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CURML ǀ Centre Universitaire Romand de Médecine Légale Unité de Génétique Forensique
Travail de diplôme
Evaluation d’une technique
d’amplification du génome entier pour
une application forensique
Estelle Margueron Ecole Supérieure de la Santé
TAB – 53e volée
Mars 2014
Responsable : Marie-Laure Morerod
2
Sommaire
La principale mission de l’unité de génétique forensique (UGF) consiste à établir, sur mandat des autorités judiciaires, des profils génétiques à partir de prélèvements effectués dans le cadre d’une affaire criminelle sur des personnes ou sur des objets pouvant contenir du matériel biologique. Les profils ADN qui répondent aux critères de qualité requis sont envoyés à la banque nationale de profils ADN CODIS. Cependant, certains échantillons ne contiennent pas une quantité d’ADN suffisante pour obtenir un profil génétique de bonne qualité et ainsi être envoyé à CODIS. L’objectif du laboratoire serait de mettre au point une technique d’amplification du génome entier (WGA) permettant d’obtenir plus de matériel génétique avant de procéder à l’analyse des STRs.
Abstract
The main mission of the Forensic Genetics Units (UGF) is to establish, on behalf of judicial authorities, genetic profiles from samples originating either directly from persons or from objects possibly contaminated with human DNA, within criminal cases framework. The DNA profiles, which meet quality criteria, are sent to the national DNA database (CODIS). However, some samples do not contain enough DNA to result in a profile good enough to be submitted to CODIS. The aim of this project was therefore to test a whole genome amplification system, in order to try to increase the amount of DNA material available prior to STR analyses.
3
Table des matières
Sommaire ................................................................................................................................................ 2
Abstract .................................................................................................................................................... 2
Table des matières .............................................................................................................................. 3
1. Introduction ................................................................................................................................... 5
1.1 Présentation du laboratoire .................................................................................................................. 5
1.1.1 Collaborations de l’UGF .................................................................................................................................... 7
1.2 Notions théoriques ................................................................................................................................... 8
1.2.1 De l’ADN au profil génétique .......................................................................................................................... 9
1.2.2 Nomenclature ..................................................................................................................................................... 13
1.3 Les échantillons de traces ................................................................................................................... 14
1.3.1 Les traces dites « complexes » ..................................................................................................................... 14
1.4 Whole Genome Amplification (WGA) ............................................................................................. 16
1.4.1 Ampli1™ WGA kit .............................................................................................................................................. 16
2. But .................................................................................................................................................... 17
3. Matériel et méthodes ............................................................................................................... 18
3.1 Prélèvement et préparation des échantillons ............................................................................. 18
3.1.1 Dilutions à partir d’un extrait de sang ..................................................................................................... 18
3.1.2 Echantillons de cellules isolées ................................................................................................................... 20
3.2 Kit Ampli1™ WGA ................................................................................................................................... 22
3.2.1 Ampli1™ QC kit .................................................................................................................................................. 23
3.3 Quantification .......................................................................................................................................... 24
3.4 Kit AmpFLSTR® NGM SElect™ .......................................................................................................... 24
4. Résultats ........................................................................................................................................ 26
4.1 Résultats obtenus à partir des dilutions d’un extrait de sang ............................................... 26
4.1.1 Observation des profils obtenus ................................................................................................................. 27
4
4.2 Résultats obtenus à partir des échantillons de cellules isolées............................................ 28
4.2.1 Observation des profils obtenus ................................................................................................................. 29
5. Discussion ..................................................................................................................................... 30
6. Conclusion .................................................................................................................................... 31
7. Remerciements ........................................................................................................................... 33
8. Bibliographie ............................................................................................................................... 34
9. Lexique ........................................................................................................................................... 35
10. Annexes ...................................................................................................................................... 37
10.1 Réactifs..................................................................................................................................................... 37
10.2 Matériel .................................................................................................................................................... 38
10.3 Protocole QIAamp DNA minikit ..................................................................................................... 39
10.4 Protocole Ampli1™ WGA kit ............................................................................................................. 40
10.5 Protocole Ampli1™ QC kit ................................................................................................................. 46
10.6 Protocole NanoDrop 3300 ............................................................................................................... 49
10.7 Protocole d’amplification NGM SElect ......................................................................................... 50
10.8 Protocole pour la préparation d’amplicons.............................................................................. 51
10.9 Résultats obtenus avec Ampli1™ QC kit ...................................................................................... 52
10.10 Profils NGM SElect ............................................................................................................................. 53
5
1. Introduction
La fin de mes études approche à grands pas, dans quelques mois je serai une technicienne en analyses biomédicales diplômée. Mais avant d’en arriver là, je dois encore réaliser un travail de diplôme en relation avec mon futur métier. Durant mon stage au sein de l’unité de génétique forensique⊛1 (UGF), un projet de recherche m’a été confié pour me permettre la rédaction de ce document. L’unité de génétique forensique figure parmi les sept unités du centre universitaire romand de médecine légale (CURML). Ce dernier regroupe les instituts universitaires de médecine légale de Genève et de Lausanne. Le site lausannois est intégré au département universitaire de médecine et santé communautaires du CHUV.
1.1 Présentation du laboratoire
Le laboratoire de génétique forensique se sert des outils qu’offre la biologie
moléculaire pour apporter des compléments d’enquête dans le cadre d’une
affaire judiciaire ou dans les cas de parenté.
L’activité principale du laboratoire consiste à établir différents types de profils
ADN à partir de matériel biologique prélevé sur des personnes ou recueilli sur
des objets dans le cadre d’une enquête criminelle. Le laboratoire est accrédité
pour effectuer les profils génétiques suivants [1] :
Profil d’ADN nucléaire autosomal⊛
Profil d’ADN sur le chromosome X
Profil d’ADN sur le chromosome Y
Profil d’ADN mitochondrial
Les profils d’ADN nucléaire autosomal sont envoyés à la banque nationale de
profils ADN CODIS (COmbined DNA Index System).
1 Les mots suivis du symbole ⊛ sont expliqués dans le lexique
6
Sur demande des autorités, l’UGF peut aussi mettre en évidence la présence de
sang, de sperme ou de salive dans un échantillon au moyen de tests
immunochromatographiques.
L’unité comprend encore une équipe de recherche et de développement qui lui
permet de rester à la pointe de la technologie et une TAB responsable de
l’analyse génétique de traces d’origine animale ou végétale.
Comme tous les autres laboratoires suisses effectuant des analyses d’ADN pour le
domaine forensique, l’UGF est soumise à certaines exigences : le laboratoire se
doit d’être accrédité et le personnel doit disposer d’une formation adéquate.
Le système de management mis en place au sein du laboratoire se réfère à la
norme internationale ISO 17025 et respecte diverses lois et ordonnances,
notamment [2] :
La loi fédérale sur l’analyse génétique humaine (RS 810.12)
La loi sur les profils ADN (RS 363)
L’ordonnance sur les profils ADN (RO 2004 5279)
L’ordonnance du DFJP sur les laboratoires d’analyses ADN (RS 363.11)
Basée dans la capitale vaudoise, l’unité de génétique forensique reçoit des
échantillons provenant de toute la Suisse romande et parfois même de l’étranger.
On distingue deux types de prélèvements :
Le matériel biologique prélevé sur des personnes dans le cadre d’une
enquête criminelle, d’une identification ou d’une expertise en filiation
le matériel biologique recueilli sur les lieux d’un délit ou sur une personne
dans le cadre d’une enquête criminelle ou d’une identification - on parle de
trace
Ces deux types de prélèvements sont traités de manière différente et dans des
endroits séparés. Les traces sont des échantillons précieux, dont la quantité
d’ADN est difficile à évaluer. Bien souvent, ces échantillons contiennent peu de
matériel génétique ou alors ce dernier est dégradé. C’est principalement pour
diminuer le risque de contamination des ces échantillons que les prélèvements
effectués sur des personnes, très souvent riches en ADN, sont analysés dans une
zone différente.
7
1.1.1 Collaborations de l’UGF
Pour mener à bien une enquête, la collaboration entre divers corps de métier est
nécessaire. La police scientifique est présente sur les scènes de crime pour
récolter des indices permettant d’identifier les auteurs et les circonstances d’un
délit. Tout matériel suspecté de contenir de l’ADN sera transmis au laboratoire
de génétique forensique, où des analyses seront effectuées pour tenter d’établir
un profil génétique. Afin de pouvoir facilement lier un suspect à une affaire ou
des affaires entre elles, les profils obtenus sont envoyés à la banque de données
des profils ADN CODIS.
Lorsqu’une correspondance est établie entre deux profils, CODIS transmet
l’information au laboratoire, qui valide ou rejette le hit⊛ avant de le renvoyer à
CODIS. Les hits confirmés sont ensuite envoyés à AFIS (Automated Fingerprint
Identification Systems) qui se chargera d’en informer la police.
Toutes les transmissions de données entre ces divers collaborateurs sont
possibles grâce à un portail informatique, le Message Handler.
Police
CODIS
Laboratoire
AFIS
Transmission des
échantillons
Pro
fils
AD
N
Hits
Transmission des hits
confirmés
Tra
nsm
issi
o
n d
es
do
nn
ées
Figure 1 : Collaborations de l’UGF
8
1.2 Notions théoriques
L’histoire de chaque être humain débute de la même manière. Un spermatozoïde
vient féconder un ovule, et de cette cellule sont issues toutes les autres cellules
propres à chaque individu.
Au cœur de chaque cellule, dans le noyau plus précisément, se trouvent les trois
milliards de nucléotides de l’ADN humain. Cet ADN qui constitue au total les 23
chromosomes⊛ que l’on retrouve dans chaque spermatozoïde et ovule. Une fois
fécondé, ce dernier contient alors 2 exemplaires de chaque chromosome : un
provenant du père et l’autre de la mère [3].
Il y a, dans l’ADN, des séquences de nucléotides qui codent pour des protéines.
On parle de séquences codantes. L’ADN codant est séparé par plusieurs milliers
de nucléotides⊛ ne portant aucune information génétique. On parle alors de
séquences non-codantes [3].
Ces dernières sont d’un grand intérêt pour la génétique forensique : elles
contiennent des éléments composés de plusieurs paires de bases répétés un
certain nombre de fois.
Exemple : ATGATGATGATG avec 4 répétitions de l’élément ATG.
La variation du nombre de répétitions des éléments varie énormément d’une
personne à l’autre. Le polymorphisme de longueur occasionné permet de
caractériser génétiquement un individu.
Ces séquences répétitives se nomment différemment selon le nombre de
nucléotides qu’elles contiennent : le terme VNTR (Variable Number Tandem
Repeats) est utilisé pour les séquences comprenant un nombre de nucléotides
supérieur à 6 et celui de STR (Short Tandem Repeats) pour les éléments répétés
composés de 2 à 6 nucléotides. Ces derniers sont les plus utilisés en génétique
forensique.
9
1.2.1 De l’ADN au profil génétique
Le profil génétique est le résultat d’une série d’étapes consécutives :
L’extraction de l’ADN contenu dans l’échantillon
Cette étape consiste à libérer l’ADN contenu dans les cellules collectées lors du
prélèvement. Il existe plusieurs méthodes d’extraction, mais toutes incluent une
étape de lyse cellulaire.
L’extraction est une étape cruciale : pour la suite du travail, de l’ADN de bonne
qualité et en quantité suffisante est nécessaire pour obtenir un profil optimal.
L’amplification de l’ADN par PCR
Ce qui se passe durant cette étape est très semblable à ce que réalise une cellule
en division : l’information génétique est minutieusement copiée à chaque
division, ce qui fait que toutes les cellules d’un individu sont génétiquement
identiques.
L’amplification est une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) : une enzyme,
la Taq polymérase, va copier un fragment cible de l’ADN un certain nombre de
fois. Cette réaction est spécifique grâce à des courts brins d’ADN synthétiques,
appelés amorces (ou primers) [4].
Une PCR est composée d’une succession de cycles qui se déroulent chacun en
trois étapes et à des températures différentes :
1. La dénaturation :
Les liaisons hydrogènes qui relient les 2 brins d’ADN sont rompues sous l’effet de
la chaleur (94-95°C).
Figure 2 : Amplification par PCR - dénaturation
10
2. L’hybridation
Une température de 55-60°C permet l’hybridation complémentaire des amorces
sur le brin d’ADN matrice. Ces amorces délimitent le début et la fin de la zone à
amplifier.
3. L’élongation
A une température de 70-72°C, la Taq polymérase va lire le brin matrice et
former le brin complémentaire en accrochant les nucléotides les uns aux autres
en partant de l’amorce.
La quantité d’ADN double au cours de chaque cycle : au final l’amplicon⊛
renferme plusieurs millions de copies du fragment cible.
Cette technique, qui nécessite des températures bien définies, est automatisée
par l’utilisation de blocs PCR. Ces derniers ont la capacité d’effectuer des
variations de température de manière reproductible et rapide.
Les kits commerciaux utilisés au laboratoire de génétique forensique sont
capables d’amplifier seize STRs simultanément ainsi que l’amélogénine, un
marqueur permettant de déterminer le sexe d’un individu - on parle alors de PCR
multiplex [4].
Figure 3 : Amplification par PCR - hybridation
Figure 4 : Amplification par PCR - élongation
11
La séparation et la détection de l’ADN amplifié par électrophorèse capillaire
Cette étape requiert l’utilisation d’un appareil d’électrophorèse capillaire. Un tel
appareil est conçu pour séparer et détecter des fragments d’ADN.
Un mélange composé de formamide et d’un standard interne de taille est ajouté
au produit de la PCR. Le premier sert à dénaturer les amplicons afin de
standardiser les résultats tandis que le second permet de calculer le nombre de
paires de bases des fragments d’ADN détectés [4].
Les fragments d’ADN vont par la suite migrer dans des capillaires remplis de
polymère sous l’action d’un courant électrique, de la cathode vers l’anode.
Cette solution de polymère se présente comme un tamis moléculaire : les
fragments de petite taille sont moins retenus par le polymère et migrent plus vite
que les fragments de taille supérieure [5].
La présence d’une molécule fluorescente sur une des deux amorces utilisées pour
amplifier chaque STR permet la détection des amplicons.
Les capillaires passent devant une fenêtre de détection pourvue d’un laser et
d’une caméra CCD (charge-coupled device).
Lorsqu’un fragment d’ADN marqué passe devant la fenêtre de détection, le laser
va exciter les électrons du fluorophore⊛. En revenant à leur niveau énergétique
initial, les électrons vont émettre un photon⊛. La longueur d’onde émise par le
photon, caractéristique du fluorophore utilisé, est détectée par la caméra CCD .
Les données enregistrées par la caméra sont ensuite analysées par un logiciel qui
permet de déterminer la taille des fragments détectés par comparaison avec celle
des fragments du standard interne de taille.
Une fois que le nombre de paires de bases de chaque fragment est défini, le
logiciel les nomme en se basant sur l’échelle allélique [4].
12
Inte
nsi
té [
RF
U]
[RF
U[R
FU
]
Taille en paire de base [bp]
[bp][bp]
Un profil génétique se présente de la manière suivante :
Les seize marqueurs qui le composent contiennent chacun un ou deux allèles
selon que l’individu soit homozygote ou hétérozygote.
Figure 5: Profil génétique NGM SElect
13
1.2.2 Nomenclature
Nomenclature des locus
Un code constitué de quatre éléments est utilisé
pour nommer les régions de l’ADN non-codant
choisies comme marqueur [3].
Prenons comme exemple le locus D18S51 :
La lettre « D » est associée à ADN (DNA en anglais)
Le numéro « 18 » se rapporte au chromosome qui porte la séquence d’ADN
La lettre « S » indique que la séquence d’ADN est unique.
Le numéro « 51 » correspond à un numéro de série qui rend le locus unique.
Nomenclature des allèles
Les allèles sont nommés selon le nombre d’éléments répétés contenus dans la
séquence. Dans la figure 5, le locus D18S51 comporte deux pics : le premier a été
nommé 13 et le second 20. Cela signifie que sur un chromosome l’élément en
question est répété 13 fois et que son homologue compte 20 répétitions.
Un allèle intermédiaire est désigné par le nombre d’éléments
répétitifs complets suivi du nombre de nucléotides de l’élément
répétitif partiel.
Prenons comme exemple l’allèle 9.3 du locus TH01 :
L’élément répété dans ce STR comporte quatre nucléotides. Cet
élément est donc entièrement répété 9 fois et sur les quatre
nucléotides, 3 sont encore répétés une fois.
L’allèle est alors nommé 9.3
Figure 6: Locus D18S51
Figure 7: Allèles 6-9.3
14
1.3 Les échantillons de traces
Sur le lieu d’un crime, la police scientifique recherche des traces biologiques
susceptibles d’identifier le coupable. Une fois les prélèvements effectués, ces
précieux échantillons sont acheminés au laboratoire pour analyse.
Ces échantillons sont uniques et d’une grande diversité. Aux taches de sang et de
sperme, s’ajoutent les traces de contacts ou de salive. Sans oublier que le
matériel génétique peut être retrouvé sur un nombre incalculable de supports
différents, pouvant aller du mégot de cigarettes à la poignée d’une porte.
Bien souvent, les profils de traces impliquent plusieurs personnes, ce qui ajoute
une difficulté supplémentaire.
Lorsque les prélèvements arrivent au laboratoire, les TAB décident, selon la
nature de la trace, du protocole d’extraction à appliquer. L’extrait sera quantifié
afin d’adapter au mieux les conditions d’amplification. Les traces nécessitent
souvent plusieurs amplifications pour s’assurer de la reproductibilité des allèles
obtenus après électrophorèse capillaire. Les profils qui répondent aux critères de
qualités définis par CODIS sont enregistrés dans la base de données, les autres
sont disponibles au laboratoire pour comparaison locale.
1.3.1 Les traces dites « complexes »
Malgré des techniques adaptées et sensibles, l’obtention d’un profil génétique
n’est pas garantie. Plusieurs paramètres peuvent être à l’origine d’un profil ADN
non-exploitable, notamment la quantité d’ADN contenu dans l’échantillon, son
degré de dégradation ou la présence d’inhibiteurs⊛ de la PCR.
En théorie, une seule molécule d’ADN suffirait à identifier un individu, au
laboratoire c’est plutôt avec une centaine de cellules qu’on obtient un profil
génétique optimal [3]. Sans un produit de départ doté d’une certaine quantité
d’ADN de bonne qualité, l’obtention d’un profil ADN exploitable devient difficile
en raison de l’apparition d’effets stochastiques⊛.
15
Les effets stochastiques
Voici un exemple où les allèles du locus D18S51 sont
correctement balancés : le nombre de molécule d’ADN
portant l’allèle 13 est égal au nombre de molécule d’ADN
portant l’allèle 20.
Cependant les traces recueillies peuvent avoir été endommagées et les molécules
d’ADN abîmées. Il est tout à fait possible que sur nos allèles 13-20 de l’exemple
ci-dessus, la molécule d’ADN portant l’allèle 13 soit restée intacte et que celle
portant l’allèle 20 ait été partiellement altérée : on observera alors un
déséquilibre entre les pics – on parle de déséquilibre allélique [3].
Il est également possible que dans notre exemple des allèles 13-20, la molécule
d’ADN portant l’allèle 20 soit entièrement altérée. Dans ce cas là, seul l’allèle 13
sera détecté lors de l’électrophorèse – on parle alors d’allèle drop-out [3].
A l’inverse, il se peut que des allèles n’appartenant pas à l’individu en question se
retrouvent sur le profil – on parle dans ce cas d’allèle drop-in.
Les effets stochastiques peuvent également être générés au laboratoire, lors des
pipetages. Le volume prélevé ne contient pas toutes les molécules présentes dans
l’extrait, ce qui peut occasionner un déséquilibre ou des allèles drop-out.
Figure 8 : Individu hétérozygote pour le marqueur D18S51
Figure 9: Effets stochastiques
Coquoz R. et al. (2013), Preuves par l’ADN : la génétique au service de la justice (p.146)
16
1.4 Whole Genome Amplification (WGA)
De nombreuses publications démontrent des résultats concluants pour cette
technique d’amplification du génome⊛ entier. Cependant, elle est surtout
optimisée pour des échantillons relativement riches en ADN [6,7].
L’utilisation de cette technique dans le domaine forensique serait intéressante
pour traiter les échantillons de traces contenant très peu de matériel génétique.
Certaines études sur l’application forensique du WGA montrent des résultats
prometteurs, mais la technique reste, pour l’instant, encore limitée par des
défauts de réplications fréquemment observés avec des quantités d’ADN de
départ inférieures à 1ng/µl [6,7].
L’UGF voit, au travers de cette technique, une solution pour traiter les traces
pauvres en ADN, qui pour certaines affaires, peuvent s’avérer être primordiales.
Un projet de recherche a été confié à Neïla Meel dans le cadre de son travail de
diplôme. Ce dernier consistait à comparer deux kits commerciaux dans le but de
mettre en place une méthode d’analyse applicable en routine. Suite aux résultats
que Neïla a obtenu avec les kits GenomiPhi V2 DNA Amplification (GE Life
Science) et GenomePlex WGA Whole Genome Amplification (Sigma-Aldrich),
aucune méthode d’analyse n’a pu être appliquée au laboratoire [8].
1.4.1 Ampli1™ WGA kit
Selon le fabriquant (Silicon Biosystems), le kit Ampli1™ WGA permet d’amplifier
de manière fiable et reproductible, tout le génome à partir d’une seule cellule. Le
protocole, basé sur une réaction de ligation-mediated PCR, est également adapté
à un nombre de cellules plus élevé [9].
Intéressée par la prétendue performance de ce kit, l’unité de génétique
forensique m’a proposé de le tester dans le cadre de mon travail de diplôme.
17
2. But
Le projet « Whole Genome Amplification » a été mis en place par le laboratoire dans le but d’augmenter le nombre de profils pouvant être envoyés à CODIS. Les méthodes d’analyses utilisées actuellement à l’UGF ne permettent pas d’obtenir des résultats concluants avec les échantillons dont la quantité d’ADN approche les dizaines de picogrammes.
Le but de ce travail consiste à évaluer une technique d’amplification du génome entier afin de mettre en place une méthode d’analyse applicable en routine. Pour chaque échantillon, une amplification respectant le protocole de routine sera effectuée en parallèle de l’amplification du génome entier avec le kit Ampli1™ WGA. Les résultats obtenus seront comparés pour évaluer une éventuelle augmentation du nombre de locus détectés ainsi que leur validité.
A la base, le kit Ampli1™ WGA est prévu pour amplifier tout le génome à partir de cellules isolées, il inclut donc une étape de lyse. Cependant, cette méthode serait appliquée à l’UGF uniquement lorsque les kits utilisés en routine ne permettent pas d’obtenir un profil exploitable. Ce qui signifie que l’ADN aura déjà été extrait…
Afin d’évaluer la performance du kit Ampli1™ WGA sur ce type d’échantillons, des dilutions à partir de sang préalablement extrait ont été effectuées jusqu’à obtenir diverses concentrations d’ADN situées en dessous de 10 pg/µl. Le sang a été prélevé sur deux collaborateurs volontaires dont le profil ADN est connu.
D’autres essais ont été réalisés à partir de cellules isolées, ce pourquoi le kit est initialement prévu. Pour cela, des frottis de muqueuse jugale (FMJ) ont été prélevés sur deux collaboratrices volontaires dont le profil ADN est déjà établi. Les écouvillons ont été envoyés chez Silicon Biosystems à Bologne afin que les cellules épithéliales soient isolées par la technologie DEPArray™. Les essais ont été effectués sur des échantillons contenant entre 1 et 20 cellules.
Ces essais vont permettre de déterminer si le kit Ampli1™ WGA est compatible avec le kit AmpFLSTR® NGM SElect™ (Applied Biosystems) utilisé en routine pour l’analyse des STRs. Il sera aussi question d’évaluer la conséquence de deux amplifications successives sur les résultats.
Selon la fiabilité des résultats obtenus, le laboratoire évaluera l’intérêt d’une éventuelle application du protocole Ampli1™ WGA en routine en tenant compte notamment des coûts et de la durée de l’analyse, ainsi que de la complexité des manipulations à effectuer.
18
3. Matériel et méthodes
3.1 Prélèvement et préparation des échantillons
3.1.1 Dilutions à partir d’un extrait de sang
Un tube de sang (Monovette® EDTA K, 2.7ml) a été prélevé sur deux
collaborateurs volontaires dont le profil génétique est connu : NAD et FG.
Après avoir extrait ces deux échantillons avec le QIAamp DNA minikit (Qiagen), la
quantité d’ADN contenu dans l’extrait a été estimée à l’aide du Nanodrop 3300
(Thermo Scientific)(voir chapitre 3.3).
En théorie, la quantité d’ADN contenue dans du sang se situe autour de 35 ng/µl
[3]. Les extraits NAD et FG ont été dilués avec du Tris-EDTA 1x de manière à
obtenir, en théorie toujours, les concentrations d’ADN suivantes :
500 pg/µl, 250 pg/µl et 125 pg/µl.
Chaque dilution a été mesurée à triple sur le Nanodrop 3300. La moyenne ainsi
obtenue a été multipliée par le facteur de dilution afin d’obtenir une estimation
de la quantité d’ADN contenu dans l’extrait.
Pour NAD, la quantité d’ADN contenu dans l’extrait a été estimée à 58 ng/µl.
Pour FG, la quantité d’ADN contenu dans l’extrait a été estimée à 16 ng/µl.
A partir de ces valeurs, une série de 9 dilutions a été effectuée sur chaque extrait
jusqu’à obtenir des concentrations inférieures à 10 pg/µl.
19
Tableau 1 : Dilutions NAD
Concentrations [pg/µl] Volume d’ADN Volume Low TE
NAD 580 10 µl extrait NAD 990 µl
NAD 58 20 µl NAD 580 180 µl
NAD 29 100 µl NAD 58 100 µl
NAD 14.5 100 µl NAD 29 100 µl
NAD 7.25 100 µl NAD 14.5 100 µl
NAD 3.6 100 µl NAD 7.25 100 µl
NAD 1.8 100 µl NAD 3.6 100 µl
NAD 0.9 100 µl NAD 1.8 100 µl
NAD 0.45 100 µl NAD 0.9 100 µl
Tableau 2 : Dilutions FG
Concentrations [pg/µl] Volume d’ADN Volume Low TE
FG 160 10 µl extrait FG 990 µl
FG 40 100 µl FG 160 300 µl
FG 20 100 µl FG 40 100 µl
FG 10 100 µl FG 20 100 µl
FG 5 100 µl FG 10 100 µl
FG 2.5 100 µl FG 5 100 µl
FG 1.25 100 µl FG 2.5 100 µl
FG 0.6 100 µl FG 1.25 100 µl
FG 0.3 100 µl FG 0.6 100 µl
Les dilutions ci-dessus, excepté NAD 580 et FG 160, ont été amplifiées avec le kit
AmpFLSTR® NGM SElect™ (voir chapitre 3.4) afin de déterminer la limite de
détection du kit et de sélectionner les échantillons qui vont être amplifiés avec le
kit Ampli1™ WGA. Les conditions utilisées sont les mêmes que celles utilisées en
routine.
Suite aux résultats obtenus, une amplification du génome entier avec le kit
Ampli1™ WGA sera effectuée sur les échantillons suivants :
NAD 1.8, NAD 0.9 et NAD 0.45 / FG 1.25, FG 0.6 et FG 0.3
20
Les profils obtenus à partir de NAD 0.9 et 0.45 ainsi que FG 0.6 et 0.3 ne
présentent pas six locus reproductibles, ils ne répondent donc pas aux critères
définis par CODIS. Les échantillons NAD 1.8 et FG 1.25 vont servir de « contrôle »
pour l’amplification WGA.
Les profils obtenus dans les conditions de routine seront finalement comparés à
ceux obtenus à la suite de l’amplification WGA.
3.1.1.1 Extraction QIAamp
Le principe de cette extraction repose sur l’affinité de l’ADN pour la silice en
présence de sels chaotropiques⊛.
Les parois des cellules sont d’abord rompues sous l’effet de la chaleur et d’un
détergent. L’échantillon est ensuite transféré sur une colonne possédant une
membrane de gel-silice, sur laquelle l’ADN va se lier en présence d’un tampon de
forte concentration ionique au cours d’une brève centrifugation. Les protéines et
autres impuretés sont éliminées par deux lavages. Puis l’ajout d’un tampon
d’élution de pH basique et de faible concentration ionique permet de récupérer
l’ADN après centrifugation [4].
3.1.2 Echantillons de cellules isolées
Un frottis de muqueuse jugale a été effectué sur deux collaboratrices volontaires
dont le profil ADN est connu, JN et MLM.
Ces échantillons ont été envoyés dans un laboratoire spécialisé à Bologne afin
que les cellules épithéliales soient isolées sur le DEPArray™. Ce trieur de cellules
a été développé par Silicon Biosystems, fournisseur du kit Ampli1™ WGA. Ce
dernier est initialement prévu pour amplifier tout le génome à partir de cellules
isolées par la technologie DEPArray™.
21
Avant d’être chargés sur le trieur de cellules, les FMJ ont été incubés 30 minutes
à 25°C dans du PBS contenant 2 mmol/l d’EDTA. Le surnageant qui contient alors
les cellules épithéliales est récupéré après centrifugation.
Au total, le tri de ces cellules a permis d’obtenir 15 échantillons contenant un
certain nombre de cellules épithéliales dans 1µl de PBS. Ces échantillons sont
prêts à être amplifiés avec le kit Ampli1™ WGA.
Cependant, toujours dans le but de comparer les résultats obtenus dans les
conditions de routine actuelles à ceux obtenus suite à l’amplification du génome
entier, cinq échantillons représentatifs du panel à disposition (1 à 20 cellules)
ont été extraits selon le protocole QIAamp avant d’être amplifiés avec le kit
AmpFLSTR® NGM SElect™.
Tableau 3 : Echantillons de cellules triées extraits avec le QIAamp DNA minikit puis amplifiés avec le
kit AmpFLSTR® NGM SElect™
Donneur ID Nombre de cellules
JN AEX 1650 17 5
JN AEX 1650 20 10
JN AEX 1650 22 20
MLM AEX1651 5 15
MLM AEX1651 6 1
Les échantillons restant ont été amplifiés avec le kit Ampli™ WGA.
Tableau 4 : Echantillons de cellules triées amplifiés avec le kit Ampli1™ WGA.
Donneur ID Nombre de cellules
JN AEX 1650 14 1
JN AEX 1650 15 1
JN AEX 1650 16 1
JN AEX 1650 18 3
JN AEX 1650 19 10
MLM AEX1651 3 1
MLM AEX1651 4 20
MLM AEX1651 7 1
MLM AEX1651 8 8
MLM AEX1651 9 9
22
3.1.2.1 DEPArray™ Technology
Le DEPArray™ différencie les populations de cellules sur la base de différents
paramètres (surface, diamètre, périphérie des cellules…), observés par
microscopie à fluorescence. Les échantillons sont chargés dans une cartouche qui
est ensuite placée dans le trieur de cellules. La cartouche est scannée dans le
visible ainsi que dans le canal de fluorescence choisi. Les cellules contenues dans
nos échantillons ont été marqués par le DAPI, une molécule fluorescente se liant
aux bases adénine (A) et thymine (T) de l’ADN [10,11].
Les cellules peuvent ensuite être isolées grâce à un principe d’électrocinétique
appelé diélectrophorèse (DEP).
La cartouche se compose d’un damier d’électrodes et d’une plaque de verre. Les
cellules se retrouvent « piégées » dans des cages de potentiel créées par un flux
continu d’électrons provenant du verre chargé négativement et allant sur les
électrodes chargées positivement. En changeant la charge des électrodes, la cage
de potentiel contenant la cellule va se déplacer [10].
3.2 Kit Ampli1™ WGA
Afin de pouvoir procéder à une amplification fidèle du matériel génétique
présent dans l’échantillon, l’ADN est préalablement digéré en fragments de tailles
diverses (de quelques paires de bases à environ 5000bp) à l’aide d’une enzyme
de restriction⊛.
Figure 10 : Principe de la diélectrophorèse
23
Les réactions de PCR utilisées pour dupliquer l’ADN ne pouvant pas être
effectuées directement sur ces fragments, des linkers⊛ universels dont la
séquence est connue sont ajoutés en 3’ et 5’.
Grâce à ces linkers, il devient ensuite possible d’amplifier les différents
fragments à l’aide d’amorces dont la séquence est complémentaire aux linkers
utilisés via une réaction de PCR [12].
3.2.1 Ampli1™ QC kit
Le kit Ampli1™ QC permet d’amplifier simultanément les 4 marqueurs suivants
afin d’évaluer la qualité de l’ADN généré par le kit Ampli1™ WGA [13].
Tableau 5 : Marqueurs du kit Ampli1™ QC
Marqueur Chromosome Taille de l’amplicon [bp]
A 12p 91
B* 5q 108-166
C 17p 299
D 6q 614 *Le marqueur B se situe dans une région polymorphique. Le produit PCR peut être soit homozygote
(1bande située entre 108 et 166 bp), soit hétérozygote (2 bandes situées entre 108 et 166 bp).
Les fragments d’ADN amplifiés avec le kit Ampli1™ QC sont détectés par
électrophorèse sur gel d’agarose (1.2%).
Figure 11 : Exemple d’une électrophorèse sur gel d’agarose sur les amplicons
obtenus avec le kit Ampli1™ WGA
Silicon Biosystems, Ampli1™ QC kit [User Manual], v1.0-01/2013, p.2
24
3.3 Quantification
Tous les échantillons ont été quantifiés sur le NanoDrop 3300, un appareil à
source optique multiple permettant d’effectuer des mesures dans la fluorescence.
Grâce à un système combinant la technologie de rétention d’échantillon au
filtrage virtuel pour les applications à LED blanches, les mesures effectuées sur le
NanoDrop 3300 ne nécessitent pas plus de 2 microlitres d’échantillon et peuvent
se faire à travers un large spectre de longueurs d’onde [14].
La source d’excitation provient d’une des trois diodes orientées à 90° par rapport
au détecteur à 2048 capteurs CCD. Ce dernier est relié à la surface de mesure par
une fibre optique en quartz.
Le fluorophore utilisé pour la quantification des échantillons est le SYBR Green I.
Sa plage de détection se situant entre 1 et 1000 pg/μl, le SYBR Green I est
parfaitement adapté aux échantillons pauvres en ADN. Lorsqu’il est lié à de l’ADN
double-brin, le SYBR Green I présente un maximum d’émission à 527 nm [15].
3.4 Kit AmpFLSTR® NGM SElect™
Ce kit permet d’amplifier simultanément 16 STRs ainsi que l’amélogénine qui
permet de caractériser le sexe de l’individu source de l’échantillon [16].
Les marqueurs utilisés dans le kit AmpFLSTR® NGM SElect™ ont été définis par la
réglementation sur l’utilisation de profil ADN. Ils sont choisis en fonction de leur
taux de variabilité élevé, de leur faible taux de mutation ainsi que de leur
indépendance génique.
Sur les 16 marqueurs, seuls deux sont situés sur le même chromosome : il s’agit
du D12S391 et du vWA. Les marqueurs situés sur le même chromosome doivent
être séparés par une distance d’au moins 50 centimorgans⊛ (cM) pour être
considérés comme indépendants et assurer une recombinaison totale. Ces deux
marqueurs, localisés sur le chromosome 12, ne sont séparés que par une distance
de 6.3 centimorgans. Ces deux locus sont dits génétiquement liés [17].
25
Le kit AmpFLSTR® NGM SElect™ est le kit de référence choisi pour alimenter la
base de données nationale. Il est utilisé comme kit de routine au laboratoire de
génétique forensique.
Les conditions d’amplification utilisée en routine sont différentes selon le type de
prélèvement à analyser et ont été définies suite à une validation interne du kit.
Les conditions d’amplification pour les FMJ ont été standardisées, ces
derniers sont amplifiés dans un volume PCR de 10 µl à 27 cycles à partir de 1
µl d’extrait.
Les traces sont amplifiées dans un volume de 25 µl (15 µl de mix PCR) à 30
cycles. Le volume d’ADN nécessaire est défini selon le tableau ci-dessous.
Tableau 6 : Conditions d’amplification NGM SElect
Concentration en pg/µl µl ADN
>1000 Diluer pour avoir env. 1
ng/µl
500 à 1000 2 µl
250 à 500 3 µl
125 à 250 4 µl
62.5 à 125 5 µl
< 62.5 10 µl
Les amplicons obtenus post-WGA ont été amplifiés dans un volume final de 25 µl
à 27 cycles au vu des résultats de la quantification.
Les fragments d’ADN ont été détectés par électrophorèse capillaire sur un
séquenceur automatique ABI 3500xL (Applied Biosystems).
26
4. Résultats
A chaque amplification, ont été ajoutés un témoin positif et un témoin négatif afin
de pouvoir assurer la fiabilité des résultats. Chacun de ces témoins s’est avéré
valide. Tous les résultats ont donc pu être pris en compte.
Un profil comprenant moins de 5 allèles détectés est considéré comme négatif.
Un profil exploitable signifie que le profil répond au format CODIS. C’est-à-dire
qu’il possède au moins 6 locus reproductibles pour un profil simple (=1
personne).
Pour chaque échantillon, le « % d’allèles corrects détectés » a été calculé en
fonction du nombre d’allèles attendus et le « nombre d’allèles drop-in » a été
relevé. Chaque allèle nommé (>50 RFU) a été pris en compte dans les résultats.
4.1 Résultats obtenus à partir des dilutions d’un extrait de sang Tableau 7 : Résultats des essais effectués à partir de dilutions d’un extrait de sang
AM NGM Select selon les
conditions de routine UGF
AM avec le kit Ampli1™ WGA
+ NGM SElect
Allèles
corrects [%]
Nombre de
drop-in
Allèles
corrects [%]
Nombre de
drop-in
Quantification
post-WGA [ng/µl]
Ampli1™
QC kit
NAD 1.8 79% 0 30% 5 29.0 0/4
NAD 0.9 18% 0 6% 6 34.7 0/4
NAD 0.45 32% 3 3% 2 30.8 0/4
FG 1.25 85% 1 39% 13 18.8 0/4
FG 0.6 61% 0 12% 7 29.0 0/4
FG 0.3 36% 0 27% 10 30.3 0/4
AM : amplification
27
Les résultats obtenus sont l’inverse de ceux attendus. On observe une baisse du
pourcentage d’allèles corrects détectés lorsque l’amplification du génome entier
avec le kit Ampli1™ WGA est effectuée. De plus le nombre de drop-in est très
important.
Le fait qu’aucun fragment d’ADN ne soit détecté avec le kit Ampli1™ QC signifie
que la PCR n’a probablement pas pu avoir lieu. Cependant, des « smear⊛ PCR »
sont observés dans les puits correspondants à ces échantillons, ce qui exclut donc
un problème technique survenu au laboratoire. L’amplicon WGA semble alors
être en cause.
4.1.1 Observation des profils obtenus
Les profils obtenus avec les conditions de routine présentent surtout des drop-
out et un déséquilibre allélique. Les grands marqueurs (>250bp) sont, pour la
plupart, absents. La faible intensité des profils (<500 RFU alors que l’intensité
optimale se situe entre 2000 et 9000 RFU) reflète la faible quantité d’ADN
présent dans les échantillons. Tous les profils contiennent plus de 5 allèles, aucun
n’est donc considéré comme négatif. Deux profils, NAD 1.8 et FG 1.25, pourraient
être envoyés à CODIS, malgré une qualité médiocre (faible intensité des profils,
allèles drop-out, déséquilibre allèlique). Les autres sont considérés comme pas
interprétables.
Les profils NGM SElect obtenus sur les échantillons préalablement amplifiés avec
le kit Ampli1™ WGA sont, d’une manière globale, de mauvaise qualité. Une
énorme différence d’intensité est observée entre les marqueurs (de 100 RFU à
22000 RFU). Le bruit de fond est augmenté, ainsi que la présence d’artéfacts. Il
est difficile d’interpréter ces profils en raison de leur apparence atypique.
28
4.2 Résultats obtenus à partir des échantillons de cellules isolées
Tableau 8 : Résultats des essais effectués à partir d’échantillons de cellules isolées
AM NGM Select selon les
conditions de routine UGF
AM avec le kit Ampli1™ WGA
+ NGM SElect
Allèles
corrects [%]
Nombre de
drop-in
Allèles
corrects [%]
Nombre de
drop-in
Quantification
post-WGA
[ng/µl]
Ampli1™
QC kit
1650 17
5 cellules 61% 4
1650 20
10 cellules 65% 4
1650 22
20 cellules 97% 3
1651 5
15 cellules 96% 5
1651 6
1 cellule 35% 3
1650 14
1 cellule 23% 9 27.1 0/4
1650 15
1 cellule 32% 3 25.3 1/4
1650 16
1 cellule 29% 9 26.4 1/4
1650 18
3 cellules 55% 3 25.9 3/4
1650 19
10 cellules 61% 5 24.2 4/4
1651 3
1 cellule 42% 8 22.6 3/4
1651 4
20 cellules 96% 2 6.8 4/4
1651 7
1 cellule 54% 7 27.1 4/4
1651 8
8 cellules 73% 5 9.0 4/4
1651 9
9 cellules 77% 1 6.5 4/4
AM : amplification
29
Le pourcentage d’allèles corrects et le nombre de drop-in sont assez similaires
entre les deux méthodes, si l’on se base sur des échantillons contenant plus ou
moins le même nombre de cellules.
On remarque également que des fragments d’ADN sont amplifiés avec le kit
Ampli1™ QC, puis détectés lors de l’électrophorèse sur gel d’agarose.
4.2.1 Observation des profils obtenus
Les profils obtenus dans les conditions de routine présentent également des
drop-out et des déséquilibres entre les allèles. La faible intensité des profils
(<500 RFU) reflète la faible quantité d’ADN présent dans les échantillons. Aucun
profil n’est considéré comme négatif. Un minimum de 10 cellules est nécessaire
pour obtenir un profil exploitable.
Les profils NGM SElect obtenus sur les échantillons de cellules isolées,
préalablement amplifiés avec le kit Ampli1™ WGA, sont de meilleure qualité que
ceux obtenus dans les mêmes conditions, mais à partir de dilutions d’un extrait
de sang. Les artéfacts observés dans ces derniers n’apparaissent pas. Il faut tout
de même un minimum de 8 cellules pour obtenir un profil exploitable. Certains
marqueurs sont faiblement exprimés, de manière récurrente. Cela concerne
notamment l’amélogénine ainsi que les locus D8S1179, D18S51, D22S1045, FGA
et D1S1656. Si l’on compare ces profils avec ceux obtenus avec les conditions de
routine, on remarque une augmentation de l’intensité (<750 RFU à >10'000
RFU). Ce qui signifie que l’amplification du génome entier est tout de même
efficace.
30
5. Discussion
Le point le plus important à relever est sans doute que les résultats obtenus
diffèrent énormément selon le type d’échantillons utilisé. Rappelons que le kit
Ampli1™ WGA a été initialement développé pour amplifier le génome entier de
cellules isolées par la technologie DEPArray™. Cependant, d’un point de vue
théorique l’amplification WGA avec ce kit devrait également être réalisable sur
des cellules non-isolées.
La raison d’une telle différence pourrait provenir du matériel utilisé pour
débuter l’amplification WGA. Les cellules isolées se trouvent dans 1 µl de tampon
PBS, mais ce volume contient un nombre défini de cellules intactes, à l’intérieur
desquelles les molécules d’ADN sont en nombre équitable. Tandis que pour les
échantillons obtenus par dilution de l’extrait de sang, effectuer l’amplification du
génome entier à partir de 1 µl d’échantillon n’est pas vraiment adéquat.
Les observations effectuées sur les profils établis à partir des dilutions des
extraits de sang ont soulevées plusieurs questions, qui sont malheureusement
restées sans réponses :
Comment est-il possible d’observer une telle différence d’intensité entre les
marqueurs ?
Les échantillons extraits selon le protocole QIAamp seraient-il incompatibles
avec le kit Ampli1™ WGA ? Pour quelles raisons ?
Une incompatibilité entre le kit Ampli1™ WGA et le kit AmpFLSTR® NGM SElect™
pourrait être à l’origine des 6 marqueurs qui, de manière systématique, ne sont
pas amplifiés correctement. Il est possible que les sites de restriction de l’enzyme
utilisée dans le kit Ampli1™ WGA soient situés sur les régions flanquantes⊛ des
STRs concernés. Les amorces ne pourraient donc pas s’apparier de manière
optimale. Ceci aurait des conséquences sur la quantité de brins synthétisés.
Les profils observés sont tous des profils simples. Il faut être conscient que les
profils obtenus pour la majorité des traces analysées au laboratoire, sont des
profils de mélange déjà assez complexe à interpréter. Les méthodes d’analyses
appliquées en routine doivent, pour cette raison, être pertinentes et robustes,
afin de fournir des résultats reproductibles et fiables.
31
6. Conclusion
Le but de ce travail consistait à évaluer une technique d’amplification du génome
entier afin de déterminer l’éventuelle pertinence d’une telle analyse en routine.
Déterminer la compatibilité entre le kit Ampli1™ WGA et le kit AmpFLSTR® NGM
SElect™, évaluer la conséquence de deux amplifications successives sur les
résultats et définir si cette méthode apporte un réel intérêt au laboratoire
faisaient partie des points à développer.
Les résultats obtenus avec les échantillons de cellules isolées démontrent que la
quantité d’ADN nécessaire pour obtenir des profils exploitables avec le kit
Ampli1™ WGA, permet également d’obtenir un profil exploitable avec le kit
AmpFLSTR® NGM SElect™.
Cependant, certains marqueurs ne sont systématiquement pas amplifiés de
manière optimale après une analyse WGA. La compatibilité entre les deux kits est
remise en cause.
Le nombre de drop-in observés à la suite d’une amplification (NGM SElect) ou de
deux amplifications (WGA-NGM SElect) est similaire. Aucune différence
significative n’a été mise en évidence.
Les résultats obtenus à partir des dilutions d’un extrait de sang ne sont pas
concluants. En effet, même les échantillons de « contrôle » (NAD 1.8 et FG 1.25) à
partir desquels un profil NGM Select exploitable a été obtenu, n’ont pas donné un
résultat concluant.
Malgré l’obtention de profils exploitables à partir des cellules isolées, le fait de
n’exploiter aucun résultat issu des dilutions d’un extrait de sang montre que la
technique n’est pas adaptée aux échantillons de traces analysés à l’UGF. De plus,
le coût élevé du kit (1'300.-/50 réactions) ainsi que la complexité et la durée des
manipulations, rendent la technique difficilement applicable au laboratoire.
En l’état actuel des choses, le kit Ampli1™ WGA de Silicon Biosystems ne peut être
utilisé en routine au laboratoire de génétique forensique.
32
6.1 Perspectives
A l’heure actuelle, il y a relativement peu de chance qu’une méthode
d’amplification du génome entier soit appliquée en routine au laboratoire de
génétique forensique. Le kit Ampli1™ WGA de Silicon Biosystems représentait en
quelque sorte la dernière carte à jouer.
Il serait tout de même intéressant de comprendre pourquoi l’amplification WGA
à partir des dilutions effectuées sur des extraits de sang n’a pas fonctionné. Une
série de tests pourrait être réalisée sur des échantillons d’origine diverses
(salive, contact, etc) et extraits de manière différente.
Une autre idée serait de purifier l’amplicon WGA, sur colonne de silice ou sur
billes magnétiques par exemple, dans le but d’éliminer un possible inhibiteur
avant de procéder à l’amplification avec le kit AmpFLSTR® NGM SElect™.
Cependant il y a des chances pour que le problème soit situé en amont, car
l’amplification ne semble pas pouvoir avoir lieu.
Cela dit, même si les essais effectués permettaient d’obtenir des résultats fiables
et reproductibles avec le kit Ampli1™ WGA, le laboratoire devrait encore évaluer
le réel intérêt à développer cette technique. Vu les coûts engendrés par une telle
analyse, l’amplification du génome entier se feraient certainement que sur les
échantillons pauvres en ADN provenant d’affaires importantes. Ce qui représente
seulement un très faible pourcentage des cas de routine.
6.2 Conclusion personnelle
L’élaboration de ce travail de diplôme m’a permis de me construire des bases
théoriques solides dans une branche que je n’avais pas vraiment eu l’occasion de
découvrir, en raison de mon parcours professionnel différent. J’ai pu également
me familiariser avec des techniques différentes de celles utilisées en routine, ce
qui m’a permis d’acquérir de nouvelles connaissances.
33
La plus grande difficulté de ce travail a été de comprendre le fonctionnement du
kit Ampli1™ WGA, la documentation sur le sujet étant relativement restreinte. Un
grand merci à Frédéric pour son aide considérable.
Il n’a pas toujours été évident de combiner ce travail à celui de la routine, surtout
quand tout ne se passe pas comme prévu. Mais ces imprévus font partie de la vie
de laboratoire, il faut faire avec !
Ce n’est pas évident d’avoir un regard objectif sur l’ensemble du travail, mais
malgré des résultats peu concluants, je suis satisfaite du travail effectué. Ce
travail m’appris de m’adapter à certaines conditions et de mieux gérer les
situations de stress, mais également de développer mon sens critique.
7. Remerciements
Un grand merci à Marie-Laure Morerod pour sa disponibilité et son soutien, ainsi
que pour les nombreux conseils qu’elle m’a apportés tout au long de ce travail. Je
lui suis infiniment reconnaissante de son implication et de sa contribution.
Je tiens également à remercier le Dr. Vincent Castella pour son aide, ainsi que ses
remarques pertinentes lors de l’interprétation des résultats. Son expérience dans
le domaine forensique m’a été très utile.
Un merci tout particulier au Dr. Frederic Grosjean pour ses nombreuses
explications au sujet du kit Ampli1™ WGA et du DEPArray™, et sa patience
remarquable. Les explications du Dr. Diana Hall m’ont également beaucoup aidée
dans la compréhension de certaines notions théoriques.
Et pour terminer, un grand merci à tout le personnel de l’unité de génétique
forensique pour leur sympathie, leur soutien, ainsi que pour toutes les
connaissances qu’ils m’ont transmises durant ce stage.
34
8. Bibliographie
[1] CURML (20.12.2013), Qui sommes-nous ? Unité de Génétique Forensique [Page Web],
lien : www.curml.ch (page consultée le 06.01.2013)
[2] Unité de Génétique Forensique, Manuel de management [Document Qualité],
001MM00, 21.10.2013
[3] Coquoz R. et al. (2013), Preuve par l’ADN : la génétique au service de la justice, (3ème
édition revue et augmentée), (Collection Sciences Forensiques), Lausanne : Presses
polytechniques et universitaires romandes
[4] Unité de Génétique Forensique, Méthode d’analyse : profil d’ADN nucléaire autosomal
[Document Qualité], 072MA25, 17.12.2013
[5] Kummer D. (2003), Influence de deux « carrier DNA » sur l’extraction d’ADN à partir
de traces biologiques forensiques [Travail de diplôme], Lausanne : Ecole Cantonale
Vaudoise de Laborantines et Laborantins Médicaux
[6] Barber & Foran, (2006), The utility of Whole Genome Amplification for typing
compromised forensic samples, Journal of Forensic Sciences (pp. 1344-1349)
[7] Lasken & Egholm, (2003), Whole Genom Amplification: abundant supplies of DNA
from precious samples or clinical specimens, Trends in biotechnology (pp. 531-535)
[8] Meel N. (2014), Essai de techniques WGA pour l’analyse d’échantillons pauvres en
ADN [Travail de diplôme], Lausanne : ESsanté
[9] Silicon Biosystems, Ampli1™ WGA kit: Whole Genome Amplification from Single Cells
[10] Grosjean F. (2013), DEPArray demo-Bologna Silicon Biosystems [Présentation],
Lausanne: Unité de génétique forensique
[11] Silicon Biosystems, DEPArray™ Technology: sorting and recovery of rare cells
[12] Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01
[13] Silicon Biosystems, Ampli1™ QC kit [User Manual], v1.0-01/2013
35
[14] Thermo Scientific (2011), Nanodrop 3300 Fluorospectrometer [User’s Manual],
Instrument description, pp 1-2
[15] Thermo Scientific, Protocol Nanodrop 3300 : SYBR Green I dsDNA Assay [Page Web],
page consultée le 08.03.2014, lien : www.nanodrop.com
[16] Applied Biosystems (2012), AmpFLSTR® NGM Select™ PCR Amplification kit [User
Guide] Part Number 4458841 Rev.E 03/2012
[17] K.L. O’Connor et al. (2011), Linkage disequilibrium analysis of D12S391 and vWA in
U.S. population and paternity samples, Forensic Science International : Genetics 5,
538-540
9. Lexique
Amplicon : Région du génome ayant été amplifiée
Autosomal : Se dit d’un élément se trouvant sur un chromosome non-sexuel
Centimorgans : Unité de mesure de la distance séparant deux gènes situés sur le
même chromosome. Il représente la fréquence de recombinaison lors de la
méiose : 1cM ⟶ 1% de recombinaison
Chaotropique : Un agent chaotropique est une molécule qui détruit la structure
tridimensionnelle des macromolécules biologiques comme les protéines, l’ADN
ou l’ARN.
Chromosome : Structure du noyau cellulaire qui correspond à une forme
compactée de l’ADN
Enzyme de restriction : Enzyme capable de couper la double chaîne d’ADN au
niveau d’une séquence de nucléotides caractéristique.
Flanquantes : Les régions flanquantes sont les régions situées aux abords d’un
STR, sur lesquelles les amorces viennent s’hybrider
36
Fluorophore : Substance chimique capable d’émettre de la lumière après
excitation
Forensique : Ce terme, tiré de l’anglais, est utilisé pour qualifier ce qui intervient
dans le cadre de la justice
Génome : Ensemble de l’information génétique d’un individu
Hit : Terme signifiant qu’une correspondance a été établie entre deux profils
Inhibiteurs : Se dit d’une molécule ou de conditions physico-chimique qui
empêche le bon déroulement d’une réaction
Linker : Fragment d’ADN synthétique venant se lier aux fragments d’ADN cible
Nucléotides : Les nucléotides sont des unités de construction de l’ADN
Photon : Particule élémentaire de la lumière, associée aux ondes
électromagnétiques
Smear : ADN dégradé apparaissant sous forme de bandes non-spécifiques
Stochastique : Adjectif synonyme d’aléatoire, qui relève du hasard
37
10. Annexes
10.1 Réactifs
Extraction
Kit QIAamp DNA mini (50) – Qiagen, lot 145041571
Ethanol >99.8% - Flucka, lot BCBM0508V
Amplification Ampli1™ WGA
Kit Ampli1™ WGA – Silicon Biosystems, lot 10397300, exp: 2015-01-31
Contrôle Qualité de l’amplification WGA
Kit Ampli1™ QC – Silicon Biosystems, lot 14759500 (Primers lot RV01305-011C),
exp : mars 2014
Agarose – Sigma, lot 120M0463V
TBE Buffer 10x – Gibco by Life Technologies, lot 1413707
Low DNA Mass Ladder – Invitrogen, lot 1169490
Gel Pilot Loading Dye 5x – Qiagen, lot 142324490
Témoin 2800M Control DNA – Promega, lot 0000061305
Quantification
Solution de Tris-EDTA 1x préparée au laboratoire le 11.03.2014
SYBR Green Nucleic Acid Gel Stain 10’000x conc. in DMSO – Cambrex, lot 18B114
AmpFLSTR® NGM SElect™ Témoin 007 – Applied Biosystems, lot 1303079
Témoin 2800M Control DNA – Promega, lot 0000061305
Amplification AmpFLSTR® NGM SElect™
Kit AmpFLSTR® NGM SElect™ - Applied Biosystems, lot 1311035
AmpFLSTR® NGM SElect™ Témoin 007 – Applied Biosystems, lot 1307081
Electrophorèse capillaire
HiDi™ Formamide – Applied Biosystems, lot 1310282
GeneScan™ 600LIZ® Size standard – Applied Biosystems, lot 1309054
AmpFLSTR® NGM SElect™ Allelic Ladder – Applied Biosystems, lot 1305006
38
10.2 Matériel
Hotte UV:
CBS Work Station – Axonlab
Micropipettes et embouts filtrés
Tubes PCR
Blocs froids
Thermomixer:
Thermomixer Comfort – Vaudaux/Eppendorf
Thermocyclers:
T Professional Standard – Biometra
GeneAmp PCR System 9700 96 wells – Applied Biosystems
Fluorospectromètre:
NanoDrop 3300 – Thermo Scientific
Séquenceur automatique:
Genetic Analyzer ABI 3500xL – Applied Biosystems
Cuve PeqLab
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10.3 Protocole QIAamp DNA minikit
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10.4 Protocole Ampli1™ WGA kit
Figure 12 : Procédure de l’amplification du génome entier avec le kit Ampli1™ WGA
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.8
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Tableau 9 : Préparation du « Lysis Reaction Mix »
Tableau 10 : Incubation de la réaction de lyse
Remarque: Toutes les manipulations ont été effectuées sur blocs froids
Etape 1 : Cell lysis
1) Dans une hotte « amplification traces », préparer un tube PCR 0.2 ml pour
chaque échantillon. Y déposer 1 µl d’échantillon/témoin.
2) Préparer le « Lysis Reaction Mix » dans un tube PCR 0.2 ml :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.9
3) Vortexer et centrifuger brièvement le mix
4) Ajouter 2 µl de mix à chaque échantillon (sur les bords du tube)
Volume final : 3 µl
5) Centrifuger brièvement et incuber les échantillons sur un bloc PCR :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.10
Remarque: Ne pas congeler les échantillons, passer directement à l’étape 2a
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Tableau 11 : Préparation du « Digestion Reaction
Mix »
Tableau12 : Incubation de la réaction de digestion
Etape 2a : Digestion
1) Dans une hotte « amplification traces », préparer le « Digestion Reaction
Mix » dans un tube PCR 0.2 ml :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.10
2) Vortexer et centrifuger brièvement le mix
3) Dans le « local 473 », ajouter 2 µl de mix à chaque échantillon (sur les
bords du tube) - Volume final : 5 µl
4) Centrifuger brièvement et incuber les échantillons sur un bloc PCR :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.11
Remarque: Ne pas congeler les échantillons, passer directement à l’étape 2b
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Tableau 13 : Préparation du « Preannealing Reaction Mix »
Tableau 14 : Incubation de la réaction de
preannealing
Etape 2b : Preannealing
Remarque : Cette étape est une pré-préparation du mix de l’étape 3. Elle peut être réalisée
en parallèle que l’étape 2a, en utilisant un autre thermocycler.
1) Dans une hotte « amplification traces », préparer le « Preannealing
Reaction Mix » dans un tube PCR 0.2 ml :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.11
2) Vortexer et centrifuger brièvement le mix
3) Incuber le mix sur un bloc PCR :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.12
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Tableau 15 : Préparation du « Ligation Reaction Mix »
Tableau 16 : Incubation de la réaction de ligation
Etape 3: Ligation
1) Dans le « local 473 », préparer le « Ligation Reaction Mix » dans un tube
PCR 0.2 ml :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.12
2) Ajouter 5 µl de mix à chaque échantillon (sur les bords du tube)
Volume final : 10 µl
3) Centrifuger brièvement et incuber les échantillons sur un bloc PCR :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.13
Remarque: Ne pas congeler les échantillons, passer directement à l’étape 4
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Tableau 17 : Préparation du « Primary PCR Reaction Mix »
Tableau 18 : Incubation de la réaction de PCR
Etape 4: Primary PCR
1) Dans une hotte « amplification traces », préparer le «Primary PCR Reaction
Mix » dans un tube stérile 1.5 ml :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.13
2) Ajouter 40 µl de mix à chaque échantillon (sur les bords du tube)
Volume final : 50 µl
4) Centrifuger brièvement et incuber les échantillons sur un bloc PCR :
Silicon Biosystems (2011), Ampli1™ WGA kit [User Manual], version 01, p.14
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Tableau 19 : Préparation du mix PCR
10.5 Protocole Ampli1™ QC kit
1) Dans un tube stérile 1.5 ml, préparer le mix PCR :
Silicon Biosystems, Ampli1™ QC kit [User Manual], v1.0-01/2013, p.2
2) Vortexer et centrifuger brièvement le mix
3) Ajouter 9 µl de mix à chaque tube PCR 0.2 ml préalablement préparés
4) Ajouter 1 µl d’échantillon/témoin
5) Centrifuger brièvement et incuber les échantillons dans un bloc PCR :
Silicon Biosystems, Ampli1™ QC kit [User Manual], v1.0-01/2013, p.2
Tableau 20 : Programme PCR Ampli1™ QC kit
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Préparation du gel d’agarose et du tampon de migration selon document 107
- Peser 1.2 g de poudre dans un Erlenmeyer 250 ml
- Ajouter 100 ml de TBE 1X
- Mettre un aimant et couvrir l’Erlenmeyer d’un morceau de papier d’aluminium.
- Porter la solution à ébullition sur une plaque chauffante avec agitateur
- Pendant que la solution chauffe :
1. préparer le moule (mettre du scotch sur les côtés ouverts du petit moule ou placer les joints de caoutchouc sur les côtés du grand gel afin de former un réceptacle étanche) et installer le peigne désiré
2. dégeler le Gel Star
- Lorsque tout l’agarose est dissout, retirer l’Erlenmeyer de la plaque chauffante et enlever l’aimant.
- Refroidir le gel 1 à 2 minutes sous l’eau courante froide en faisant tourner
l’Erlenmeyer pour que le refroidissement soit homogène.
- Ajouter 6 µl de Gel Star à la solution.
- Faire tourner l’Erlenmeyer pour que la solution soit homogène et couler le gel.
- Laisser refroidir environ 30 min à température ambiante, puis environ 30
min à 1 h au réfrigérateur. Le gel peut être conservé 24 heures au réfrigérateur emballé dans un film plastique.
- Enlever le scotch ou les caoutchoucs et installer le gel dans la cuve de
migration. Les puits doivent être du côté de la cathode (électrode négative, noire). Immerger le gel dans 650 ml de TBE 1x, retirer le peigne et charger les échantillons (préparés selon doc 108) à l’aide d’une micropipette.
- Après avoir chargé les échantillons et échelle(s) de taille, installer le
couvercle, brancher les câbles sur le power supply et commencer la migration à 110 Volts pour 30 minutes
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Préparation des échantillons selon document 108
Amplicons Low DNA Mass
Ladder
Echantillon 1.0 µl 2.0 µl
H20 stérile 4.0 l 3.0 l
Blue juice 1.2 µl 1.2 µl
Total 6.2 µl 6.2 µl
Tableau 21 : Préparation des
échantillons
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Tableau 22 : Dilution standard
10.6 Protocole NanoDrop 3300
1) Préparer une série de dilutions standard (Témoin 2800M) :
Thermo Scientific, Protocol Nanodrop 3300 : SYBR Green I dsDNA Assay [Page Web], page consultée le
08.03.2014, lien : www.nanodrop.com
2) Diluer le SYBR Green pour obtenir une solution diluée 4500x :
- 1µl SYBR Green + 99 µl TE 1x (1:100)
- 22.2 µl dil. 1:100 + 977.7 µl TE 1x (1:4500)
3) Dans un tube PCR 0.2 ml, pipeter 5 µl de standard/échantillons/témoin
4) Ajouter 5 µl de SYBR Green dilué et centrifuger brièvement
5) Pour chaque standard, effectuer 5 mesures, puis enregistrer la courbe
standard ainsi obtenue
6) Procéder à la quantification des échantillons
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10.7 Protocole d’amplification NGM SElect
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10.8 Protocole pour la préparation d’amplicons
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Figure 13 : Résultats Ampli1™ QC kit pour les dilutions effectuées à partir d’un extrait de sang
Figure 14 : Résultats Ampli1™ QC kit pour les échantillons de cellules isolées
10.9 Résultats obtenus avec Ampli1™ QC kit
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Figure 15 : Profil NGM SElect – NAD 1.8
10.10 Profils NGM SElect
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Figure 16 : Profil NGM SElect obtenu après WGA– NAD 1.8
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Figure 17 : Profil NGM SElect – FG 1.25
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Figure 18 : Profil NGM SElect obtenu après WGA– FG 1.25
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Figure 19 : Profil NGM SElect – AEX 1651 6 (1 cellule)
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Figure 20 : Profil NGM Select obtenu après WGA – AEX 1650 14 (1 cellule)
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Figure 21 : Profil NGM SElect – AEX 1650 20 (10 cellules)
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Figure 22 : Profil NGM Select obtenu après WGA – AEX 1650 19 (10 cellules)
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Figure 23 : Profil NGM SElect – AEX 1650 22 (20 cellules)
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Figure 24 : Profil NGM Select obtenu après WGA – AEX 1651 4 (20 cellules)
