Évaluation de la toxicité d’un polluantÉvaluation de la toxicité d’un polluant

But : estimer les relations entre l’exposition d’un organisme à un polluant et sa réponse

Tests de toxicité aiguë : ils ont lieu sur une courte période comparativement au cycle de vie des organismes. Ce terme est utilisé pour définir soit l’exposition, soit la réponse à cette exposition. Un effet toxique aiguë est induit et observé sur une courte période d ’exposition

Tests de toxicité chronique : ils sont réalisés pendant des expositions plus longues (10 à 20 % du cycle de vie). Les effets constatés lors d’une telle exposition sont qualifiés de chroniques. Ces effets sont à relier à des changements de métabolisme, de la reproduction, de la croissance ou de l’aptitude à survivre. Les concentrations d’expositions sont plus faibles que ceux des test de toxicité aiguë.

Les tests de génotoxicités : ils permettent de détecter la capacité d’une substance ou d ’un processus physique à générer des dommages sur le matériel génétique.

Courbe théorique dose réponse :

0.1

Réponse (%)

10 100

100

50

0

Concentration en polluant

1

NOEC

LOEC

Témoin

CE50

*

*

*

**

CE50 : dose qui affecte 50% de la population NOEC : concentration sans effet observésLOEC : plus basse concentration efficace

Les tests biologiques ou bioessaisLes tests biologiques ou bioessais

Procédures effectuées en laboratoire et destinées à déterminer, à l’aide d’expérimentations sur divers types d’êtres vivants, les activités biocides et/ou les particularités toxicologiques de substances chimiques

Critères d’homologation des bioessais :

1. simplicité2. rapidité d’exécution3. reproductibilité 4. sensibilité 5. représentativité des conditions naturelles6. coût économique le plus faible possible

Trois catégories principales de biotestsTrois catégories principales de biotests

- tests de létalité - tests sublétaux - tests à long terme

- tests de reproduction- tests d’effets mutagènes - tests d’effets tératogènes - tests d’inhibition de croissance

Catégories de tests biologiquesCatégories de tests biologiques

Détermination des CL 50 dans des expositions à court terme (24-96 h) sur des organismes de référence (rotifères, daphnies, truitelles)

Exemple de bioessais létaux en milieu aquatique

• test daphnie (Daphnia magna), normalisé en France par l’AFNOR (NF T90 301) • test truitelle (Oncorhynchus mykiss) (NF T90 305) • test poisson zèbre (Brachydanio rerio) (NF T90 303) • test bar (Dicentrarchus labrax) (NF T90 307)

Exemple de bioessais létaux en milieu terrestre

• tests lombriciens : Eisenia foetida (ISO 11268-1; OCDE 207) • tests insectes pour toxicité atmosphérique

Les tests létauxLes tests létaux

Seuil d’effet : 10%

Fidélité : bichromate de potassium (+)

Répétitivité (même personne)

Reproductibilité (labo différents)

Prélèvement

Conservation

Exemple de bioessais sublétaux et à long terme (1)Exemple de bioessais sublétaux et à long terme (1)

en milieu aquatiqueen milieu aquatique :

• test de croissance d’algues unicellulaires (NF T90-375) exposées à un polluant toxique à une dilution inférieure à celle provoquant la mortalité aiguë

- numération au compteur ou spectrophotométrie

Espèces cibles : Chlorella vulgaris, Selenastrum capricornutum

• test d’inhibition d’activité biologique : inhibition de la bioluminescence bactérienne (sous produit de la respiration cellulaire) sur Vibrio Fischeri (Test MICROTOX)

• test d’inhibition de la photosynthèse

Exemple de bioessais sublétaux et à long terme (2)Exemple de bioessais sublétaux et à long terme (2)

en milieu terrestreen milieu terrestre :

tests macroinvertébrés de la pédofaune pour toxicité des sols ou de l’air

• isopodes (cloportes) Porcellio scaber et Oniscus asellus

• acarien de litière des forêts Platynothrus peltifer (métaux toxiques)

• collembole Folsomia candida (test normalisé à 28 jours) OCDE

• acariens corticoles pour biotests d’aéropolluants

• mollusques gastéropodes pulmonés (limaces, Arion ater) et escargots (Helix adserpa, H. pomatia) biotests d’effets sur la reproduction

• plantes

LE TEST DE GERMINATIONLE TEST DE GERMINATION

En l'absence de norme concernant spécifiquement les sous-produits organiques, ce test est inspiré de la norme NF X 31-201 concernant les substances chimiques

solubles dans l'eau.

La méthodologie du test est celle définie par la norme avec les modifications inhérentes aux produits testés (boues de STEP, composts, ...), pour trois doses.

Objectif : Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la germination des semences mises en contact avec différentes concentrations du produit testé.

Méthodologie : Substrat : sol standard, ou sol du site d'épandage du produit étudié.  Plante test : orge, cresson (NF X 44-167), ou plante cultivée sur le sol recevant le produit. Conditions : contrôlées, en phytotron. Doses testées : 3 multiples de la dose d'épandage maximale, déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). Durée du test : 4 à 7 jours. Paramètres mesurés : taux de germination.

                                                                                                                                                                                                                           

LE TEST DE CROISSANCE FOLIAIRELE TEST DE CROISSANCE FOLIAIRE

Objectif :

Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la croissance des parties aériennes des végétaux supérieurs mis en contact avec différentes concentrations du produit testé.

Méthodologie :

Substrat : sol standard, ou Sol du site d'épandage du produit étudié. Plante test : orge, cresson, ou plante cultivée sur le sol recevant le produit. Conditions : contrôlées, en phytotron. Doses testées : 3 multiples de la dose d'épandage maximale, déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). Durée du test :17 jours. Paramètres mesurés: matière fraîche et matière sèche des parties aériennes de la plante.

                                                                                                                                                                                                                                                    

LE TEST DE CROISSANCE RADICULAIRELE TEST DE CROISSANCE RADICULAIRE

•Objectif :

Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la croissance radiculaire des végétaux supérieurs mis en contact avec différentes concentrations du produit testé.

•Méthodologie :

•Substrat : sol standard, ou sol du site d'épandage du produit étudié. •Plante test : orge. •Conditions : contrôlées, en phytotron. •Doses testées: 3 multiples de la dose d'épandage maximale déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). •Durée du test : 17 jours. •Paramètres mesurés : longueur de la plus longue racine et matière sèche radiculaire.

                                                                                                                                                                                                            

                        

« Les toxicités »

Echelle de temps

Court terme Moyen terme Long et Très long terme

Toxicitéaiguë

Toxicitéchronique

Toxicitégénétique

RISQUE VISIBLE RISQUE CACHE

Critères de mesure

MortalitéMortalité Croissance ReproductionCroissance Reproduction Altérations du patrimoine génétiqueAltérations du patrimoine génétique

CANCEROGENESECANCEROGENESE

Place des effets génotoxiques parmi les différentes toxicités

TERATOGENESETERATOGENESEMUTAGENESEMUTAGENESE

La mutation comme événement de base pour mesurer les effets La mutation comme événement de base pour mesurer les effets

Des systèmes d’alarme à court terme Des systèmes sensibles (doses sublétales)

La mesure des effets génotoxiques

LésionsPré-mutationnelles Mutations

ponctuellesMutations

chromosomiques

Tests de génotoxicités :Tests de génotoxicités :

Essais à court terme utilisés pour évaluer la génotoxicité de différents composés chimiques, d’effluents ou de déchets toxiques

Bioindicateurs d’effets :

micronoyaux

Test Trad

FETAX

COMET assay

Test de mutation génique

Le test COMET

S’effectue sur tout type de cellules

Visualisation des cassures de l’ADN

Méthode quantitative

d

Tail moment = d x IF (Intensité de fluorescence dans la queue)

IF

02468

10121416

2 4 7 12 24

Plomb

Témoin

Temps (h)

Ta

il m

om

ent

1- Les micro-noyaux

Larves d’amphibiens : globules rouges (NF T90 327)

Poissons : globules rouges

Lymphocytes et érythrocytes de souris

Racines de Vicia faba (NF T90 327)

Deux effets :

• Cassures de l ’ADN

• Poisons mitotiques

Test nécessitant des cellules en

mitoses

Test MN Vicia faba AFNOR NF T90-327• Lixiviat ISO/PRF TS 21268-2 • Les graines sont hydratées pendant 24 heures à température ambiante dans de

l’eau déminéralisée, puis sont écossées. • Les graines sont désinfectées au moyen d’hypochlorite de calcium (CaClO 0,9%,

15 minutes) puis rincées à l’eau déminéralisée avant d’être mises à germer verticalement, à 24°C

• Après 3 jours, les extrémités des racines sont coupées (5 mm environ) de façon à favoriser le développement des racines secondaires. Les graines sont alors placées au dessus d’un récipient contenant le milieu nutritif préalablement oxygéné (solution de Hoagland), à 22°C. Après 5 jours, les racines secondaires peuvent être utilisées pour le test.

• Pour l’exposition, cinq plantules sont placées dans un récipient contenant la solution d’exposition, les racines étant immergées.

• Cinq répétitions sont mises en place pour chaque concentration. • Les récipients sont placés à l’obscurité et à 24 °C pendant 30 heures. • Deux contrôles sont mis en place (positif et négatif)• En fin d’exposition, les extrémités des racines (environ 2 cm) d’une douzaine de

racines secondaires sont coupées et placées une nuit à 4°C dans une solution de Carnoy.

• Pour l’observation, les racines sont hydrolysées dans l’acide chlorhydrique (HCl 1 N) pendant 6 minutes à 60°C.

• L’ADN des racines est coloré à l’orcéine pendant 3 minutes à 60°C. Six racines différentes sont observées pour chaque plantule.

x400x400

Micronoyaux

0

4

8

12

16

20

24

Évaluation des effets toxiques et génotoxiques de lisiers de porcs sur la base de 50 ans d’épandage

Mic

ron

oya

ux

Méthanisé Brut

Mitoses

0,0%

2,0%

4,0%

6,0%

8,0%

10,0%

12,0%

14,0%

Mit

os

e

Cu (ppm) Brut Méthanisé

1 0,16 0,1710 1,66 1,7250 10,08 8,64

100 16,58 17,28

Zn (ppm) Brut Méthanisé

1 0,50 0,4110 5,12 4,1250 31,09 20,62100 51,17 41,28

Conc %

1 Conc % 10 50 100

1 Conc % 10 50 100

Conc %

Zn

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

1,0 10,0 100,0 1000,0

Métal total (µM)

Mic

ron

oya

ux

(‰)

Cu

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

Mic

ron

oya

ux

(‰)

Lisier Brut Lisier Méthanisé Solutions minérales

Zn

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

1,0 10,0 100,0 1000,0

Métal total (µM)

Mic

ron

oya

ux

(‰)

Zn

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

1,0 10,0 100,0 1000,0

Métal total (µM)

Mic

ron

oya

ux

(‰)

Cu

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

Mic

ron

oya

ux

(‰)

Lisier Brut Lisier Méthanisé Solutions minérales

Cu

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

Mic

ron

oya

ux

(‰)

Lisier Brut Lisier Méthanisé Solutions minérales

Induction de micronoyaux en fonction du cuivre et du zinc total dans les solutions

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0

Cu soluble (µM)

Mic

ron

oya

ux

(‰)

Lisier Brut Lisier Méthanisé Solutions minérales Sols Montardon

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0

Cu soluble (µM)

Mic

ron

oya

ux

(‰)

Lisier Brut Lisier Méthanisé Solutions minérales Sols Montardon

Induction de micronoyaux en fonction du cuivre soluble

ms TOT

Témoin 4,55

Lisier brut 2,62

Lisier méth 4,10

Développement d’un test MN en sol contaminé par des HAP

Développement d’1 méthode en sol

Résultats – Méthode normalisée et micro-culture

-> Méthode normalisée (expo 24 heures en hydroponie)

-> pas d’effet des sol contaminée en HAP

Results of the Vicia-micronucleus test on soil aqueous extracts after 30 h and by direct contact

after 2, 5 and 7 days

Mitotic index / 100 cells SD (n=5)

MCN / 1000 cells SD (n=5)

Soil aqueous extracts Negative control (Hoagland’s solution)

11,6 ± 1,6 3,5 ± 2,9

Positive control 1 (MH 10-5 M) 6,1 ± 2,0 * 22,1 ± 7,9 * Positive control 2 (Cd 10-8 M) 5,9 ± 1,5 * 30 ± 16,3 * Soil A 15,0 ± 3,5 18,5 ± 4,4 * Soil B 14,0 ± 4,7 9,0 ± 3,3

Direct contact - 2 days Negative control (loamy sand) 13,5 ± 3,1 0,08 ± 0,18 Positive control 1 (MH 10-5 M) 7,3 ± 4,3 24,65 ± 7,50 * Positive control 2 (Cd 10-8 M) 11,7 ± 5,1 0,95 ± 0,55 * Soil A 12,5 ± 2,2 0,84 ± 0,43 * Soil B 9,0 ± 3,3 0,69 ± 0,23 *

Direct contact - 5 days Negative control (loamy sand) 20,3 ± 3,7 0,12 ± 0,29 Positive control 1 (MH 10-5 M) 21,3 ± 4,3 9,78 ± 6, 21 * Positive control 2 (Cd 10-8 M) 18,8 ± 3,1 1,23 ± 0,96* Soil A 17,6 ± 3,2 0,81 ± 0,47* Soil B 18,5 ± 1,9 0,32 ± 0,37

Direct contact - 7 days Negative control (loamy sand) 11,6 ± 3,1 0,13 ± 0,28 Positive control 1 (MH 10-5 M) 10,2 ± 1,5 1,4 ± 0,7* Positive control 2 (Cd 10-8 M) 16,1 ± 2,5 0,27 ± 0,37 Soil A 11,5 ± 2,8 0,42 ± 0,61 Soil B 13,0 ± 5,4 0,34 ± 0,39 * significant value, P< 0.05 (Mann-Whitney)

Résultats – Méthodes en sol

-> Détermination de la durée d’exposition

Toxicité et hétérogénéité des résultats après 5 jours

=> Résultats à 2 jours

Chemical analysis of soils and aqueous extracts from soils collected on industrial sites A and B

Concentration in Soil A Concentration in Soil B Soil

(mg/kg DM) Aqueous extract

(µg /L) Soil

(mg/Kg DM) Aqueous extract

(µg/L) Metals

As 28 6 Cd 6 1.2 Cr 62 < Cu 34 157 ± 0.03 20 75 ± 0.00 Ni 33 < Pb 1933 391 ± 0.04 35 Zn 87 80

HAP

Naphtalène nd nd 12 1 Fluoranthène nd nd 90 47 Benzo b fluoranthène nd nd 84 84 Benzo k fluoranthène nd nd 29 27 Benz a pyrène nd nd 60 92 Benzo g, h, i pérylène nd nd 24 33 Indéno 1, 2, 3, c, d pyrène

nd nd 33 62

Acénaphtylène nd nd 4 2 Acénaphtène nd nd 8 13 Fluorène nd nd 9 2 Phénanthrène nd nd 27 8 Anthracène nd nd 59 12 Pyrène nd nd 55 50 Benz a anthracène nd nd 51 64 Chrysène nd nd 49 54 Dibenzo a, h anthracène nd nd 16 44

Résultats – Méthodes en sol-> Effet dose (2 jours d’exposition)

Génotoxicité du solSensibilité de l’outil (réponse différente de

l’hydroponie et lien dose-réponse)

Tradescantia paludosa

Test trad

•

Pink mutation

Sample of 1 mutation event (photo at left) and the standard mutation scoring sheet (table on the right)

Inflorescences : période optimale d’exposition des plantes aux polluants

Chambre à gaz équipé de systèmes de contrôles

Plantes exposé en milieu urbain

In situ water pollution monitoring device

Aquatoon, a floating device

Cycle de développement d’un amphibien urodèle

Cycle de vie principalement inféodé au milieu aquatique(jeunes stades de développement = les plus sensibles)

Œufs sans coquilles, puis têtards munis de branchies

Larves à la peau très fine

Animaux sédentaires, évolution des conditions locales

AMPHIBIENS = Très bons indicateursde la santé des écosystèmes aquatiques

et très bons modèles d’étude cytogénétique

Grande quantité d’ADNrépartie dans un petit

nombre de chromosomesCellules

Érythrocytaires de grande taille

Utilisation du modèle amphibien

Une méthode standardisée au niveau National et InternationalNormalisation AFNOR T 90-325 (2000)

Normalisation internationale ISO 21427-1 (2006)

3 espèces concernées : 2 urodèles Axolotl et Pleurodèle, 1 anoure Xénope

Xenopus laevis

Protocole simplifié des essais

L’essai des micronoyaux sur les larves d’amphibiens

Taux pour mille decellules micronucléées

Micronoyaux

Ambystoma mexicanum

1-Production des larves

-Fécondation in vivo ou in vitro (HGC)

-Elevage des embryons et des larvesJusqu’au stade d’utilisation dans l’essai

2-Exposition des organismes (12 j)

- Essai préliminaire de toxicité

- Essai définitif de génotoxicité Renouvellement quotidien des solutions d’essai

3-Prélèvements sanguins

4-Lecture/analysedes résultats

Pleurodeles waltl

3- test FETAX (Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus)

But : déterminer les malformations, la mortalité et l’inhibition de croissance des

embryons soumis aux xénobiotiques (Dumont 1983, USA)

Test utilisé pour l’essai de substance seule ou en mélange

- Solvants industriels

- pesticides

- eaux de surfaces et nappes phréatiques

- extraits de sédiments

- effluents de procédés de traitement des eaux

Le test débute après la segmentation (stade blastula-début gastrula) : stade 8 xénope

Le test fini après l’organogenèse : stade 47 (5J)

Modalités du protocole : test in vitro

Mâles sont endormis(tricaïne méthane sulfonate)

Prélèvement des testicules

conservation en solution de Barth

Inhibition de la mobilité des spermatozoïdes

Femelles reçoivent 450 UI gonadotrophine

(veille de l’expérience)

Ponte

répartition des œufs

Mélange + solution FETAX

restaure la mobilité des spermatozoïdes et la fertilité des œufs (8h à 22°C)

Fin du stade blastula (début du test, 5j à 23°C)

Séléction des œufs (8x2/traitement)

Dénombrement des larves vivantes (battements cardiaques)

Anesthésie

Observation des larves

- mesure de la taille des larves vivantes et non mal formés

- analyse des malformations

Mesure de la concentration létale (CL50) à 120h

Mesure de la concentration tératogène (CT50) à 120h

Indice de Tératogénicité = CL50

TC50

IT<1.3 non tératogène

1.3 < IT < 2 faiblement tératogène

2 < IT < 3 modérément tératogène

IT>3 hautement tératogène

- Mutations géniques : Nicotina tabacum

Nicotiana tabacum Caractère (necrotic character) gène NNicotiana tomentosiformus (2n =24)

Nicotiana sylvestrus (2n =24)

Le gène N (homozygote) confère l’hypersensibilité au VMT

Nicotiana glutinosa (résistante à tous les virus par nécrose)

Nicotiana glutinosa X Nicotiana tabacum

F1 (N/n)

F1 X F1 N/N (caractéristiques du tabac, Nicotiana tabacum xanthi n.c)

Traitement des graines par Éthyle méthane sulfonate :

Plan M1 de N. tabacum avec secteurs sur feuilles vert/jaune (J1)

Pour comprendre les variations de caractère :

régénération de plantes entières à partir du fragment de limbes présentant des variations somatiques

Cultures primaires Néo-formation de bourgeons Néo-formation de racines

Plante néo-formée

(étude la descendance)

Existence d’une relation entre le phénotype V/J et la structure hétérozygote de deux gènes non liés : a1 et a2 .

a1+/ a1 et a2

+/ a2 déficience chlorophyllienne partielle

Décoloration = blocage de la synthèse de lamelles thylacoïdiennes

Étude de la descendance coopération fonctionnelle entre a1+ et a2

+

a1 + a1

+

a1+ a1

a1 a1

a2+ a2

+ a2+ a2 a2

a2

V1 V2 V3

V J1 J3

J2 J4

1439 1218 1180

815 214 14

82 6 0

µg chlorophylle / g PF

• Coopération fonctionnelle entre a1et a2

• a1est fonctionnel et antagoniste de a1+ et a2

+

• a2 est amorphe

Génotype a1+/ a1 a2/ a2, greffé sur le

type vert

a1+/ a1 a2+/ a2

Agents mutagènes

réversion ou mutation du gène a1

rétablissement de la synthèse chlorophyllienne

Conclusion

Un grand nombre de tests peuvent permettre d’évaluer a priori l’action de molécules :

Toxicité aiguë, Génotoxicité, métabolisme, Tératogénicité, perturbateurs endocriniens…

Ces test ne peuvent entièrement prévoir les risques à long terme pour l’environnement

- différentes interactions possibles entre polluant et milieu

- difficile de prévoir la réaction d’une espèce animale particulière dont dépend une chaîne trophique

Synergie ou antagonisme entre différentes molécules

Nécessité de recherche a posteriori afin de suivre l’évolution de la qualité du milieu et son impact sur le vivant en utilisant différents bio-marqueurs

Marqueurs de « stress » in situ à différent niveau d’organisation du vivant

Couplage avec des analyses chimiques