloartanol Obtusifoldienol, c-euphorbol, amyrine (5)
Sitosteryl-3--D-glucoside euphorbol taraxrol Ulubelen et al., 1986
Rustaiyan et al., 1982 Aynehchi et Hakimzadeh, 1978 Aynehchi et
al., 1978 Aynehchi et Kiumehr, 1972, 1974, 1977 Aynehchi et al.,
1972 SesquiterpnesE. chrysocoma
(6R)-2-chloro-6-[(1S)-1,5-dimethylhex-4-en-1-yl]-3-methylcyclohex-2-en-1-one
Shi et al. 2005b Flavonodes et coumarines E. larica E. lanata E.
tinctoria kaempferol-3-O-glucoside, quercetine-3-O-glucoside,
kaempferol-3-rutinoside, rutine, 6-methoxyapigenine
kaempferol-7-O-rhamnoside, kaempferol-3-O-galactoside,
quercetine-7-O-digalactoside,esculetine
quercetine,quercetine-7-glucoside, kaempferol rhamnoside Ulubelen
et al., 1983 Aynehchi et al., 1978 Aynehchi et Ulubelen, 1974
Phnols E. decipiens methyl (2,4-dihydroxy- 3-formyl-6-methoxy)
phenyl cetone (3)et Ahmad et al., 2002 21 OR
E. teheranica E. hylonoma E. ebracteolata 1,1-bis
(2,6-dihydroxy-3-acetyl-4-methoxyphnyl) methane (4) methyle gallate
octacosyl cis-ferulate
2,2',4,4'-tetrahydroxy-6,6'-dimethoxy-3,3'-dimethyl-7,5'-bisacetophenone,2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methylacetophenone
4-O--L-arabinofuranosyl-(16)--D-glucopyranoside et
decahydro-1,4,7,7-tetramethyl-1H-cycloprop[e]azulene-2,5-diol
(1R,2R,4S,5S,7R,7R) Jassbi, 2000; Ahmad et Jassbi, 1999 Ruan et
al., 2007 Yin et al. 2005 R1 R2 (1) Pr Bu (2) BuBu OR Pr OR
Bu CHOOHOHMeOO (3) MeOOOOMeHO OHOH OH (4) OOR1OR2ONiCOAcO 22 HO
(5) Figure 3. Structures de quelques molcules isoles du genre
Euphorbia. Plusieurs Euphorbes comme Euphorbia hirta et E.
stenoclada sont utilises par la population malgache pour le
traitement dasthme et de dautres maladies des voies respiratoires.
Notre intrt est bas sur ltude de leffet de E. stenoclada sur la
prolifration des cellules musculaires lisses bronchiques. 5.
Lasthme 5.1. Gnralits Lasthmeestunemaladie
particulirementinvalidanteapparaissant gnralementaucoursdespremires
annesdelavie,maisgalementlge adulte,etquinebnficie,lheure actuelle,
daucun traitement curatif (Gergen et al., 2001).
Diffrentestudespidmiologiquesontrapportuneaugmentationdelaprvalencede
lasthme,chezlessujetsjeunes,aucoursdestrentederniresannes,dansdiffrentspays,
dont la France (Neukirch et al., 1995). Cette prvalence se situe,
chez lenfant, entre 2,1et 32,2 %, en fonction des pays. Une
dfinition consensuelle de lasthme a tabli quil sagit dune maladie
chronique des voies ariennes, caractrise par une inflammation de la
paroi bronchique (figure 4) (National
InstituteofHealth,1997).Cetteinflammationestresponsabledessymptmes(dyspne
Figure 4. Modifications morphologiques dans une bronche inflamme 23
paroxystiquesifflante,essoufflement,sensationdoppressionthoracique,toux)etdune
insuffisance respiratoire de degr variable qui est, au moins en
partie, rversible spontanment ou laide dun traitement.
Leprocessusinflammatoiredanslasthmesecaractriseparuneaccumulationdansla
paroibronchique,dosinophiles,delymphocytesTdephnotypeCD4+ouCD8+,de
lymphocytes T et de cellules B, de macrophages, de cellules
dendritiques, de mastocytes et
deplaquettes(Djukanovicetal.,1990).Laplupartdecestypescellulairesprsententdes
marqueursdactivationleursurface(figure6).Ledegrdesvritdelasthmedtermine
lesmodalitsdestraitementsdespatients.Ceux-ciagissentsurlasurvenuedessymptmes
(mdicamentsbronchodilatateurs,agonistesdetype2-adrnergiques)etserventlimiter
linflammation(corticodes).Leffetdescorticodes,quisetraduitparunediminutiondes
symptmesetdunombredecrisesetparuneamliorationdelobstructionbronchique,
semble conscutif leurs proprits anti-inflammatoires et
immunosuppressives. En effet, une
inhibitiondelasynthsedediffrentescytokines,chimiokinesetfacteursdecroissanceest
observe (Barnes et al., 1996). 5.2. Le remodelage bronchique :
caractristiques histopathologiques dans lasthme
Diffrentestudescliniquesonttablique,malgruntraitementparlescorticodesbien
conduit,entre5et10%(selonlespays)depatientsasthmatiquesprsententundclin
progressifetirrversibledeleurfonctionrespiratoire(Langeetal.,1998).Acettevolution
pjorativepeutsesurajouteruneobstructionbronchiqueirrversible,responsabledune
insuffisance respiratoire chronique et dun handicap fonctionnel
parfois svre (Chung et al., 1999). Ce sont ces cas qui rendent
compte de la plus grande partie des cots lis lasthme, cots directs
en rapport aveclhospitalisation et le traitement mdical, ou cots
indirects, lis pour lessentiel labsentisme scolaire ou
professionnel (Chung et al., 1999). La survenue de
cesaltrationsfonctionnellesrespiratoiresseraitlaconsquencedunpaississement
progressifdelaparoibronchiquedunprocessusderemodelagetissulaire(Eliasetal.,
1999).Surleplanhistopathologique,leremodelagebronchiquesecaractriseparune
desquamationdelpithliumaccompagneduneaugmentationdelespacesituentreles
cellulespithlialesbasales,unehypertrophieetunehyperplasiedumusclelisse,une
hypertrophiedescellulesglandulaires,associeunehyperscrtiondemucusetune
fragmentationdesfibresdlastinedutissuconjonctif.Unpaississementdelamembrane
24 basale, accompagn dune fibrose sous-pithliale, caractrise par un
dpt de collagne, de
tnascineetdefibronectineavecuneaugmentationdunombredefibroblastesetde
myofibroblastes est galement observ (Elias et al., 1999) ;Bousquet
et al., 2000) (Figures 5-6).Ces modifications structurales sont
observes dans les bronches segmentaires et semblent
spcifiquesdelasthme.Ainsi,lanalysedeprlvementsbronchiquesdesujetsatteintsde
broncho-pneumopathiechroniqueobstructive,uneautremaladieinflammatoirepulmonaire
chronique saccompagnant dune dtrioration irrversible de la fonction
respiratoire (Barnes
etal.,2000),montrepluttunemtaplasiepithliale,sanspaississementdelamembrane
basale et un processus de fibrose qui prdomine uniquement dans les
voies ariennes distales et le parenchyme pulmonaire (Jeffery et
al., 2001). Figure 5. Caractristiques histopathologiques du
remodelage bronchique dans lasthme. Sur une coupe provenant dune
biopsie bronchique dun sujet tmoin (A), lpithlium
estintactetlamuqueusebronchiqueneprsentepasdinfiltratdecellules
inflammatoires, ni de fibrose sous-pithliale. La masse musculaire
est limite.
Surdescoupesissuesdebiopsiesbronchiquesdepatientsasthmatiques(B-E),
lpithlium est ls (B, C et D), la membrane basale (MB) est paissie
(D), la masse musculaire est augmente de faon notable (E) et la
muqueuse bronchique est infiltre par des osinophiles (B), des
fibroblastes et des myofibroblastes (C et D), qui scrtent du
collagne (C).
Desimmunomarquagesontteffectussurdescryosectionsfixesenactoneen
utilisantdesanticorpsreconnaissantspcifiquementlesosinophiles(B),les
fibroblastesetlesmyofibroblastes(D),lecollagnedetypeIV(C)etlescellules
musculaires lisses (E), suivis dune rvlation la phosphatase
alcaline (grossissement 300).(source : Benayoun et al., 2003). 25
Figure 6. Modifications structurales en cas dasthme. Fb :
fibroblastes ; Ep : Epithlium ; Mc : mastocytes ; cml : cellules
musculaires lisses ; Eo : Eosinophiles ; LT/LB : lymphocytes
T/lymphocytes B ; A.Desquamation de lpithlium B.Fibrose sous -
pithliale C.Augmentation de la vascularisation D.Augmentation de
linnervation sensitive E.Hyperprolifration des muscles lisses
5.2.Causes et facteurs de risque Il est fondamental pour l'avenir
de l'asthmatique de dterminer la cause de son asthme.
Lorsquel'allergneestidentifi,onparled'asthmeallergique,atopiqueouencore
d'hyperractivitbronchiquespcifique.Lasubstanceallergisantepeutseprsentersous
formeinhale (dansl'air)ousousformeingre
(alimentsoumdicaments).Dansl'air,les
plusfrquemmentencausesontlespoussiresdemaison,lespollens,lesmoisissures,ou
encoredeslmentsprsentsdansl'environnementprofessionneldumalade
:farinedu boulanger par exemple. Dans certains cas, l'lment
responsable de l'asthme ne peut tre mis
envidence.Onparled'hyperractivitbronchiquenonspcifique.Danslesdeuxcas,il
convientderechercherdesfacteursaggravantsdelamaladieasthmatiquetelle
tabagisme
(actifoupassif),uneffortphysiqueouunstress.Sontgalementrecherchs
:un Bronche saineBronche inflamme A B C D E 26
refluxgastro-sophagienouunevascularite.Lanotiond'unterrainfamilialoupersonnel
allergique peut se retrouver lors du diagnostic d'asthme. (Godard,
2005) 5.3.Les
allergnesL'tiologieallergique,trsmajoritairechezl'enfant,dcrotsensiblementavecl'ge.Chezl'enfant,l'asthmeestdans9095%d'origineallergiquemmes'iln'estpastoujours
faciledemettreclairementenvidencel'allergneimpliqu.(Godardetal.,2000
;Godard, 2005) 5.4.1. Les pneumoallergnes Ce sont des allergnes
prsents dans lair ambiant et qui, inhals en quantit minime, sont
capables de sensibiliser les sujetset de dclencher les symptmes
enarrivantau niveau des muqueuses respiratoires. Citons par exemple
: -les allergnes polliniques, -les acariens,
-lesprotinesanimalesprovenantdanimauxdomestiques,dexprienceoude
compagnie,-les arthropodes (tels que criquets ou blattes) peuvent
tre responsables dasthme dans certaines rgions chaudes et humides,
-les moisissures et les levures atmosphriques, -les bactries, qui
ont peut-tre un rle allergisant mais lasthme induit par une
allergie bactrienne semble exceptionnel. 5.4.2. Les trophoallergnes
Les alimentset les boissons peuventtre responsables de
manifestations respiratoires par le biais de sensibilisation
allergique. 5.4.3. Les allergnes mdicamenteux
Cesallergnesserencontrentdanslindustriepharmaceutique,dansleslocauxde
productionnotammentainsiquedanslesmilieuxhospitaliers.Ilssontainsisusceptiblesde
toucher tous les professionnels de sant ainsi que les patients. 27
5.4.4. Les allergnes professionnels On estime 10% la part
professionnelle des asthmes apparus lge adulte. Citons par exemple
lasthme la farine de bl pour les boulangers, aux isocyanates pour
les peintres, aux poussires de bois pour les menuisiers ou bnistes.
5.4.5. La pollution atmosphriqueLes bronches et alvoles sont
largement ouverts sur lextrieur et offrent aux nuisances
unesurfacedelordrede90100m2.Lesgazouparticulesrencontrsdanslatmosphre
relvent essentiellement de : -Lapollutionacido-particulaire
:ledioxydedesoufre(SO2),lesparticulesen suspension et les arosols
acides (sulfates), -La pollution photo-oxydante : lozone et le
dioxyde dazote.
Lesprincipalessourcesdepollutionsontlesfoyersfixesdecombustion,lesusines
dincinration des dchets mnagers et industriels, le trafic
automobile. 5.4.6. Le tabagisme Chez l'asthmatique, le tabac est un
cofacteur indiscutable : 20 % des asthmatiques sont
desfumeurs.Parlui-mme,l'arosoltabagiqueprovoqueuneinflammationdesvoies
ariennesavechyperscrtion,paralysie(etdestruction)ciliaire.Letabagismeactifestpar
ailleurs responsable d'une augmentation des IgE sriques. 5.4.7. Les
virus Les tudes pidmiologiques montrent que prs de 50 % des crises
d'asthme du jeune
enfantsontliesuneviroserespiratoire.Avantl'gededeuxans,levirusrespiratoire
syncitial est le plus souvent en cause (40 70 % des cas). 5.4.8.
Autres facteurs favorisants Ils sont nombreux. Citons par exemple :
-les infections germe banales,-lasthme avec intolrance
laspirine,-lasthme li une sensibilit aux sulfites (soit 4 8 % des
asthmatiques),-lasthme et le reflux gastro-sophagien (RGO)
-lasthmed'effort,quisecaractriseparlasurvenued'uneobstructionbronchique
l'arrt de l'effort, typiquement 5 15 minutes aprs. 28 5.5.
Mdicaments
antiasthmatiquesIlexistedeuxprincipauxtypesdemdicamentscontrel'asthme:lesmdicamentsde
contrle(prvention)etlesmdicamentsdesecours.(Li,2006).Pourlamajoritdes
asthmatiques, le mdecin prescrit les deux types de mdicaments:
5.5.1. Le mdicament de contrle Il est utilis quotidiennement chez
lasthmatique, en prventif. Tableau3
:Exemplesdespcialitspharmaceutiquesutilisesenprventiondecrises
dasthmeClasse thrapeutique Mdicaments commercialiss Caractristiques
Corticostrodes inhals (voie pulmonaire) Corticostrodes (voie orale)
budsonide(Pulmicort) fluticasone (Flovent) Prednisone, Prednisolone
(PediaPred et Dexamethasone) Ils permettent une pntration directe
dans les poumons et une diminution des effets secondaires observs
lors dune administration orale; Ils rduisent l'inflammation
(gonflement, rougeur et mucosits) des voies respiratoires. Ils sont
prconiss si l'inflammation des voies respiratoires est grave et si
le patient na pas le plein contrle de ses symptmes d'asthme.
Bronchodilatateurs action prolonge Thophylline salmtrol (Serevent)
formotrol (Foradil, Oxeze) TheoDur Uniphyll Phyllocontin TheoLair
Ils aident garder les voies respiratoires ouvertes, relaxer les
muscles et prvenir les crises d'asthme. Ils ne devraient pas tre
utiliss titre de mdicament de secours. Ils sont toujours prescrits
avec un corticostrode inhal. Il sagit dun bronchodilatateur qui
fonctionne directement sur les muscles des voies respiratoires pour
les relaxer. Elle n'est pas couramment utilise pour traiter les
symptmes d'asthme. Elle est utilise en soire, lorsque
l'essoufflement nuit au sommeil. Antagonistes des rcepteurs de
leucotrines zafirlukast (Accolate) montelukast (Singulair) Les
antagonistes des rcepteurs de leucotrines agissent contre une des
composantes inflammatoires de l'asthme et protgent contre la
bronchoconstriction. 29 5.5.2. Le mdicament de secours Il doit tre
toujours gard porte de la main en cas d'urgence : lorsque la
respiration devient difficile,en cas de crise d'asthme ou
d'exercice physique. Le mdicament de secours
necontrlepaslessymptmesd'asthme,longterme.Maisilagitrapidement,rduitles
effetsdesdclencheursd'asthme,commel'exercicephysiqueetl'airfroid.Soneffetest
cependant de courte dure. Tableau4
:Exemplesdespcialitspharmaceutiquesutilisesencasdecrises
dasthmeClasse thrapeutique Mdicaments commercialissCaractristiques
Bronchodilatateurs 2 agonistes salbutamol (VentolinApo-Salvent Novo
Salmol) fenoterol (Berotec) terbutaline (Bricanyl) Ils permettent
de soulager les symptmes de la toux, de l'oppression thoracique, de
la respiration sifflante et de l'essoufflement. 6. Matriel et
mthodes 6.1. Extraction et isolement Les parties ariennes
dEuphorbia stenoclada (ES) ont t collectes en t 2003 dans la rgion
de Tular (au sud-est de Madagascar) et authentifie par un botaniste
confirm, Mr
A.Rakotozafy.Unchantillon(ref4768)atdposdanslherbierduparcbotaniquede
Tsimbazaza.11g du mlange de feuilles et tiges ont t schs, finement
broys et mis en contact avec de lEtOH95(enrespectantunrapport1
:10,soit100mlpour10gdepoidssecdematriel
vgtal),sousagitationmagntiquetempratureambiante.Lextractionatrenouvele
troisfois,chaquemacrationdurant5h.Les3extraitssuccessifsonttfiltrs,combinset
vaporssecsouspressionrduite.Lextraitobtenu(appelextraitEtOH)atensuite
mis en suspension dansde leau distille (200 ml) et soumis
uneextraction liquide-liquide au cyclohexane (3 200 ml). Lextrait
total ainsi dlipid (appel ES-tot) a t vapor sec sous pression
rduite. Le rendement dextraction obtenu est de 13,2% (p/p) soit
1,46 g dES-tot. 30 Ungrammede (ES-tot)
atsolubilisdansdumthanolpuisfractionnparflash chromatographie en
phase inverse (FLASH 40+M, KP-C18-HS, 40 mm 150 mm, Biotage,
DyaxCorp.Company),enutilisantungradientdlutionde10100%MeOH(dbitde40
mL/min).37fractionsontainsitrcuprespuisanalysesparCCManalytique(gelde
siliceF254,ref5554,Merck)enutilisantcommeluantunmlangedactatedthyle/acide
formique/acideactique/eau)(100:11:11:27
;v/v/v/v).Lesspotssontdtectssouslampe ultra-violette 254 et 366nm
et rvls avec le ractif de NEU (2 - aminothyldiphnylborate de sodium
1 % dans le mthanol). Les fractions similaires sont ainsi regroupes
en 5 fractions nommes FA FE. Lvaluation biologique a port sur ces 5
fractions de manire ne slectionner que la fraction
active(FE).Celle-ciatensuitepurifieparCLHP-C18semi-prparative(25021mm,
Nucleodur,Macherey-Nagel)selonlesconditionschromatographiquesdtaillesdans
le
tableau5,enutilisantundbitde10ml/mineteneffectuantunedtection370nm(115
UV detector, Gilson). Tableau 5 : Gradient dlution utilis en CLHP
semi-prparative Temps (min)0,01M H3PO4(%)MeOH(%) 0955 5955 155050
403070 450100 500100 Le fractionnement de (FE) a permis disoler 6
sous-fractions dont la puret a t contrle par
CLHP-C18analytique(250mm4,6mm,Nucleodur,Macherey-Nagel ;9010pumpet
Prostar photodiode array detector, Varian) dans les conditions
chromatographiques dtailles
dansletableau6,enutilisantundbitde1ml/minetenutilisantundtecteurbarettede
diodes (Prostar Diode Array Detector, Varian). Tableau 6 : Gradient
dlution utilis en CLHP analytique. Temps (min)0,01M H3PO4(%)MeOH(%)
0955 105050 353070 400100 450100 50955 31 Tableau 7 : Gradient
dlution utilis en CLHP analytique. Temps (min)0,01M H3PO4(%)MeOH(%)
0955 105050 453070 502080 550100 650100 70955
Lesconstituantsdelafractionactive(FE)onttidentifisparCLHP/UV/SM(CLHP,
Agilent; Polaris column; Bruker 3000+ mass spectrometer) et
co-lution avec leurs standards respectifs. Les spectres de masse
sont obtenus en modes positif et ngatif.
LensembledufractionnementdelextraitdEuphorbiastenoclada,suivantuneapproche
bioguide, est rsum dans la Figure 7. Parties ariennes dES
Epuisement dans lEtOH Extrait EtOHDlipidation ExtraitC6H12
FA FB FC FDFE
FE1 FE2 FE3FE4 FE5FE6 Figure 7.Protocole dextraction et de
purification dE. stenoclada C18-Flash chromatographie (gradient:
H2O-MeOH) C18-CLHP semi-prparative (gradient: H2O-MeOH) ES tot 32
6.2. Traitement des cellules et test de prolifration cellulaire
Lescellulesmusculaireslissesbronchiqueshumaines(CMLBH)ontttraitespar
linterleukine-1-bta ( IL-1, 10U/ml, R&D Systems, Lille, France)
ou son solvant de dilution pendant4jours
;lemilieuestchangquotidiennement(DulbeccosmodifiedEagles
medium(DMEM/F12,srumdeveauftal10%,L-Glutamine(2mM),acidesaminsnon
essentiels(1
:100),penicilline50U/ml),streptomycine(50g/ml)(Invitrogen),insuline(5
g/ml) (Lilly, St Cloud, France). Les cellules sont prtraites par
lextrait total (ES tot), les 5 fractions FA FE, les six
sous-fractionsFE1FE6,dansleurssolvantsrespectifs(1%EtOHenmilieudeculture)pendant
1h avant traitement avec lIL-1, chaque jour pendant 4 jours.
LaprolifrationcellulaireestmesureavecletestXTT(2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide),(CellProliferationkitIIXTT,Roche
Diagnostics,Mannheim,Germany),selonlesrecommandationsdufournisseur.Lessaiest
bassurlacapacitdescellulesvivantesrduireleselXTTencompossformazande
couleurorange.Lecolorantformesthydrosolubleetsonintensitestimepar
spectrophotomtrie.Lintensitdelacolorationestproportionnelleaunombredescellules
vivantesetlabsorbanceestimmdiatementmesure450
nm.Lescellulessontdposes
dansdesplaquesde96puits(3000cellulesparpuit)dansunmilieudesevrage(srumde
veauftaldilu(0.3%),milieuDMEM-F12,L-Glutamine,acidesaminsnonessentiels,
penicilline-streptomycine)etlaissesadhrerpendant3h,puistraitescommedcrit
prcdemmentpendant4jours.LescellulessontlaissesragiraveclXTT(1
mg/mL) pendant 3 h. 33 Figure 8. Courbe talon des cellules
10gdelextraitsontdissousdans1mldthanol50%etvaluspourleureffetanti-prolifratifsurlesCMLBH.Delammemanire,touteslesfractionsetsous-fractionssont
dissoutesdansdelthanol50%1%deconcentrationfinaleetvaluespourleureffet
anti-prolifratif.Lechoixdusolvantateffectuenraisondelabonnedissolutiondes
extraits et surtout pour son atoxicit pour les cellules par
comparaison avec le DMSO 5% et 1% (concentration finale) et lthanol
absolu 1%.
Unerelationdestructure/activit(RSA)atfaiteparcomparaisondelactivitanti-prolifrativedelaquerctine(Chromadex,ASB-00017045-500)etquelquesunsdeses
drivscommercialementdisponibles
:3-mthylquerctine(Chromadex,ASB-00009525-005), pentamthylquerctine
(Chromadex ASB-00017080-010), hyproside =
querctine-3-O-galactoside(Chromadex,ASB-00008916-005),quercitrine=querctine-3-O-rhamnoside
(Chromadex, ASB-00017170-005) et isoquercitrine=
querctine-3-O-glucoside (Chromadex, ASB-00009505-005).Leur
valuation biologique a t effectue 2 concentrations : 10 et 20g/mL.
6.3. Activit antiradicalaire (test au DPPH) 6.3.1. Principe du
testLeDPPH(1,1-Diphnyl-2-picrylhydrazyl)estunradicallibrestabledecouleur
violacequiabsorbe517nm.Enprsencedecompossanti-radicalaires,leradicalDPPH
y = 0,0001x - 0,2356 R2 = 0,9854 0 0,5 11,5 2 2,5
05000100001500020000 Nombre de cellules par puits Abs 34 est rduit
et change de couleur en virant au jaune. Les absorbances mesures
517 nm servent calculer le pourcentage dinhibition du radical DPPH,
qui est proportionnel au pouvoir anti-radicalaire de
lchantillon.
NN.NO2NO2O2NNN:HNO2NO2O2NHOR1,1-Diphnyl-2-picrylhydrazyl (DPPH.)
Violet(DPPH):HPale Orange Figure 9.Rduction du radical DPPH 6.3.2.
Protocole Le protocole utilis est celui dcrit par Parejo et al.,
2002 et a t rsum dans le tableau ci-dessous. Tableau 8 : Protocole
exprimental (test du DPPH) DPPHchantillonMeOH/H2O (50%) Blanc
chantillon00,75ml1,5ml Blanc DPPH (100%)1,5ml00,75ml
Echantillon1,5ml0,75ml0 Incubation pendant 20 min temprature
ambiante La mesure se fait au spectrophotomtre aprs 5 minutes de
raction. Ce temps a t fix aprs
destudesdecintiquederactionentre5minuteset30minutes,lepourcentagede
dcoloration 517 nm en tait inchang. Celui-ci est calcul en
utilisant la formule suivante : % dcoloration = 1- (DO chantillon
DO blanc chantillon) 100 DO blanc DPPH 35
Ilestfonctiondelaconcentrationdelchantillontest.Lacourbesemi-logarithmique
obtenue permet dtablir la CI50 de lchantillon qui correspond la
concentration permettant 50% de dcoloration. Les dilutions des
chantillons tests sont comprises entre 1 et 100 pour un premier
test, puis
lintervalleestrduitautourdelaCI50estime.Chaqueconcentrationesttesteen3
rptitions et chaque chantillon est test en triplicatas. 6.4. Dosage
des polyphnols totaux6.4.1. Principe
Lesteneursenpolyphnolstotauxdesextraits,fractionsetsous-fractionssont
dterminesaumoyenduractifdeFolin-Ciocalteu(Parejoetal.,2002).Cedernierest
constituparunmlangedacidephosphotungstiqueetdacidephosphomolybdiquequiest
rduit,lorsdeloxydationdesphnolsenmlangedoxydesbleusdetungstneetde
molybdne.Lacolorationbleueproduitepossdeuneabsorptionmaximaleauxenvironsde
750nm.Labsorbance,parrfrenceunegammetalonobtenueavecunacidephnolique
(acidegallique),permetdedterminerlaquantitdepolyphnolstotauxprsentedansun
extrait. Elle est exprime en mg dquivalent acide gallique par g de
matire sche. 6.4.2. ProtocoleTableau 9 : Protocole exprimental
(test Folin-Ciocalteu) 6.4.3. Courbe talon de lacide gallique
Lagammedeconcentrationsdacidegalliqueutilisepourledosagedespolyphnolsetles
absorbances respectives mesures 725nm sont reprsents dans le
tableau 10. Tableau 10 : Absorbances de la gamme de concentration
dacide galliqueBlancEchantillon Extrait(100 g/ml) (l)-100 H2Od
(l)500400 Ractif de Folin 1N (l)250250 Incuber pendant 2 min Na2CO3
20% (l)12501250 Volume total (l)20002000 Agiter, puis incuber
pendant 40 min lobscurit et temprature ambiante, mesurer
labsorbance 725 nm. 36 Acide gallique [g/ml]Absorbance 50,043
100,115 200,255 300,424 500,7 600,817 700,986 801,094 y = 0,0138xR2
= 0,997800,20,40,60,811,20 10 20 30 40 50 60 70 80 90concentration
(g/ml)A Figure 10. Courbe talon de lacide gallique 6.5.
Statistiques
Lesrsultatsdestestsdeprolifration,ladterminationdupouvoiranti-radicalaireetle
dosagedespolyphnolsontteffectusentriplicatas.Pourletestdeprolifration,les
rsultatssontexprimsenmoyenneSEM(cart-typelamoyenne).Lesdonnesontt
analyses par le test de Student, le test de Student-Newman-Keuls en
cas de comparaison de plus de 2 variables, ou par le test de
Dunnett pour la comparaison des donnes dose-rponse avec un niveau
de significationP>10 3-12,84 0,692,89 0,022,85 0,2 3-22,54
0,452,2 0,062,1 0,08 41,82 0,261,38 0,393,83 0,82 52,23 0,131,48
0,195,79 0,49 63,27 0,551,60 0,141,86 0,12 Acide ascorbique0,59
0,121,62 0,625,8 0,79 Les rsultats sont exprims en moyenne
cart-type de triplicatas. a, c Les valeurs sont exprimse en CI50
(g/ml). b Les valeurs sont exprimes en EC1 (M dquivalent de
Fe2+/ml).
Lesactivitsanti-oxydantesdescomposspursonttcomparesaveccellesde
lextraitAcOEtdefeuillesdeLimoniastrumfeeietlacideascorbiquepriscommerfrence
positive (tableau 19). Ainsi, dans le test DPPH, tous les composs
isols, lexception du compos (2), ont montr un effet anti-oxydant
potentiel. Lacide gallique (1) est aussi efficace que le tmoin de
rfrence(acideascorbique).Enfait,lescomposs(1),(3-2)et(5)sontutilissenroutine
comme des substances de rfrence dans les tests anti-oxydants
(Erlund, 2004).
DansletestFRAP,lacidegalliqueestgalementlecomposleplusactif,entant
mme2foisplusactifquelacideascorbique.Lesautrescomposs(4-6)ontgalementun
fortpouvoirrducteur(CI50
