extrait des principes actifs et test de leur bioactivité bon.pdf

Rpublique Algrienne Dmocratique et Populaire

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Universit Mentouri de Constantine

Facult des Sciences de la Nature et de la Vie

Dpartement de Biologie Animale

N dordre : N de srie :

En vue de lobtention du diplme de :

DOCTORAT EN SCIENCES

OPTION : PHYSIO-TOXICOLOGIE

Etude Analytique et Biologique des

Flavonodes Naturels.

Prsent par : Melle AKROUM Soud

Devant le jury :

Prsidente : Mme

KHALFALLAH Nadra Prof. Universit Mentouri de Constantine

Promoteur : Mr. LALAOUI Korrichi M.C. Universit Mentouri de Constantine

Examinateurs : Mme

BENAYACHE Fadila Prof. Universit Mentouri de Constantine

Mr. HOUHAMDI Moussa Prof. Universit 8 mai 1945 de Guelma

Mr. ABDENOUR Cherif Prof. Universit Badji Mokhtar de Annaba

Mr. AMIRA Smal M.C. Universit Ferhat Abbas de Stif

Anne universitaire : 2010-2011.

Je ddie ce travail

A ma Mre

A la mmoire de mon Pre

A ma Sur

Et A mon Frre

Remerciements

Je tiens remercier :

Monsieur LALAOUI Korrichi, Matre de confrences lUniversit Mentouri de

Constantine, qui a dirig mes travaux au cours de ces trois annes en me faisant bnficier

de son exprience et de sa comptence.

Madame KHALFALLAH Nadra, Professeur lUniversit Mentouri de Constantine,

pour son soutien indfectible, et pour lhonneur quelle nous fait en acceptant de prsider

le jury de cette thse.

Madame BENAYACHE Fadila, Professeur lUniversit Mentouri de Constantine,

Monsieur HOUHAMDI Moussa, Professeur lUniversit 8 mai 1945 de Guelma,

Monsieur ABDENOUR Cherif, Professeur lUniversit Badji Mokhtar de Annaba,

Monsieur AMIRA Smal, Matre de confrences lUniversit Ferhat Abbas de Stif,

qui nous ont fait lhonneur daccepter de juger et de siger dans le jury de thse.

Monsieur HADDI Mohamed Laid, Matre de confrences lUniversit Mentouri de

Constantine, pour sa participation dans la ralisation de la partie mycologique, ses

prcieux conseils et son aide constante tout au long de la ralisation de ce travail.

Madame SATTA Dalila, Professeur lUniversit Mentouri de Constantine, pour son

soutien constant et ses prcieux conseils.

Monsieur RHOUATI Salah, Professeur lUniversit Mentouri de Constantine, pour

nous avoir accueilli dans son laboratoire

Monsieur BENAMEUR Ahmed, Charg de cours lUniversit Mentouri de

Constantine, pour son aide prcieuse et son soutien tout au long de ce travail.

Mes remerciements sadressent aussi tout le personnel du dpartement de

Microbiologie et Biochimie de lUniversit de Bjaia pour l'accueil chaleureux quil nous

ont toujours rserv et pour leur aide dans la ralisation de cette tude notamment en

nous fournissant les ractifs manquants.

INTRODUCTION 1

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE. 4

1. Gnralits sur les Polyphnols . 4

1.1. Dfinition des polyphnols . 4

1.2. Classification des polyphnols ... 5

1.2.1. Les acides phnols .. 5

1.2.2. Les flavonodes ... 6

1.2.3. Les anthocyanes 6

1.2.4. Les flavanes ... 7

1.2.5. Les tannins .. 7

1.3. Biosynthse des polyphnols . 10

1.3.1. La voie de lacide shikimique 10

1.3.2. La voie de lacide malonique 10

1.4. Intrts thrapeutiques des polyphnols 12

1.4.1. Activit anticancreuse ... 12

1.4.2. Prvention contre les maladies cardiovasculaires .. 12

1.4.3. Prvention contre les maladies hormono-dpendantes .. 13

1.4.4. Action gastro-protectrice des polyphnols 13

2. Les flavonodes 14

2.1. Dfinition et gnralits 14

2.2. Biosynthse des flavonodes ..... 14

2.3. Classification des flavonodes 15

2.3.1. Flavones et flavonols .. 15

2.3.2. Flavanones et hydroflavonols . 15

2.3.3. Flavan-3-ols, flavan-3,4-diols et anthocyanidols ... 15

2.3.4. Chalcones et aurones .. 15

2.4. Intrts thrapeutiques des flavonodes .. 17

2.4.1. Activit des flavonodes contre le cancer ... 17

2.4.2. Activit antimicrobienne des flavonodes .. 18

2.4.3. Activit des flavonodes contre la radiotoxicit, la peroxydation

lipidique et latteinte hmatologique

20

2.4.4. Activit cardioprotectrice des flavonodes . 20

2.4.5. Intrt des flavonodes contre lobsit .. 21

2.4.6. Intrt des flavonodes contre les inflammations .. 21

2.4.7. Rle des flavonodes dans la protection des neurones ... 22

2.4.8. Rle des flavonodes dans la protection oculaire ... 22

3. Les Tannins . 23

3.1. Dfinition des tannins . 23

3.2. Les types de tannins .. 24

3.2.1. Les tannins hydrolysables . 24

3.2.2. Les tannins condenss .... 25

3.3. Effet antinutritionnel des tannins condenss .. 26

3.3.1. Inhibition des enzymes digestives .. 26

3.3.2. Non assimilation des aliments 26

3.4. Prsentation de la tannase ... 27

MATERIEL ET METHODES 28

1. Quelques Intrts Biologiques des Extraits Bruts ................. 28

Origine des plantes ........ 28 Origine des microorganismes ........ 28 1.1. Prparation des extraits thanoliques et mthanoliques bruts 29

1.2. Test de lactivit antimicrobienne des extraits ... 31

1.3. Test de lactivit antioxydante des extraits 32

1.4. Test de lactivit cytotoxique des extraits . 33

1.5. Screening phytochimique des extraits .... 34

2. Quelques Intrts Biologiques des Flavonodes ...... 37

2.1. Identification des types de flavonodes prsents dans les extraits thanoliques 37

2.1.1. Partitions entre solvants ..... 37

2.1.2. Chromatographie sur couche mince ....... 39

2.1.3. Premire tape dans lidentification des flavanodes ..... 39

2.1.4. Spectres mthanoliques ..... 41

2.1.5. Hydrolyses des htrosides .... 41

2.2. Test de lactivit antimicrobienne des flavonodes identifis 42

2.3. Test de lactivit antioxydante des flavonodes identifis ...... 42

2.4. Test de lactivit cytotoxique des flavonodes identifis ... 42

2.5. Mesure de lactivit antibactrienne in vivo contre Streptococcus pneumoniae 42

2.6. Mesure de la toxicit aigue de quelques flavonodes identifis ..... 44

3. Biodgradation Des Tannins Condenss ..... 45 Origine des plantes .... 45

3.1. Prparations des extraits tanniques .... 46

3.1.1. Extraction des tannins condenss ....... 46

3.1.2. Sparation des tannins par partitions entre solvants .. 46

3.1.3. Chromatographie prparative sur couche mince et spectre UV- visible

des spots ...................

46

3.2. Dosage et identification des tannins condenss .... 47

3.3. Isolement des moisissures capables de dgrader les tannins condenss .... 47

3.4. Production extracellulaire de la tannase en culture submerge .. 50

3.5. Mesure de lactivit enzymatique de la tannase ..... 50

4. Analyse Statistique .... 51

RESULTATS .. 52

1. Quelques Intrts Biologiques Des Extraits Bruts ........ 52

1.1. Activit antimicrobienne des extraits mthanoliques et thanoliques bruts ... 52

1.2. Activit antioxydante des extraits mthanoliques et thanoliques bruts .... 58

1.3. Activit cytotoxique des extraits mthanoliques et thanoliques bruts ..... 60

1.4. Screening phytochimique des extraits mthanoliques et thanoliques bruts .... 61

2. Quelques Intrts Biologiques des Flavonodes .......... 64

2.1. Identification des types de flavonodes prsents dans les extraits thanoliques 64

2.2. Activit antimicrobienne des flavonodes identifis ..... 71

2.3. Activit antioxydante des flavonodes identifis ... 74

2.4. Activit cytotoxique des flavonodes identifis . 74

2.5. Activit antibactrienne in vivo contre Streptococcus pneumoniae .. 77

2.6. Mesure de la toxicit aigue des flavonodes les plus actifs .... 78

3. Biodgradation Des Tannins Condenss ....... 80

3.1. Dosage et identification des tannins condenss .... 80

3.2. Recherche et isolement des moisissures capables de dgrader les tannins

condenss ..

82

3.3. Mesure de lactivit enzymatique de la tannase produite ... 94

DISCUSSION ...... 95

CONCLUSION .... 100

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 102

ANNEXE .. 112

Abs : Absorbance.

ADV : Adnovirus.

AlCl3 : Chlorure d'aluminium.

AML-1 : Acute Myelogenous Leukemia 1.

AT : Acide Tannique.

Bcl-2 : B-cell lymphoma 2.

C : Carbone.

CCM : Chromatographie sur Couche Mince.

CI50 : Concentration dInhibition de 50 % de croissance.

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice.

DE50 : Densit Effective Mdiane.

DL0 : Dose Ltale de 0 % dindividus.

DL50 : Dose Ltale de 50 % dindividus.

DO : Densit Optique.

FL : Follicular Lymphoma.

HCl : Acide chlorhydrique.

HIV : Human Immunodeficiency Virus.

HMC-1 : Human Mastocytes Cytokins 1.

HV : Herpes Virus.

H3BO3 : Acide borique.

IL : Interleukine.

IL-6 : Interleukine 6.

IL-1- : Interleukin-1 beta.

LDL : Low Density Lipoprotein.

LPS : Lipopolysaccharides.

M : Molaire.

MAB : Matl Agar Blakeskee.

MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase.

MEC : Mthyl-Ethyl-Ctone.

MeOH : Mthanol.

min. : minute.

mM : millimolaire.

NaOAc : Actate de sodium

NaOH : Hydroxyde de sodium.

NF-kappaB : Nuclear Factor-kappa B.

NF-kappaB/P65 : Nuclear Factor-kappa B subunit P65.

NF-B : Nuclear Factor-b.

NO : Nitric Oxide.

P : Phosphate.

PPAR-: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma.

P38 : sous unit P38.

RAS : Radical Scavenging Activity.

Rf : Rapport frontal.

S : Sabouraud.

sec. : secondes.

TCF : Tannins Condenss des Fves.

TCT : Tannins Condenss du Th.

TNF- : Tumor Necrosis Factor .

U : Unit.

UFC : Unit Formant Colonie.

UV : Ultraviolet.

UVB : Ultraviolets B.

V : Volume.

1N : Une fois Normale.

2N : Deux fois Normale.

1

Les plantes sont capables de produire une grande diversit de produits ne participant pas

leur mtabolisme de base, mais reprsentant plutt des produits du mtabolisme secondaire.

Nous pouvons citer comme exemple les alcalodes, les terpnes, les strodes, les

polyphnols, les huiles essentielles etc.

Parmi ces composs, les polyphnols reprsentent lun des groupes les plus importants

du fait quils aient une faible toxicit et de nombreux avantages biologiques, notamment

thrapeutiques, pharmaceutiques, cosmtologiques et alimentaires.

Ces dernires annes, nous avons assist un grand regain des phytothrapeutes pour les

produits riches en polyphnols, et principalement en flavonodes. Ces derniers ont dailleurs

montr quils avaient des proprits biologiques trs importantes et trs vastes. Nous pouvons

dire que ce sont notamment de grands antioxydants et antimicrobiens.

En effet, de nombreuses tudes ultrieures ont prouv que les flavonodes taient

capables dinhiber diffrents types de microorganismes : bactries, levures, moisissures,

protozoaires et mme virus. Nanmoins il y avait une grande spcificit entre les molcules

actives et les microorganismes viss ; do limportance de bien choisir le flavonode

appropri.

De mme lactivit antioxydante a t attribue la majorit des flavonodes dcouverts.

Ces derniers avaient la capacit de neutraliser diffrents types de radicaux libres : les

peroxydes (ROO), les alcoxyles (RO), les superoxydes (O2-) et les hydroxyles (HO) ;

empchant de ce fait loxydation des lipides, des protines, des enzymes et de lADN.

Des flavonodes tels que la rutine, la disomine, la lutoline et la querctine sont

aujourdhui de plus en plus commercialiss pour diverses applications mdicamenteuses,

alimentaires et cosmtologiques ; et ce que les molcules soient ltat pur ou sous forme

dextraits.

Aprs les flavonodes, lintrt des chercheurs a port sur les tannins qui sont

reprsents par deux types : les hydrolysables et les condenss. De mme que les flavonodes,

les tannins sont considrs dun point de vue thrapeutique comme des polyphnols trs

puissants ; notamment les tannins condenss. Du fait quils soient forms par polymrisation

des molcules flavoniques, ces derniers ont acquis la majorit de leurs activits biologiques.

2

Nanmoins, lutilisation des tannins condenss en dehors du domaine cosmtologique

demeure jusqu aujourdhui trs limite ; car ces macromolcules ont linconvnient majeur

de se combiner aux molcules nutritives prsentes dans notre alimentation et dempcher ainsi

leur assimilation par le corps.

Bien que les tannins condenss soient trs avantageux, ils demeurent donc peu utiliss

dans les productions mdicamenteuses et alimentaires.

La solution ce problme a commenc surgir dernirement avec la dcouverte de la

tannin-acyl-hydrolase (EC 3.1.1.20), communment appele tannase . Cette enzyme na

t rvle jusqu aujourdhui que chez certaines bactries (principalement des anarobies) et

des moisissures. De ce fait, les ruminants possdant des bactries capables de produire cette

enzyme acquirent la capacit de dgrader les tannins condenss ; et donc le privilge de

bnficier de tous les intrts apports par ces polyphnols sans avoir subir leur rle

antinutritionnel tant redout.

Suivant, ce principe les biotechnologues ont commenc sintresser aux productions

industrielles de la tannase par les microorganismes. Le but tant de linclure dans notre

alimentation ou dans la fabrication de certains mdicaments.

Les moisissures reprsentent aujourdhui les meilleurs producteurs de ce cette enzyme et

ce du fait quelles soient pour la majorit des arobies ; donc faciles cultiver et manipuler.

Dans ce travail, nous nous sommes fix les objectifs suivants:

Premirement : Prparer les extraits vgtaux les plus utiliss par les phytothrapeutes,

savoir les extraits thanoliques et mthanoliques, pour plusieurs plantes mdicinales et

alimentaires utilises en Algrie ; dterminer le type le plus actif pour les activits

antimicrobienne, antioxydante et cytotoxique testes in vitro ; puis, raliser un screening

phytochimique afin de connatre la nature des composs secondaires prsents dans chaque

extrait et slectionner les plus riches en flavonodes.

Deuximement : Identifier des flavonodes prsents en quantit suffisante ; tester in

vitro leurs activits antimicrobienne, antioxydante et cytotoxique ; pour les molcules les plus

actives, tester in vivo leur activit antimicrobienne contre Streptococcus pneumoniae puis

mesurer leur toxicit aigue.

3

Troisimement : Extraire et doser les tannins condenss prsents dans les feuilles de

Camellia sinensis (th noir) et des tguments de graines de Vicia faba L. seville (fves) ;

rechercher et isoler des moisissures capables de dgrader ces molcules ; puis, mesurer

lactivit enzymatique des tannases fongiques produites.

4

1. Gnralits Sur Les Polyphnols :

1.1. Dfinition des polyphnols :

Les polyphnols sont des molcules synthtises par les vgtaux lors du mtabolisme

secondaire pour se dfendre contre les agressions environnementales. Ils sont localiss dans

diffrentes parties des plantes selon lespce vgtale et le groupe polyphnolique considrs.

Ces composs regroupent une multitude de molcules et reprsentent lun des groupes les

plus importants prsents dans le rgne vgtal.

Comme dfinition, nous pouvons dire que les polyphnols sont des composs

phnoliques hydrosolubles, de poids molculaire compris entre 500 et 3000 Dalton, et ayant,

outre les proprits habituelles des phnols, la capacit de prcipiter les alcalodes, la glatine

et autres protines (Dangles et al. 1992, Hagerman et al. 1998, Sarni-Manchado et Cheynier

2006).

Les polyphnols regroupent un vaste ensemble de substances chimiques comprenant au

moins un noyau aromatique, et un ou plusieurs groupes hydroxyles, en plus dautres

constituants (Bamforth 2000). Ils peuvent aller de molcules simples, comme les acides

phnoliques, des composs hautement polymriss, de plus de 30000 Dalton, comme les

tannins (Hagerman et al. 1998, Sarni-Manchado et Cheynier 2006).

Comme la majorit des composs secondaires, les polyphnols sont produits par les

plantes afin daccomplir des fonctions prcises, les plus notoires tant :

Dfense contre les pathognes ; principalement les moisissures et les bactries

phytopathognes.

Dissuasion alimentaire. On parle du phnomne dalllopathie : certaines plantes

mettent des substances pour inhiber la croissance des autres plantes.

Attraction des pollinisateurs : les couleurs, mais aussi les odeurs attirent les insectes.

Exemple : certaines orchides synthtisent des phromones sexuelles qui sont des

substances volatiles mises par les insectes femelles pour attirer les mles.

Protections contre les rayonnements UV.

5

Molcules qui donnent des armes et parfums aux plantes. Ce qui sert principalement

repousser les herbivores. Exemple : les polyphnols des plargoniums (Druyne 1999,

Schiestl et al. 2000, Yi-Cai et al. 2000, Sasaki et Takahashi 2002).

1.2. Classification des polyphnols :

Les polyphnols possdent plusieurs groupements phnoliques avec ou sans autres

fonctions (alcooliques, carboxyles). Dans cette famille de molcules, se trouvent de

nombreuses substances, qui peuvent se classer selon leur structure en cinq groupes

principaux:

1.2.1. Les acides phnols :

Les acides phnols, ou acides phnoliques, ont une fonction acide et plusieurs fonctions

phnols. Ils sont incolores et plutt rares dans la nature. Ils se divisent en deux catgories :

Les acides phnols drivs de lacide benzoque sont trs communs, aussi bien sous

forme libre que combine ltat desters ou dhtrosides (Haslam 1994). Exemple : lacide

gallique qui est un lment principal de la structure des tannins hydrolysables (Figure1).

Les acides phnols drivs de lacide cinnamique sont souvent estrifis. Les plus

courants sont lacide cinnamique, lacide cafque, lacide frulique, lacide p-coumarique et

lacide sinaptique (Haslam 1994, Bruneton 2009) ; dont certains sont reprsents dans la

figure 2.

Acide vanillique Acide gallique Acide benzoque

Figure 1 : Exemple de quelques acides phnols de la srie benzoque (Bruneton 2009,

Pawlowska et al. 2006).

O

OH

HO

HO

OH

O

OH

HO

H3CO

O

OH

6

1.2.2. Les flavonodes :

Les flavonodes ont un squelette de base form par deux cycles en C6 (A et B) relis

entre eux par une chane en C3 qui peut voluer en un htrocycle (cycle C) (Figure 3). Ils

donnent des couleurs allant du jaune clair au jaune or. Selon les dtails structuraux les

flavonodes se divisent en 6 groupes : flavones, flavonols, flavonones, isoflavones, chalcones,

aurones.

Ces composs existent sous forme libre dite aglycone ou sous forme dhtrosides, c'est-

-dire lie des oses et autres substances (Heller et Forkmann 1993).

1.2.3. Les anthocyanes :

Les anthocyanes donnent des couleurs trs varies : bleu, rouge, mauve, rose ou rouge.

Ces molcules ont, comme les flavonodes, un squelette de base en C15 form de deux cycles

A et B, et dun hrrocycle (cycle C) ; mais leur caractristique principale est que ce dernier

est charg positivement. Cette charge est due leur structure de base commune : le cation

flavylium ou 2 phenyl 1-benzopyrilium (Figure 4) (Heller et Forkmann 1993).

Les trois anthocyanes principaux sont :

* La plargonidine : qui a un OH en 4 et donne une couleur rouge-orange.

O

OH

Figure 3 : Structure de base dun flavonode (Heller et Forkmann

1993).

A

B B

C A

O

O

Acide ferulique Acide cafique

Figure 2 : Exemple de quelques acides phnols de la srie cinnamique (Bruneton 2009,

Pawlowska et al. 2006).

Acide cinnamique

O

OH

HO

HO

O

OH

HO

O

OH

HO

H3CO

7

* La cyanidine : qui a deux OH en 3, 4 ou en 4, 5. Elle donne une couleur rouge

magenta.

*La delphinidine : qui a trois OH en 3, 4, 5. Elle donne une couleur mauve.

1.2.4. Les flavanes :

Les flavanes sont sous forme de monomres (ex : la catchine) ou sous forme de

polymres (dimres, trimresde catchine). Ils existent sous forme de plusieurs

stroisomres provenant de deux carbones asymtriques : C2 et C3. Les flavanes sont trs

rpandues dans les corces vgtales (Figure 5) (Jakupovic et al. 1988).

1.2.5. Les tannins :

Les tannins sont des macromolcules qui se divisent selon leur structure en deux

groupes principaux :

* Les tannins hydrolysables : sont des esters dacide gallique qui se lient aux molcules

de glucose. Plus prcisment, un glucose se lie plusieurs molcules d'acide gallique (Sarni-

Manchado et Cheynier 2006) (Figure 6).

Figure 4 : Structure du cation flavylium ou 2-phnyl-1-benzopyrilium (Heller et

Forkmann 1993).

Figure 5 : Structure de la (+) catchine (Jakupovic et al. 1988).

HO O

OH

OH OH

OH

8

* Les tannins condenss : proanthocyanidines : ce sont des composs phnoliques

htrognes. Ils se trouvent sous forme doligomres ou polymres de flavanes, flavan-3-ols,

5 desoxy-3-flavonols et flavan-3,4-diols (Figure 7).

Les polymres donnent une structure hrisse dOH phnoliques capable de former des

liaisons stables avec les protines (Montenegro de Matta et al. 1976, Sarni-Manchado et

Cheynier 2006).

O O

O

O

O

O

O

O OH

OH OH

O

O

O

H H

O

O

O

OH

HO

HO O

HO

O O

O

O

O

O

O

O OH

OH OH

O

O

O

H H

OH

OH

O

OH

HO

HO HO

HO

Brevilagine 1

Brevilagine 2

Figure 6 : Quelques tannins hydrolysables reprsentatifs (Gorger et al. 1994, Bruneton 1999).

O

O

OH

HO

O O

OH O

OH O O

OH OH

OH

Acide tannique

O

HO

OH O

O

O

HO

HO OH

O

OH

OH O

O O

HO

HO OH

O

OH O

HO

O

O OH

OH OH

O

OH

O OH

O

OH OH

O

HO

9

HO O

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

OH Profisetinidine

HO O

OH

OH

OH HO

O HO

OH

OH

proguibourtinidine

HO O

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

OH Prorobinetinidine

HO O

OH

OH

OH

HO

O

OH

HO

HO

OH

OH

OH

Promelaccacidine

HO O

OH

OH

OH

HO

O

OH

HO

OH

OH

Procyanidine

OH

HO O

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

OH

Prodelphinidine

OH OH

Figure 7 : Quelques proanthocyanidines slectionns (Seigler et al. 1986, Konig et al.

1994, Sarni-Manchado et Cheynier 2006).

10

1.3. Biosynthse des polyphnols : La biosynthse des polyphnols se fait par deux voies principales qui sont :

1.3.1. La voie de lacide shikimique :

Dans cette voie, lrythrose 4-phosphate et le phosphonol pyruvate sont produits par les

hydrates de carbones lors de leur dgradation par la voie des pentoses phosphate et la

glycolyse respectivement.

Ces derniers sont lorigine des composs phnoliques C6-C1 formant les tannins

hydrolysables et de la chalcone qui est la molcule de base de tous les flavonodes et tannins

condenss (Haslam 1994, Dewick 1995)

Aussi, il est intressant de prciser que la tyrosine et la phnylalanine drivent de cette

voie mtabolique. En effet, ces deux acides amins sont des intermdiaires mtaboliques entre

lacide shikimique et lacide cinnamique.

1.3.2. La voie de lacide malonique :

La glycolyse et la -oxydation aboutissent la formation de lactyl CoA donnant le

malonate.

Cest travers cette voie que seffectue la cyclisation des chanes polyctoniques,

obtenues par condensation rpte dunits Actate qui se fait par carboxylation de

lactyl-CoA. Cette raction est catalyse par lenzyme actyl-CoA carboxylase (Fleeger et

Flipse 1964, Richter 1993) (Figure 8).

11

Actyl CoA

Hydrates de carbone Lipides

Acides gras

-oxydation

Voie des Pentoses P Glycolyse

P-nol Pyruvate

Phnylalanine

NH3

NH3

Malonyl CoA

CHALCONES

FLAVONODES

ANTHOCYANES

TANNINS CONDENSES

3 Malonyl CoA

Cyclisation

Polythylctone

Erythrose 4 -P

Acide shikimique

Tyrosine

Acide cinnamique

NH3

NH3

ACIDE

GALLIQUE

TANNINS

HYDROLYSABLES

Figure 8 : Reprsentation des voies de biosynthse des polyphnols.

12

1.4. Intrts thrapeutiques des polyphnols :

La principale caractristique des polyphnols est quils sont des agents antioxydants trs

puissants (Pietta 2002, Frei et Higdon 2003, Oszmianski et al. 2007). En effet, ils sont

capables de piger les radicaux libres et d'activer les autres antioxydants prsents dans le

corps. Ce principe a t utilis dans la fabrication de plusieurs mdicaments, comme le Daflon

produit base de diosmine.

Cette mme activit antioxydante permet aux polyphnols de rguler les radicaux bon-

mauvais (qui peuvent tre les deux), comme l'oxyde nitrique qui favorise une bonne

circulation sanguine, coordonne l'activit du systme immunitaire avec celle du cerveau et

module la communication entre les cellules de ce dernier (Srivastava et al. 2000, Kenny et al.

2007).

En raison de ces vertus, les composs phnoliques sont largement utiliss dans les

domaines thrapeutiques et pharmaceutiques. Parmi les nombreux intrts quoffrent les

polyphnols la sant, nous pouvons citer les suivants :

1.4.1. Activit anticancreuse : Les substances polyphnoliques sont capables dactiver

les mcanismes naturels de la dfense anticancreuse. En effet, les premiers stades de la phase

dinitiation cancreuse peuvent tre bloqus par la capacit des tissus cibles intercepter et

mtaboliser les agents mutagnes. Des cellules impliques, comme les hpatocytes,

synthtisent des enzymes dites de phase I (notamment des monooxygnases, telle que les

cytochromes P-450) qui peuvent oxyder les substances mutagnes hydrophobes en produits

constituant le substrat des enzymes de phase II (glucoronyl transfrases, sulfotransfrases).

Ces dernires convertissent leurs substrats en espces hydrolysables facilement excrtes hors

des cellules. Les enzymes de phase I et II agissent galement dans la muqueuse intestinale.

Elles sont synthtises sous laction des substances polyphnoliques trouves dans les

lgumes, et aussi sous laction des isothiocyanates (drivs des glucosinolates) (Ames et al.

1995, Jhonson 1999).

1.4.2. Prvention contre les maladies cardiovasculaires : En effet, la

consommation des polyphnols favorise la protection contre les altrations cardiaques et

vasculaire (Martin et Andriantsitohaina 2002).

Au niveau des artres, ces molcules prviennent loxydation des lipoprotines de faible

densit (LDL) (Yamanaka 1996) vitant ainsi lathrosclrose (paississement des artres qui

contribue rduire le flux sanguins et peut conduire lasphyxie des tissus irrigus).

13

Les polyphnols inhibent aussi lagrgation plaquettaire implique dans le phnomne

de thrombose, qui induit locclusion des artres. Ainsi en prvenant larthrosclrose et les

risques de thrombose, ces composs limitent les risques dinfarctus du myocarde (Rein et al.

2000).

1.4.3. Prvention contre les maladies hormono-dpendantes : Lexemple le plus

important est la prvention contre lostoporose. Ceci en modulant la rponse aux oestrognes

endognes. Certains polyphnols et plus particulirement les isoflavones du soja ont une

affinit remarquable pour les rcepteurs doestrognes et sont qualifis pour cela de phyto-

oestrognes.

Les fruits et lgumes contenant aussi des polyphnols, tels que la querctine de loignon

ou le kaempferol de la chicore, possdent galement des proprits pseudo-oestrogniques

inhibant la perte osseuse chez la rate ovariectomise. Mais, de nouvelles tudes restent

ncessaires pour confirmer ces effets chez lhomme (Gerber et Berta-Vanrullen 2006).

Aussi, les effets bnfiques des polyphnols (lignanes en particulier) dans la prvention

de cancers hormono-dpendants ont t largement documents ces dernires annes par des

tudes pidmiologiques identifiant une relation entre la prsence de lignanes dans la ration

alimentaire et le taux dincidence de certains cancers (Lain et al. 2007) .

1.4.4. Action gastro-protectrice des polyphnols : Les polyphnols ; dont

principalement les flavonodes et les acides phnoliques comme lacide caffique, lacide

gallique et lacide gallique ; sont capables de rduire la surface des lsions gastriques

produites par landomthacine chez les rates. Lacutissimine B et phillyraeodine A isoles et

purifies partir de de Quercus suber et Quercus coccifera ont aussi confirm laction gastro-

protectrice attribue aux polyphnols. De mme, ces derniers montrent une activit

antibactrienne trs importante contre Helicobacter pylori, responsable de l'ulcre de

l'estomac et du duodnum (Funatogawa et al. 4004, Ruggiero et al. 2006).

14

2. Les flavonodes :

2.1. Dfinition et gnralits :

Lappellation flavonodes rassemble une trs large gamme de composs

polyphnoliques forms par un squelette de base 15 atomes de carbones. Ces composs

reprsente le groupe de composs phnoliques le plus diversifi : plus de 4000 flavonodes

ont dj t identifis (Harborne 1989, Sarni-Manchado et Cheynier 2006).

Le terme flavonode est d leur couleur jaune (= flavus en latin) quils engendrent.

Dailleurs, leurs fonctions principales chez les vgtaux semblent tre attribues leur

coloration ; au del de la chlorophylle, des carotnodes et des btalanes (Wilson 1987). Les

flavonodes sont prsents dans diffrentes parties des vgtaux suprieurs selon le type de

lespce : racines, tiges, feuilles, fleurs, pollen, fruits, graines, boisetc. Aussi, ils varient

quantitativement et qualitativement selon le stade de dveloppement du vgtal (Fritch et

Griesbach 1975). Certains sont plus spcifiques de certains tissus. Exemple : les chalcones se

trouvent plus frquemment dans les ptales de fleurs.

2.2. Biosynthse des flavonodes :

Comme a a t prcis auparavant, les flavonodes possdent un squelette de base 15

atomes de carbone. Ce dernier est constitu de deux cycles en C6 (A et B) relis par une

chanes en C3, on parle alors de chalcones. Ces dernires reprsentent le prcurseur commun

de tous les autres flavonodes (Heller et Forkmann 1993, Griesbach 1996, Hashimoto et al.

2004).

La chalcone est mtabolise sous laction de la chalcone isomrase en flavanone :

naringnine. Cest sur cette dernire quagit ensuite la flavone synthase ou la (2S)- flavanone-

3-hydroxylase pour donner les flavones : apignine, dihydroflavonol et (2R-3R)-

dihydrokaemphrol respectivement.

Les deux enzymes cites fonctionnent diffremment : la premire introduit la double

liaison entre les carbones 2 et 3, tandis que la deuxime catalyse lhydroxylation du C3. Le

dihydroflavonol en prsence de la flavonol synthase ou la dihydroflavonol-4- reductase, se

mtabolise en flavonol, kaempfrol ou en flavan-3,4-diol et leucoanthocyanidol

respectivement (Ono et al 2006, Seeram et al. 2006).

15

Toutes les voies mtaboliques intervenant dans la biosynthse des flavonodes peuvent

tre simplifies comme cest schmatis dans la figure 9.

O

OH

Chalcones

Aurones O

O

O

O

Flavanones

Isof lavones

O

O

O

O

Flavones

Flavonols

O

O

OH

Anthocy anidol s

OH

O +

Anthocy anes

O +

Flavan-3 ,4 -diol s OH

O

OH

Figure 9 : Schma simplifi de la biosynthse de

diffrentes classes de flavonodes (Morreel et al 2006).

16

Les composs de chaque groupe se distinguent par le nombre, la position et la nature des

substituants (groupements hydroxyles, mthoxyles) sur les deux cycles aromatiques et la

chane en C3 intermdiaire ou lhtrocycle.

A ltat naturel, les flavonodes se trouvent souvent sous forme de glycosides. Une ou

plusieurs de leurs fonctions hydroxyles sont alors glycosyles. La partie du flavonode autre

que le sucre est dite : aglycone.

2.3. Classification des flavonodes :

Les principaux groupes de flavonodes peuvent tre dfinis et diffrencis comme suit :

2.3.1. Flavones et flavonols : Le cycle A de ces deux types de molcules est substitu

par deux hydroxyles phnoliques en C5 et en C7. Ces hydroxyles peuvent tre libres ou

estrifis. Dautre part, le cycle B est substitu en C4 ou di-substitu en C3' et C4' par des

groupements OH ou mthoxyles (OCH3).

Les flavonols se distinguent des flavones par un OH en C3 (Morreel et al 2006).

2.3.2. Flavanones et hydroflavonols : Se caractrisent par labsence de la double

liaison entre le C2 et le C3 et par la prsence des centres dasymtrie. Les variations

structurales sont ici de mme nature que celles dcrites pour les flavones et les flavonols.

Les dihydroflavonols se distinguent des flavanones par lhydroxylation de la position C3

(Ono et al 2006).

2.3.3. Flavan-3-ols, flavan-3,4-diols et anthocyanidols : Ces molcules sont toujours

hydroxyles en C3 et se caractrisent par labsence du groupe carboxyle en C4. Cette position

peut tre libre (flavan-3-ols et anthocyanidols) ou hydroxyle (flavan-3,4-diols).

Les anthocyanosides sont caractrises par lengagement de lOH en C3 dans une

liaison hterosidique. On trouve parmi ces composs, le palargonidol-3,4-O-glucoside et le

cyamidol-3-O-rutinose ou keracyanine (Bruneton 1999).

Les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols sont souvent lorigine des polymres

flavoniques appels proanthocyanidols ou tannins condenss (Bruneton 1999).

2.3.4. Chalcones et aurones : Les chalcones ont leur noyau pyranique central ouvert et

sont constitues par deux units aromatiques relies par une chane tricabone, ctonique et

insature. Le noyau B est assez frquemment non substitu, alors que les substitutions sur le

17

cycle A sont plus souvent identiques celles des autres flavonodes. Les aurones sont

caractrises par une structure de 2-benzylidne coumarone (Bruneton 1999, Ono et al 2006).

Nanmoins, selon dautres auteurs (Sarni-Manchado et Cheynier 2006), la classification

des flavonodes inclue aussi le groupe des anthocyanes. Ceci en raison de la grande similitude

structurale de ces derniers avec les flavonodes ; et plus prcisment avec les anthocyanidols.

2.4. Intrts thrapeutiques des flavonodes :

Les intrts thrapeutiques des flavonodes ont maintes fois t dmontrs. Pour citez

quelques exemples, nous pouvons dire que :

Des expriences menes sur des souris ont montr que la querctine et la querctrine

avaient une activit antidiarrhique trs importante. Le mcanisme de ces composs consistait

augmenter labsorption des lectrolytes et de leau par la muqueuse intestinale (Galvez et al.

1993a, Galvez et al. 1993b). Aussi dautres flavonodes, comme lapignine, ont t dcrits

comme des composs bactricides et bactriostatiques trs efficaces (Basile et al. 1999,

Cushnie et al. 2003, Martini et al. 2004). De mme les flavonodes ont dj t utiliss pour le

traitement des cataractes dorigine diabtique du fait quils inhibent laldose rductase

(Goodarzi et al. 2006, Ouali et al. 2007).

Mais pour confirmer et mettre le point sur les diffrentes activits biologiques des

flavonodes qui nous ont dailleurs pouss aborder ce travail, nous nous devons de prsenter

ce qui suit :

2.4.1. Activit des flavonodes contre le cancer :

Parmi les flavonodes les plus actifs sur les cellules tumorales, nous citons la querctine

et la catchine qui sont trs abondantes dans les aliments.

La querctine prvient la cancrogense, surtout le cancer de la peau et du colon. La

prsence de 20 % de querctine dans lalimentation chez les animaux diminue le cancer du

colon et y prvient lapparition des cryptes anormales. Le mcanisme suggr est que la

querctine joue le rle dun antagoniste des topoisomrases I et II produites par les cellules

tumorales.

La catchine, quant elle, est un inhibiteur de certaines ractions doxydation donnant

un ADN anormal, elle inhibe surtout la formation du 8-hydroxydesoxyguanosine (8-OHDG),

un marqueur des dommages oxydatifs de lADN. La catchine a t dmontre comme tant

plus active que la vitamine E sur les radicaux libres. Elle est trs abondante dans le th sous

forme dpigallocatchingallate (EGCG) (Pietta 2000, Tomofuji et al. 2009).

18

2.4.2. Activit antimicrobienne des flavonodes :

Lactivit antimicrobienne et donc anti-infectieuse des flavonodes a t dmontre par

de nombreuse tudes. Cette activit est due principalement la capacit de ces molcules

inhiber lexpression de lADN et la synthse de certaines enzymes et protines membranaires

des microorganismes (Ulanowska et al. 2006).

2.4.2.1. Activit antibactrienne des flavonodes :

Les flavonodes ont une activit antibactrienne trs vaste et trs diversifie. En effet, ils

sattaquent un grand nombre de bactries avec une intensit diffrente selon le

microorganisme et lcosystme dans lequel il se trouve : les flavonodes sont capables

dinhiber la croissance de diffrents types de bactries : Staphylococcus aureus (Babayi et al.

2004), Escherichia coli (Ulanowska et al. 2006), Enterococcus feacalis, Enterobacter

cloaceae, Heliotropium sinuatum, Proteus mirabilis etc. (Didrak 1999, Modak 2001,

Okigbo et al. 2005).

Chaque compos agit spcifiquement sur un ou plusieurs germes. Exemple : sur

plusieurs bactries testes lapignine na montr une faible activit que contre

Staphylococcus aureus, toutes les autres ont t fort sensibles ce flavonode. Au contraire, la

galangine na donn une activit que sur Staphylococcus aureus ; les autres microorganismes

se sont avrs rsistants contre cette molcule (Basile et al. 1999, Cushnie et al. 2003, Martini

et al. 2004). Aussi dans certains travaux, il a t cit que les flavonodes extraits avec du

mthanol 95 % taient actifs sur certaines bactries, alors que ceux extraits avec du mthanol

60 % de la mme plante ne ltaient pas, comme ctait le cas des flavonodes de Linum

capitatum contre Staphylococcus aureus ( Slavica et al. 2004).

La diffusion radiale souvent demeure utilise pour mettre en vidence lactivit

antimicrobienne in vitro, mme si la mesure par le biais de cette mthode est parfois difficile

cause des zones diffusionnelles (Ilic et al. 2004).

Bien que le mcanisme daction des flavonodes sur les microorganismes demeure

encore imprcis, certaines tudes ont commenc donner un dbut dexplication de leur

activit antibactrienne en citant des exemples bien explicites ; comme celui de la querctine

cense agir sur lADN gyrase dEscherichia coli (Dadi et al. 2009).

En effet, selon les travaux de Dadi et ses collaborateurs, la querctine serait capable

dinhiber la gyrase bactrienne par deux mcanismes :

Elle se fixe sur lADN au niveau des sites dinsertion de lenzyme bloquant ainsi son

activit.

19

Elle bloque le site de fixation de lATP se trouvant sur lADN gyrase.

Dans les deux cas laction du flavonode se manifeste par le clivage de lADN bactrien,

dsormais incapable de subir les modifications topologiques ncessaires son bon

fonctionnement.

2.4.2.2. Activit antifongique des flavonodes :

Aussi, comme la majorit des polyphnols, les flavonodes ont une activit antifongique

trs puissante. Lune des tudes les plus importantes sur cette activit tait celle de Ortuno et

ses collaborateurs (2006), qui ont dmontr lactivit des flavanones glycosides et des

polymthoxyflavones extraites de Cirtus parasidi et de Cirtus sinensis sur Penicillium

digitatum. En effet, la naringinine, lhespridine, la nobiltine, la simensetine et la tangertine

extraites de ces deux espces de Cirtus servent protger ces dernires contre les attaques de

Penicillium digitatum (Ortuno et al. 2006).

Batawita et ses collaborateurs (2002), dans leur tude sur les flavonodes de Conyza

aegyptica L., ont aussi dmontr que ces molcules avaient une action fongicide et

fongistatique sur diffrents agents de mycoses : Microsporum canis, Microsporum gypseum,

Trichophyton mentagrophytes et Candida zeylanodes. Dautres flavonodes extraits de

Tibouchina grandifolia ont montr une forte activit antifongique contre diffrents types de

moisissures (Kuster et al. 2009).

Nanmoins, les tudes portes sur lactivit antifongique des flavonodes restent encore

insuffisantes du fait de la grande htrognit des moisissures et des levures.

2.4.2.3. Activit antivirale des flavonodes :

Les flavonodes sont aussi connus pour leur activit antivirale, principalement contre le

rtrovirus HIV responsable du symptme dimmunodficience acquise (SIDA), le virus

dinfluenza, le virus de lherpes (HV), ladnovirus (ADV) et le virus de la grippe A

(A/WS/33) (Spedding et al. 1989, Choi et al. 2009).

Certains chercheurs (Spedding et al. 1989) ont dabord suggr que ces polyphnols

agissaient comme inhibiteurs de la transcriptase et/ou la transcriptase reverse de lagent viral

et de lADN et lARN polymrases de la cellule hte ; bloquant ainsi tout le processus

infectieux. Dautres travaux plus rcents ont ensuite dmontr que les flavonodes inhibaient

plus exactement la synthse de lARNm viral (Choi et al. 2009). Ceci, impliquait que les

flavonodes nintervenaient pas dans labsorption des agents viraux, mais plutt un stade

plus avanc impliqu dans la rplication virale.

20

2.4.3. Activit des flavonodes contre la cardiotoxicit, la peroxydation lipidique et

latteinte hmatologique :

En effet, les flavonodes sont aussi connus pour avoir un rle prventif contre la

cardiotoxicit, leur inhibition de la peroxydation lipidique et leur capacit prvenir

diffrentes atteintes hmatologiques (Sadzuka et al. 1997).

En effet, les flavonodes apportent une protection contre les radicaux libres en

empchant leur liaison avec les lipides membranaires des cellules ; ce qui se traduit par une

diminution du malonyl dialdhyde (peroxyde lipidique) et par la protection de la composition

hmatologique en permettant une bonne rgnration rythrocytaire et une prvention contre

la leucopnie et la thrombopnie observes en prsence des radicaux libres (Chaudhuri et al.

2007, Chandana Venkateswara et Vijayakuma 2008).

Les flavonodes ont une capacit capturer et dsactiver les radicaux libres. Cette

activit antiradicalaire ncessite :

Une structure orthodiphnolique du cycle B des flavonodes.

Une double liaison en C2-C3 conjugue avec la fonction C4-oxo, responsable de la

dlocalisation dlectrons.

Les hydroxyles en position C3 et C5 qui permettent une activit antiradicalaire

maximale (Lopez-Lazaro 2000, Siess et al. 2000).

2.4.4. Activit cardioprotectrice des flavonodes :

Les flavonodes sont rputs pour leur effet protecteur sur la sant cardiovasculaire en

modifiant plusieurs processus pathologiques qui interviennent dans lapparition des maladies

cardiovasculaires. Ces effets sont notamment les suivants :

Inhibition de loxydation du cholestrol LDL (mauvais cholestrol) par les radicaux

libres, tape initiale importante dans la formation de la plaque dathrome.

Abolition de la tendance des cellules sanguines de petite taille ou plaquettes se

regrouper et former des caillots sanguins. Cet effet est souvent dcrit comme leffet

aspirine .

Rgulation des rponses inflammatoires et immunitaires au niveau de la paroi des

vaisseaux sanguins qui peut tre anormale en cas de maladie cardiovasculaire.

Rgulation du tonus vasculaire ou degr de constriction des petits vaisseaux sanguins

qui contribue lhypertension (Ariefdjohan et Savaiano 2005, Ding 2006).

21

2.4.5. Intrt des flavonodes contre lobsit :

Certains flavonodes sont supposs apporter un intrt dans le mtabolisme lipidique en

diminuant la lipidmie. Leffet de quelques flavanones (la naringnine, la naringine,

lhespertine et lhesperidine) sur la conversion des pradipocytes en adipocytes, sur une

ligne cellulaire AML-I a t tudi (Morikawa et al. 2008). Les deux flavonodes sous forme

aglycone, savoir la naringnine et lhespertine, ont induit un arrt de la croissance des

cellules entran par une apoptose. Limpact de la naringnine sur diffrentes protines

impliques dans lapoptose a t dtermin. Le rsultat tait que dans les cellules traites avec

ce flavonode, les taux de protines antiapoptotiques (p-Akt, NF-B, et Bcl-2) taient

diminus, et ceux de Bad (protines pro-apoptotiques) augments.

Lexposition des cellules la naringnine ou lhespertine durant de courtes priodes a

augment la taille des gouttes lipidiques dans le cytoplasme. De plus, lexpression de la fatty

acid synthase (intervenant dans la synthse des acides gras) et des PPAR- a t augmente

dans les cellules traites la naringnine.

Ces rsultats suggrent que lapoptose induite par les flavanones nintervient pas sur la

conversion des pre-adipocytes en adipocytes. De ce fait, les adipocytes sembleraient ne pas

tre une cible directe pour les activits hypolipmiantes des flavanones (Morikawa et al.

2008).

2.4.6. Intrt des flavonodes contre les inflammations :

Les mastocytes sont des cellules qui participent aux ractions allergiques et a

linflammation en secrtant des mdiateurs inflammatoires comme lhistamine et des

cytokines pro-inflammatoires. Laction pharmacologique des flavonodes suggre quils

pourraient prsenter un intrt dans le traitement des dsordres allergiques en sous-rgulant

ces mastocytes.

En effet, une tude porte sur lastragaline, la fisetine, le kaempferol, la myrictine, la

querctine et la rutine, sur les ractions inflammatoires allergiques induites par les mastocytes

a permis de constater que toutes ces molcules, hormis lastragaline, inhibaient la scrtion de

lhistamine. Les cinq flavonodes actifs ont galement inhib la hausse du taux de calcium

intracellulaire.

Lanalyse de lexpression des gnes et de la scrtion de plusieurs cytokines dans des

mastocytes humains (cellules HMC-1) a rvl que la fisetine, la querctine et la rutine

diminuaient lexpression et la production du TNF-, de lIL-1-, de lIL-6 et de lIL-8. La

myricetine, quant elle, a diminu celles du TNF- et de lIL-6 mais pas celles de lIL-1- ou

22

de lIL-8. Enfin la fisetine, la myricetine et la rutine ont supprim lactivation de NF-kappaB

(Park et al. 2008).

2.4.7. Rle des flavonodes dans la protection des neurones :

Les flavonodes sont en effet connus pour tre des agents protecteurs contre la

dgnrescence des neurones. Ce rle a principalement t mis en vidence dans le cas de la

maladie de Parkinson. De nombreuses tudes suggrent que linflammation joue un rle dans

lapparition de cette maladie. Des chercheurs ont valu leffet de la lutoline, un flavonode

possdant diverses activits et notamment des effets anti-inflammatoires, sur la diminution du

captage de la dopamine et la perte de neurones dans les cultures msencphaliques gliales.

Lvaluation de la diminution du captage de dopamine a t ralise, dans ltude considre

(Chen et al. 2008), grce a un test de stimulation au LPS et la perte de neurones par la mesure

de limmuno-ractivit de ceux-ci la tyrosine- hydroxylase. Les rsultats taient que la

lutoline a inhib de manire dose-dpendante la diminution du captage de la dopamine par

les neurones et la perte de neurones. De plus, la lutoline a galement inhib significativement

lactivation de la microglie induite et la production excessive du TNF- (cytokine pro-

inflammatoire), du NO et du superoxyde dans les cultures de neurones msencphaliques et

les cultures enrichies en microglie.

Ces rsultats ont dmontr que la lutoline tait capables de protger les neurones des

dommages ainsi causs (Chen et al. 2008).

2.4.8. Rle des flavonodes dans la protection oculaire :

Le stress oxydant induit par les rayons ultraviolets (UV) joue un rle important dans la

progression de la cataracte. Certains flavonodes, comme la fisetine, ont t examins pour

leur effet protecteur contre le stress oxydant induit par les UV dans des cellules pithliales de

la lentille (SRA01/04).

Les cellules ont t exposes diffrentes intensits dUVB, et ont t cultives avec

des concentrations croissantes de fisetine. La viabilit des cellules ainsi que le stress oxydant

(cytometrie de flux) ont t alors mesurs. Aussi, la translocation du NF-kappaB, implique

dans les mcanismes inflammatoires, a t suivie par immunocytochimie. Enfin, lexpression

des protines NF-kappaB/P65, IkappaB et MAPK (mitogen activated protein kinase) a t

mesure (Yao et al. 2008).

Le traitement des cellules avec les flavonodes tests a permis dinhiber la mort

cellulaire induite par les UVB, ainsi que la gnration despces oxygnes ractives.

23

Dun point de vue mcanistique, la fisetine tait la plus active, et a inhib lactivation et

la translocation des NF-kappaB/p65 induite par les UVB, et ce via linhibition de la

dgradation et de lactivation du IkappaB. La fisetine a galement inhib la phosphorylation

de plusieurs protines de la famille des MAPK (P38 et c-Jun N-terminal kinase (JNK)) induite

par les UVB (Yao et al. 2008).

Les flavonodes, et principalement la fisetine, pourraient donc permettre de limiter le

stress oxydant induit par les rayons UV, ainsi que lactivation des NF-kappaB et MAPK dans

les cellules pithliales de la lentille oculaire humaine, suggrant ainsi un potentiel effet

protecteur vis--vis de lapparition de la cataracte.

3. Les Tannins :

3.1. Dfinition des tannins :

Les tannins sont des composs phnoliques trs abondants chez les angiospermes, les

gymnospermes et les dicotyldones (Konig et al. 1994). Ils ont la capacit de se combiner et

de prcipiter les protines. Ces combinaisons varient dune protine une autre selon les

degrs daffinits (Hagerman 1989, Dangles et al. 1992).

Le terme tannin ou tanin vient de la source de tannins utilise pour le tannage

des peaux danimaux en cuir. Dans ce processus, les molcules de tannins se lient aux

protines par des liaisons rsistantes aux attaques fongiques et bactriennes. Le poids

molculaire des tannins varie entre 500 et 2000 Dalton (3000 pour les structures les plus

complexes) (Dangles et al. 1992).

Dans notre alimentation, lastringence est la qualit organoleptique qui indique la

prsence des tannins. Elle a un rle important dans le choix des aliments (corrlation inverse

entre les espces vgtales choisies et leur teneur en tannins) (Horne et al. 2002, Del Bubba et

al. 2009).

Comme les autres types de polyphnols, les tannins sont aussi rpandus pour leurs

nombreuses activits thrapeutiques notamment ; anti-infectieuses (Latte et Kolodziej 2001,

Leitao et al. 2005), cardiovasculaires (Yamanaka et al. 1996, Cheruvanky 2004),

hormonodpendantes et anticancreuses (Notomo et al. 2004, Gosse et al. 2005).

24

3.2. Les types de tannins :

Comme a a t cit auparavant, selon la structure nous avons deux types de tannins :

les tannins hydrolysables et les tannins condenss. Mme si ne nous intressons dans ce

travail quaux tannins condenss pour leur effet antinutritionnel, nous nous devons de dcrire

brivement les deux types.

3.2.1. Les tannins hydrolysables : Sont forms par liaison de plusieurs acides galliques

un carbonhydrate, gnralement le glucose. On parle de gallotannins. Aussi des units de

galloyl peuvent tre ajoutes par liaisons esters, gnralement en position C3 de lacide

gallique. Et les units dacide gallique voisines saccouplent formant les esters dacide

hexahydroxydiphnique, dits : ellagitannins (Figure 10).

Ces deux groupes, les gallotannins et les ellagitannins sont appels tannins

hydrolysables. Comme leur nom lindique, ces composs peuvent tre dgrads en fragments

simples (acides phnols et sucres).

Lacide gallique provient de loxydation des composs C6-C3, comme lacide p-

coumarique ou les acides oxygns correspondants. Mme si lacide shikimique reste

considr comme tant le meilleur prcurseur (Gorger et al. 1994).

G = galloyl HO

HO

OH

O

HO

HO

OH

O O

HO

OH

OH

G-G = Hexahydroxydiphenoyl

O

O

GO OG

O

OG

H

4

6 G

G O

O

GO OG

O

OH

H

4

6 G

G

tlmagrandine II tlmagrandine I

+

Glucose

Figure 10 : Exemples dellagitannins (tlmagrandines) forms par simple liaison des

groupes galloyl (Dangles et al. 1992).

25

3.2.2. Les tannins condenss : Ce sont des proanthocyanidines. C'est--dire, des

composs polyphnoliques htrognes : dimres, oligomres ou polymres de flavanes,

flavan-3-ols, 5-flavanols, 5-deoxy-3-flavanols et flavan-3,4-diols (Sarni-Manchado et

Cheynier 2006).

Ces composs sont forms par condensation des molcules de flavonodes entre elles

(Figure 11). En effet, les tannins condenss ont tous comme prcurseurs des flavonodes (C6-

C3-C6) et diffrent entre eux par le type de liaison, les monomres de flavonodes impliqus,

la position strochimique des carbones 2, 3 et 4, les hydroxylations et la prsence ou non de

substituants comme lacide gallique.

Les deux groupes majeurs des proanthocyanidines sont les procyanidines et les

prodelphinidines (Figure 7). Les monomres constitutifs des procyanidines sont la catchine

et lpicatchine qui peuvent tre substitues par lacide gallique ou les sucres, gnralement

en position C3 ou plus rarement en position C7. Les monomres de prodelphinidines sont la

gallocatchine et lpigallocatchine, mais on distingue galement des monomres de

querctine et de myrictine (Seigler et al. 1986, Konig et al. 1994).

Contrairement aux tannins hydrolysables, les condenss ne peuvent pas tre dgrads

par lhomme. En ralit, seules quelques bactries et moisissures peuvent les dgrader en

produisant une tannase approprie (Zimmer et Cordesse 1996, Pinto et al. 2001, Mahapatra

Liaison des

C4 et C8

successifs

HO Oligomres ou polymres

HO O

OH

R

R

OH OH

8

4

n

HO O

OH

R

R

HO

4

HO O

OH

R

R

4

8

OH OH

HO O

OH

R

R

8

OH

n = 0 8 ou

plus

OH

Flavonode constitutif

Figure 11 : Biosynthse des proanthocyanidines par condensation des molcules de

flavonodes (Sarni-Manchado et Cheynier 2006).

26

et al. 2005, Goel et al. 2005). Quand ces microorganismes sont prsents dans le rumen de

certains animaux, ils leur procurent la capacit de catalyser les tannins condenss, librant

ainsi des anthocyanes (Ammar et al. 2009, Vasta et al. 2009).

3.3. Effet antinutritionnel des tannins condenss :

Leffet antinutritionnel des tannins condenss se traduit de deux manires principales :

leur capacit inhiber les enzymes digestives et leur liaison aux molcules nutritives

empchant ainsi leur assimilation par le corps.

3.3.1. Inhibition des enzymes digestives :

Les tannins condenss sont capables de se lier aux enzymes digestives causant de ce fait

leur inhibition. Plusieurs de ces polyphnols ont une action sur l-amylase (Kandra et al.

2004), l-glucosidase, les protases (Kocisko 2004), la trypsine et les hmagglutinines

(Gilani et al. 2005, De Mejia 2005).

Linhibition de ces enzymes cause un trouble de lactivit du tube digestif et diminue la

valeur nutritive des aliments ingrs qui ne pourront pas tre assimils.

3.3.2. Non assimilation des aliments :

Les tannins condenss ont une grande capacit se lier aux diffrents types de

molcules prsents dans lalimentation par des liaison covalentes : polysaccharides (pectines,

xyloglucon, amidon, celluloses), minraux (fer, argent), vitamines.. etc. (Tervino et al.

1992, Gaffney al. 2004). Mais, les principales molcules qui se lient ces composs

polyphnoliques sont les protines (Zimmer et Cordesse 1996).

Cette caractristique a longuement t tudie en utilisant diffrents composs

protiques et glucidiques. La BSA (Bovin Serum Albumin), le gluten, l -amylase et la -

galactosidase sont les principales protines utilises, et lamidon ainsi que la pectine les

principaux polysaccharides (Gedir et al. 2005)

Les liaisons entre les tannins et les molcules qui sy attachent dpendent de plusieurs

facteurs lis au milieu, la structure des molcules combinantes (exemple : limportance de la

proline dans la structure des protines), comme la nature hydrophile ou hydrophobe et la

concentration des tannins impliqus (Zimmer et Cordesse 1996, Zhang et al. 2002).

Il a t dmontr que la liaison des protines aux tannins dans le rumen cause une

diminution de la dgradation et de lassimilation de ces protines, ce qui cause une perte de la

valeur nutritive des aliments et provoque une malnutrition. A long terme, la grande teneur en

27

tannins de lalimentation cause chez les ruminants une perturbation de la microflore du rumen

et donc de son activit, une limitation de labsorption du nitrogne, une diminution de

lingestion et mme une toxicit.

Chez certains animaux, la prsence de microorganismes gastro-intestinaux ayant une

capacit dgrader les tannins condenss, par la production de la tannase, limite ces effets

nfastes. C'est le cas de Streptococcus gallolytians, Lonepinella koalarum, Selemomona

ruminantium (Zimmer et Cordesse 1996, Goel et al. 2005).

Les effets antinutritionnels ont t observs aussi chez les rats, les poussins et le btail.

En effet, des travaux antrieurs ont montr quune alimentation teneur leve en tannins

condenss avait un effet ngatif sur la digestibilit des protines et des hydrates de carbone, et

rduisait la croissance, lefficacit de lalimentation, lnergie mtabolisable et la disponibilit

biologique des acides amins ( Gilani et al. 2005).

3.4. Prsentation de la tannase :

La tannase, ou tannin-acyl-hydrolase (E.C 3.1.1.20), est une enzyme permettant la

dgradation des tannins condenss. Elle est optimale 40C, pH = 6 et aprs 15 minutes

dincubation. Les ions mtalliques comme le zinc, le manganse, le cuivre, le magnsium et le

fer inhibent son activit. Par contre, le potassium laugmente (Sabu et al. 2004).

La tannase est efficace sur un large intervalle de temprature et de pH, ce qui permet son

utilisation dans plusieurs processus industriels (Enemuor et Odibo 2009). Elle est produite par

diffrents types de moisissures et bactries, appartenant principalement aux genres :

Aspergillus, Penicillium, Streptococcus et Enterobacter (Osawa et Walsh 1993, Murugan et

al. 2007, Costa et al. 2008).

En enzymologie, la tannase est considre comme tant lenzyme qui agit sur les tannins

hydrolysables en catalysant la raction chimique suivante :

Et sur les tannins condenss, cest lenzyme qui lyse les liaisons covalentes existant

entre les molcules flavoniques constitutives ; principalement des liaisons de type C4-C8.

Ceci permet la libration des monomres sous forme danthocyanes (Dyckerhoff et

Armbruster 1933).

2 Gallate

Digallate + H2O

28

1. Quelques Intrts Biologiques des Extraits Bruts :

Origine des plantes : Les plantes ont t rcupres ltat frais chez diffrents

marchands de fruits et lgumes, en sassurant de la priodes de rcolte de chacune. La

cueillette sest faite durant la floraison ou la fructification (Tableaux 1 et 2), en raison de la

richesse des plantes en flavonodes et polyphnols durant ces priodes (Bruneton 1999).

La confirmation de lidentification des plantes a t faite aux dpartements de botanique

des universits de Constantine et de Jijel.

Origine des microorganismes : Les microorganismes utiliss provenaient du CHU

(Centre Hospitalier Universitaire) de Constantine et des laboratoires de microbiologie et

dinfectieux de lhpital Mohammed Ben-Yahia, de Jijel.

Tableau 1 : Liste des plantes alimentaires utilises.

Nom commun Nom scientifique Parties utilises Priode de

rcolte

Poireau Allium porrum L. Bulbes Avril 2008

Oignon Allium cepa L. Bulbes Avril 2008

Ciboulette Allium schoenoprasum L. Bulbes Avril 2008

Fve Vicia faba L. Tguments de graines Mai 2008

Persil Petroselinum sativum Feuilles Juin 2008

Chicore Cichorium intybus L. Feuilles des sommits

fleuries

Septembre

2008

Pamplemoussier Citrus paradisi Feuilles des sommits

fleuries

Avril 2008

Cleri Apium graveolens L. Feuilles des sommits

fleuries

Septembre

2008

Canneberge Vaccinium macrocarpon Fruits Octobre 2008

Grenadier Punica granatum Tguments des fruits Septembre

2008

29

Tableau 2 : Liste des plantes mdicinales utilises.

Nom commun Nom scientifique Parties utilises Priode de

rcolte

Lin Linum capitatum Fleurs, feuilles des sommits

fleuries

Mai 2008

Tilleul Tilia sylvestris Fleurs Juin 2008

Menthe longues

feuilles

Mentha longifolia Feuilles des sommits fleuries Juillet 2008

Safran Crocus sativus Fleurs, feuilles des sommits

fleuries

Octobre 2008

Verveine Lippia citriodora Feuilles des sommits fleuries Juillet 2008

Thym Thymus vulgaris Feuilles des sommits fleuries Juillet 2008

Carthame Carthamus tinctorius Fleurs Aot 2008

Lavande Lavandula officinalis Feuilles des sommits fleuries Juillet 2008

Romarin Rosmarinus officinalis Feuilles des sommits fleuries Mars 2008

Ortie blanche Lamium album Feuilles des sommits fleuries Mai 2008

Clome Cleome schweinfurthii Feuilles des sommits fleuries Aot 2008

Cumin Cuminum cyminum Tguments des graines. Juin 2008

Camomille Chamaemelum nobile Fleurs, feuilles des sommits

fleuries

Juin 2008

Curry Murraya koenigii Feuilles des sommits fleuries Juin 2008

Absinthe Artemisia absinthium Feuilles des sommits fleuries Septembre 2008

Cardamome Elettaria cardamom Feuilles des sommits fleuries,

graines, fleurs.

Mai 2008

Th Camellia sinensis Feuilles des sommits fleuries. Mai 2008

1.1. Prparation des extraits thanoliques et mthanoliques bruts :

Les extraits thanoliques ont t obtenus par trois macrations successives et agitation

du matriel vgtal pendant 24 H dans un mlange thanol / eau (80 / 20 : V / V). Le rapport

solvant / matriel vgtal utilis tait de 10 / 1 (ml / g) (Marston et Hostettmann 2006).

AlphonseHighlight

30

Les extraits mthanoliques, quant eux, taient prpars selon la mthode dite de

Soxhlet, pendant plusieurs heures reflux. Le rapport solvant / matriel vgtal tait toujours

de 10 / 1 (ml / g) (Marston et Hostettmann 2006).

Les extraits ont ensuite t laisss pour dcanter pendant 24 H afin dliminer les boues,

graisses et rsines risquant de gner la suite des oprations. Les phases aqueuses limpides de

chaque extrait ont ensuite t rcupres, filtres et vapores sec dans un rotavapor Buchi

55C jusqu schage complet. Les rsidus secs ont t repris avec de leau distille de sorte

avoir des dilutions 1 / 5 pour chaque extrait (Figures 12 et 13).

Lappareil de Soxhlet a t utilis pour la prparation des extraits mthanoliques car le

screening phytochimique a dmontr quil permettait lextraction dun plus grand nombre de

molcules. Par contre, pour les extraits thanoliques, nous avons choisi la macration, car elle

donnait les mmes rsultats que lappareil de Soxhlet tout en tant beaucoup plus facile

raliser.

3 macrations

successives

(Ethanol / eau :

8 / 2)

Filtration des

extraits runis Evaporation

sec laide dun

rotavapor

Dcantation

Vgtal rejet

Filtre

Matriel

vgtal broy

finement Reprise

dans de

leau

Filtration

Figure 12 : Protocole de prparation des extraits thanoliques.

Couvercle

AlphonseHighlight

AlphonseHighlight

31

1.2. Test de lactivit antimicrobienne des extraits :

Objectif : Dterminer parmi les extraits prpars ceux qui avaient la plus grande activit

inhibitrice des bactries Gram-positif, des bactries Gram-ngatif et des levures.

Principe : Lactivit antimicrobienne des extraits thanoliques et mthanoliques tait

teste in vitro par la mthode de diffusion sur glose (Osato 2009, Liao et al. 2010). Cette

mthode a exactement le mme principe que celui des tests dantibiogramme. C'est--dire,

lapplication de patchs imprgns de principes actifs sur des milieux de culture ensemencs de

microorganismes. Lactivit antimicrobienne, quand elle tait prsente, se manifestait alors

par des zones dinhibition autour des disques.

Application : Des disques (patchs) de 6 mm de diamtre ont t dcoups sur du papier

Wattman n1 puis autoclavs dans 10 ml deau distille 120C pendant 20 min.

Des sries de dilutions allant de 0,150 0,005 mg / ml ont t prpares pour chaque

extrait. Les microorganismes apports sous forme de suspensions ont t normaliss 106

UFC / ml pour les bactries et 104 UFC / ml pour les levures. Ceci en mettant 0,2 ml de

chaque suspension apporte dans 20 ml de bouillon nutritif dans le cas des bactries et 20 ml

de bouillon Sabouraud dans le cas des levures. Lincubation sest faite 37C pendant 24 H

pour les bactries et 35C pendant 48 H pour les levures. Les concentrations microbiennes des

Figure 13 : Protocole de prparation des extraits mthanoliques.

Prparation des

extraits laide dun appareil de

Soxhlet

Rcupration des

extraits

Reprise

dans de

leau

Evaporation

sec laide dun

rotavapor

Vgtal rejet

AlphonseHighlight

SOKAMTEHighlight

SOKAMTEHighlight

SOKAMTEHighlight

32

inoculums ont t values et exprimes par la mesure de la densit optique (DO 600 nm)

laide dun spectrophotomtre Shimadzu (Osato 2009).

Les microorganismes ont t ensemencs par talement sur des boites de Ptri contenant

la glose Muller-Hinton pour les bactries et la glose Sabouraud pour les levures. Les

disques ont t ensuite imprgns chacun par 20 l de principe actif (extrait dilu) et dposs

sur la surface des gloses. Comme tmoin nous avons utilis des disques industriels

dampicilline (1g dantibiotique par disque). Pour les bactries, lincubation sest faite

37C pendant 18 H et pour les levures, 28C pendant 48 H (Osato 2009) (Figure 14).

1.3. Test de lactivit antioxydante des extraits :

Objectif : Dterminer parmi les extraits prpars ceux qui avaient la plus grande activit

antioxydante contre le DDPH (2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Cette activit est lorigine de

lactivit antioxydante.

Principe : Le DPPH est un radical libre stable que nous avons utilis pour remplacer les

radicaux libres produits par les cellules en rponses des stress internes ou externes. En

Versement du principe actif

Boites de Ptri contenant la glose

Ensemencement des

boites par les

microorganismes

Pince

Patch

Application des

disques (patchs)

Imprgnation des disques

Incubation

Figure 14 : Protocole du test de lactivit antimicrobienne des extraits.

Disques

SOKAMTEHighlight

SOKAMTEUnderline

SOKAMTEHighlight

33

prsence dun antioxydant, la couleur violette caractristique du DPPH virait au jaune et

labsorbance mesure 517 nm sabaissait. Lajout de diffrentes dilutions des extraits la

solution de DPPH permettait de dterminer celle qui abaissait le plus labsorbance.

Application : Cette activit a t teste selon la mthode dcrite par Brand et al. (1995).

Pour chaque extrait, nous avons prpar des dilutions de 10, 50, 100, 500 et 1000 g / ml ;

puis, une solution thanolique de DPPH 1 molaire. Aprs le mlange de 1 ml de cette dernire

avec 1 ml de la dilution de lextrait considre, labsorbance tait mesure 517 nm chaque

15 sec. jusqu stabilit de la valeur. Comme tmoin, nous avons utilis lacide ascorbique

dont nous avons prpar la mme srie de dilutions que pour les extraits.

loeil nu, la prsence de lactivit antioxydante contre le DPPH se tmoignait par le

virage de la couleur de ce dernier du violet initial au jaune. Mais, la mesure de la valeur

exacte de cette activit tait calcule selon lquation suivante :

Pourcentage de lactivit antioxydante = (Abs DPPH Abs finale) / Abs DPPH x 100

Abs DPPH : Absorbance de dpart de la solution 1 molaire du DPPH.

Abs finale: La valeur stable de labsorbance aprs lajout de lextrait.

1.4. Test de lactivit cytotoxique des extraits :

Objectif : Tester lactivit cytotoxique des extraits prpars afin de dterminer les plus

actifs sur des cellules humaines.

Principe : La cytotoxicit tait mesure par le dosage de labsorption du rouge neutre

par des cellules FL qui sont une ligne cellulaire de lamnion humain (American Type Culture

Collection ATCC-CCL 62). Aprs addition des extraits, le dosage de cette absorption a

permis de dterminer le nombre de cellules vivantes. Car en effet, seules ces dernires taient

capables de grer la fixation active du rouge neutre. La mthode utilise tait celle de Lindl et

Bauer (1989), modifie par Awadh Ali et ses collaborateurs (2007).

Application : Les cellules ramenes une concentration de 1 2 x 106 cellules / ml

taient ensemences sur des plaques de microtitrage 96 puits (100 l par puits), puis

incubes dans lincubateur 37C pendant 24 H sous 5 % de CO2. Le milieu de culture tait

compos de MEM (Minimal Essential Medium provenant de Cellgro mediatech et fournit par

Stratech Scientific Limited, France) complment avec 9 % de SVB (Srum de Veau Ftal),

34

1 mM de glutamine et 1 % de pnicilline (50 U / ml), streptomycine (50 g / ml) et nomycine

(50 g / ml).

Aprs 24 H, les cellules ont form une monocouche. Le milieu de culture a alors t

dcant et remplac dlicatement par lextrait test en dposant 100 l par puits. Les cellules

taient incubes une seconde fois pendant 24 H ; et lissue de lincubation, la plaque de

microtitrage tait lave au tampon phosphate salin, puis le milieu de culture contenant le

colorant avec une concentration de 5 l / ml tait pipet sur les cellules raison de 100 l par

puits.

Aprs 3 H dincubation, les plaques de microtitrage ont t laves afin denlever lexcs

du colorant. Le colorant prsent dans les cellules tait extrait par la solution dlution

constitu de 1 % (V/V) dacide actique dans 50 % (V/V) dthanol. Aprs une heure

dlution, la densit optique tait mesure 540 nm avec un test ELISA-Reader-HT II (Actes

Anthos Labtec Salzbourg, A).

Comme contrle ngatif, nous avons utilis le mme milieu cellulaire sans extrait et

comme contrle positif, un milieu cellulaire contenant de lorganozinc. Ces deux milieux ont

t incubs dans les mmes conditions.

Pour chaque chantillon, une moyenne de quatre mesures tait dtermine (n = 4). Les

valeurs CI50 (concentration qui a provoqu une inhibition de 50 % de croissance par rapport

au contrle) ont t calcules statistiquement par le logiciel SPSS 14.0 pour Windows avec le

test U de Mann Whitney.

1.5. Screening phytochimique des extraits :

Objectif : Dterminer les types de molcules prsents dans les extraits thanoliques et

mthanoliques et confirmer le type de solvant (thanol ou mthanol) adquat pour extraire le

plus de flavonodes.

Principe : Sparer les diffrentes molcules prsentes dans les extraits par

chromatographie sur couche mince (CCM). Puis, tirer le spectre UV-visible de chaque

molcule. La comparaison de ces spectres avec des tmoins permettait de connatre la nature

des molcules prsentes.

Application : Pour les extraits thanoliques, nous avons ralis une CCM analytique sur

gel de polyamide DC6 (Marston et Hostettmann 2006). Ce gel a t prpar en mlangeant

10g de poudre de polyamide dans 50 ml dthanol, puis il a t tal sur des plaques en verre

35

analytiques (20x10 cm et 20x20 cm). Ces dernires taient prtes lemploi aprs schage du

gel.

Pour la CCM des extraits mthanoliques, nous avons utilis un gel de silice (Marston et

Hostettmann 2006) prpar en mlangeant 30 g de poudre de silice avec 60 ml deau distille.

Le dosage de la poudre et de leau a t dtermin par ttonnement. Aprs talement du gel

sur les plaques en verre analytiques et schage, ces dernires ont t actives par chauffage

dans une tuve 100C pendant 1 H.

Le dpt des extraits sur les plaques a t fait linairement de faon ponctuelle avec des

capillaires (pipettes capillaires) usage unique. Les capillaires devaient tre poss

perpendiculairement et prudemment sur la plaque afin de ne pas gratter le gel (Figure 15).

Le choix de la phase mobile (systme solvant appropri) sest fait aprs essai de

plusieurs mlanges de solvants. Ceux ayant donn les meilleures sparations taient :

Pour le support de polyamide :

Tolune / Mthylthylctone / Ethanol /Ether de ptrole : 2 / 1 / 1 / 1 (V/V/V/V).

Pour le support de silice :

Butanol / Acide actique / Eau : 4 / 1 / 5 (V/V/V).

Aprs saturations des cuves de CCM en vapeur de solvant, les plaques ont t places

dedans de sorte que les bords o ont t effectus les dpts fussent tremps dans le fond du

solvant ; tout en prenant soin dviter tout contact entre les dpts des chantillons et le

mlange de solvant.

Les diffrents constituants des chantillons dposs ont alors migr avec des vitesses

diffrentes. Dans le cas idal, nous obtenions autant de taches que de constituants sur le trajet

de migration du solvant (Figure 16).

Capillaire dposant

lextrait

Dpt perpendiculaire

Dpts

Figure 15 : Mode de dpt pour une CCM.

36

La visualisation des spots obtenus sest faite laide dune lampe UV dans une chambre

noire ( 254 et 366 nm) (Marston et Hostettmann 2006). Ces derniers ont ensuite t gratts et

dissous dans du mthanol afin de sparer les molcules du gel. La filtration des solutions

obtenues sest faite dans des seringues relies des filtres ayant des diamtres de 25 m. Ces

dispositifs permettaient de retenir le gel en laissant passer le mthanol charg des molcules

spares (Figure 17).

Le spectre UV-visible de chaque molcule a t ralis laide dun spectrophotomtre

Shimadzu. En comparant les rsultats obtenus avec les spectres de quelques substances

tmoins, nous sommes arrivs connatre la nature de chaque composant.

Remarque : Afin de raliser toutes ces activits, il tait ncessaire dutiliser les

quantits adquates de plantes. Les extraits bruts utiliss devaient tre rcuprs dans des

quantits denviron 2 4 g.

Seringue

Gel gratt dans le

mthanol

Filtre

Tube de

rcupration

Mthanol charg de

composs extraits

Figure 17 : Systme de filtration.

Plaque de CCM

Vapeur de solvant

Spots obtenus

aprs migration

Figure 16 : Figure modifie reprsentant la migration des constituants des

extraits (Reich et Schibli 2007).

Ligne de dpt

Migration du

solvant

37

2. Quelques Intrts Biologiques des Flavonodes :

2.1. Identification des types de flavonodes prsents dans les extraits thanoliques :

Les rsultats du screening ont montr que les extraits thanoliques contenaient

principalement des flavonodes. Dautre part, les travaux de Markham (1982) ont prcis que

lthanol tait en effet un solvant de choix pour extraire ce type de molcules. Lidentification

des flavonodes sest donc faite sur les extraits thanoliques et non mthanoliques.

Objectif : Identifier les flavonodes prsents dans chaque extrait thanolique afin de

connatre les plantes les plus riches en ces composs.

Principe : Les flavonodes ont t spars selon leurs substitutions par des partitions

entre solvants, puis ils ont t identifis par une srie danalyses spectrales bases sur

laddition de quelques agents ionisants et chlatants. Les substitutions flavoniques ont ensuite

t identifies par des co-CCM avec des substances tmoins (Marston et Hostettmann 2006).

Remarque : Afin de raliser toutes les activits biologiques, il tait ncessaire dutiliser

les quantits adquates de plantes. Les flavonodes utiliss devaient tre extraits dans des

quantits denviron 10 45 g selon le nombre des tests effectus.

Application :

2.1.1. Partitions entre solvants (affrontements) : Les extraits thanoliques ont t

ramens un volume de 100 ml dans de leau distille. Pour chaque partition, la mme

quantit du solvant a t utilise (rapport 1 / 1 : V / V). Cette tape a permis la sparation des

flavonodes prsents dans les extraits thanoliques bruts selon leurs substitutions (Figure 18).

Laffrontement avec lther de ptrole enlevait les composs non phnoliques (cette

phase tait ensuite rejete). Laffrontement avec lther dithylique soutirait les aglycones et

avec lactate dthyle soutirait les flavonodes mono-glycosyls. La phase aqueuse restante

contenait alors les flavonodes bi-glycosyls et les autres non soutirs (Markham 1982).

Les phases ther dithylique, actate dthyle et la phase aqueuse ont t vapores sec

dans un rotavapor, puis reprises dans 4 5 ml de mhanol.

38

Figure 18 : Sparation des flavonodes par les partitions entre solvants.

Composs non

polyphnoliques

Evaporation sec

Affrontement avec lther

de ptrole

Affrontement avec lther dithylique

Affrontement avec lactate dthyle

Reprise dans 4 5 ml

de mthanol

Phase aqueuse restante

Phase

Ether

Phase

H2O

Solvant daffrontement

Affrontements

Phase aqueuse

Phase

Actate

3 macrations

successives

(Ethanol/eau :

8 / 2)

Filtration des

extraits runis Evaporation

sec laide dun rotavapor

Dcantation

Vgtal rejet

Filtre

Matriel

vgtal broy

finement

Reprise dans

100 ml deau

Filtration

Couvercle

39

2.1.2. Chromatographie sur couche mince : Les composs prsents dans les

diffrentes phases ont t spars par une CCM prparative, qui se ralisait sur des plaques en

verre de 20x20 cm.

Le dpt a t fait le long des plaques. Pour chaque phase, 12 plaques ont t prpares

afin davoir des quantits de flavonodes suffisantes pour la suite des oprations (Figure 19).

La migration sest faite sur gel de polyamide DC6 en utilisant le systme solvant :

tolune / mthanol / mthylthylctone (4/3/3 : V/V/V) pour les phases ther dithylique et

actate dthyle.

Pour la phase aqueuse, nous avons utilis le systme : eau / mthanol /

mthylthylctone / acthylactone (13/3/3/1 : V/V/V/V). Les molcules ont t dtectes

dans une chambre noire laide dune lampe UV 365 nm, puis ont t grattes et filtres

dans du mthanol comme dcrit auparavant (screening phytochimique).

2.1.3. Premire tape dans lidentification des flavonodes : Les spots flavoniques

reprsentant les constituants du dpt ont t caractriss par leur fluorescence (couleur) sous

lampe UV et leur facteur de rtention.

A* Relation : structure fluorescence :

Lexamen sous lumire ultraviolette fournissait des informations trs importantes sur la

configuration structurale des molcules isoles. En effet, il apportait des indications

particulires concernant les substitutions (Tableau 3).

Dpt en ligne

continue

Plaque de 20x20 cm

Constituants spars en

lignes continues Migration

Figure 19 : CCM prparative donnant des flavonodes sous forme

de lignes spares.

40

Tableau 3 : Relation entre la fluorescence et la structure des flavonodes (Markham

1982).

Spots colors Types de flavonodes

Noir flavonols 5, 6, 7 tri - OH libres

flavonols 5, 7, 8 tri OH libres

Brun noir 3-OH absent ou 3-OH substitu

Violet flavones 5-OH et 4 OH

flavones 3-OR et 5-OH, 4 OH

flavones ou flavonols 5 OH avec 4 OH absent ou substitu en 3

flavones 6- ou 8-OH

Chalcones, isoflavones, dihydroflavonols, flavonones

Bleu clair (fluorescent) flavones sans 5 - OH libre

flavonols sans 5 OH libres avec 3-OH substitu

Jaune terne, jaune orang flavonols 3 -OH libre avec ou sans 5 -OH substitu

Jaune vert brillant 5 OH libre ou 5 OH substitu

Jaune fluorescent flavonols avec 3 OH libre

Jaune ple Dihydroflavonols

B* Relation : structure Rf :

Les relations existant entre le Rf (rapport frontal ou facteur de rtention) et la structure

des molcules apportaient aussi des renseignements sur la structure des polyphnols spars

par CCM. Le comportement chromatographique en fonction de la composition molculaire

dans un solvant alcoolique ou aqueux permettait de mentionner les premires indications

concernant la substitution de la molcule (Tableau 4).

Rf = A / B.

De sorte que :

A : reprsente la distance entre lorigine (le dpt) et la tche du produit.

B : reprsente la distance entre lorigine (le dpt) et le front su solvant (Figure 20).

B

A

Front du

solvant

Ligne de dpt

Figure 20 : Le rapport frontal (Rf).

41

Tableau 4 : Relation entre le Rf et la structure (Markham 1982).

Structure flavonique Rf (rapport frontal)

Augmentation des OH Diminution du Rf dans un solvant lipophile

Glycosylation Rf augmente dans un solvant aqueux

Rf diminue dans un solvant alcoolique.

Hydroxyles mthyls Rf augmente dans un solvant alcoolique

Methylation dun OH en C5 Rf diminue dans un solvant alcoolique

Htrosides de flavones avec 3 OH libre Rf nul dans leau

2.1.4. Spectres mthanoliques : Aprs grattage du gel et filtration comme dcrit

prcdemment (dans le Screening phytochimique des extraits), les flavonodes sont rcuprs

sous forme de solutions mthanoliques. Les spectres dabsorption UV-visible ont t raliss

pour chaque compos afin de confirmer sa nature.

2.1.5. Hydrolyses des htrosides : Afin de complter le protocole didentification en

dterminant les substitutions flavoniques, nous avons effectu une hydrolyse acide ou alcaline

aux flavonodes spars.

Lhydrolyse acide sappliquait dans le cas des substituants O-glycosyles. Lextrait

purifi tait chauff en prsence de lacide chlorhydrique (2N) dans un bain-marie, pendant

15 120 min. selon le degr de substitution de laglycone. Aprs refroidissement, laglycone

tait rcupr par affrontement lther dithylique. Puis, la phase aqueuse provenant de

lhydrolyse des htrosides tait concentre ; elle contenait les sucres librs qui taient

confronts par co-CCM avec des tmoins (glucose, xylose, rhamnose, galactose et arabinose

.etc.). Cette chromatographie seffectuait sur plaque de silice avec le systme solvant :

actone / eau (90 / 10 : V / V).

La rvlation des sucres tait effectue par du malonate daniline, suivi dun passage

ltuve 100C (Markham 1982).

Lhydrolyse alcaline tait ralise pour les flavonodes supposs acyls. Ces derniers

taient mis dans une solution 10 % de potasse (1N) pendant 30 min. sous courant dazote.

Au terme de cette raction, le milieu tait acidifi par lacide chlorhydrique (2N) jusqu' pH =

3 puis puis par lther dithylique pour extraire laglycone. Quant aux sucres qui taient

rests dans la phase aqueuse, ils subissaient le mme traitement dcrit pour lhydrolyse acide

(Markham 1982).

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2.2. Test de lactivit antimicrobienne des flavonodes identifis :

Objectif : Dterminer parmi les flavonodes extraits et identifis ceux qui avaient la

plus grande activit inhibitrice in vitro contre des bactries Gram-positif, des bactries

Gram-ngatif et des levures.

Protocole : Ce test tait ralis selon le mme protocole dcrit prcdemment pour

te

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extrait des principes actifs et test de leur bioactivité bon.pdf