Evaluation du noyau des spermatozoïdes :

Maturité nucléaire/Fragmentation de l’ADN

J. Auger et F. Eustache

Introduction …

acrosome

noyau

axonème

acrosome cape

acrosomique

noyau

appareil de Golgi

centrioles centrioles

centrioles

noyau

noyau

microtubules

mitochondries

mitochondries

reste cytoplasmique

gaine mitochondriale

flagelle en développement

mitochondries

1 2 3 4

5

6

7

Evolution de la forme et de la texture du noyau au cours de la spermiogenèse humaine par cytométrie d’image TEM

Rappel : LES DIFFERENTS STADES DE LA SPERMIOGENESE

(Auger et Dadoune, 1993)

1 2 3/4 5 6 7 8 1 2 3/4 5 6 7 8 1 2 3/4 5 6 7 8 1 2 3/4 5 6 7 8

Paramètres morphométriques Paramètres densitométriques

Surface Facteur de forme

Grand axe

Petit axe

Moyenne niveaux gris (NG)

Ecart- type (NG)

Assymétrie (NG)

Aplatissement (NG)

TRANSITIONS DES PROTEINES ASSOCIEES A L’ADN AU COURS DE LA SPERMIOGENESE

Enlèvement des histones

par digestion enzymatique

Remplacement par des protéines

de transition très basiques

et de faible poids moléculaire

Elimination des nucléosomes

et arrêt de la transcription *

Remplacement des protéines de

transition par les protamines stabilisant

et compactant la chromatine par

la formation de ponts disulfure

* tout événement ultérieur repose sur des processus post-transcriptionnels

STADES 1 Stade Golgi 2 Stade cape 3 4 Stades acrosome 5 6 7 Stades de maturation 8

Spermatides jeunes (rondes)

Spermatides intermédiaires

(noyau en cours d’élongation

et de condensation)

Spermatides âgées

(noyau allongé et condensé)

Modèle hypothétique des étapes probablement

impliquées dans les modifications

de l’organisation tridimensionnelle de l'ADN

au cours de la spermiogenèse

Après le retrait des nucléosomes, les boucles d ’ADN se

retrouvent libres, c’est à dire sans aucune contrainte physique

Les boucles entre les points d’ancrage sont enlevées par des

coupures simples ou doubles brins produites par un mécanisme

jusqu'ici inconnu

Les protéines de transition et les protamines se déposent

stimulant la réparation des brins d'ADN avec pour conséquence

un état plus stable de l’ADN

ORGANISATION MOLECULAIRE ET SUBCELLULAIRE DE LA CHROMATINE DU SPERMATOZOIDE HUMAIN

Schéma de l’organisation de l’ADN dans

le noyau du spermatozoïde humain

après extraction des protamines par

SDS et 2 M NaCl, La matrice nucléaire

conserve la forme initiale du noyau et

l’ADN se déploie vers l’extérieur sous la

forme de boucles attachées par leur

base à la matrice

ANOMALIES DU NOYAU DES SPERMATOZOIDES : CAUSES POSSIBLES

Méiose

Défaut de

ségrégation

chromosomique

Aneuploïdie

Anomalies

matrice

nucléaire

Mauvaise organisation

spatiale de la

chromatine

Spermatogénèse

Spermiogenèse

Anomalies des

protéines

associées à l’ADN

Défauts de

condensation

de la chromatine

Dommage

exogène

ADN simple brin

ADN fragmenté

Adduits (dont ADN oxydé)

Spermiogenèse post-testiculaire post-éjaculation

METHODES D’ETUDE DU NOYAU DES SPERMATOZOIDES

Anomalies génétiques

du spermatozoïde

quantitatif : FISH

qualitatif : Caryotype

Défauts de condensation

de la chromatine

TEM

Bleu d’aniline

CMA3

Electrophorèse des protéines nucléaires

Groupes thiol

ADN simple brin (natif ou après dénaturation)

ADN fragmenté

Acridine orange par FCM (SCSA) ou microscopie de fluorescence

TUNEL assay

COMET assay

Nick translation

HPLC

HPLC+spertrométrie de masse Anticorps, autoradiographie

ADN oxydé

Adduits

SCD

Échantillon(s) biologique(s) d'origine humaine :sperme (*)

Etude de la qualité du noyau du spermatozoïde

Méthode manuelle de type qualitatif et quantitatif Identification par microscopie optique après coloration (bleu d’aniline, fragmentation sur lame, …)

Méthodes reconnues (A) Méthodes reconnues, adaptées ou développées (B)

Échantillon(s) biologique(s) d'origine humaine :sperme (*)

Etude de la qualité du noyau du spermatozoïde

Méthode manuelle de type quantitatif Cytomètrie en flux après marquage

Méthodes reconnues (A) Méthodes reconnues, adaptées ou développées (B)

Nature de l’échantillon biologique

Nature de l’examen/analyse

Principe de la méthode

Référence de la méthode

Portée flexible standard (A): Le laboratoire peut adopter toute méthode reconnue (fournisseur, bibliographie ou normalisée), selon le(s) même(s) principe(s) de méthode, dans la limite des possibilités définies dans la portée d'accréditation. Portée flexible étendue (B) : Le laboratoire peut adopter et/ou adapter toute méthode reconnue (fournisseur, bibliographie ou normalisée), voire développer ses propres méthodes, selon le(s) même(s) principe(s) de méthode, dans la limite des possibilités définies dans la portée d'accréditation.

L’accréditation …

0081 Coloration des spermatozoïdes au bleu d'aniline B 50 D007 Analyse en microscopie électronique des spermatozoïdes BHN 2500 D019 Préparation de spermatozoïdes en vue de FISH BHN 120 D008 Evaluation de la qualité de l'ADN des spermatozoïdes par la coloration à l'acridine orange, lecture en cytometrie de flux BHN 300 D009 Test de fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes par la technique TUNEL lecture en cytofluorometrie BHN 450 D026 Test de fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes par la technique TUNEL, lecture sur lame BHN 250

Les cotations …

MICROSCOPIE ELECTRONIQUE

A TRANSMISSION

Forme, densité et texture normales

Forme et/ou densité et/ou texture anormales

COLORATION DES NOYAUX AU BLEU D’ANILINE

Principe

Cette coloration serait en relation avec la persistance de nucléoprotéines riches en

Lysine (histones et/ou protéines de transition) responsables d’une condensation

défectueuse de la chromatine (Terquem et Dadoune, 1983)

F Relation significative taux de fécondation en FIV x maturité nucléaire

(Jeulin et al,, 1986)

(Morel et al,, 1998)

F Immaturité nucléaire et disomies (n =57)

Corrélation positive fréquence de disomies (8, 15, 18, X, Y) et % spz colorés

(Liu et Baker, 1992)

FIV et caractéristiques spermatiques Facteurs les + significativement liés au taux de fécondation : Nb de spz liés à la ZP, % de spermatozoïdes normaux et % de spermatozoïdes avec un noyau normal (BA et AO)

F

Moyenne ± ESM

Fécond (n=49) Infécond (n=396)

Spermatozoïdes non colorés (%) 75 ± 3 53 ± 1 F

5ème variable la + significative parmi 13 variables spermatiques (régression logistique) (Auger et al,, 1990)

(Hamadeh et al,, 1998)

F FIV infertilité masculine (n=95) Taux de fécondation

Taux de grossesse

20% spz colorés 80% 53%

> 20% spz colorés 59% 30%

Acridine Orange / SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) : Principe et Lecture

Test évaluant la résistance de l'ADN à une dénaturation induite par un milieu acide

Utilisation d’un colorant fluorescent, l'acridine orange, qui a la propriété d'émettre :

- une fluorescence verte quand il se fixe à de l'ADN natif (double brin), et

- une fluorescence rouge quand il se fixe à de l'ADN dénaturé (mono brin).

Quantification : Microscope à fluorescence / FCM (SCSA)

Microscope à fluorescence

> 300 cellules analysées

at = spz rouge / spz rouge + spz vert

0 0 0 100 100 100 Fluorescence rouge

100 100 100

Flu

ore

scen

ce v

erte

L’analyse est faite sur >5000 spermatozoïdes

FCM : QUE MESURE LE SCSA ?

Les % de 4 populations de spermatozoïdes selon l’état de leur ADN :

• 1 sous population de spermatozoïdes bien condensée avec peu d’ADN simple brin :

fluorescence verte

• 2 sous populations de spermatozoïdes avec susceptibilité accrue à la dénaturation :

a) modérément riche en ADN simple brin : fluorescence rouge moyenne

b) riche en ADN simple brin : fluorescence rouge importante

• 1 sous population de spermatozoïdes avec chromatine immature (chromatine peu

condensée) : population révélée par un plus grand degré de colorabilité :

fluorescence verte intense (HDS, High DNA Stainability)

Acridine Orange / SCSA : Lecture

Le rapport de spermatozoïdes évalués anormaux (rouges) sur l’ensemble de la population (rouge+vert) at est déterminé ainsi que le % de cellules en dehors de

la population principale : COMPat ou DFI, DNA Fragmentation Index

High DNA Stainability,

(% HDS)

High DNA Stainability,

(% HDS)

Moderate DFI

Moderate DFI*

Moderate

High DFI

High DFI#

High

Moderate High

* fluorescence rouge moyenne

(modérément riche en ADN simple brin)

# fluorescence rouge importante

(riche en ADN simple brin)

fluorescence verte intense (HDS)

0 0 0 100

100

Stabilité des données du SCSA en fonction du temps

Répétabilité élevée des mesures sur des échantillons mensuels (8) consécutifs de 5 individus

Un épisode de fièvre importante peut modifier les profils de fluorescence

Degré de fluorescence rouge (j18 à j25) ainsi que la population de spermatozoïdes avec un ADN très colorable (chromatine mal condensée (P2 ?), j33)

Intérêt du SCSA pour le diagnostic et le pronostic de l'infertilité : Existe-t-il un seuil?

FIV

50% spz vert : toujours des fécondations < 50% spz vert : - 13/33 cas (39%) avec fécondations

- aucune grossesse (Hoshi et al, 1996)

(Larson et al, 2000)

COMPat < 27 27 Nb total patients

Fécondation 24 14 10 normal : 45% ovocytes 19 12 7 anormal : 20% ovocytes 5 1 4 Grossesse Nb patients avec transfert 21 12 9 Pas de grossesse 14 5 9 Grossesse clinique 7 7 0

Fertilité in vivo

Couples volontaires de la population générale (n = 165)

Intérêt du SCSA pour le pronostic de fertilité

Faible fluorescence verte Forte fluorescence verte (>15%)

COMPat COMPat

Faible Modéré Fort Faible Modéré Fort

<15% 15-30% >30% <15% 15-30% >30%

(Evenson et al, 1999)

DNC = 1-3 mois 76,7 12,3 0,0 6,9 4,1 0,0

DNC = 4-12 mois 55,0 30,0 7,5 2,5 2,5 2,5

G- dans les 12 mois 41,9 19,4 6,5 9,7 9,7 12,9

LIMITES…

L'instrumentation est chère et fortement complexe…

Plus important, le SCSA emploie des protocoles et des normes de calibration entièrement différents de ceux utilisés dans d'autres protocoles de cytométrie

Un niveau élevé d'expertise et d'expérience avec le SCSA est exigé pour un diagnostic et un pronostic appropriés…

« Quelques centres qui ont essayé d'employer le SCSA pour leurs patients ont, en raison du manque d'expérience, donné une information fausse (mari stérile!) alors que le même sperme analysé par SCSA dans notre laboratoire (Evenson) indiquait un potentiel de fertilité élevé ! »

Technique TUNEL : Principe

Quantification :

Microscope (peroxydase/DAB + contre coloration)

Microscope à fluorescence (fluoresceine + contre coloration DAPI ou IP)

FCM (fluoresceine + contre coloration DAPI ou IP)

5’

3’

3’

5’

Cette méthode quantifie l’incorporation de nucléotides ( ) marqués ( ) aux

extrémités 3'-OH des fragments d'ADN (simple ou double brin) grâce à une Terminal

deosynucleotidyl transférase (TdT).

Témoin + : traitement par DNase

Témoin - : absence de la transférase

Technique TUNEL : Lecture

FCM

10 000 cellules analysées

Contrôle négatif Patient Contrôle positif

Fluorescence Rouge

Fluorescence Verte

Flu

ore

scence

Vert

e

Microscope à fluorescence / Microscope (peroxydase)

> 300 cellules analysées

pb de l’hétérogénéité du marquage

% s

pe

rma

tozo

ïde

s T

UN

EL +

Immédiatement après l’irradiation

Mêmes échantillons, après 24h

p < 0,01

Grays

Degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes humains (technique TUNEL) après irradiation

(Ramos et Wetzels, 2001)

Paramètres

Fertiles

Infertiles

Hodgkin

Concentration 106/ml

100,9 ±42,7

15,5 ±9,0

56,5 ±43,2

Mobilité (%)

58,3 ±5,6

18,2 ±12,1

42,3 ±16,1

Formes atypiques (%)

42,2 ±3,4

76,0 ±9,9

53,6 ±13,9

ADN fragmenté (%)

5,2 ±2,1

15,7 ±3,9

16,5 ±5,5

ADN fragmenté dans le sperme éjaculé (Gandini et al, 1999)

Donneurs

SIDA

Varicocèle

Infections du tractus génital

Têtes rondes

Cryptorchidie

Stérilité inexpliquée

Séminome testiculaire

Fragmentation

de l ’ADN

0,1 %

5 %

5 %

8 %

10 %

17 %

25 %

50 %

ADN fragmenté dans le sperme éjaculé (Baccetti et al, 1996)

Taux de

fécondation (%)

< 20

20-80

> 80

Nb de cas avec > 4% des

spermatozoïdes avec un

ADN fragmenté

47,4 %

13,2 %

24,0 %

Taux de

clivage (%)

< 20

20-39

40

Nb de cas avec > 4% des

spermatozoïdes avec un

ADN fragmenté

50,0 %

38,5 %

15,8 %

(Sun et al, 1997)

Résultats de la FIV et fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes sélectionnés

Taux de

fécondation (%)

< 20

20-39

40-59

60-79

80

Nb de cas avec > 25% des

spermatozoïdes avec un

ADN fragmenté

75,0 %

50,0 %

20,0 %

7,3 %

0,0 %

(Lopes et al, 1998)

Résultats de l ’ICSI et fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes sélectionnés

Adequate ovarian follicular status does not prevent the decrease in pregnancy rates associated with high sperm DNA fragmentation N. Frydman 2008

117 cycles de FIV; ♀ < 38 ans

TF <35% TF ≥ 35% P

[SPZ] 17,1 [7-260] 17,8 [7-150] NS

Vitalité (%) 70 [51-95] 70 [55-90] NS

Mobilité a + b (%) 30 [20-50] 30 [10-50] NS

FT (%) 46 [19-67] 40 [19-62] NS

Nbre d’ovocytes ponctionnés 11,7 +/- 0,6 11,3 +/- 0,6 NS

Nbre d’ovocytes M 2 ponctionnés 7,0 +/- 0.5 7.2 +/- 0,5 NS

Taux de fécondation (%) 69,9% [64,4-75,3] 71,7% [66,0-77,4] NS

Prévalence d’une bonne qualité embryon. 62.2% [54,9-69,5] 62,5% [54,4-70,6] NS

Taux de grossesse clin. / ponction (%) 62,5% [50,4-74,6] 37,5% [24,0-51,0] 0,007

Taux d’implantation 42,4% [33,8-51,0] 24,5% [16,0-33,0] 0,0043

Grossesse évolutive / ponction (%) 57,8% [45,5-70,1] 23,5% [11,7-35,3] 0,0002

FCS 10,0% [0,51-19,5] 36,8% [14,7-58,9] 0,01

Naissance / ponction 56,2% [43,8-68,6] 23,5% [11,7-35,3] 0,0004

46 bébés 16 bébés

Intégrité de l’ADN chez un homme en bonne santé âgé de 40 ans pendant 10 ans TUNEL : médiane = 8.9% [1.4% -18.6%] SCSA : DNA fragmentation index (DFI) : médiane = 12.7% [7.9%-16.5%] SCSA : high DNA stainability (HDS) : médiane = 6.5% [5.5%-8.2%]

Ten-year variation in semen parameters and sperm deoxyribonucleic acid integrity in a healthy fertile man. Sergerie et al.,2006

L’homme fertile et variations au cours du temps ?

Que peut-on dire de ces tests? Comment et quand les utiliser?

Do sperm DNA integrity tests predict pregnancy with in vitro fertilization? Collins et al., 2008 (1999-2006; 198 études)

Study Treatment Assay Normal range

Cycles Pregnancy outcome

Outcome rates (%)

Boe-Hanson, 2006 IVF

ICSI

SCSA

SCSA

DFI <27%

DFI <27%

139

47

Clinical

Clinical

28

30

Borini, 2006 IVF

ICSI

TUNEL

TUNEL

<10%

<10%

82

50

Clinical

Clinical

22

24

Bungum, 2007 IVF

ICSI

SCSA

SCSA

DFI <30%

DFI <30%

388

223

Delivery

Delivery

28

38

Check, 2005 IVF SCSA DFI <30% 106 Ongoing 17

Gandini, 2004 ICSI SCSA DFI <30% 22 Full term 41

Host, 2000 IVF

ICSI

TUNEL

TUNEL

≤ 4%

≤ 4%

175

61

Biochemical

Biochemical

29

34

Huang, 2005 IVF

ICSI

TUNEL

TUNEL

≤ 4%

≤ 4%

217

86

Pregnancy

Pregnancy

55

51

Larson, 2000 IVF, ICSI SCSA DFI <27% 24 Pregnancy 29

Larson-Cook, 2003 IVF, ICSI SCSA DFI <27% 89 Clinical 31

Payne, 2005 IVF, ICSI SCSA DFI <27% 94 Clinical 33

Seli, 2004 IVF, ICSI TUNEL <20% 49 Clinical 47

Virro, 2004 IVF, ICSI SCSA DFI <30% 249 Ongoing 41

Zini, 2005 IVF, ICSI SCSA DD ≤ 30% 60 Clinical 52

Do sperm DNA integrity tests predict pregnancy with in vitro fertilization? Collins et al., 2008

The small but statistically significant association between sperm DNA integrity test

results and pregnancy in IVF and ICSI cycles is not strong enough to provide

a clinical indication for routine use of these tests in infertility evaluation of men

Sperm DNA damage has a modest impact on pregnancy rates at IVF

High levels of sperm DNA damage have generally been associated with lower IUI pregnancy rates

A systematic review and meta-analysis of ICSI studies indicates that sperm DNA damage is not associated with ICSI pregnancy rates (combined OR of 1.14, 95% CI 0.86, 1.54, p=0.65)

A systematic review and meta-analysis of IVF and ICSI studies shows that sperm DNA damage is associated with a significant increase in the rate of pregnancy loss after IVF and ICSI with a combined OR of 2.48 (95% CI; 1.52, 4.04, p<0.0001)

Influence of sperm DNA damage on natural and assisted pregnancy (Zini and Sigman, 2009)

« 4.6 Assessment of sperm chromatin

Several methods have been used to test the normality of sperm chromatin and DNA. They all

use dyes that bind to histone (aniline blue) or nucleic acid (acridine orange, chromomycin) and

are assessed histologically or by fl ow cytometry. Newer methods include those based on

assessment of DNA strand breaks, such as terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-

mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP)-nick-end labelling (or TUNEL for short (in situ end-

labelling, ISEL), comet assays or sperm chromatin dispersion (SCD). The results of these tests

are correlated with each other (Chohan et al., 2006) and with sperm morphology, motility

and viability. They may give additional information about fertilization rates with standard IVF

and, possibly, spontaneous pregnancy rates. The sperm chromatin structure assay (SCSA) can

be predictive of fertilization failure in vivo and in vitro (Evenson & Wixon, 2006). Whether

there is any relationship between the results of these tests and miscarriage or other

outcomes of pregnancy is not yet clear. »

Ce que dit l’OMS 2010 …

Pas de méthodes proposées / Pas de recommandations

Le Manuel Bioforma

• Test largement utilisé en BDR/AMP

• Absence de Standardisation / méthode de référence

• Absence de seuil ou norme?

• Contrôle qualité?

AU TOTAL,

Accréditation de ces tests : ?