EXAMEN DIRECT ET EN MYCOLOG IE

PLACE DE UHISTOLOGIE

Dominique Chabasse a,,, Nelly Contet-Audonneau b

R ~ s u m e

L'examen direct des produits pathologiques est I'etape, au labora- toire, la plus simple et la plus rapide pour le diagnostic mycolo- gique, & partir des pr616vements superficiels et des liquides biolo- giques issus des organes profonds. II inclut aussi I'examen histopathologique incontournable pour le diagnostic des mycoses sous-cutan6es et profondes. Le choix de la m6thode (6tat frais ou fixation coloration) et les resultats attendus d~pendent du site de I'infection fongique, qu'elle soit superficielle (peau, phaneres) ou profonde. L'examen direct positif signe la mycose, il permet souvent de d6buter le traitement specifique.

E x a m e n d i rec t - h i s t o p a t h o l o g i e - m ~ t h o d e - c o l o r a n t s -

d i a g n o s t i c .

S u m m a r y

Direct examination of the clinical material is the simple end most helpful procedure for the laboratory diagnosis of funga/ infection. Its also include histopathological examination important step for the diagnosis of subcutaneous and deep-sealect fungal infection. The choice of appropriate method (unstained wet-mount prepara- tions or stained smears.) depends of the type of mycosis and the site of infection. Direct examination assume often alone the the- rapy of fungal infection.

Direc t e x a m i n a t i o n - h i s t o p h a t o l o g y - m e d h o d s t a i n i n g

t e c h n i q u e - d i a g n o s i s .

1, Introduction

L es infections dues aux champignons microscopiques ont pris ces dernieres annees une place importante dans la pathologie infec-

tieuse [1,2]. Uincidence des maladies fongiques ne cesse de croftre, tant en pratique de ville (dermatophyties ungueales par exemple) qu'hospitaliere (candidoses, aspergilloses systemiques, pneumo- cystoses...) avec I'augmentation des maladies nosocomiales [6]. En mycologie comme dans I'ensemble de la microbiologie, I'examen direct

a Laboratoire de parasitologie-mycologie Centre hospitalier universJtaire 4, rue Larrey 49033 Angers cedex 01 b Laboratoire de mycologie H6pital Foumier 36, quai de la Bataille 54035 Nancy cedex

* Correspondance DoChabasse@chu-angers.fr

article re~u le 31 mai, accepte le 10 octobre 2003,

© Elsevier SAS.

du produit pathologique est I'etape incontournable de la demarche dia- gnostique au niveau du laboratoire [3, 4, 5, 9]. II permet d'affirmer la presence du champignon & I'etat parasitaire dans un liquide biologique et/ou un tissu confirmant le diagnostic d'une ,, mycose ,,, et justifiant la mise en route (sans attendre le resultat des cultures) du traitement. I 'examen direct se complete, ou peut 6tre avantageusement remplac~, en particulier pour les tissus profonds, par I'examen anatomopatho- Iogique, tr~s contributif & 1'6tude de la r6action h6te-parasite ['7]. Nous preciserons dans cet article les cibles respectives de ces deux methodes, au sein de la pathologie fongique.

2. L'examen direct en mycologie

II convient de situer son inter#t selon les situations pratiques (origine du prelevement) [8].

2.1. Peau et phaneres

Les produits d'un grattage superficiel (squames epidermiques, frag- ments d'ongles, cheveux, poils...) sont habituels dans un laboratoire qui pratique les prelevements pour le diagnostic de certitude d'une mycose cutanee (dermatophytie par exemple). Pour sa r~alisation pra- tique, on realise un ,, etat frais ,, en utilisant des #claircissants (voir encadr#), contenant le plus souvent de la potasse, qui vont ramollir la keratine. Ces eclaircissants peuvent ¢tre associ6s b. un colorant noir

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Dossier scienfifique

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, #ichophyto~ 6 C MicrospO~e ~ S~ie~ ~ ~ a ~ i~S ~he~6~ ~rasltiSme p &ire ~pe 3 ) : : '.

qui impregne immediatement les structures fongiques (noir chlorazol, encre Parker blue black super Quinck) ou & un fluorochrome (Blankophor, Calcofluor, Uvibio), mais ces derniers necessitent I'uti- lisation d'un microscope a fluorescence. Pour les ongles, I'association noir chlorazol-potasse & 20 % est recom- mandee. Uutilisation du contraste de phase facilite, en I'absence de colorant, la lecture. Les el6ments fongiques : spores, blastospores et/ou filaments sont ainsi observes imm6diatement (figure 1). II en est de meme pour les cheveux ou les poils, ce qui permet une analyse precise du parasitisme pilaire de type endothrix, ectoendothrix ou favique (figures 2, 3 et 4). Le scotch-test ou test & la cellophane adhesive (qui consiste & appli- quer un morceau de Scotch transparent sur les lesions) est particu- lierement indique pour le diagnostic des levures du genre Malassezia, agents du Pityriasis versicolor (figure 5).

2.2. Pus d 'abces et /ou serosi t6s issues des lesions f is tu l isees ou u ic6rees

Un etat frais (decrit precedemment en 2.1 .) et un 6talement sur lame (frottis) avec coloration au MGG (May-GdJnwald-Giemsa) ou par Vim- pr6gnation argentique selon Gomori-Grocott seront de preference rea- lises dans ce type de prel~vement. Ces techniques simples permettent d'objectiver les formes levures, les filaments myceliens et, plus anecdotique, los grains issus de royce- tomes (figure 6), ainei que les cellules fumagdL'des des agents de chro- mornycoses rarernent rencontrees en France (figure 7).

2.3. Les l iquides pa tho log iques

Ce sont essentiellement des produits issus de prelevemente profonds et des muqueuses : liquide cephalorachidien (LCR) (figure 8), urines, selles, leucorrhees, produits du LBA (lavage bronchiolo-alveolaire), d'ex- pectoration induite et autres liquides de ponction ou d'&spiration (sinu- sienne, gastrique, pleurale ou peritoneale). Sur le produit de centrifugation, ces liquides feront I'objet d'un examen & I'¢tat frais (figure 9), d'un frottis sur lame porte-objet avec coloration de pr6ference au MGG (figure 10) au GomorbGrocott (figure 11).

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2.4. Les produi ts issus des muqueuses Un 6couvillonnage buccal, anal, nasal, auriculaire, ou vaginal (figure 12) est particulierement recommand¢ pour objectiver la presence d'un cham- pignon & ces niveaux. Un 6couvillon sera destine a I'examen direct apres dilution dans un solute physiologique, puis 6talement (frottis) et coloration (MGG) du produit etale sur une lame porte-objet. Un deuxieme ecou- villon sera utilise pour la culture.

2.5. Les t issus pa tho log iques Tout produit de biopsie ou d'ex6rese, issus de tissue profonds, peut etre broye (dans un Potter) puis 6tale, fixe et colore (MGG, Gomori-Grocott).

2.6. L' interpretat ion Quel que soit le site du prelevement, I'infection fongique est affirmee par la presence du mycete 9. I'etat parasitaire darts le produit patho- Iogique. Le champignon peut se presenter sous differentes formes, ce qui permet dej& une orientation diagnostique sur la famille ou le genre du micromycete incrimine : • des spores ou blastospores : une levurose, et s[ elles sent associees & un pseudomycelium : une candidose ; • des filaments myceliens regulierement septes au diametre regulier : los champignons hyalins (~orsque la paroi reste claire), des Dematies (ou champignons noirs) si cette paroi est foncee ; • des filaments larges, peu ou pas septes : les Zygomycetes (agents de mucormycoses) ; • des structures de reproduction (t6tes aspergillaires) (figure 10), sporocystes de Mucorales ;

• des grains (agents de mycetomes) (figure 6), etc.

3. L'examen histologique ou histopathologique

3.1. in t roduct ion

I 'examen histopathologique est rexamen direct de choix pour le diagnostic de mycoses sous-cutan6es et profondes. II contribue au m6me objectif

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sur 2 a 3 pm de large.

Chromomycoses (Phialophora spp, Fonsecaea sp)

, =

Phaeohyphomycoses (Aiternarioses ;;)(Alternaria spp)

i Zygomycose s cosmopolites

-- Fo~meS asterd~'deS en histologie 10pm de diametre et reaction de Splendore,Hoeppli.

CelluleS fumagd(des (figure ?) caracterisees par : -- une paroi bruneepaisse, : ~- des divisions transversales, i -- parfois associees & des filaments de 6 & ! 2 pm de diametre.

l-lements vesiculeux -I- pigmentes en brun d e 6 & 1 2 p m de diametre (sans cloisons ni divisions internes).

Filaments !arges (coenoc.ytiques) irreguliers de 5 & 201Jm de diametre, peu ou pas cloisonnes. ou mucormyc0se s

I Zygomycoses trepicates - Conidiobolomycose

ii _ Basidiobolomycose

Mycetomes fonglques

Aspects de mucormycoses, On 0bServe en plus & I'HES; autour des filaments, un depet 60sinophile perifongique d'epaisseu r variable (phenomene de Spiendore-Hoeppli).

Les grains fongiques (heirs ou blanc-jaun&tre) issus de fistules, sent ecrases entre lame et lamelle, its sent ConstitUes de filaments myceliens de 2 & 5 pm de diametre agglomeres en areas (figure 6). Ilsse distinguent des grains actinomyc0Siques de diametre moindre < 1 IJm.

Cryptococcose (Cryptococcus neoformans)

Pneumocystose & Pneumocystis carinfi

Levures arrondies de taille variable, parfois bourgeonnantes, associees & une capsule. La taille de I'ensemble levure + capsule mesure de 5 & 20 t~m de diametre. La capsule est bien mise en evidence & I'etat frais par I'encre de Chine (figure 8). Dans tes tissus elle n'est pas coloree par I'HES, le PAS ou le Gomori-Grocott. Elle est en revanche bien raise en evidence par le muci-carmin de Meyer ou le bleu alcian & pH acide.

Avec la coloration de May-GfiJnwald-Giensa, les formes vegetatives d'aspect punctiforme sent difficilement distinguables au sein des areas spumeux. Les kystes de 5 & 9 pm apparaissent sous forme de corps intra-kystiques au nombre de 8 avec une paroi claire non coloree. L'impregnation argentique est la coloration ideale pour colorer la paroi des kystes.

' Ceux-ci prennent souvent un aspect froisse, plisse donnant aussi des images de ,, parentheses ,, (figure 11). '

Aspergillose & Aspergillus spp L'aspergillome ou truffe aspergillaire correspond & un feutrage de filaments myceliens vesiculeux. Ces derniers ont un diametre de 4 I~m environ, ils sent septes et se ramifient & angle aigu. Dans t'asper- gillose invasive ou seml-lnvaswe les filaments sent regul ers & bords paralleles septes avec des embran- chements & angle aigu.

Fusariose & Fusarium spp Dans les fusarioses invasives et dans les tissus, les filaments se dichotomisent & angle droit, ils prennent aussi un aspect vesiculeux.

Phaeohyphomycoses Les filaments septes, de 3 A 5 pm de diametre, sent seuvent irreguliers boudines, voire vesiculeux (Dematies ou champignons fences) (Alternaria sp). La paroi peut etre d'emblee pigmentee & I'HES mats c'est inconstant, la presence de

melanine peut etre ebjectivee par la coloration de Fontana-Masson.

que I'examen direct de mycologie : ebjectiver la presence du champignon au sein meme des lesions ; il precise parrots le groupe fongique en cause. Mats I'histologie apporte une donnee supplementaire : la connaissance de la reaction de I'hete vis-b.-vis du parasite (champignon).

3.2. Real isat ion

Le produit pathologique, issu de biopsies ou de ponctions, est fixe dans du formol ou du Bouin, II fera I'objet de coupes et de colorations anatomopathologiques.

3.2.1. L'h#mat~ine-~osine-safran (lIES)

Cette coloration, particulierement indiquee pour etudier la reaction de I'hete & la presence du parasite (infiltrat cellulaire, granulome,

necrose, fibrese). Les champignons hyalins sent generalement peu visibles ; en revanche, chez les filamenteux noirs (Dematies) la paroi est plus ou moins pigmentee. Le diagnostic s'en trouve plus aise. On distingue aussi, par leur caractere refringent, la paroi des levures.

3.2.2. L'imprdgnation argentique selon Gomori-Grocott

Cette technique colore specifiquement et de fa?on intense la paroi des champignons dans les tissus.

Elle est particulierement indiquee en cas de pauci-parasitisme.

Attention, il existe aussi d'autres structures non fongiques qui sent colo- r~es par le Gomori-Grocott, comme les hematies et les noyaux nus, la confusion est donc possible.

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Dossier scienfi ique

3.2.3. Le ~ periodic-acid schiff J* (PAS)

II colore en rouge violet de fagon non sp~cifique les elements fongiques.

II est bien adapte au diagnostic de levuroses.

Mais ce produit colore aussi des bacteries et de nombreux parasites (toxoplasmes, amibes...).

3.2.4. Le muei-carmin et le bleu alcian

Le muci-carmin et le bleu alcian & pH acide sont particuli6rement indi- ques pour objectiver la capsule de Cryptococcus neoformans.

U6tude histologique b6n6ficie aussi de I'immunohistochimie.

Cette technique ne peut aider & pr6ciser la nature des champignons en cause dans les tissus. Elle fait appel & des techniques d'immuno- fluorescence ou d'immunoperoxydase utilisant des immunos6rums polyclonaux, ou mieux des anticorps monoclonaux (anti-Candida, anti- Cryptococcus, anti-Aspergillus). Toutefois, ces techniques ne per- mettent pas toujours de conclure formellement.

4. Synth~se : les principales mycoses et r~sultats du direct et /ou de I'histologie

I 'apport de I'examen direct varie selon que la mycose est superficielle, sous-cutan6e ou profonde.

4.1. Les mycoses super f ic ie l les

Voir tableau L

4.2. Les mycoses sous-cu tanees

Voir tableau II.

4.3. Les mycoses p ro fondes et /ou sys temiques

4.3.1. Les mycoses cosmopolites

Voir tableau IlL

4.3.2. Les mycoses tropicales ou d'importation

Elles sont dues & des champignons dimorphiques.

C'est la forme parasitaire (levures, sph6rules...), totalement differente de la forme saprophytique, qui est observee (tableau IV).

5. Conclusion

L ~I examen direct en mycologie est 1'6tape incontournable dans la demarche diagnostique mycologique. En cas de positivit6, il confirme

la presence du champignon, de ce fait signe la mycose. II peut dej& appor- ter une orientation pertinente pour le diagnostic de certitude (par exemple le type de parasitisme pilaire oriente sur tel ou tel type de dermatophytes impliqu6s dans les teignes). Le r6sultat est donc quasi-imm6diat, per- mettant une r6ponse rapide au praticien. I'examen histo-pathologique est particuli~rement contributif dans le diagnostic des mycoses sous-cutan6es et profondes. En outre, il assure aussi une orientation diagnostique per- mettant aussi la mise en route d'un traitement antifongique adapt6.

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