Université Mohamed Kheidher –Biskra-Faculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de la vie

1ère année Master Biochimie et Biologie moléculaire

Exposé sur:

Dosage et conservation des acides nucléiques

2011/2012

Plan de travail:Introduction

I-Dosage des acides nucléiques

Méthode basée sur la fluorescence 

Dosage par Spectrophotométrie 

II-Conservation des acides nucléiques

Conservation de l’ADN

Conservation de l’ARN

Conclusion

Introduction:De nombreuses techniques sont utilisées aujourd'hui pour étudier les

acides nucléiques se trouve plusieurs méthodes peuvent être utilisées.la

plus précise et aussi commune est la méthodes spectrophotométrique qui

se base sur l’absorbance des acides nucléiques dans l’ultra-violet.

L’autre méthode consiste à mesurer la densité de fluorescence d’un

fragment d’ADN.

Après la réalisation des techniques de dosage utilisée la conservation pour maintenir la structure des acides nucléotides.

Dosages des acides nucléiques

spectrofluorométrie spectrophotométrie

I-Dosage des acides nucléiques :

Estimation des quantités d’ADN et d’ARN :

Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à partir d’un matériel biologique.

Méthode basée sur la fluorescence :

On utilise un spéctrofluorimétre pour mesurer l’intensité de la fluorescence d’une solution des acides nucléiques en présence d’un excès de fluorochrome. On compare ensuite les valeurs de ces intensités avec celle d’une solution d’acides nucléiques standard (courbe standard).cette méthode permet de mesure des quantités des acides nucléiques de d’ordre de quelques pictogrammes. 

Les fluorochromes qui se fixe sur le ADN et dont le taux de fixation est directement lié a la quantité de ADN émettra une quantité de fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de ADN présente.

Principe :

Les différents fluorochrome:

- Se fixant spécifiquement sur des paires de bases:

Bases A-T: DAPI Bases G-C: mithramycine .

- Intercalant: Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui ont l'avantage d'être moins chers ).

Utilisation du DAPI :

Le DAPI(Di Aminido Phenyl lndol) colorant utilisé en cytochimie et spécifique de l'ADN fluoresce en bleu.

Cet isotope radioactif se lie spécifiquement à l’ADN double brin, à une longueur d’onde précise à la suite d’une excitation lumineuse. On utilise une longueur d’onde d’excitation de 369 nm et d’émission de 460 nm. Les méthodes fluorimétrique sont très sensibles ; elles permettent de doser des quantités d’ADN de 1 µg. elles sont plus longues et plus couteuses que la méthode spectrophotométrie.

Utilisation BET (bromure d’éthidium) :

Les acide nucléiques peuvent aussi être dosé grâce à des colorant, un des plus utilisés est le bromure d’éthidium qui s’intercale entre les bases et qui émet dans le rouge lorsqu’il est excité par un rayonnement UV .il colore l’ADN mais aussi l’acide nucléique simple brin tel que l’ARN.

Méthode basée sur la spectrophotométrie:

Le dosage des acides nucléiques par la spectrophotométrie est une méthode plus simple et plus rapide.les acides nucléiques ont la propriété d’absorber les U.V .à une longueur d’onde de 260 nm, une lecture de l’absorbance à cette longueur d’onde permettra de déterminer la concentration d’un échantillon d’un acide nucléique. La concentration d’un acide nucléique donné est obtenue par la relation suivant :

Concentration (µg /ml) = DO (densités optiques) 260nm× 50×facteur de dilution

L’unité de densité optique à 260 nm correspond à : 1 unité de A260=50 µg /ml : une solution d’ADN double brin.1 unité de A260=33 µg/ml : une solution d’ ADN simple brin1unité de A260=40 µg/ml : une solution d’ARN

Ces valeurs s’appliquant à des acides nucléiques parfaitement purs et en solution homogène, certains contrôles doivent être effectués.

Une lecture au spectrophotomètre en ultra-violet permet de vérifié la pureté de l’ADN obtenu.

Pour vérifier que cet ADN purifié n’a pas été dénaturé en cour d’expérience, c'est-à-dire qu’il est toujours en double hélice, on fera une mesure de l’hyperchromicité (augmentation de A260) après dénaturation alcalin par NaOH. Le pourcentage l’hyperchromicité est R=25%.

Si l’ADN est dénaturé, le pourcentage d’hyperchromicité est égale à 0%.

%Hyperchromicité = A(ADN dénaturé)-A(ADN natif)×100 /A(ADN natif). 

Principe de spectrophotométrie :

Vidéo ici

Lorsqu’une lumière d’intensité I₀ passe à travers une solution, une partie de celle-ci est absorbée par le(s) soluté(s). L’intensité de la lumière transmise est donc inférieure à I . On définit l’absorbance de la solution comme :

A=log I/I0

Dosage des acides nucléiques par absorption UV

Les nucléotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due aux bases azotées A,C,G,T, U - Estimation de la concentration en acides nucléiques .- Estimation de la pureté de l’échantillon .

Spectre d’absorbance

Échantillon d’ADN pur : Abs 260/Abs 280 compris entre 1,8 et 2 si le rapport est < 1,7 présence de protéines. Si le rapport est > 2 présence d’ARN.

Conservation des acides nucléiques

Conservation d’ARN

Conservation d’ADN

II- Conservation des acides nucléiques :

- Conservation d’ADN :

Tableau 01 : Les conditions de stockage d’ADN

conservation d’ADN

Le tampon Le pH La température

Stockage à court terme

Tris-EDTA = 8,0 à 4°C

Stockage à long terme

Tris-EDTA = 8,0 à – 20°C

Tableau 02 : les conditions de conservation d’ARN purifié et non purifié

Conservation d’ARN

Le tampon Le pH La température

Stockage d’ARN purifié à court

terme

-Tris-EDTA-L’eau pure Rnase free avec ou sans EDTACitrate de sodium

-80°C pendant un an

Stockage d’ARN purifié à long

termeL’éthanol Inférieur

à -20°C

Stockage d’ARN non purifié isothiocyanate de

guanidine[-20°C à -80°C]Pendant 18 mois

-

- Conservation d’ARN :

Conclusion

Après la réalisation de l’extraction et la purification des acides nucléiques on entamer le dosage de ces dernier par deux méthodes basés sur la fluorescence et la spectrophotométrie. Et stockage d ADN et D ARN purifier et non purifier dans des conditions favorables ces étapes suivie par la séparation détection caractérisation et identification des acides nucléiques