E.T.S.L. BREVET de TECHNICIEN SUPERIEUR de BIOPHYSICIEN

Session 2011

TECHNIQUES d’ANALYSES SPECTRALES & SEPARATIVES

ÉPREUVE SUR 80 POINTS

Aucun document autorisé. Machine à calculer autorisée. Durée : 4 heures 10 pages Chaque exercice est indépendant. Exercice 1 : Chromatographie en phase gazeuse de la nicotine ( 19,5 points) On réalise le chromatogramme d’une solution de nicotine, afin de connaître ses caractéristiques chromatographiques pour une utilisation ultérieure en tant qu’étalon interne, dans les conditions opératoires suivantes : CPG. Colonne remplie ; Phase stationnaire : 10 % Carbowax 20 M/2 % KOH sur 80/100 Chromosorb W AW ; Dimension de la colonne : 183 cm (longueur) x 2 mm (diamètre intérieur) ; Débit de la phase mobile : D = 20 mL/min ; Quantité injectée : 1 µL ; Détecteur : FID. Four : T1 = 200 °C. Temps de rétention de la nicotine : tR1 = 3,20 min.

Figure 1 : Chromatogramme de la nicotine pour un four programmé à une température

de 200 °C

1/ Préciser le principe de la chromatographie en phase gazeuse. Dans le cas de cet exercice, préciser quel est le mode de fonctionnement du four. (2 points)

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2/ La colonne remplie utilisée est remplie d’un matériau de garnissage ou support solide, finement et uniformément divisé, recouvert d’une couche mince de la phase stationnaire liquide. - a - Quel est l’utilité du support solide ? (1,5 points)

- b - Quelle est la nature du support utilisé, et pourquoi est-ce un support de choix pour la chromatographie en phase gazeuse ? (1,5 points)

3/ Le détecteur utilisé est un FID. - a - Que veut dire l’acronyme FID ? (1 point)

- b - Indiquer le principe de fonctionnement de ce type de détecteur. Préciser les avantages et les inconvénients de ce type de détecteur. (2 points)

4/ La phase stationnaire mentionnée dans les spécifications est généralement utilisée pour les alcaloïdes comme la nicotine. Elle pourrait être remplacée par une phase plus conventionnelle telle que la 5% phényl-polydiméthyl siloxane. À quel type d’échantillon (en terme de polarité) réserve-t-on cette phase ? Quelle est la signification de la valeur 5 %, indiquée dans le nom du polymère utilisé pour la phase stationnaire ? (1,5 points) 5/ Citer un exemple de phase mobile utilisable pour ce type de chromatographie. Quelles doivent être les caractéristiques de la phase mobile ? (1,5 points) 6/ - a - Calculer la vitesse linéaire moyenne u de la phase mobile dans la colonne en cm/s.

(On rappelle que le débit est un volume par unité de temps) (1,5 points)

- b - En déduire le temps mort tM de cette analyse. La valeur obtenue est-elle cohérente avec le chromatogramme présenté en figure 5 ? (1 point)

- c - On change le mode de programmation du chromatographe afin de réaliser une nouvelle chromatographie de la nicotine. Pour un four programmé à une température T2 = 180 °C, on obtient pour la nicotine un temps de rétention tR2 = 6,60 min. L’étude thermodynamique de l’influence de la température sur les temps de rétention montre que ces deux grandeurs sont liées par la relation suivante :

Ln(tR – tM) =

!

A

T + B

Où A et B sont des constantes pour un composé donné et une colonne donnée. Calculer le temps de rétention tR3 de la nicotine à une température T3 = 160 °C.

(3 points)

- d - Peut-on éluer la nicotine en moins d’une minute, sachant que la température limite d’utilisation de la colonne est de 250 °C ? (3 points)

7/ Conclure en précisant sur quel(s) autre(s) facteur(s), l’utilisateur pourrait agir afin de diminuer le temps d’analyse. (2 points)

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Exercice 2 : Dosage direct du phosphore dans les sols par spectrométrie d’absorption atomique et comparaison avec une méthode de spectrophotométrie ( 31,5 points) Le phosphore constitue l’un des éléments minéraux nécessaires à la croissance des plantes dans lesquelles il est stocké. En excès dans les sols et les eaux de surface, il contribue à une dégradation des milieux aquatiques par un développement rapide des algues et des plantes aquatiques. La bonne compréhension des mécanismes biogéochimiques du phosphore nécessite donc la quantification de cet élément. 1/ La spectrométrie d’absorption atomique est peu utilisée pour le dosage direct du phosphore en particulier lorsque la flamme, alimentée par un mélange de protoxyde d’azote et d’acétylène, est utilisée comme atomiseur.

- a - Indiquer en quoi consiste le processus d’atomisation (1 point).

- b - L’atomiseur de flamme est constitué d’un nébuliseur à tubes concentriques. Légender le nébuliseur fourni en annexe 1 (à rendre avec la copie), et expliquer succinctement son fonctionnement. (3 points)

- c - Indiquer quels sont le combustible, le comburant utilisés dans la flamme ainsi que le domaine approximatif de température de la flamme. Pourquoi utilise-t-on un tel mélange ? (2,5 points)

2/ Pour augmenter la sensibilité de la méthode, on utilise l’atomisation par four ou encore appelée électrothermique. De plus, cette méthode permet l’analyse directe du phosphore d’un échantillon solide ou mis en solution, en n’étant que peu affectée par les interférences spectrales. Préciser ce que sont les interférences spectrales. (1,5 points) 3/ Pour irradier l’échantillon, on utilise une lampe à cathode creuse en phosphore.

- a - Compléter le schéma de l’annexe 2 (à rendre avec la copie) et expliquer le principe de fonctionnement d’une telle lampe. (5,5 points) - b - Le phosphore est dosé à la longueur d’onde λ = 213,6 nm. Dans quel domaine de longueur d’onde se situe la longueur d’onde de dosage ? Calculer l’énergie correspondante absorbée par l’atome de phosphore en eV. (1,5 points) On donne 1 eV = 1,6.10-19 J ; h = 6,62.10-34 J.s, et c = 3,00.108 m.s-1.

4/ Les conditions analytiques décrites précédemment ont été utilisées pour le dosage du phosphore dans un échantillon de sol certifié (SSC) et dans un échantillon de végétal certifié (SVC). Les concentrations en phosphore mesurées ont été exprimées en poids sec et sous forme d’une concentration moyenne ± écart-type.

- a - Pour l’échantillon SSC, on obtient 1037±112 mg de phosphore par kg de sol à comparer à la valeur certifiée de 1010±65 mg.kg-1. Obtient-on une sur-évaluation ou une sous-évaluation par rapport à la valeur certifiée (à chiffrer). (1,5 points)

- b - Pour l’échantillon SVC, on obtient 2207±156 mg de phosphore par kg de végétal à comparer à la valeur certifiée de 2204±78 mg.kg-1. Obtient-on une sur-évaluation ou une sous-évaluation par rapport à la valeur certifiée (à chiffrer). (1,5 points)

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5/ Le phosphore assimilable de trois échantillons composites de sols agricoles a été analysé par ETAAS (Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry) ou en français SAAE (Spectrophotométrie d’Absorption Atomique Électrothermique). Les résultats ainsi obtenus ont été comparés avec ceux issus d’analyses par spectrophotométrie (SC) réalisées par le Laboratoire d’Analyse des Sols de l’INRA d’Arras. Tableau 1 : Comparaison des teneurs en Phosphore obtenues par SAAE (P1) et spectrophotométrie (P2) de 3 échantillons de sols agricoles.

Échantillons

P1 (mg.kg-1) (par SAAE)

Coefficient de variation de P1

(%)

P2 (mg.kg-1) (SC)

Écart relatif entre P1 et P2

(%) S1 513,6±13,5 2,6 528,3 - 2,8 S2 150,5±6,9 ? 153,7 ? S3 153,5±2,3 ? 151,9 ?

- a - Calculer les valeurs des coefficients de variation pour les échantillons S2 et S3 (représentés par des points d’interrogation dans le tableau). Que peut-on dire de ces valeurs ? (2 points)

- b - Calculer les valeurs des écarts relatifs pour les échantillons S2 et S3 (représentés par des points d’interrogation dans le tableau). Que peut-on dire de ces valeurs ? (2 points)

6/ - a - La démarche a été complétée par l’analyse du phosphore de 35 échantillons de sols

urbains, en utilisant d’une part, un spectrophotomètre d’absorption moléculaire, Spectronic Genesys 5 (Thermo Fisher Scientific), et d’autre part, la ETAAS. La première méthode de dosage sera celle de référence, et la seconde sera la méthode alternative : elles ont été comparées en termes de justesse. La figure 4 représente les moyennes des concentrations en phosphore obtenues par la méthode de référence en fonction de celles mesurées en ETAAS.

Figure 2 : Corrélations entre les teneurs en Phosphore (P) mesurées en ETAAS

(ou SAAE) et celles obtenues par spectrophotométrie (SC)

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Que permettent de dire les valeurs de R2 ? (1 point)

- b - Le tableau 4 présente les valeurs des paramètres statistiques calculés. Tableau 2 : Valeurs des données statistiques.

Grandeurs statistiques

Ensemble des données (toute teneur en

phosphore)

Teneur en Phosphore faible

20 < [P] < 80 mg.kg-1 Écart-type résiduel 14,003 3,330

Écart-type de la pente 0,015 0,054 Écart-type de l’ordonnée à l’origine 2,997 2,484 La pente est-elle significativement

différente de 1 ? ? NON

L’ordonnée à l’origine est-elle significativement différente de 0 ?

? NON

Dans le cas de l’ensemble des données, à l’aide d’un calcul statistique, répondre par oui ou par non aux deux dernières cases de la colonne correspondante. On donne ttable = 2,04. Que dire alors des différences entre les deux méthodes (référence et alternative) ? (4 points) 7/ Il est à noter toutefois, à la longueur d’onde λ = 213,6 nm, la présence possible d’interférences spectrales, en particulier, avec le fer (λFe = 213,859 nm) et le zinc (λZn = 213,856 nm).

- a - Calculer en valeur absolue, les variations d’énergie absorbée entre le phosphore et le fer et entre le phosphore et le zinc. Donner les résultats en meV. ( 2 points)

- b - Pour tester les interférences spectrales on effectue des mesures répertoriées dans le tableau 3 :

Tableau 3 : Concentrations en phosphore (P) mesurées en ETAAS (λ = 213,6 nm) après ajout d’une quantité croissante de Fe ou de Zn.

P (0 mg.L-1) P (2,25 mg.L-1) Fe ou Zn (mg.L-1) P seul P + Fe P + Zn P seul P + Fe P + Zn

1 0,003 0,005 0,052 2,194 2,191 2,077 10 0,004 0,050 0,085 2,194 2,426 2,268

100 0,003 0,072 0,147 2,286 2,149 2,049 500 0,002 0,032 0,302 2,299 2,414 1,454

Moyenne 0,003 0,040 0,146 2,243 2,295 1,962 Écart-type 0,001 0,028 0,111 0,057 0,146 0,352

Que montrent ces résultats ? Pour des concentrations en zinc supérieures à une valeur de 100 mg.L-1, y a-t-il une sous-évaluation ou une sur-évaluation de la concentration en phosphore mesurée ? (1,5 points) - c - En conclusion, que faudrait-il faire pour réduire voire éliminer les interférences spectrales ? (1 point)

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Exercice 3 : Dialyse. ( 13 points) La myosine du muscle squelettique du lapin (M = 545 kDa) est extraite dans un tampon T1 de force ionique et de pH convenables. Pour purifier la fraction correspondant uniquement à la myosine, on fait une précipitation dans de l’acétone à - 20 °C. Le culot contenant la myosine fortement contaminée est repris dans du tampon T2 et on obtient ainsi une suspension S1. Après prélèvement d’un aliquot pour faire le dosage des protéines, le volume restant de S1 est de 15,3 mL. Dans S1, l’acétone est à 3 % (p/v). S1 est ensuite dialysée contre le tampon T2 afin de conserver l’intégrité de la myosine. Le dosage de la myosine dans S1 donne une concentration en protéine de 1,81 mg.mL-1. 1/ Que se passe-t-il au cours de la dialyse ? Que cherche-t-on à faire ? (2 points) 2/ Si on dialysait contre le tampon T2 renouvelé en permanence, au bout de combien de temps (en heure) pourrait-on considérer que la myosine est pure (au moins de 0,01 % de contaminant en masse par rapport à la masse de protéine) ? (4 points) 3/ Avant de procéder à la dialyse, le technicien cherche à savoir lequel des deux protocoles suivants lui donnera le meilleur résultat. Dans les deux cas, il fait les calculs en travaillant sur les 15,3 mL de S1. À chaque étape, le tampon est remplacé par du tampon frais. (1 point) (Compartiment 1 : VS1 = 15,3 mL ; compartiment 2 correspondant au bain de contre-dialyse : Vtampon = T2) Tableau 4 : Concentration de X en fonction de la pression osmotique.

- a - Calculer pour le protocole 1, la concentration (p/v) finale en acétone dans le boudin de dialyse. (3 points)

- b - Idem pour le protocole 2. (3 points)

- c - Conclusion sur le protocole le plus efficace. (1 point) Données : δ = 1,82.10-2 min-1.

Protocole 1 Protocole 2 Tampon T2 (mL) Temps (min) Tampon T2 (mL) Temps (min)

Etape 1 250 120 100 180 Etape 2 250 120 250 120 Etape 3 250 120 400 60

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Exercice 4 : Étude spectroscopique UV-Visible du salicylaldehyde benzoylhydrazone (SBH) et de sa complexation ( 16 points) Les complexes métalliques de la molécule de SBH sont très étudiés. Le SBH peut réagir avec plusieurs cations métalliques de transition pour former des complexes de référence dans l’industrie pharmaceutique. Par exemple, le complexe du SBH avec le cuivre présente une activité anti-tumeur. La comparaison des spectres du SBH dans différents milieux ainsi que ceux des complexes correspondants permet d’identifier les chromophores et d’en déduire la nature des liaisons de coordination formées entre la molécule de SBH avec, en particulier, le Cobalt Co(II). 1/ Rappeler la définition d’un chromophore. (1 point) 2/ Expérimentalement, on utilise des cuves en quartz. Quel est l’intérêt d’utiliser de telles cuves ? (0,5 point) 3/ On effectue un premier spectre du SBH dans le méthanol. Pour cela, on met 3 mL de méthanol dans une cuve en quartz, dans laquelle, on rajoute 10 µL de SBH. L’appareil utilisé étant un spectrophotomètre monofaisceau informatisé, indiquer, en pratique, les différentes étapes d’obtention d’un spectre optimisé. (4 points) On obtient alors le spectre ci-contre :

Figure 3 : Spectre du SBH. 4/ On observe sur le spectre précédent, principalement 4 pics d’absorption dont les caractéristiques sont les suivantes : Tableau 5 : Caractéristiques des pics composant le spectre UV-Visible du SBH dans le méthanol (CSBH = 4,2.10-5 mol.L-1).

λ ( ? ) A ( ? ) ε ( ? ) 234,4 0,253 6,09.103 286,1 0,535 2,16.103 297,2 0,186 4,47.103 329,1 0,444 10,67.103

Indiquer le nom et l’unité de chacune de ces grandeurs. Aux vues des valeurs de A, peut-on écrire une relation de linéarité entre ces grandeurs ? Donner le nom de cette relation. (2,5 points)

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5/ Lorsque l’on rajoute un métal de transition M comme le Cobalt Co(II) à différente concentration, et un composé X comme la molécule AcONa (Ac représentant le groupement acétyle CH3CO), on forme le complexe dont la structure est donnée ci-dessous :

Figure 4 : Structure du complexe M-SBH.

On obtient les spectres suivants :

Figure 5 : Évolution du spectre d’absorption UV-Visible du SBH en présence de 0 ; 0,5 ; 1,0 et 1,5

fois une concentration donnée (1,6.10-3 mol.L-1) de cobalt (II).

On observe 4 nouveaux pics qui sont à 226,7 ; 258,5 ; 300,7 et 382,5 nm.

- a - Que peut-on dire de l’effet de complexation sur la molécule de SBH (utiliser les termes batochrome, hypsochrome, hyperchrome et hypochrome, en ayant pris soin au préalable de définir chacun de ces termes). (4 points)

- b - Les spectres, à une concentration de 1,0 à 1,5 fois la concentration en cobalt Co(II), étant quasiment confondus, que peut-on en conclure sur la réaction de complexation ? (0,5 point)

6/ D’autres facteurs peuvent modifier l’absorption des chromophores, comme par exemple, le changement de solvant, le pH ou la température.

- a - Indiquer ce qu’est la solvatochromie en précisant le type d’interactions qui entrent en jeu. (1 point)

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- b - Quel effet a le pH du milieu sur l’absorption des chromophores ? (1,5 points)

- c - Quel est l’effet d’une augmentation de température ? (1 point)

FIN DE L’ÉPREUVE

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ANNEXES À RENDRE AVEC LA COPIE

Annexe 1 (exercice 2)

Annexe 2 (exercice 2)