Etude structurale, fonctionnelle et metabolique du meristeme apical jeune de l'lsoetes setacea

NICOLE MICHAUX-FERRIERE Ltrborcrtoire tle Cytologic et tle Morpl~oge'tri.se oe'ge'tales, Biititnetrt L, 4 , Plnce Jlrssielr, 75230 Plrris, Fratrce

R ~ ~ L I le 26 septembre 1979

MICHAUX-FERRIERE, N. 1980. Etude structurale, fonctionnelle et mitabolique du meristeme apical jeune de I'Isoetes setcrcecr. Can. J . Bot. 58: 2506-2512.

Individualise morphologiquement et cytologiquement apres le troisieme plastochrone, le point vegetatif de l'lsoetes setcrcecr Lam. se caractirise a I'etat jeune, compare a I'etat adulte par des dimensions riduites et une uniformite structurale et fonctionnelle. Dans ces jeunes meristemes, les cellules ont un renouvellement de I'ARN tres rapide et un cycle cellulaire bref a la phase de presynthese, G I , preponderante. Aucune cellule presentant les caracteres originaux mor- phologiques, cytologiques et metaboliques des apicales de filicinees n'a pu etre decelee.

MICHAUX-FERRIERE, N. 1980. Etude structurale, fonctionnelle et metabolique du meristeme apical jeune de I'lsoetes setacea. Can. J . Bot. 58: 2506-25 12.

The apical meristem of Isoetes setaceo Lam. is morphologically and cytologically indi- vidualized after the third plastochron. Compared with the adult, the young meristem is charac- terized by reduced dimensions and the absence of structural and functional zonation. In these young meristems. cells have a very fast RNA turnover and a short cell cycle in which the presynthesis phase, G I , is preponderant. No cells exhibiting morphological, cytological, or metabolical characters typical of filicinean apical cells have been recognized.

Introduction Materiel et methodes d'etude

L'lsoetes setacea Lam. est une petite plante perenne, semi aquatique qui vit dans des mares temporaires. Son meristeme caulinaire est sit& au fond d'une depression du tubercule trilobe sur les bords de laquelle s'etagent les jeunes feuilles. Plusieurs auteurs ont decrit la structure apicale de diverses especes d'Isoetes. Pour Hegelmaier (l874), Farmer (1890), Bhambie (1957), Sharma (1961) ou Loiseau et Battut (1963), aucune cellule apicale n'est reperable dans le point vegetatif de ces plantes, que ce soit a l'etat adulte ou jeune. Au contraire, Hofmeister (1862), Bruchmann (1874), Scott et Hill (1900) et Lang (1915) observent une ou plusieurs apicales qui, par leur position et leur comportement particulier vis a vis des colorants, sont interpretees comme des initiales. Enfin, pour Popham (195 l), Paolillo (1963) et Karrfalt (1977), seuls les points vigetatifs jeunes possedent une apicale.

Les caracteres structuraux et metaboliques du meristkme adulte de l'lsoetes setacea ont etC digages anterieurement (Michaux 1966 et 1969; Michaux-Ferriere 1976) et aucune cellule apicale n'a pu itre mise en evidence. Afin de prkciser si durant la phase juvenile une apicale est presente, une etude structurale et fonctionnelle du miris- teme, au debut de son fonctionnement, a i t6 realisee.

Obterztiorl des jeutzes sporopl~ytes Des microspores sont mises conjointement en culture avec

des macrospores soit sur de la terre provenant du lieu de recolte des Isoetes, soit dans de I'eau pure, soit dans une solution de Knop diluee au demi. Sur la terre humide, dans les conditions de temperature du laboratoire, 2 a 3 semaines de culture sont nicessaires pour obtenir des sporophytes possedant deux feuil- les visibles a I'oeil nu. Ce laps de temps est comparable B celui generalement donne dans la litterature (Lamotte 1933; Bierhorst 1971). En milieu aqueux, nutritif ou non, 4 a 8 jours de culture suffisent pour que des sporophytes a deux feuilles soient ob- servable~.

MPthodes d'e'tude Les plants etudies possedent entre 2 et 12 feuilles visibles

macroscopiquement. Pour I'examen histocytologique en mi- croscopie photonique et pour la determination des volumes nucleaires et cellulaires moyens, les jeunes miristemes sont fixes respectivement par le melange de Navachine et par le craf I1 (Martoja et Martoja 1967). Les sections, de 5 8 pm d'epais- seur, sont colorees par I'hCmatoxyline de Regaud et le rouge de ruthenium ou traities par la triple coloration: safranine, hematoxyline d'Eidenhain, bleu d'aniline (Martoja et Martoja 1967).

Les volumes nucleaires moyens plus ou moins I'erreur stan- dard, ES, sont calculks en assimilant les noyaux ades spheres et en utilisant les mesures realisees sur tous les noyaux de sections longitudinales axiales de 10 meristemes.

Les volumes cellulaires moyens plus ou moins ES sont cal- c u l i ~ en assimilant les cellules des parallelepipiides et en utilisant les mesures effectuees sur toutes les cellules de sections longitudinales axiales et de sections transversales de 10 meris- temes.

Les caracteres metaboliques sont digages par application de

ooO8-40261801232506-07$01 .OO/O 01980 National Research Council of CanadaIConseil national de recherches du Canada

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quelques reactions histochimiques classiques (Lison 1960): la reaction de Feulgen pour la rnise en evidence de I'ADN nucleaire; la coloration B la gallocyanine ou au vert de methyle pyronine qui revele, apres un test h la ribonuclease la plus ou rnoins grande abondance des ARN cytoplasrnique et nucleolaire; la methode de Barrnett et Seligrnan (1952) qui per- met la detection des groupes sulfhydriles. Les grains d'arnidon sont colores par la reaction B I'acide periodique Schiff (PAS) et les lipides par le noir Soudan B.

Pour I'examen en rnicroscopie electronique, les echantillons sont prefixes durant une nuit dans une solution de glutaraldehyde a 4% tamponnee a pH 7,1 par le cacodylate de sodium. Apres trois r in~ages de 1 h dans ce tampon, le materiel est post fixe au tetroxyde d'osrniurn B 2% durant 2 h. Les Cchan- tillons laves puis deshydrates sont inclus dans le milieu de Spurr (1969).

L'index mitotique, IM. est le pourcentage de cellules en mitose. IM = (n,, x 100)ln.. oh II,, est le nornbre de cellules en rnitose et n,,., le nornbre total de cellules. I1 est calcult B I'aide des donnees obtenues sur les sections longitudinales axiales de 34 meristernes, traitees par le reactif de Schiff.

Afin d'evaluer la duree du cycle cellulaire, des his- toautoradiographies sont realistes sur des echantillons ayant incorpore de la thyrnidine tritiee (activite specifique 5 CilmM ( I Ci = 37 GBq); concentration 4 pCilmL), durant 1.2, 4 , 6 ou 8 h. Les Isoetes ttant des vegetaux aquatiques, I'incorporation peut s'effectuer par simple immersion des plantes dans la solu- tion tritiee sans que les conditions physiologiques norrnales de la plante soient perturbees.

Pour chaque temps d'incorporation, a, les pourcentages de noyaux radioactifs, y, sont etablis sur des lots de 10 rneristemes; .r est un parametre certain, y est une variable aleatoire. A I'en- sernble de points experimentaux de coordonnees (.r, y) une droite d'equation y = ox + b peut i tre ajustte si le coefficient de correlation r , entre les valeurs d e s et celles de y , est voisin de 1. Les parametres ( I et b sont estirnes par la rnethode dite des "rnoindres carres" qui consiste B recherche1 une equation de la droite telle que la sornrne des ecarts des points exptrirnentaux B la droite soit minimale. La valeur dex calculke pour y = 100, est une estimation de la duree totale du cycle cellulaire (Nougarede et Rondet 1976). L'emploi de cette rnethode d'estirnation, presuppose que toutes les cellules des territoires envisages se divisent, qu'elles sont asynchrones et que le pourcentage de noyaux radioactifs en fonction de la duree d'incorporation du traceur reste lineaire.

La vitesse du renouvellernent des ARN est etudiee par his- toautoradiographie. Quarante echantillons ayant subi un rnar- quage flash de 2 h a I'uridine tritiee (activite specifique 5 CilrnM; concentration 4 pCi/mL) sont fixes, par lot de cinq, 1 , 2, 3 , 4 , 8 ou 12 h apres la dilution du traceur par de I'uridine froide cinq fois plus concentree que I'uridine tritiee.

Resultats Caractkrisation histocytologique d~c mkristkme

j~tue'rtile Le rneristerne apical de l'lsoetes setacea, cornrne

celui de diverses especes d'Isoetes (Paolillo 1963), ne s'individualise rnorphologiquernent et cyto- logiquernent qu'au cours du troisierne plasto- chrone. A ce stade, le point vegetatif a un diarnktre en aire rnaxirnale de 60 prn seulernent, il est large- rnent entarne par la surrection de nouvelles feuilles, ses cellules sont tres pyroninophiles (fig. 1). Aprts

avoir initie la feuille de rang six, il se presente sous la forrne d'un d6rne axial central (fig. 2, Za) entouri d'une zone plus aplatie, Z1, dans laquelle naissent les feuilles. Une zonation ternoignant d'une repar- tition preferentielle des ARN cytoplasrniques dans les cellules laterales est observable (fig. 2). Des ce stade, le rneristerne a acquis une structure et une zonation concernant les ARN, cornparables a cel- les du rneristerne adulte (Michaux 1966).

A rnesure que les feuilles de rang 6 a 12 se for- rnent, le point vegetatif s'accroit progressivernent. Son diarnetre en aire rnaxirnale atteint 140 a 160 prn, dimension proche de celle d'un rniristerne adulte. Les rnicrophylles forrnees durant la phase juvenile ne portent pas de sporanges, elles sont rnor- phologiquernent cornparables aux feuilles adultes et elles possedent, cornrne elles, une ligule (fig. 2, li). L'exarnen de sections transversales rnontre qu'elles sont engainantes et disposees autour de I'axe selon une phyllotaxie distique (fig. 3). Cornrne chez d'autres especes dlIsoetes (Paolillo 1963), cette phyllotaxie deviendra spiralee lorsque le rneristerne aura construit une douzaine de feuilles.

Tout au long de la phase juvenile, aucune zona- tion n'est perceptible dans le point vegetatif en section longitudinale axiale, apres la rnise en evi- dencede 1'ADN (fig. 4) ou des proteines-SH (fig. 5 ) , a I'inverse de ce que l'on observe dans la plante adulte (Michaux-Ferriere 1976); par contre, les arnyloplastes decelables dans les cellules paren- chyrnateuses corticales et les lipides qui ne sont presents qu'a la peripherie du tubercule ont une localisation analogue a celle decrite dans la plante adulte (Michaux-Ferritre 1976); ils ne sont jarnais decelables au niveau du rneristerne.

Dans les points vegetatifs jeunes, la valeur du rapport nucleoplasrnique (RNP) de 1:4 aussi bien en zone axiale que laterale (tableau l), traduit, par cornparaison avec les donnees obtenues anterieure- rnent au niveau des adultes, I'hornogeneite du caractere rneristernatique.

L'etat cytologique uniforrne du rneristkrne au cours de sa phase juvenile est confirrne par une etude en rnicroscopie electronique. Les rnicro- graphies realisees dans les zones laterale (fig. 6) et axiale (fig. 7) rnontrent que l'ultrastructure nucliaire, nucleolaire et cytoplasrnique de ces deux categories cellulaires est tres voisine. Dans les deux cas, l'association frequente des ribosomes en polysornes (fleches) peut &re notee ainsi que la finesse des membranes cellulaires au niveau des- quelles les plasrnodesrnes sont toujours nornbreux, pl; de plus, l'extension du vacuorne est trks corn- parable.

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FIG. 1-2. Aspects en sections longitudinales axiales de jeunes points vkgetatifs ayant forme les trois premieres feuilles F1, F2 et F3 (Fig. I) et les 10 premieres feuilles (Fig. 2). l i , ligule; M, meristeme; P, primordium foliaire; Za, zone axiale; ZI, zone laterale. FAA - vert de methyle-pyronine. x 250.

Fonctionnement du me'ristdme a l'e'tat jeune Actiuite' mitotique Le tableau 2 regroupe les index mitotiques cal-

culks pour les cellules des zones axiale et laterale. Ces valeurs (6,74 et 7,Ol) identiques et elevees, indiquent une activite mitotique intense et uni- forme dans tout le meristeme.

Estimation de la longueur du cycle cellulaire Le tableau 3 prksente pour les zones axiale et

laterale, les pourcentages de noyaux radioactifs calcules apres des temps d'incorporation de plus en plus longs. Ces valeurs experimentales permettent le calcul des parametres a et b (tableau 4) de la droite de regression de y en fonction de x selon la methode exposee plus haut. La valeur dex obtenue pour y = 100 correspond a la duree totale du cycle cellulaire. Pour Its deux zones Ctudiees, les durees du cycle, tres breves, peuvent i tre considerees comme equivalentes (-20 h).

Caracte'ristiques du cycle cellulaire Aprks 4 h d'incorporation, des figures de noyaux

FIG. 3. Schema phyllotaxique etabli par la superposition de marques dedoublis (fig. 8, fleches) sont souvent

quatre sections transversales d'un mkristkme jeune. Les feuilles identifiables dans le miristeme (comparer la figure engainantes sont en disposition distique. M, mCristkme; n, n-1, 8 a la figure 9 dans laquelle les noYaux radioactifs n-3, n-4, n-5 et n-6 feuilles de rang 1, 2 ,3 ... 6. sont simples). Ce dedoublement tkmoigne d'une

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FIG.' 4-5. Sections longitudinales axiales de jeunes rneristtrnes. li, ligule; M, rneristtrne; P, prirnordium foliaire. Fig. 4. Mise en evidence de I'ADN. Forrnol neutre - reactif de Schiff. ~ 2 5 0 . Fig. 5. Mise en evidence des proteines-SH. Acide trichloracetique - reaction de Barrnett et Seligrnan. x 400.

TABLEAU 1. Cornparaison des volumes nucleaires moyens, des division en tours ou recente et prouve que la duree volumes cellulaires moyens (en pm3 + l'erreur standard, ES) de la phase G, est inferieure 4 h, puisque ce laps et des valeurs du rapport nuclCoplasmique, RNP. Les donnees entre parenthtses sont celles obtenues antkrieurement pour de temps pour que nOyaux en phase

les meristemes adultes de synthese lors de l'incorporation passent en G, ~ u i s en mitose.

Calcul du RNP Zone axiale Zone laterale Connaissant le valeur de l'index mitotique, IM,

Volume nucleaire 107,2+ 10,7 et la durie totale du cycle cellulaire, T, le temps

Moyen: N (90,9? 10, l ) (65,4+5,5) 7032'9y4 pass6 en mitose, t , , peut etre estime (Montezuma Volume cellulaire 562,3 + 62,5

de Carvalho 1962): t , = (IM1100) x T.

Moyen: C (948'42,l) 401 50y8 Pour la zone axiale

(503 + 54,9)

RNP = N:(C - N) 1 :4 1 :4 t , = (6,741100) x 21,3 = 1,43 h (1 :9) (1:6,5) Pour la zone laterale

TABLEAU 2. Determination de l'index mitotique, IM t M = (7,01/100) x 19,8 = 1,39 h I'erreur standard, ES, des zones axiale et laterale des mkris-

ttmes jeunes Dans les cellules meristimatiques actives la phase de synthese a une duree de quelques heures

Nombre seulement (Nougarede et Rembur 1978). S'il en est Nombre de de meme chez les Isoetes, l'ensemble des resultats

total cellules obtenus prouve que la phase prkpondkrante du Nombre de en cycle cellulaire de ces jeunes miristemes d'Isoetes

Zones d'echantillons cellules mitose IM ' ES est la phase G , . Axiale 34 178 12 6,74+0,10 Laterale 34 442 3 1 7,01+0,17

Renouuellement de 1'ARN Un marquage de I'ARN n'est decelable au niveau

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FIG. 6-7. Aspects en microscopic electronique des cellules de la zone laterale (Fig. 6) et de la zone axiale (Fig. 7) du meristeme jeune de I'lsoeres seracecr Lam. 1,-lipide; tni, mitochondrie; N , noyau; nu , nucleole;pcr, plaste;pl, plasmodesme; a, vacuole. Les fleches indiquent les ribosomes regroupes en polysome. x 13 000.

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FIG. 8-9. Histoautoradiographies de sections longitudinales axiales de jeunes meristemes, M , apres incorporation de thymidine tritiee (5CilmM; 4 pCi/rnL) durant 4 h (Fig. 8) et 1 h (Fig. 9) FAA - bleu d'azur. x 250.

TABLEAU 3. Pourcentages de noyaux marques dans les zones axiale et laterale des mtristernes jeunes de l'lsuefes sefncea au cours d'incorporations de thymidine 3 h de durees de plus en plus longues

Durte d'incorporation, Nornbre Nornbre total Nornbre de Pourcentages de noyaux Zones h d'tchantillons de noyaux noyaux rnarquts rnarquCs + ES

Axiale I 2 4 6 8

LatCrale 1 2 4 6 8

du point vegetatif et des jeunes feuilles que si l'in- corporation d'uridine tritiee est au minimum de 2 h. Une heure apres la dilution du traceur, les nucleoles seuls sont radioactifs. A mesure que le temps de culture sur milieu non radioactif aug- mente, le marquage cytoplasmique devient plus intense et le nombre de grains d'argent reduit aux niveaux nucleolaire et nucleaire diminue. Huit heures apres la dilution, la radioactiviti est essen- tiellement cytoplasmique dans la zone axiale comme dans la zone laterale. La vitesse du passage de I'ARN du noyau au cytoplasme est donc iden- tique pour les deux zones etudiees. Ce renouvelle- ment trts rapide, temoigne d'une intense activite metabolique.

TABLEAU 4. Valeurs des pararnetres des droites de regression d'tquation y = ax + b pour les zones axiale et lattrale. Les valeurs de x, calculCes pour y = 100, sont tgales a la durte (en heures) du cycle

cellulaire

Zones ttudites n b s

Axiale . 4,41 6,07 21,3 Laterale 4,47 11,50 19,8

Comparaison auec le tne'ristktne adlrlte Le point vegetatif jeune se caracterise, compare

a l'adulte, par une activite uniforme et intense. En effet, pendant la phase adulte, les zones axiale et laterale s'opposent par leur comportement et leur

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cycle cellulaire qui ont des durees et des caracteristiques differentes. Ces cycles, toujours plus longs que ceux des meristemes jeunes, ne sont plus a predominance de la phase G,: G, et G, sont de d u k e Cquivalente (Michaux 1969).

Conclusion Au cours de la phase juvenile, le meristeme api-

cal caulinaire de l'lsoetes setacea Lam. se struc- ture et acquiert progressivement ses dimensions difinitives. I1 se caracterise par l'initiation d'une douzaine de feuilles selon une phyllotaxie distique et par une homogeneite structurale et fonction- nelle. Les cellules des deux zones apicales, tres meristematiques, ont un cycle rapide a predomi- nance de la phase G, et un taux de renouvellement de I'ARN identique et tres bref.

Aucune cellule apicale, comparable a celle des mkristemes de filicinees, n'a pu itre observee. En effet, une cellule ne peut itre qualifiee d'apicale que si elle possede certaines caracteristiques cytologiques et metaboliques bien precises. Des l'etat juvenile, les apicales offrent un aspect cytologique original, de grandes dimensions et un cycle a predominance de la phase G,, plus long que celui des cellules qui l'entourent (Michaux-Ferriere 1974 et 1975). Si, chez les Isoetes, a un moment donne de la vie du meristeme, une cellule prend une position d'apicale (Paolillo 1963; Karrfalt 1977) elle ne possede aucune des caracteristiques struc- turales et fonctionnelles qui definissent les apicales vraies, et elle ne peut donc i tre assimilee ce type de cellules.

De plus, dans les points vegitatifs domines par une apicale typique (Andres 1968; Michaux- Ferriere 1974), la zonation, en ce qui concerne I'ADN et l'ARN, est tres nette des l'initiation de la deuxitme feuille. Dans les meristemes jeunes de l'lsoetes setacea, seule une repartition preferen- tielle des ARN est observable; encore n'est-elle decelable qu'apres la formation de la feuille de rang 6.

L'ensemble de ces resultats convergents dimontre bien l'absence, dans le jeune meristeme de l'lsoetes setacea, de toute cellule apicale.

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