EXAMEN MACROSCOPIQUE ET MICROSCOPIQUE DES CULTURES BACTRIENSIntroduction:

Observation macroscopique des colonies:

C'est l'tude de l'aspect des colonies.

Une colonie est l'amas, visible lil nu, constitu par des milliards de descendants d'une seule cellule bactrienne et dont la taille, la forme, la couleur, la consistance sont caractristiques de chaque espce.

L'tude de l'aspect des colonies ncessite l'observation lil nu, en lumire naturelle et artificielle, par clairage direct et par transparence des colonies.

Observation microscopique:

L'observation microscopique permet de faire une tude morphologique des cellules d'une espce microbienne.

Elle comprend l'examen l'tat frais (examen entre lame et lamelle des bactries vivantes) l'examen aprs coloration (le plus souvent sur frottis schs et fixs).

A-EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES: L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectu partir de l'isolement aprs incubation. L'aspect des colonies dpend du milieu utilis de la dure et de la temprature de l'incubation.Il ne pourra tre dcrit convenablement qu' partir de colonies bien isoles : les colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapproches. La colonie peut apparatre la surface du milieu de culture pour les germes arobies, ou tre en profondeur pour les germes anarobies

I. Aspect de colonies 1.1. La taille Elle peut tre mesure l'aide d'une rgle gradue pour les grandes colonies. Il est possible aussi d'utiliser le microscope au grossissement le plus faible pour mesurer la taille des petites colonies en utilisant de micromtres oculaires1.2. La forme- punctiforme,circulaire, filamenteuse, irrgulire, rhizode, fusiforme.1.3. lvation

- plane, leve, convexe, bombe, bossue.1.4. Le bord (Allure de contours)- rgulier, ondul, lob, dentel, filamenteux, boucl.

1.5. La couleur et/ou pigment Plusieurs colonies nont pas une couleur bien dfinie (blanc, gris). Par contre, certaines bactries produisent un pigment insoluble qui donnent un aspect bien caractristique la colonie (rose, jaune, rouge ), tandis que dautres produisent un pigment soluble qui diffuse et colore le milieu

B- LEXAMEN MICROSCOPIQUE DES BACTRIES Lobservation microscopique permet de faire une tude morphologique des cellules dune espce bactrienne. Elle comprend :

I. EXAMEN A LETAT FRAIS Cest lexamen microscopique de bactries vivantes, en milieu liquide. Il permet dapprcier leur mobilit (ou immobilit) et leur morphologie.Prparation :1. A partir dune culture en milieu liquide : Dposer sur une lame propre soit le contenu dune anse de platine soit une petite goutte laide dune pipette Pasteur. Recouvrir la goutte dune lamelle.2. partir dune culture sur milieu solide : Dposer une gouttelette de liquide (milieu liquide ou eau) sur la lame. Prlever une trace de culture lanse de platine et lmulsionner dans le liquide.Recouvrir dune lamelle.

1. Flamber lanse de platine2. Dposer une goutte de la suspension bactrienne3. Recouvrir d'une lamelle4. Observer au microscope

II. EXAMEN APRS COLORATION Lexamen aprs coloration permet dobserver des bactries tues fixes sur une lame et ayant subi laction dun ou plusieurs colorants. Les colorations, ralises sur des frottis secs et fixs, sont classes en :- Coloration simple (un seul colorant)- Coloration diffrentielle type Gram- Colorations spciales des structures bactriennes (capsules, spores.).

Remarque :La ralisation de frottis de bonne qualit est une condition pralable toute coloration.

LEXAMEN MICROSCOPIQUE DES BACTRIES Mode opratoire:A. Ralisation du frottis:Les frottis doivent tre tals sur la lame de verre en couche mince et rgulire, puis schs et fixs selon les tapes suivantes.1. Notez la rfrence de lchantillon sur une lame parfaitement propres et dgraisses. Prlevez strilement laide dune anse de platine une goutte de culture bactrienne et talez un film mince,2. Schage : Le schage est effectu auprs de la flamme dun bec bunsen jusqu ce que le frottis prsente un aspect mat.3. Fixation du frottis sec :Cette tape consiste tuer les bactries et les coller sur la lame, sans en altrer la structure. La fixation seffectue soit par:- La chaleur : la lame, tenue par une pince (frottis situ sur le dessus) est place devant (pas sur) la flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir avant dentreprendre la coloration.- Flambage lalcool. B. Coloration la fuchsine La coloration la fuchsine peut apporter des informations concernant la morphologie des germes.Mode opratoire :Sur le frottis fix et refroidi :- Faire couler la solution de fuchsine jusqu' ce que tout le frottis soit recouvert.- Laisser agir 1 minute.- Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distille, ou l'eau du robinet jusqu' limination des colorants en excs.- Scher dlicatement entre deux feuilles de papier filtre (ou buvard), sans frotter.- Examiner au microscope, objectif immersion. C. RsultatsLes bactries sont colores en rose. Cette coloration est intressante pour l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement l'tude de la morphologie des bactries qui peut se prsenter comme suit :