Faculté de Pharmacie de Marseille - pharmacie.univ … · paclitaxel) have significant consequences on cell response to the following drug (i.e vinflunine). Especially, this study

4ème Journée de la Recherche

Faculté de Pharmacie de Marseille

Editorial

Aujourd’hui, 28 mars 2007, a lieu la 4ème Journée de la Recherche de la

Faculté de Pharmacie.

Cette journée, outre l’objectif de renforcer les liens entre nos laboratoires

et nos partenaires des Universités d’Aix-Marseille et en particulier du Campus

Santé Timone, vise à assurer une meilleure sensibilisation de nos étudiants à la

Recherche.

Comme l’édition précédente, nous avons souhaité donner la parole aux

étudiants en leur adressant ce message :

« Faites de la Recherche ».

Cet objectif passe également par la réussite du nouveau contrat

quadriennal avec la reconnaissance de nos unités et équipes de recherche et par

l’aboutissement de réformes majeures telles que l’intégration de la Pharmacie au

CHU.

Nous tenons à remercier tous les orateurs et tous ceux qui ont contribué à

la réalisation de cette journée, en espérant qu’elle permettra d’intensifier les

communications indispensables aux synergies dans le monde de la Recherche.

Patrice VANELLE Doyen

Françoise DIGNAT-GEORGE Vice-Doyen chargé de la Recherche

et de la valorisation

1 me Journée de la Recherche - Faculté de Pharmacie de Marseille 4è



Programme de la Journée

12h00 - 14h00 Communications autour des posters. 14h15 - 14h30 Ouverture de la 4ème Journée de la Recherche. Professeur F. Dignat-George et Professeur P. Vanelle. 14h30 - 15h45 Communications orales par les étudiants en thèse. 15h45 - 16h30 Conférence : Biomarqueurs et cancer. Professeur J.P. Borg. UMR 599 - INSERM – I.P.C. – Université de la Méditerranée 16h30 - 17h00 Clôture de la journée.




Conférences

Simoncini S. UMR 608 - INSERM - Université de la Méditerranée Estève M.-A. CNRS-FRE 2737 - Université de la Méditerranée Pierre VERHAEGHE UMR CNRS 6517 - Université de la Méditerranée Marylin Madamet EA 864 - Université de la Méditerranée Jean-Paul Borg UMR 599 - INSERM - Université de la Méditerranée


4 4ème Journée de la Recherche - Faculté de Pharmacie de Marseille

Amplification de la génération de microparticules endothéliales induites par la thrombine par l’induction d’un état proinflammatoire dans les HMEC-1

Simoncini S1, Sapet C2, Robert S1, Sampol J1, Nguyen C3, Dignat-George F1, Anfosso F1. 1 : UMR_S 608, UFR de Pharmacie Marseille 2 : IMTSSA Marseille 3 : ERM 206, Campus de Luminy Marseille

La thrombine participe au dysfonctionnement endothélial en favorisant la libération de microparticules endothéliales (MPE) ainsi qu’en modulant l’expression de nombreux gènes. L’étude des données du transcriptome montre que la thrombine induit un profil inflammatoire dans la lignée de cellules endothéliales microcapillaires de derme (HMEC-1) en augmentant le taux de transcription et l’expression protéique de l’IL1R1 et en inhibant ceux de son antagoniste naturel l’IL1-Ra. Cependant la participation des ces gènes dans la génération des MPE n’est pas connue. L’addition exogène d’IL1-Ra (5ng/ml) ou la déplétion spécifique de l’IL-1R1 par l’ARN interférent inhibent la libération de MPE en réponse à la thrombine.

Cette inhibition affecte seulement une génération tardive de MPE se produisant entre 10 et 24

heures après le début de la stimulation par la thrombine. La cinétique de stimulation montre également une augmentation progressive de l’expression de TRAF6 et une phosphorylation transitoire d’IRAK1. L’inhibition de TRAF6 et d’IRAK1 empêche la formation tardive de MPE ce qui révèle un rôle important de cette cascade de signalisation en aval de l’IL-1R1. L’addition exogène d’IL1-Ra ne prévient pas le clivage de ROCK-II induit par la thrombine, ce qui suggère que la génération de MPE induite par IL-1R1 est une voie indépendante de ROCK-II.

Nos données montrent que le déséquilibre de la balance inflammatoire induit par la thrombine

dans les HMEC-1 contribue à augmenter la génération de MPE par une voie autocrine, amplifiant ainsi le dysfonctionnement endothélial.


Bcl-2 down-regulation and tubulin subtype composition are involved in resistance of ovarian cancer cells to vinflunine

Estève M.-A.1, Carré M.1, Bourgarel-Rey V.1, Kruczynski A.2, Raspaglio G.3, Ferlini C.3 and Braguer D.1

1 CNRS-FRE 2737, « Cytosquelette et Intégration des Signaux du Micro Environnement Tumoral » ; Faculté de pharmacie, Université Aix-Marseille, France. 2 Pierre Fabre Oncology Research Institute, Toulouse, France. 3 Department of Obstetrics and Gynaecology, Università Cattolica Sacro Cuore, Roma, Italia.

Vinflunine, a new microtubule targeting drug, has a marked antitumour activity in vitro and in vivo. Here, we studied the mechanisms mediating resistance to vinflunine. We investigated the response to vinflunine of ovarian cancer cells initially selected as paclitaxel-resistant cells (A2780-TC1 cells).

By comparison with A2780-wild type (wt) cells, we showed that A2780-TC1 cells were

highly resistant to vinflunine, with resistance factors reaching 800 and 1830 for IC50 and IC70, respectively. We showed that P-glycoprotein minimally participated in this cell resistance. The examination of tubulin composition revealed increased levels of acetylated α-tubulin, βII- and βIII-tubulin in A2780-TC1 cells before vinflunine treatment. As a consequence, vinflunine unequally affected microtubule network organization and function in A2780-wt and A2780-TC1 cells. While the drug depolymerized microtubules and induced a mitotic block in A2780-wt cells, it did not depolymerize microtubules and induced a G2 block in A2780-TC1 cells.

Elsewhere, the mitochondrial protein Bcl-2 was down-regulated in A2780-TC1 cells. This

down-regulation was related to resistance, as A2780-TC1 cells stably transfected with a Bcl-2 construct restored a partial sensitivity to vinflunine. Lastly, we confirmed the role played by Bcl-2 by showing that the mitochondrial membrane potential was only disrupted by vinflunine in cells expressing Bcl-2.

Altogether, our results indicate that modifications acquired during treatment (i.e.

paclitaxel) have significant consequences on cell response to the following drug (i.e vinflunine). Especially, this study shows that a specific pool of tubulin subtypes and a down-regulation of Bcl-2 are associated with resistance of ovarian cancer cells to vinflunine. This work has been published in Molecular Cancer Therapeutics in 2006

Synthèse, réactivité et potentiel pharmacochimique d’α-trihalogénométhylazahétérocycles

Pierre VERHAEGHE,a Pascal RATHELOT,a Sylvain RAULTb et Patrice VANELLEa

aLaboratoire de Chimie Organique Pharmaceutique (LCOP), UMR CNRS 6517, Université de la Méditerranée, Faculté de Pharmacie, 27 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France. bCentre d’Etudes et de Recherche sur le Médicament de Normandie (CERMN), UPRES EA 3915, Faculté des Sciences Pharmaceutiques, 5 rue Vaubénard, 14032 Caen cedex, France.

Dans le cadre de nos travaux de recherche en pharmacochimie, nous présentons les derniers résultats acquis sur des noyaux bicycliques aromatiques, mono ou di-azotés, porteurs d’un groupement trihalogénométhyle, notamment en série quinoléine et quinazoline.

Nous discuterons des avancées obtenues par l’utilisation de nouvelles technologies appliquées à la synthèse organique tels que la synthèse assistée par irradiation micro-ondes1 ou l’optimisation de réactions complexes, multi-paramètres, guidée par couplage LC / MS.

Ainsi, au travers de réactions de polyhalogénation, de réactions par transfert monoélectronique de type SRN1 et ERC12,3, de réactions de couplages pallado-catalysées,4 et de réactions de fluoration, nous décrirons la préparation de nouvelles structures azahétérocycliques.

N

N

CX3

R

R

NR

X

R3

R4

NR

N

NHR

R

N CX3

HN

SO

O

Ar

N CX3

O2N

Ces dernières font l’objet d’une évaluation pharmacologique portant sur : - leur affinité pour les récepteurs sérotoninergiques 5-HT1a, 4, 5a, 6 et 7 ; - leur potentiel anticancéreux (inhibition de Kinases) ; - leur activité antipaludique.

1 Verhaeghe, P. ; Rathelot, P. ; Gellis, A. ; Rault, S. ; Vanelle, P. Tetrahedron, 2006, 62, 8173-8176. 2 Verhaeghe, P. ; Rathelot, P. ; Rault, S. ; Vanelle, P. Lett. Org. Chem., 2006, 3, 891-897. 3 Sopkova de Olivera Santos, J.; Verhaeghe, P.; Lohier, J.F.; Rathelot, P.; Vanelle, P.; Rault, S. soumis à Acta Crystallogr. C. 4 Verhaeghe, P. ; Rathelot, P. ; Rault, S. ; Vanelle, P. soumis à Tetrahedron Lett.



Métabolismes respiratoires des plasmodies

Marylin Madamet EA 864

Le paludisme est une des maladies humaines les plus répandues dans le monde. L’Organisation Mondiale de la Santé fait état de 300 à 500 millions de cas annuels avec 1,5 à 3 millions de décès. L’expansion de la résistance aux thérapeutiques ainsi que les difficultés de développement d’un vaccin à cause de la variabilité antigénique des plasmodies expliquent le poids de cette pathologie en santé publique. Plasmodium falciparum est le principal agent du paludisme humain en terme de fréquence, de morbidité et de létalité.

Le métabolisme respiratoire de P. falciparum semble plus proche de celui des végétaux Au

cours de son cycle de vie, le parasite est soumis chez l’hôte à une grande variation de pression partielle d’oxygène (pO2), de par son passage de la circulation sanguine (5% pO2) aux capillaires pulmonaires (14 % pO2). Afin de vérifier l’hypothèse selon laquelle la voie de l’oxydation alternative aurait pour fonction d’éviter la formation des ROS au niveau de la mitochondrie, des mitochondries isolées seront soumises à des variations rapides des conditions d’oxygénation.

La mesure des variations de pH dans le milieu d’incubation des mitochondries devrait nous

permettre d’apprécier les modifications des voies métaboliques en réponse aux variations d’apport en O2 et les capacités de développement de l’oxydation alternative chez P. falciparum. Dans un deuxième temps, des inhibiteurs de chacune des deux voies (voie de l’oxydation alternative et voie de respiration cellulaire classique) seront ajoutés dans le milieu d’incubation. L’identification du gène plasmodial impliqué dans la voie alternative sera entreprise par la recherche d’homologie de séquence avec les végétaux supérieurs.

Les ROS ont un rôle physiologique important en agissant à faible concentration comme des

messagers secondaires capables de moduler l’expression de gènes de structure codant pour les enzymes antioxydantes (SOD1, SOD2 …). En réponse à un stress oxydatif comme l’hyperoxie, le parasite se protège en surexprimant SOD1 et SOD2, qui contribuent à l’élimination de ROS. Ce système de défense n’est efficace qu’associé à l’action de nombreuses autres enzymes antioxydantes, en particulier la glutathion transférase qui est également surexprimée. En conclusion, lorsque les parasites de P. falciparum sont exposés à un stress oxidatif, leur premier moyen de défense est de surexprimer les enzymes des systèmes de défense antioxidant.Ces variations environnementales nécessitent une adaptation du parasite et requièrent une dynamique de son transcriptome.

Le séquençage de la totalité du génome de P. falciparum et le développement de la

technologie des puces à ADN offrent l’opportunité d’étudier les variations d’expression de l’ensemble des gènes de ce parasite. Pour étudier le transcriptome, notre laboratoire a développé une puce dédiée à P. falciparum. Cet outil a permis d’identifier des gènes en réponse à une variation environnementale telle que la pO2. Une principale voie métabolique, la voie de digestion de l’hémoglobine, est réprimée à 21% de pO2.

L’étude du transcriptome qui visualise la réponse globale de la cellule, permet d’identifier des

régulations des voies métaboliques inattendues initialement. Ces connaissances permettront de définir de nouvelles cibles et modalités thérapeutiques.


Biomarqueurs et Cancer

Jean-Paul Borg

Faculté de Pharmacie de Marseille Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille UMR 599 Inserm ; Université de la Méditerranée ; Institut Paoli-Calmettes e-mail: [email protected]

Malgré les grands progrès effectués dans le traitement des cancers, la communauté médicale se heurte encore à un taux d’échec thérapeutique important et à la difficulté de contourner les effets secondaires provoqués par les médicaments anticancéreux. Il est maintenant acquis que ces problèmes pourront être en partie résolus grâce à une meilleure connaissance de la complexité moléculaire des cancers qui permettra 1) d’obtenir une meilleure classification des cancers en additionnant les indispensables données cliniques et anatomopathologiques à l’analyse moléculaire des tumeurs, 2) d’identifier de nouveaux biomarqueurs d’intérêt diagnostique ou pronostique, 3) d’isoler de nouvelles anomalies moléculaires susceptibles d’entrer dans la catégorie des nouvelles cibles thérapeutiques.

La séquence du génome met à notre disposition le panel complet de gènes humains et permet

d’envisager des méthodes d’analyses globales au sein d’un échantillon biologique normal ou pathologique. Les recherches de mutations, de délétions, de polymorphismes, et de signatures d’expression des gènes (par puces à ADN par exemple) dans les tumeurs sont maintenant réalisables et permettent de révéler l’identité moléculaire des cancers. L’essor de technologies nouvelles permet de compléter ces investigations en étudiant les protéines dont la richesse informationnelle est immense. Alors que le génome humain contient environ 30.000 gènes, les prédictions les plus pessimistes avancent le nombre de 300.000 protéines. A ce nombre, il faut rajouter pour chaque protéine la multitude de modifications post-traductionnelles (phosphorylation, clivage, ubiquitination…) que chacune d’entre elle peut subir et qui représentent des informations très précieuses pour avancer plus loin vers la dissection des mécanismes du processus tumoral.

La prise en charge de cancers inclut traditionnellement le dosage de marqueurs sériques plus

ou moins spécifiques et sensibles (CA125, Prostate Specific Antigen ou PSA…) et l’analyse qualitative et semi-quantitative de marqueurs tumoraux par immunohistochimie (IHC). Ces analyses peuvent permettre de suivre l’évolution de la maladie ou la réponse au traitement (exemple : PSA dans le cancer de la prostate) ou aider le médecin à instaurer un traitement spécifique d’une anomalie moléculaire. Les exemples de ce type sont pour le moment réduits mais leur impact est majeur. Historiquement, la mesure d’expression de récepteurs hormonaux aux estrogènes et à la progestérone a été la première à entrer dans la pratique clinique. Dans les cancers du sein, la positivité du test pour ces récepteurs qualifie la patiente à recevoir des molécules inhibitrices (tamoxifène, anti-aromatases) de l’activité de ces récepteurs hormonaux. Plus récemment, la mesure d’expression du récepteur oncogénique ErbB2 dans les cancers du sein métastatiques est devenue indissociable de l’utilisation du trastuzumab (Herceptin), un anticorps monoclonal humanisé capable de bloquer l’activité de ErbB2. La demande de «signatures protéiques» diagnostiques, pronostiques ou de prédiction de réponse aux traitements (en particulier aux molécules innovantes dites « ciblées ») est maintenant forte et nécessite l’emploi de nouvelles approches pour identifier de nouveaux biomarqueurs protéiques dans la tumeur.

mailto:[email protected]

Communications par affiches


FRE CNRS 2737

Université de la Méditerranée Cytosquelette et Intégration des Signaux du Micro Environnement Tumoral



Modulation de l’instabilité dynamique des microtubules par l’adrénomédulline : implication dans la motilité endothéliale

Milano E., Gauthier G., Honoré S., Ouafik L’H*. et Braguer D.

CNRS-FRE 2737, Laboratoire « Cytosquelette et Intégration des Signaux du Micro Environnement Tumoral » ; Faculté de pharmacie, Université Aix-Marseille, France *INSERM EMI0359 Faculté de Médecine, Université Aix-Marseille, France

Introduction: La migration endothéliale au cours de la néoangiogenèse est une étape clé dans la croissance tumorale. Nous avons précédemment montré que de faibles concentrations d’agents anti-microtubules (MT) tels que le paclitaxel et la vinflunine possédaient des propriétés anti-angiogéniques (i.e. inhibition de la formation de tubes capillaires sur Matrigel, et inhibition de la migration) associés à une augmentation importante et inattendue de l’instabilité dynamique des MTs (Pourroy B, Cancer Res 2005 ; Pasquier E, Cancer Res 2006). Nos résultats suggèrent donc un rôle primordial de la régulation de l’instabilité dynamique des MTs au cours du processus angiogénique.

Objectif : Déterminer le rôle de l’instabilité dynamique des MTs dans la migration

endothéliale induite par l’adrénomédulline (AM), facteur pro-angiogénique puissant dans de nombreuses tumeurs solides (glioblastomes, cancer de la prostate….)

Matériels et méthodes: Les effets de l’AM sur l’instabilité dynamique des MTs et la migration endothéliale ont été analysés par vidéomicroscopie. L’implication différentielle des différents récepteurs de l’AM (i.e. CRLR/Ramp1, CRLR/Ramp2 et CRLR/ Ramp3) a été analysée à l’aide d’anticorps bloquants spécifiques.

Résultats: Nos résultats montrent que l’AM (2 x10-7 M) diminue de 37% l’instabilité

dynamique des MTs dans les cellules endothéliales (HUVEC). De manière tout à fait surprenante, cet effet est principalement liée à la stimulation du récepteur mixte CGRP/ AM, CRLR/ Ramp1, par l’AM. De manière opposée, la stimulation des récepteurs spécifiques de l’AM, CRLR/Ramp2 et CRLR/ Ramp3, par l’AM induit une augmentation de l’instabilité dynamique des MTs. L’analyse de la migration endothéliale montre que la stimulation des cellules HUVEC par l’AM (2 x10-7 M) ainsi que le blocage total de l’AM à l’aide d’un anticorps anti-AM augmentent de 15% la migration des HUVEC. Ces résultats suggèrent une signalisation bivalente de l’AM via ces différents récepteurs. De manière très intéressante, l’AM augmente très fortement (x6) la migration des HUVEC quand le CRLR/ Ramp1 est bloqué par des anticorps spécifiques. Ce résultat suggère que l’AM induit la migration endothéliale via ces récepteurs spécifiques CRLR/Ramp 2 et CRLR/ Ramp3 et inhibe la migration endothéliale via le récepteur CRLR /Ramp1.

Conclusion/Perspectives: L’ensemble de nos résultats montrent que l’inhibition de

l’instabilité dynamique des MTs par l’AM (via CRLR/ Ramp1) est associée à une activité anti-migratoire, alors que l’augmentation de l’instabilité dynamique des MTs par l’AM via CRLR/Ramp2 et CRLR/Ramp3 est associée à une activité pro-migratoire. Ces résultas seront validés sur des cellules endothéliales isolées à partir de tumeurs (Glioblastomes). L’effet d’autres facteurs pro-angiogéniques tel que le VEGF sera également analysé. Ces études permettront de mieux comprendre l’implication du cytosquelette microtubulaire dans l’angiogenèse tumorale et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques anti-angiogéniques. Ce travail est inclus dans le projet structurant Glioblastome RS019 financé par l’INCa (Cancéropôle PACA)


Rôle central des mitochondries dans l’activité anti-tumorale des Epothilones

Khawaja N.R., Carré M., Kovacic H. and Braguer D. CNRS-FRE 2737, Laboratoire « Cytosquelette et Intégration des Signaux du MicroEnvironnement Tumoral » ; Faculté de pharmacie, Université Aix-Marseille, France

Prérequis: La famille des épothilones constitue une nouvelle classe prometteuse d’agents

anti-mitotiques, aussi appelés anti-microtubules. Comme les taxanes (Taxol® et Taxotère®), leurs propriétés anti-cancéreuses sont liées à la stabilisation des microtubules intracellulaires et à l’induction du programme de mort apoptotique. Un des avantages majeurs des épothilones repose sur leur capacité à agir sur des cellules tumorales résistantes aux autres agents anti-microtubules. Parmi les tumeurs pédiatriques, le neuroblastome constitue un défi de taille en chimiothérapie. Les Vinca-alcaloïdes, agents dépolymérisant les microtubules, sont jusqu’à maintenant les seuls anti-microtubules utilisés dans le traitement de ce type de tumeurs. De façon intéressante, un dérivé de l’épothilone B (ixabepilone) a récemment été montré comme actif dans des modèles murins de xénogreffe de neuroblastome. Cependant, le mécanisme d’action des Epo sur les cellules de neuroblastome humain reste inconnu.

But de l’étude: Caractériser la signalisation apoptotique induite par un épothilone (ici appelé Epo) dans les cellules SK-N-SH de neuroblastome humain. Nous nous sommes, en particulier, attachés à déterminer l’implication des mitochondries dans l’efficacité de cet agent anti-tumoral.

Résultats: Epo inhibe de façon efficace la croissance des cellules de neuroblastome à de faibles concentrations (IC50 2nM). Cet agent stabilise fortement les microtubules intracellulaires et induit l’apoptose des SK-N-SH après des modifications de la progression du cycle cellulaire. Les mitochondries jouent un rôle clef dans la cascade de signalisation apoptotique déclenchée par Epo, comme en témoigne la dépolarisation précoce des membranes mitochondriales (40 ± 5% dès 6h pour IC50). La perméabilisation des membranes mitochondriales est également illustrée par la libération du cytochrome c, facteur pro-apoptotique, dans le cytosol (90% à 30h avec IC70). Parallèlement, la microscopie électronique révèle une condensation de plus de 80 % des mitochondries après 6 h de traitement par Epo (IC70). Nous avons également mis en évidence une translocation des protéines Bim et p53 vers les mitochondries, à partir de 6 et 12 h respectivement, évènement qui pourrait être responsable des modifications de perméabilité mitochondriale. Par ailleurs, Epo augmente de façon significative la production des superoxydes par les mitochondries (76 ± 4% pour IC70). L’inhibition de ces espèces réactives de l’oxygène diminue d’un facteur 2 l’activité anti-tumorale de Epo sur les cellules de neuroblastome, confirmant l’importance des mitochondries dans l’efficacité de cet agent. Enfin, nous avons montré la capacité de Epo à agir sur les mitochondries isolées de cellules SK-N-SH en libérant le cytochrome c, comme nous l’avions déjà montré pour les autres agents anti-microtubules. De façon intéressante, Epo affecte les mitochondries, de façon directe, dans une gamme de concentrations identique à celle des Vinca-alcaloïdes et s’est avéré être le plus actif parmi agents stabilisant les microtubules.

Conclusion: Nous montrons ici le rôle crucial des mitochondries dans la haute efficacité de Epo sur les cellules de neuroblastome. Ces travaux supportent ainsi une évaluation clinique de la famille des épothilones chez les patients porteurs de ce type de tumeur.


Nox1-dependent superoxide production controls colon adenocarcinoma cell migration

Sadok A., Bourgarel-Rey V., Gattacceca F., Penel C., Lehmann M. and Kovacic H. CNRS-FRE 2737, Laboratoire « Cytosquelette et Intégration des Signaux du MicroEnvironnement Tumoral » ; Faculté de pharmacie, Université Aix-Marseille, France

Reactive oxygen species are well known mediators of various biological responses, including cell migration, growth and gene expression. Recently, new homologues of the catalytic subunit of NADPH oxidase has been discovered in non phagocytic cells, particularly in several cancer cell lines. These new homologues (Nox1 to Nox5) produce low level of superoxide compared to the phagocytic homologue Nox2/gp91phox.

Using Nox1 siRNA and pharmacological inhibition by DPI, we show that Nox1-dependent

superoxide production affects the persistence of colic adenocarcinoma cells HT29-D4 migration on Collagen-I. In our experimental setting, migration was decreased by α2β1 integrin inhibition. In contrast, α1β1 and α3β1 integrin inhibition did not affect cell migration. We show that Nox1 inhibition or down-regulation lead to a decreased superoxide production, α2β1 integrin membrane availability and α2 subunit expression. Such a regulation involves an okadaic acid inhibitable phosphatase and p38-MAPK phosphorylation. Addition of arachidonic acid, a well known epithelial cell migration activator stimulates Nox1 dependent superoxide production and HT29-D4 cell migration. Pharmacological evidences using Phospholipase A2, Lipoxygenases and PKCs inhibitors show that upstream regulation of Nox1 rely on arachidonic acid metabolism. 12-lipoxygenase inhibition by cinnamyl-3,4-dihydroxy-alpha-cyanocinnamate (CDC) inhibits basal and arachidonic acid induced Nox1-dependent superoxide production and cell migration.

Migration and ROS production inhibited by CDC might be restored by addition of 12-HETE a

down product of 12-lipoxygenase. PKC delta inhibition by Rottlerin (and also GO6983), prevents Nox1-dependent superoxide production and inhibit cell migration while other PKCs inhibitors are ineffective. To conclude, we show that Nox1 activation by arachidonic acid metabolism occurs through 12-lipoxygenase and PKC delta and controls cell migration by affecting integrin α2 subunit turn-over.


Rôle de la stathmine dans l’activité anti-angiogénique des agents antimicrotubules

H. Cao, F. Devred, E. Pasquier, P. Verdier Pinard, and D. Braguer

CNRS-FRE 2737, Laboratoire « Cytosquelette et Intégration des Signaux du MicroEnvironnement Tumoral » ; Faculté de pharmacie, Université Aix-Marseille, France

Les microtubules jouent un rôle clé dans de nombreux processus essentiels à la vie cellulaire, en particulier la division, la polarité, la migration, et le trafic intracellulaire. Ces processus, perturbés dans la progression tumorale, sont régulés par un ensemble de protéines associées aux microtubules (MAP), parmi lesquelles la stathmine. En clinique, un nombre croissant d’études montre son implication dans l’apparition ou la progression de certains cancers (Ghosh 1993, Friedrich 1995, Curmi 2000, Price 2000, Yuan 2006). Dans les cellules, la stathmine, qui provoque le désassemblage des microtubules, est elle-même finement régulée par des kinases et phosphatases, se détachant du système tubuline/microtubules lorsque les 4 sites de phosphorylation connus sont occupés.

Il a récemment été mis en évidence, au sein du laboratoire, un taux d’expression élevé de

stathmine dans les cellules endothéliales humaines. De façon intéressante, ces cellules présentent une sensibilité accrue aux agents anti-microtubules (alors définis comme anti-angiogeniques), associée à une augmentation significative de la dynamique microtubulaire (Pasquier CancerRes 2005, Pourroy Cancer Res 2006). Aussi nous nous intéressons maintenant d’une part à l’implication de la stathmine dans cette sensibilité particulière des cellules endothéliales vis-à-vis des agents anti-microtubules et d’autre part à son mécanisme moléculaire d’interaction avec la tubuline, responsable de cette activité.

Ainsi, nous évaluerons les variations d’expression et de phosphorylation de la stathmine dans

les cellules endothéliales sous l’effet de différents agents anti-microtubules (stabilisant ou déstabilisant les microtubules). En comparant les niveaux d’expression et de phosphorylation de la stathmine dans des cellules endothéliales (HMEC-1) et des cellules cancéreuses de poumon (A549) en présence de concentrations croissantes de paclitaxel, nous avons déjà montré que la phosphorylation, et donc l’inactivation de la stathmine, survenait dès les très faibles doses (0.1nM) chez HMEC-1 alors qu’elle n’augmentait chez A549 qu’aux doses cytotoxiques (>5nM). Cela laisse penser que la phosphorylation entraîne une augmentation du pool de tubuline libre dans la cellule qui pourrait être responsable de cette augmentation de dynamique.

En parallèle, nous avons commencé à caractériser les mécanismes moléculaires de liaison de

la stathmine avec sa cible. Pour cela nous avons réalisé la purification de stathmine humaine recombinante (à partir de E. coli) et déterminé les paramètres thermodynamiques de sa liaison avec la tubuline (purifiée à partir de cerveaux ovins ou de cellules humaines en culture). Cela nous a permis de montrer par microcalorimétrie que l’extrémité C-terminale de la tubuline n’intervenait pas dans la fixation de la stathmine, et nous permettra prochainement de mesurer l’influence directe des agents microtubules sur cette interaction.

L’ensemble de ces résultats, cellulaires et moléculaires, devraient nous permettre de mieux

comprendre le rôle de la stathmine dans les processus d’angiogenèse tumorale et développer à terme de nouvelles thérapies anti-cancéreuses.

UMR 608 - INSERM

Université de la Méditerranée Physiopathologie de l’Endothélium



SECRETION DE L’INTERLEUKINE 1 ALPHA VIA LES MICROPARTICLES ENDOTHELIALES

Y. Berda-Haddad1, C. Farnarier1, L. Camoin-Jau1, P. Salers1, H. Borghi2, F. Sabatier-Malaterre1, F. Dignat-George1 et G. Kaplanski1. 1 UMR 608 - INSERM - Université de la Méditerranée - UFR de Pharmacie, Marseille, France 2 Faculté de Médecine, Service commun de Microscopie Electronique, Université de la Méditerranée, Marseille, France

Introduction : L’interleukine-1 alpha (IL-1a) est une cytokine proinflammatoire ubiquitaire. Elle est synthétisée sous la forme d’un précurseur dépourvu de séquence d’adressage et de sécrétion, qui ne sera libéré sous forme soluble qu’en situation d’apoptose cellulaire. Dans la cellule, une partie du précurseur est myristilée ou palmytilée ce qui facilite son association à la membrane plasmique. Cette localisation permet lors de l’activation cellulaire son clivage en forme mature par la calpaïne. C’est cette « IL-1a membranaire » qui exerce ses fonctions pro inflammatoires selon un mode juxtacrine ou paracrine.

A l’heure actuelle, les mécanismes de localisation et de sécrétion sont mal compris. Lors de processus d’activation et/ou d’apoptose cellulaires, les cellules eucaryotes subissent

des remodelages membranaires à l’origine de la formation de microparticules. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que les microparticules endothéliales (MPE) pourraient constituer des vecteurs de l’IL-1a dans l’organisme.

Méthodes : Pour vérifier cette hypothèse, nous avons mis au point un modèle de vésiculation

cellulaire à partir de cellules endothéliales provenant de cordons ombilicaux d’origine humaine (HUVEC). Nous avons recherché par microscopie électronique et par cytométrie de flux la présence de l’IL-1a associée à des MPE provenant de cellules au repos ou de cellules activées par le TNF.

Afin d’attester de la fonctionnalité biologique de l’IL-1a associée aux MPE nous avons testé

la capacité des MPE à induire la synthèse d’IL-8 et du « Monocyte Chemotactic Protein 1 » (MCP-1) par les cellules endothéliales.

Résultats : L’IL-1a a été mise en évidence sur les MPE provenant de cellules au repos et

stimulées par cytométrie et par microscopie électronique. L’analyse quantitative des résultats obtenus en microscopie électronique a permis de montrer que l’activation des cellules endothéliales augmente la densité d’expression de l’IL-1a par MPE. Cette IL-1a est biologiquement active car elle est capable d’induire spécifiquement la synthèse de l’IL-8 et du MCP-1.

Conclusion : Ce travail montre pour la première fois une forme circulante d’IL-1a associée

aux microparticules endothéliales. Elle pourrait constituer une forme de vectorisation biologiquement active pour cette cytokine qui permettrait une action à distance selon un mode autocrine ou paracrine.


Endothelial markers of injury/repair equilibrium in patients undergoing coronary angioplasty.

A. Basire1, F. Sabatier1, L. Bonello2, F. Paganelli2 and F. Dignat-George1. 1 UMR 608 - INSERM - Université de la Méditerranée - UFR de Pharmacie, Marseille, France 2 Service de Cardiologie, Hôpital Nord, Assistance Publique Hôpitaux de Marseille, France

Introduction : Circulating endothelial progenitor cells (EPC) mediate vascular reparative processes. Healing of the endothelial monolayer after coronary angioplasty is of critical importance to prevent complications. We investigate the effect of coronary angioplasty on EPC number in patients with stable coronary artery disease and its relationship with the endothelial damage reflected by circulating endothelial cells (CEC).

Methods : Fifteen patients undergoing coronary angioplasty were analyzed for CEC using

CD146-based immuno-magnetic separation, and circulating progenitor cells using flow cytometry numeration of CD34+CD45+ cells and endothelial colony forming assay.

Results : Angioplasty induced a transient increase in CEC number. When normalized to the

stent surface, CEC counts correlated with peak troponin Ic levels. Interestingly, a significant increase in circulating haematopoietic and endothelial progenitors compared to baseline levels was also observed. The magnitude of progenitor cells mobilization was found to be higher in patients pre-treated by statins. Moreover, patients with the higher CEC count displayed lower EPC mobilization suggesting they could be at higher risk for post procedural complications.

Conclusion : Endothelial damage induced by angioplasty triggers mobilization of progenitors

cells involved in vascular repair. The combined measurement of CEC and EPC may provide a promising tool for prediction of angioplasty outcome.


L’indoxyl sulfate, une toxine urémique, induit un stress oxydant dans les cellules endothéliales

Laetitia Dou1, Noémie Jourde-Chiche1,2, Claire Cerini1, Yvon Berland2, Philippe Brunet1,2 & F. Dignat-George1

1 UMR 608 - INSERM - Université de la Méditerranée - UFR de Pharmacie, Marseille, France 2 Service de Néphrologie Dialyse Transplantation Rénale, Hôpital de la Conception, Marseille, France

Les patients insuffisants rénaux chroniques (IRC) présentent un dysfonctionnement endothélial et un stress oxydant important, dont les causes ne sont pas encore clairement définies. Les toxines urémiques, retenues chez ces patients, pourraient être des agents pathogènes spécifiques de l’IRC, impliqués dans ces deux processus. Parmi ces toxines, nous avons montré que l’indoxyl sulfate induisait un dysfonctionnement endothélial in vitro. L’objectif de ce travail a été de déterminer si l’indoxyl sulfate pouvait également induire un stress oxydant dans les cellules endothéliales.

Des cellules endothéliales humaines issues de veines de cordon ombilicaux (HUVEC) ont été

incubées en présence d’indoxyl sulfate, puis la production d’espèces activées de l’oxygène (ROS) a été étudié par cytofluorimétrie. Nous avons ensuite analysé l’implication des enzymes pro-oxydantes NAD(P)H oxidases, xanthine oxidase, and NO synthases dans cette production de ROS. Enfin, nous avons mesuré les taux du système antioxydant cellulaire le plus actif: le glutathion.

L’indoxyl sulfate, aux concentrations rencontrées chez les patients IRC induit une production

significative de ROS dans les HUVEC. Cette production peut être diminuée par deux inhibiteurs de NAD(P)H oxidase : l’apocynine et le DPI, mais pas par des inhibiteurs de xanthine oxidase, de NO synthase ou de respiration mitochondriale. De plus, l’indoxyl sulfate diminue fortement les taux de glutathion cellulaire, le système de défense antioxydant majeur de la cellule.

En conclusion, la toxine urémique indoxyl sulfate accroit la production de ROS par les

HUVEC en induisant une augmentation de l’activité NAD(P)H oxidase et en diminuant les taux de glutathion cellulaire. Ainsi, l’indoxyl sulfate induit un stress oxydant dans les cellules endothéliales en activant un mécanisme pro-oxydant et en altérant un système anti-oxydant.


Immuno-magnetic enrichment followed by multi-parameter flow cytometry: a new approach to count circulating endothelial cells

A. Widemann1, L. Arnaud1 , F. Sabatier1, L. Bonello2, F. G. Massarani1, Dignat-George1. 1 UMR 608 - INSERM - Université de la Méditerranée - UFR de Pharmacie, Marseille, France 2 Service de Cardiologie, CHU Nord, Marseille

Introduction: Circulating endothelial cells (CEC) have emerged as non invasive biomarkers of vascular dysfunction. Their detection remains a challenge due to their extreme scarcity in peripheral blood. The currently used CD146-based immuno-magnetic separation (IMS) assay has provided consensus values in healthy controls and increased counts in various pathologies but remains tedious and operator dependent. Our objective is to validate a new assay (CellQuant FF CD146, Biocytex, Marseille, F) combining a pre-enrichment of CD146+ cells and a multi-parametric flow cytometry (FCM).

Method: CEC were determined in peripheral blood from 20 healthy volunteers, 12 patients undergoing coronary angioplasty and 30 renal transplant recipients using both CD146-based assays, IMS and CellQuant FF. For the latter, 2x1 ml of peripheral blood are incubated with CD146 coated magnetic nanoparticles (ferrofluids). Isolated CD146+ cells are then labelled using CD45-FITC and CD146-PE (or isotype control), and propidium iodide (PI). In FCM analysis, CEC are identified as CD45dim/CD146bright/PI+ events. They are clearly discriminated from CD45bright/CD146dim/PI+ activated T lymphocytes. Absolute numbers of CEC are determined using counting beads

Results: Both techniques similarly evidenced increased CEC levels in patients undergoing coronary angioplasty (CA) and renal transplantation (RT) compared to healthy controls (HC)(tab.1). In patients and in spiking experiments, CEC values from the two methods were significantly correlated (r=0.83 and 0.99 respectively), with FCM assay showing higher recovery

Conclusions : This new hybrid FCM assay constitutes an accurate alternative to visual counts

of CEC following CD146 based IMS. Extensive studies are required to define the specific advantages of this assay in clinical situations.

Patients IMS assay hybrid FCM assay HC 5±3 9±7 CA 17±16 (p=0.0016) 30±20 (p<0.0001) RT 28±30 (p=0.0015) 56±48 (p<0.0001) Tab.1: CEC counts (CEC/ml) in patient groups (p value compared to HC)


Preterm birth and fetal growth restriction have an impact on elastic and collagenic structures of human umbilical arteries.

Tauzin Laurent1, Risso Francesco1, Lamy Edouard2, Chareyre Corinne2, Simeoni Umberto1, Charpiot Philippe2

1 Faculté de médecine, Université de la Méditerranée and Service de néonatologie, Assistance Publique Hôpitaux de Marseille, France 2 UMR 608 - INSERM - Université de la Méditerranée - UFR de Pharmacie, Marseille, France

Background: Epidemiologic studies have shown that low birth weight is associated to metabolic and vascular disorders in adulthood. Moreover, low birth weight and preterm birth are known as risk factor for raised systolic blood pressure. However, the underlying mechanisms are not fully known. We hypothesized that low birth weight impairs the normal development of arterial wall and may thus pave the way for arterial disorders in adulthood.

Aim: The purpose of this study was to determine the impact of low birth weight due to either

fetal growth restriction or preterm birth on arterial elastic and collagenic structure in umbilical arteries. Patients and methods: Studies were performed on umbilical cord arteries from 90 newborn

infants between 25 and 42 weeks of gestational age. Transverse 6 μm serial sections of umbilical arteries were stained with (+)catechin-fuchsin to specifically identify elastic components. Elastin and collagen were extracted from an arterial dry tissue by an alkaline procedure. For biochemical quantification, elastin was hydrolyzed (6N HCl, 24 h, 110°C) and quantified by colorimetric determination of the amino acid content. Collagen was quantified by colorimetric determination of hydroxyproline.

Results: The number of elastic layers in umbilical arteries increased with gestational age. By

use of regression linear models, elastin content of the arterial wall was dependent on gestational age independently on Z-score for birth weight, gender, cesarean section or preeclampsia. Elastin content increased significantly after 32 weeks of gestational age in newborn infants with normal fetal growth. In newborn infants at term, both elastin and collagen contents were dependent on Z-score for birth weight independently on the other factors.

Conclusions: Preterm birth and impaired foetal growth have an impact on elastic and

collagenic structures of human umbilical arteries. Fetal growth restriction and preterm birth could lead to arterial hypertension in adulthood through an early impairment of arterial elastic structure.

UMR CNRS 6517

Université de la Méditerranée Laboratoire de Chimie Organique Pharmaceutique


Synthèse de 4-arylquinazolines fonctionnalisées par réaction de couplage métallo-catalysé sous irradiation micro-ondes

Pierre VERHAEGHE,a Pascal RATHELOT,a Sylvain RAULTc et Patrice VANELLEa. aLaboratoire de Chimie Organique Pharmaceutique, LCOP UMR CNRS 6517, Université de la Méditerranée, 27, Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 5, France. [email protected] bCentre d’Etudes et de Recherche sur le Médicament de Normandie, UPRES EA 3915, Faculté des Sciences Pharmaceutiques, Université de Caen Basse Normandie, France.

Les réactions de couplage métallo-catalysé sont des outils modernes, hautement performants en synthèse organique. Elles font aujourd’hui l’objet d’un développement considérable, notamment dans le domaine de la pharmacochimie. Parmi ces réactions, la réaction de Suzuki-Miyaura1 qui consiste à coupler un dérivé d’acide boronique avec un substrat halogéné aromatique, au moyen d’un catalyseur palladié, en présence d’une base occupe une place privilégiée2.

Ayant acquis une certaine expérience dans l’utilisation de réacteurs micro-ondes3, nous avons travaillé à la mise au point de réactions de couplage de Suzuki-Miyaura appliquées à la 2-trichlorométhyl-4-chloroquinazoline, sous irradiation micro-ondes. Ainsi, une série d’arylquinazolines trichlorométhylées a été synthétisée et purifiée de manière rapide et efficace4.

N

NH

O

CH3 N

N

Cl

CCl3N

N

CCl3

RPCl5 / POCl3

800 W M.O.

B(OH)2

R

Pd / Cs2CO3

150 W M.O.

Ces molécules sont actuellement en cours d’évaluation anticancéreuse. En parallèle, la réactivité de ces structures trihalogénées tricycliques est étudiée, afin d’étendre leur intéret pharmacologique (infectiologie et SNC).

1 Sambasivarao, K. ; Kakali, L. ; Dhurke, K. Tetrahedron, 2002, 58, 9633-9695. 2 Crozet, M. ; Castera-Ducros, C. ; Vanelle, P. Tetrahedron Lett., 2006, 47, 7061-7065. 3 Verhaeghe, P. ; Rathelot, P. ; Gellis, A. ; Rault, S. ; Vanelle, P. Tetrahedron, 2006, 62, 8173-8176. 4 Verhaeghe, P. ; Rathelot, P. ; Rault, S. ; Vanelle, P. soumis à Tetrahedron Lett.


Synthèse sous irradiation micro-ondes de nouveaux dérivés de la quinazoline à visée thérapeutique

Youssef KABRI, Christophe CURTI, Armand GELLIS, Patrice VANELLE

Laboratoire de Chimie Organique Pharmaceutique, LCOP UMR CNRS 6517, Université de la Méditerranée, 27 bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 5, France. [email protected]

Les quinazolines présentent des propriétés pharmacologiques dans différents domaines et en particulier dans le domaine antimicrobien1, anti-tumoral2, analgésique, anti-inflammatoire, anti-convulsivant, fongicide3 et anti-malarique4.

L’activation des réactions par irradiation micro-ondes est une technologie en plein

développement à l’heure actuelle. L’attrait particulier de cette nouvelle technologie réside en une accélération considérable des réactions étudiées avec une simplification des modes opératoires.

L'intérêt du noyau quinazoline pour la chimie médicinale nous a conduits à développer la

synthèse de nouvelles quinazolin-4(3H)-ones, sous irradiation micro-ondes selon un nouveau procédé de synthèse rapide et performant.

N

N

OH

ClN

N

OR

Cl

CN

NH2

2 étapes

Micro-ondes

Li+ -CR2R3NO2

N

NR

R3

R2

O

Micro-ondes

N

N

OR

ClR5O OR5

O O

R4

N

N

OR

O

R5O

O

OR5

Micro-ondes

R1 R1 R1

R1

R1

R1

N

N

OR

ClR1

R2SO2-Na+

N

N

OR

SO2R2R1

Micro-ondes

R4

Micro-ondes

2 étapes

Après l’obtention des dérivés chlorométhylés en 4 étapes, leur réactivité a été étudiée sous irradiation micro-ondes, non seulement avec les anions nitronates, mais aussi avec divers anions malonates ou centrés sur un hétéroatome. L'évaluation biologique des composés ainsi obtenus est en cours d'étude.

1 Kuyper, Lee F. J. Med. Chem., 1996, 39, 892-903 2 Lipunova, G. N. Pharm. Chem. J., 2000, 34(1), 19-22 3 Insuasty, B. Heterocycl. Commun. 2003, 9(2), 153-160 4 Bhattacharjee, A. K. Eur. J. Med. Chem., 2004, 39(1), 59-67


Toward new class of 5-HT receptor ligands: TDAE approach in benzodioxole and ortho-dimethoxybenzene series

Ouassila AMIRI-ATTOU, Marc SINCE, Thierry TERME and Patrice VANELLE

Laboratoire de Chimie Organique Pharmaceutique (LCOP), UMR CNRS 6517 Université de la Méditerranée, Faculté de Pharmacie, 27 Bd J. Moulin, 13385 Marseille Cedex 05, France- [email protected]

Serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) is a neurotransmitter that exerts its effects on the central and peripheral nervous system by interacting with a large variety of receptors. Since the past decades, considerable attention has been centered on the identification of agents which act selectively at each of these receptor subtypes because of the wide range of physiologic systems and pathologic conditions in which 5-HT is known to play a role.

We have recently shown that from o- and p-nitrobenzyl chloride, Tetrakis(Dimethyl-Amino)Ethylene (TDAE) could generate a nitrobenzyl carbanion which is able to react with various electrophiles as aromatic aldehydes, α-keto esters, ketomalonate and α-keto lactam derivatives.1-5 In continuation of our program directed toward the study of single electron transfer reactions of bioreductive alkylating agents and the preparation of new potentially bioactive compounds in the CNS area, we report herein an original access to highly functionalized benzodioxoles and ortho-dimethoxybenzenes.

H3CO

H3CO

NO2

Cl R

O H 1) TDAE, DMF, -20°C

2) rt, 2h

O

O

NO2

Cl R

O H 1) TDAE, DMF, -20°C

2) rt, 2h

H3CO

H3CO

NO2

O

O

NO2

OH

R

R

OH

XR

O HO H

OOR1

OEt N

O

O

H3C

=

The results of the primary evaluation on 5-HT1a, 5-HT4, 5-HT5a, 5-HT6, 5-HT7 serotonin receptors of synthesized benzodioxoles and ortho-dimethoxybenzenes will be presented. 1 Giuglio-Tonolo, G.; Terme, T.; Médebielle, M.; Vanelle, P. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 6433-6435. 2 Giuglio-Tonolo, G.; Terme, T.; Médebielle, M.; Vanelle, P. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 5121-5124. 3 Amiri-Attou, O.; Terme, T.; Vanelle, P. Molecules 2005, 10, 545-551. 4 Montana, M.; Terme, T.; Vanelle, P. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 8373-8376. 5 Montana, M.; Terme, T.; Vanelle, P. Tetrahedron Lett. 2006, 47, 6573-6576.


Original TDAE reactivity in ortho-dimethoxybenzene series: Impact of experimental conditions

Ouassila AMIRI-ATTOU, Thierry TERME and Patrice VANELLE

Laboratoire de Chimie Organique Pharmaceutique (LCOP), UMR CNRS 6517 Université de la Méditerranée, Faculté de Pharmacie, 27 Bd J. Moulin, 13385 Marseille Cedex 05, France - [email protected]

Tetrakis(dimethylamino)ethylene (TDAE) is a reducing agent which reacts with halogenated derivatives to generate an anion under mild conditions via a single electron transfer (SET). In our research program directed toward the development of original synthetic methods using TDAE methodology in medicinal chemistry, we have developed many reactions between halogenated derivatives and electrophile compounds such as aldehydes, ketones, α-keto-esters, α-ketolactams and ketomalonates.1-5

TDAE

N

N

N

N

CH3

CH3H3C

H3CCH3 CH3

CH3CH3

H3CO

H3CO

NO2

Cl 1

Cl

In continuation of this program, we have prepared the ortho-dimethoxybenzene dichloride (1) as catechol and ortho-quinonic precursors and studied their reactivity with aromatic aldehydes in the presence of TDAE.

This reaction shows a high sensitivity of experimental conditions: light catalysis, solvent

nature (DMF, THF…), presence or absence and nature of aromatic aldehyde and TDAE amount. According to the experimental conditions used, we have observed the formation of an epoxide (2) or a stilbenic derivative (3) or the dimeric dichloride (4).

H3CO

H3CO

NO2

Cl

O H

1) TDAE, Solvent, -20°C

2) rt, 2hR

1Cl

H3CO

H3CO

NO2

O

R

H3CO

H3CO

NO2

H3CO

H3CO

NO2

H3CO

H3CO

NO2

H3CO

H3CO

NO2

Cl

Cl

2

3 4

The mechanism of formation of these products will be discussed. 1 Giuglio-Tonolo, G.; Terme, T.; Médebielle, M.; Vanelle, P. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 6433-6435. 2 Giuglio-Tonolo, G.; Terme, T.; Médebielle, M.; Vanelle, P. Tetrahedron Lett. 2004, 45, 5121-5124. 3 Amiri-Attou, O.; Terme, T.; Vanelle, P. Molecules 2005, 10, 545-551. 4 Montana, M.; Terme, T.; Vanelle, P. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 8373-8376. 5 Montana, M.; Terme, T.; Vanelle, P. Tetrahedron Lett. 2006, 47, 6573-6576.



Antiparasitic, cytotoxic and mutagenic properties of 20 new 5-nitroimidazoles bearing an arylsulfomethyl group in the 4-position

Maxime D. Crozet1, Céline Botta2, Monique Gasquet3, Vincent Rémusat1, Christophe Curti1, Olivier Chapelle3, Nadine Azas3, Michel De Méo2 and Patrice Vanelle1* 1 - Laboratoire de Chimie Organique Pharmaceutique, UMR - CNRS 6517, Université de la Méditerranée, Faculté de Pharmacie, 27 Bd Jean Moulin, Marseille Cedex 05. 2 - Laboratoire de Biogénotoxicologie et Mutagenèse Environnementale - EA 1784 - IFR PMSE 112, Université de la Méditerranée, Faculté de Pharmacie, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05. 3 - Laboratoire de Parasitologie, Mycologie médicale, Hygiène et Zoologie - EA 864, Université de la Méditerranée, Faculté de Pharmacie, 27 Bd Jean Moulin, Marseille Cedex 05.

To improve the antiparasitic pharmacophore, 20 new 5-nitroimidazoles bearing an arylsulfonylmethyl group were synthesized from 1-methyl-5-nitro-1H-imidazole, dimetridazole, metronidazole and secnidazole. The antiparasitic activity of these molecules was assessed against Trichomonas vaginalis (TV81) using the trypan blue exclusion staining. The in vitro cytotoxicity was evaluated on human monocytes (THP1 cells) by flow cytometry. The mutagenicity was determined by the Salmonella mutagenicity assay using the Salmonella typhimurium tester strains TA 100 and the overproducing nitroreductase YG1042 without S9 mix.

All the molecules possessed an antitrichomonas activity. The IC50 ranged from 0.044 µM to

2.553 µM and all IC50 were below the one of metronidazole (2.746 µM). Nine derivatives were cytotoxic in THP1 cells. The determination of the specificity indexes (SI), defined as the ratios of the cytotoxic activity and the antitrichomonas activity, indicated that 11 derivatives had a SI over the one of metronidazole. Finally, all the molecules were found to be mutagenic on TA 100.

Molecules, bearing an additional methyl group on the 2-position, showed a lower

mutagenicity than metronidazole. Comparison of the mutagenicity on TA100 and YG1042 indicated that the nitroreduction of the nitro group was not involved in the mutagenicity for 5 molecules. A correlation could be calculated between the antitrichomonas and mutagenic activities. However, three derivatives could not be fitted in the model. They were characterized by a low mutagenicity and an efficient antitrichomonas activity.

UMR 599 - INSERM

Université de la Méditerranée Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille

Institut Paoli-Calmettes



Scrib functions in a multimolecular protein complex involved in cell migration

Sébastien Nola1, Stéphane Audebert1, Jean-Paul Borg1,2 and Marie-José Santoni1

1 Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille UMR 599 Inserm, Institut Paoli-Calmettes, Université de la Méditerranée; 2 Faculté de Pharmacie de Marseille

The PDZ protein Scrib is described for its crucial role in the proper development of

Metazoans. At the cellular level, deficiency in Scrib has a profound effect in many aspects of cell polarity and cell movement although it remains unclear how it acts in these processes. In human cell lines, we identified that Scrib belongs to a tripartite complex containing βPIX, a Guanine Exchange Factor for Rac and Cdc42, and GIT1, a GTPase Activating Protein for Arf6. This complex is involved in receptor recycling and vesicle exocytosis.

Our current study in mammary carcinoma cell line T47D shows that the oncogenic serine-

threonine kinase PAK1 associates with Scrib and βPIX and that Scrib, βPIX and PAK1 are located at the leading edge of migratory cells. Using RNA interference and dominant-negative constructs, we demonstrate that members of this protein complex are required for epithelial cells to properly respond to a chemoattractant stimulus.

Loss of Scrib most likely impairs cell migration by disrupting the correct positioning of βPIX

and PAK1 at the plasma membrane. These data provide evidence that PAK1 is a member of the Scrib complex and that the Scrib/βPIX/PAK1 signalling machinery is required for directional cell migration.


Role of Erbin in the TFGβ signaling pathway Nadine Déliot1, Claire Nourry1, Sylvie Marchetto1, Camille Arnaud1, Patrick Lécine1, Jean-Paul Borg1, 2

1 Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille UMR 599 Inserm, Institut Paoli-Calmettes, Université de la Méditerranée;

2 Faculté de Pharmacie de Marseille.

The Transforming Growth Factor-beta (TGFβ) signalling pathway is involved in many biological responses via its intracellular effectors, the Smad proteins, and is known to be both a tumour suppressor in the earliest phase, and an oncogenic determinant in the latest phase of cancer growth. We show that Erbin, a PDZ (PSD95/Dlg/ZO-1) protein interact with Smad3, in epithelial cells. Erbin belongs to the LAP (LRR and PDZ) protein family and contains LRR (Leucine Rich Repeat) motifs at the N terminus and one C-terminal PDZ domain. Smad3 interacts with Erbin but not with other members of the LAP family. This interaction is mediated by the PDZ domain of Erbin and the C-terminus MH2 domain of Smad3. This complex is localized at the plasma membrane. To study the role of this interaction, we set up different cellular models such as MEF (mouse embryonic fibroblasts) and keratinocytes derived from erbin-deficient mice generated in the lab. We show that Erbin plays a role in TGFβ signalling and that it is involved in the TGFβ-dependant migration of MEF cells and epithelial cells.

So Erbin and Smad3 interact together and are part of a complex containing SARA, an anchor

protein and the TGF β receptor1.


In search of predictive factors for the response to cetuximab in metastatic colorectal cancer.

Brynn Taylor1, Yves Toiron1, Jean-Paul Borg1, 2, and Anthony Gonçalvès1, 3, 4

1 Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille UMR 599 Inserm, Institut Paoli-Calmettes, Université de la Méditerranée;

2 Faculté de Pharmacie de Marseille; 3 Oncologie Médicale, Institut Paoli-Calmettes, Marseille; 4Université de la Méditerranée, UFR de Médecine.

Cetuximab, an anti-EGFR monoclonal antibody, has demonstrated significant anti-tumor activity in approximately 20% of metastatic colorectal cancer patients resistant to chemotherapy when administered with irinotecan. The molecular mechanism underlying clinical response or resistance to this drug is not yet understood, and so currently there are no diagnostic tools to identify patients likely to benefit from treatment.

Serum (n=59) and tissue samples (n=25) from metastatic colorectal cancer patients treated

with cetuximab and irinotecan who had a partial response (25%), stable disease (37%) or progressive disease (37%) will be analyzed with both targeted and high-throughput tools to identify predictive factors for the response or resistance to cetuximab. Seric protein profiles will be generated using SELDI-TOF MS technology, permitting the identification of a protein profile which correlates with cetuximab activity. Complementary analyses will be performed on tissue samples including gene sequencing and tissue proteomics. Finally, gene expression profiles will be generated with DNA chips.

The goal of this project is to use a combinatory approach to elucidate the molecular

mechanism of cetuximab sensitivity or resistance, and furthermore identify potential theragnostic factors.


Role of the new protein complex MCC1 and Scrib in epithelial cells Camille Arnaud1, Jean-Paul Borg1,2 and Patrick Lécine1

1 Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille UMR 599 Inserm, Institut Paoli-Calmettes, Université de la Méditerranée; 2 Faculté de Pharmacie de Marseille

85% of cancers originate from epithelial tissues. Our lab is working on a recently identified mammalian protein family called the LAP (LRR and PDZ) family whose Drosophila orthologs are known to play a role in cell polarity and tumorigenesis.

We identified several partners of Scrib, a LAP protein, by two hybrids in the yeast. Among

them, MCC1 (Mutated in Colorectal Cancer) was reported to be mutated in somatic cells and possibly implicated in sporadic colorectal cancers. We biochemically confirmed its interaction with Scrib and determined the domains responsible for the interaction. Scrib interacts through its four PDZ domains with the carboxy-terminal ESTL motif of MCC1.

MCC1 was previously described to participate in the control of cell cycle. Using BrdU

incorporation assays, we analysed the effects of downregulation or overexpression of MCC1 and Scrib in HeLa and hTERT-RPE1 cells. Our preliminary results seem to implicate MCC1 and Scrib in the control of cell cycle. Further studies are now needed to confirm the role of this protein complex in tumorigenesis.


The serine/threonine kinase LKB1 is a cell polarity protein involved in cell migration

Michael Sebbagh1 and Jean-Paul Borg1, 2

1Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille UMR 599 Inserm, Institut Paoli-Calmettes, Université de la Méditerranée; 2 Faculté de Pharmacie de Marseille.

Epithelial cells have a polarized architecture required for their function as barrier and filter for small molecules. They have an apical membrane in contact with fluids and a basolateral membrane that contacts extracellular matrices at the bottom and forms adherens junctions stabilized by E-cadherin, a cell adhesion molecule, at the lateral membrane.

More than 80% of adult tumors have an epithelial origin and they frequently present an

aberrant cell polarization that is correlated to a loss of E-cadherin expression. Recently, the cell polarity serine/threonine kinase LKB1 was shown to be retained at the adherens junction through an E-cadherin dependent mechanism. LKB1 and E-cadherin are both involved in cell cycle regulation and are lost during tumour progression and metastatic process.

Acquisition of a metastasic phenotype usually results to an increased cell motility. We

hypothesized that loss of LKB1 in tumours may promote increased cell motility. Knock-down of E-cadherin or LKB1 in T47D breast carcinoma cells led to a spontaneous migration assay in Boyden chambers. Currently, we are trying to determine if this effect is controlled by a unique pathway.

CNRS UMR 6020

Université de la Méditerranée Unité des Rickettsies



Caractéristiques génotypiques des primo-infections VIH-1 diagnostiquées en 2005-2006 dans les hôpitaux publics de Marseille.

Amandine Buclez (1,2), Philippe Colson (1,2), Anne Motte (1,2), Isabelle Ravaux (3), Isabelle Poizot-Martin (4), Jacques Moreau (5), Mireille Henry (1,2), Catherine Tamalet (1,2). (1) Laboratoire de Virologie, Fédération Hospitalière de Bactériologie-Virologie Clinique et d’Hygiène, Centre Hospitalier Universitaire Timone, 264 rue Saint-Pierre 13385, Marseille cedex 05 (2) CNRS UMR 6020 IFR48, faculté de Médecine, université de la Méditerranée, 27 boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05 (3) CISIH, hôpital Conception, boulevard Baille, 13 385 Marseille cedex 05 (4) CISIH, hôpital Sainte-Marguerite, boulevard Sainte-Marguerite, 13 009 Marseille (5) CISIH, hôpital Nord, chemin des Bourrelys, 13 915 Marseille cedex 20

Introduction : La primo-infection VIH-1 (PIV), définie par une infection aiguë <6 mois, représente en France 5% des nouveaux diagnostics d’infection. De plus, environ 14% des souches VIH-1 analysées au stade de la PIV portent des mutations associées à la résistance aux antirétroviraux, pouvant influencer la réponse thérapeutique. L'objectif de ce travail a été d’analyser le profil génotypique des séquences VIH-1 obtenues chez des patients au stade de PIV, afin d’étudier la fréquence et la nature des mutations conférant la résistance.

Patients et Méthodes : Analyse rétrospective des profils génotypiques au cours des PIV diagnostiquées dans les hôpitaux publics de Marseille en 2005-2006. Amplification et séquençage de l’ARN VIH-1 plasmatique codant pour 2 enzymes cibles du traitement antirétroviral, la protéase et la transcriptase inverse (TI ; 240 premiers acides aminés) à l’aide de techniques maisons. Le sous-type du VIH-1 groupe M a été déterminé par analyse phylogénétique. Les mutations de résistance sont celles définies par l’ANRS (v.14).

Résultats : Dix-huit PIV ont été diagnostiquées en 2005-2006 , représentant environ 5% des nouveaux diagnostics; sexe ratio H/F= 2,0; âge moyen= 39 ans (21-54). Des séquences VIH-1 ont pu être obtenues chez 15 patients. Elles ont été classées de sous-type B dans 13 cas, C et D dans un cas. Par séquence, en moyenne 3,7 mutation(s) associée(s) à la résistance sont présentes dans la protéase et 0,3 dans la TI. Dans la protéase, 38% des 42 positions amino-acides impliquées dans la résistance sont mutées. Les mutations les plus fréquentes (≥20% des séquences) sont aux positions 10, 35, 36, 37, 41, 60, 62, 63, 77, 93; elles correspondent à des mutations mineures de résistance. Dans la TI, 9,4% des 32 positions amino-acides impliquées dans la résistance sont mutées. Les séquences VIH-1 provenant de 2 patients portent la mutation K103N conférant une résistance croisée aux inhibiteurs non-nucléosidiques de la TI. Une résistance possible à la zidovudine et la stavudine est observée chez un 3ème patient (substitution T215E).

Conclusion : Parmi les patients diagnostiqués au stade de la PIV à Marseille en 2005-2006, 13% ont été contaminés par des virus résistants à une classe d’antirétroviraux, les inhibiteurs non-nucléosidiques de la TI. Cela limite les stratégies thérapeutiques en cas d’indication de traitement antirétroviral, et montre l’intérêt du test génotypique de résistance au stade de la primo-infection. Deux autres patients ont été contaminés par des VIH-1/M non B, les plus répandus en Afrique sub-Saharienne, dont la sensibilité aux antirétroviraux est moins bien connue que celle des virus de sous-type B.


Charge virale sérique et profils génotypiques des infections chroniques par le VHB chez des femmes enceintes en 2006 dans les hôpitaux publics de Marseille.

Christel Pissier (1,2), Patrick Borentain (3), Mireille Henry (1,2), Anne Motte (1,2), Ludovic Cravello (4), Danielle Botta-Fridlund (3), Catherine Tamalet (1,2), René Gerolami (3), Philippe Colson (1,2) (1) Laboratoire de Virologie, Fédération Hospitalière de Bactériologie-Virologie Clinique et d’Hygiène, Centre Hospitalier Universitaire Timone, 264 rue Saint-Pierre 13385, Marseille cedex 05 (2) CNRS UMR 6020 IFR48, faculté de Médecine, université de la Méditerranée, 27 boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05 (3) Service d’Hépato-Gastro-Entérologie, Centre Hospitalier Universitaire Conception, boulevard Baille, 13 385 Marseille cedex 05 (4) Service de Gynécologie-Obstétrique, Centre Hospitalier Universitaire Conception, boulevard Baille, 13 385 Marseille cedex 05

Introduction : Le dépistage du portage de l’antigène de surface du virus de l’hépatite B

(VHB) (AgHBs) est obligatoire en France au 6ème mois de grossesse, et la sérovaccination anti-HBs à la naissance est pratiquée systématiquement chez les nouveau-nés de mères chroniquement infectées (AgHBs-positives). Cette attitude permet de prévenir efficacement l’infection chronique de l’enfant, mais peut être mise en échec si les mères sont fortement virémiques. L'objectif de ce travail a été d’analyser l’ADN VHB sérique chez ces femmes, et le profil génotypique des souches VHB en cas de virémie détectable.

Patients et Méthodes : Quantification de l’ADN VHB sérique chez les femmes enceintes

diagnostiquées AgHBs-positives de janvier à juin 2006 au CHU Conception à Marseille (technique de PCR quantitative en temps réel, Cobas TaqMan Roche). Séquençage des régions de l’ADN VHB codant pour l’AgHBs/la transcriptase inverse à partir du sérum par des techniques maisons. Le génotype VHB a été déterminé par analyse phylogénétique.

Résultats : Seize femmes enceintes d’âge moyen 27 ans (19-38) ont été diagnostiquées

AgHBs-positives. L'ADN VHB sérique était détectable chez 11 patientes (69% ; seuil de détection= 35 copies/ml). La virémie VHB était <500 copies/mL chez 3 patientes, et comprise entre 500 et 105 copies/ml chez 5 patientes. Une virémie très élevée >107 copies/mL a été trouvée chez 3 patientes (19 %).

Trois génotypes VHB ont été retrouvés: D (n=5), A (n=2), et E (n=1). Une patiente était infectée par des VHB portant dans le « déterminant « a » de la région hydrophile majeure de l’AgHBs la mutation G145A. Cette mutation a été précédemment associée à une altération de la reconnaissance de l’AgHBs par des immunoglobulines anti-HBs et à des résultats faussement négatifs de tests diagnostics de détection de l’AgHBs. Les mutations sP135H and sS143L ont également été observées chez respectivement une et 2 autres patientes. Dans la transcriptase inverse du VHB, les mutations V191I et P237T ont été retrouvées.

Conclusion : Près de 20% des femmes enceintes AgHBs-positives ont une virémie VHB très

élevée. Un traitement préventif de la contamination materno-foetale par lamivudine peut être discuté chez ces patientes. L’impact potentiel des mutations de l’AgHBs sur le succès de la séro-vaccination chez l’enfant est un argument pour réaliser un dépistage du VHB en même temps que celui des anticorps anti-HBs au cours du suivi de l’enfant.


IDENTIFICATION OF A PHYLOGENETIC CLUSTER OF CORYNEBACTERIA IN CYSTIC FIBROSIS PATIENTS

Carole Cassagne, Didier Raoult, and Jean-Marc Rolain* Unité des Rickettsies, CNRS UMR 6020, IFR 48, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de la Méditerranée, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05, France.

In Cystic Fibrosis (CF), the main cause of morbidity and mortality remains lung obstruction due to inflammation and infection. Sequencially, CF lung is colonized by various bacteria with Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia being the more common recovered pathogens. In this study we report 6 cases of CF patients eventually colonized or infected with Corynebacteria.

The sputa were collected from children and adults CF patients in two reference center at Marseille (France). Nine Corynebacteria were isolated from six children sputum samples (mean age : 5,99 +/- 5,4 years) and none from adults. Among the Corynebacteria isolated, six were associated with symptoms whom the major was cough. In four sputum samples, other pathogens were isolated including S.aureus, Enterobacter faecalis or fungi. Three patients were reinfected by a Corynebacteria after 11 months, 2,5 months and 9 days.

The strains were all sensitive to β-lactamin, rifampicin, gentamicin, doxycycline,

cotrimoxazol and all were resistant to erythromicin except one. All the strains were identified by phenotypic methods (Api Coryne database system 2.0) and by 16SrRNA and partial rpoB gene sequencing retained as the more accurate genotypic identification as recommended by Lascola et Al. Eight Corynebacteria belong to the Corynebacterium pseudodiphtericum/propiquum cluster with a confidence level >98%. The last strain could not be identified correctly by gene sequencing and may represent a new Corynebacterium species (similarity < 95,9 %).

Bacteria of the genus Corynebacterium were never reported in CF patients probably because these bacteria are usually considered as contaminant of culture of sputum samples. Corynebacteria retrieved from CF patients clustered in C. Pseudodiphericum/propinquum subgroup and one strain may represent a new species of this cluster. Furthermore different closely related Corynebacteria were isolated during time in the same patient suggesting a mixed colonization and/or infection. The significance of the isolation of these bacteria known to cause various pulmonary diseases and being a part of the normal microflora of the higher respiratory tract; remain unclear but may contribute to the progression of the disease. Epidemiological and clinical studies are warranted to define the role of these bacteria in the progression of CF disease.


Molecular mechanisms of resistance to antibiotics in Bartonella bacilliformis

Silpak Biswas, Didier Raoult, and Jean-Marc Rolain* Unité des Rickettsies, CNRS UMR 6020, IFR 48, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de la Méditerranée, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05, France.

Objectives: Bartonella bacilliformis is the etiological agent of Carrion’s disease. Although ciprofloxacin, rifampicin and erythromycin have been successfully used in the treatment of the disease, failures and relapses have been reported. The objective of our study was to select in vitro mutants resistant to antibiotics in order to determine the frequency of mutations and to characterize the mechanism of resistance at the molecular level.

Methods: Antibiotic-resistant mutants were selected by serial passages of bacteria on blood

agar plates containing antibiotics. Candidate genes involved in resistance were amplified and sequenced and compared to look at mutations associated with antibiotic resistance.

Results: Ciprofloxacin, rifampicin, and erythromycin-resistant mutants were obtained after 5,

3, and 4 passages, respectively. Conversely, no mutant was obtained with either gentamicin or doxycycline even after 16 passages. The ciprofloxacin mutant contained an amino acid change at position 87 (Asp → Asn) in its Quinolone Resistant Determining Region of the DNA gyrase protein whereas the rifampicin-resistant strain had an amino acid change at position 531 (ser → phe) in the Rifampicin Resistant Determining Region of the rpoB gene. Similarly, erythromycin-resistant mutant showed an A2058G mutation in the 23S rRNA gene.

Conclusion: According to the current knowledge for the treatment of human bartonellosis,

we believe that doxycycline in association with gentamicin may be the preferred regimen for the treatment of the acute and eruptive stage of Carrion’s disease but clinical trials are warranted to support our findings.


Evaluation of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis by 23S rRNA quantification by real time PCR

Alexandre Toro, Didier Raoult, and Jean-Marc Rolain* Unité des Rickettsies, CNRS UMR 6020, IFR 48, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de la Méditerranée, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05, France.

Mycobacterium tuberculosis is a major human pathogen responsible annually of 2 millions of death worldwide. Emergence of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains within the last few decades has made rapid detection of these strains essential for the effective clinical management of patients. Rapid detection of resistance to rifampin is important since it is regarded as a marker for multi-drug resistant tuberculosis and is associated with poor clinical outcome. In this study we propose to quantify 23S ribosomal RNA after reverse transcription in a real-time quantitative PCR assay for antimycobacterial susceptibility testing with faster results than conventional assays.

Six strains of M. tuberculosis were used for determination of rifampin activity by a

quantitative RT-PCR targeting the 23S rRNA gene. Reverse transcription and cDNA amplification were realized using the Kit Super Script III Platinum One-step quantitative RT-PCR (Invitrogen) in a LightCycler instrument for quantification using primers and Taqman* probe targeting the 23s RNA gene.

In conclusion, this is the first report on the use of quantitative real-time PCR after reverse

transcription for antituberculosis drug susceptibility testing. Our results showed that this method requires only 2 days from the setup of the testing to the final results for rifampin and was found to provide excellent agreement with standard methods. We should extend this method with other clinically relevant isolates and other major antituberculous agents including isoniazid, ethambutol, and streptomycin. An early and more detailed detection of antibiotic resistance in M. tuberculosis can improve the treatment outcome and reduce the spread of resistant tuberculosis.


Comparison of Phenotypic and Genotypic Methods for Identification of Bacteria in Sputa from Cystic Fibrosis Patients

Fadi Bittar, Didier Raoult, and Jean-Marc Rolain* Unité des Rickettsies, CNRS UMR 6020, IFR 48, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de la Méditerranée, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05, France.

Objectives. There is strong evidence that culture-based methods detect only a small proportion of bacteria present in the respiratory tracts of cystic fibrosis (CF) patients. In addition, classical methods for identification of bacteria in such patients lack sometimes accuracy. The objectives of this study were (i) to compare standard microbiological culture and phenotypic identification to molecular methods by use of 16S rRNA amplification, cloning and sequencing and (ii) to describe new or emerging pathogens in CF patients.

Methods. Sputa from CF patients (adults and children) were collected over a period of 2

months. Sputa were cultured with standard agar plates including: chocolate Poly ViteX, ANC, MacConKey, Cepacia, blood and mannitol salt agar according to our laboratory guidelines. DNA from these sputa was extracted using MagNaPure LC machine. A 1000 pb sequence of 16S r RNA gene was amplified using primers previously described and PCR products were cloned in a pGEM-T Easy vector. A total of 24 to 40 clones were collected per sputum and sequenced using an ABI 3130 automated sequencer.

Results. Twenty-five sputa from CF patients [9 adults (>= 18 years) and 16 children (< 18

years)] were studied. Staphylococcus aureus was the most frequent recovered bacteria from culture in both children and adult patients (35% and 38% respectively). Pseudomonas aeruginosa was only detected in adult’s patients (23%). Seven isolates had unacceptable profile with standard API system. The correct identification of these isolates was done after direct sequencing of 16S rRNA gene and also after cloning. For molecular cloning and sequencing analysis, we have obtained and sequenced 760 clones in 25 sputa. Among these 760 clones, 53 different bacterial species were identified including 30% of anaerobes (16 species/ 53). New bacteria not reported in CF patients was detected like Dolosigranulum pigrum and Dialister pneumosintes. The median number of species per sputum was 7,2 ± 3,9. Identical results between culture and molecular data were observed in 54.5% of cases. Discrepancies were documented, including: a positive molecular analysis and negative culture in 7 cases (antibiotic treatment was found in these patients) and 7 false-negative molecular analysis due to the bias of cloning. Misidentification was also observed for 7 bacteria.

Conclusions. Our molecular results demonstrate the complex microbial community in sputum

of CF patients and indicate that misidentification of all bacteria was frequent. Moreover, our study demonstrates that new or emerging bacteria such as D. pigrum, D. pneumosintes and Inquilinus limosus may be detected in these patients.


Resistance of Tropheryma whipplei to cotrimoxazole : implication of mutations in DiHydroPteroate Synthase (DHPS)

Nawal Bakkali, Didier Raoult, and Jean-Marc Rolain* Unité des Rickettsies, CNRS UMR 6020, IFR 48, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de la Méditerranée, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05, France.

Le traitement empirique recommandé pour la maladie de Whipple est l’administration du cotrimoxazole (trimethoprime/sulfamethoxazole) pendant une durée d’au moins 1 an, précédé par l’administration de streptomycine et de pénicilline G pendant 2 semaines. Cependant de nombreuses rechutes et/ou échecs thérapeutiques ont été rapportés avec cette stratégie thérapeutique. L’isolement et la culture de cette bactérie a été réalisé pour la première fois en 2000 dans notre laboratoire ce qui a permis d’une part d’évaluer la sensibilité in vitro des antibiotiques et d’autre de réaliser le séquençage complet de son génome. In vitro Tropheryma whipplei est sensible à de nombreux antibiotiques y compris le cotrimoxazole. L’analyse du génome de cette bactérie a cependant montré que la cible du triméthoprime, la DiHydroFolate Reductase (DHFR), était absente du chromosome bactérien suggérant que seul le sulfamethoxazole possédait une activité antibactérienne par inhibition de la DiHyfroPteroate Synthase (DHPS), cible de cet antibiotique. Ceci a pu être confirmé par la suite in vitro suggérant que le traitement recommandé consiste en une monothérapie. De ce fait, la sélection de mutants résistants au sulfamethoxazole (mutations au niveau du gène DHPS) est probable et doit pouvoir expliquer les échecs et rechutes observés au cours du traitement.

Les objectifs de ce travail sont de caractériser le gène de la DHPS dans les isolats cliniques et

les PCR positives de patients en échec thérapeutique et de démontrer par complémentation d’E. coli KO-DHPS que les mutations associées dans ce gène confèrent la résistance aux sulfamides.

L’obtention des séquences du gène DHPS à partir du génome entièrement séquencé nous a

permis de désigner des amorces de PCR permettant d’amplifier le gène DHPS pour 6 autres souches cliniques et chez deux patients en échec thérapeutique. Nous montrons en particulier l’existence chez un patient en échec thérapeutique de 3 mutations au sein de ce gène conférant une modification de la séquence protéique. Plus précisément, la mutation V56I qui est localisée dans une région très conservée de cette protéine a été retrouvée chez un patient et d’autres séquences sont actuellement en cours d’étude au laboratoire.

Afin de démontrer que cette séquence mutée suffit à conférer la résistance au

sulfaméthoxazole, nous avons amplifié et cloné dans un vecteur d’expression de type pIVEX2.3d les séquences sauvages et mutées de ce patient. Les constructions plasmidiques ainsi réalisées sont utilisées pour complémenter deux souches d’E. coli knock-out pour le gène DHPS. Dans cette étude nous voulons démontrer que l’échec thérapeutique après un long traitement par le cotrimoxazole est dû à la sélection d’isolats résistants ayant des mutations dans le gène de la DHPS.

La complémentation va nous permettre de prouver cela. La détermination du mécanisme de

résistance est primordiale pour mettre au point un traitement optimal pour cette maladie.

EA 864

Université de la Méditerranée Pharmacogénétique des Maladies Parasitaires


ANTIPLASMODIAL ACTIVITY OF ALKALOIDS ISOLATED FROM STEPHANIA ROTUNDA

Aun CHEA(1) , Sotheara HOUT(2), Sok Siya BUN(1), Monique GASQUET(2), Michèle LAGET(3), Nadine AZAS(2), Riad ELIAS(1), Guy BALANSARD(1)

(1) Laboratoire de Pharmacognosie, (2) Laboratoire de Parasitologie, (3) Laboratoire de Microbiologie, Faculté de Pharmacie, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 5, France

The ethnobotanical survey carried out in 9 regions of Cambodia between 2002 and 2005 led to reveal the use of tuber of Stephania rotunda Lour (Menispermaceae) in traditional medicine for the treatment of malaria. Bioassay-guided fractionation led to isolate 14 alkaloids by using chromatography methods. The structural elucidation by spectroscopic methods (one-dimensional experiments: 1H- and 13C-NMR spectra and two-dimensional experiments: COSY, HMQC and HMBC) allowed to identify 8 known alkaloids: dehydroroemerine, tetrahydropalmatine, roemerine, isocorydine, corydalmine, cepharanthine, stepharine and coclaurine. Amongst the known alkaloids, cepharanthine was described in this plant for the first time. The structures of 6 other alkaloids are under elucidation.

NO

OCH3

H3CN

12

7

9

3

1

4

8a

11

564a

10

13

8

14 15

12'

1'

15'

11'

8a'

9'

14'

13'

8'

10'

7'

4a'5'

6'4'

3'

CH3

O

O

OH3CO

Cepharanthine displays an in vitro activity on a chloroquine resistant Plasmodium falciparum strain (W2) with IC50 = 0.61 µM. The cytoxicity assays on human monocytic THP1 cells showed an IC50 =10.3 µM and a selective index of cepharanthine is around 16. This antiplasmodial activity has been confirmed in vivo during assays carried out in mice experimentally infected by Plasmodium berghei. An oral administration dose of 10 mg/Kg during 4 days results in decreasing of 50 % parasitemia of treated mice compared to controls. Synergistic effect has been found by association of cepharanthine with other antimalarial agents (chloroquine, artesunate) and other alkaloids isolated from Stephania rotunda. Isobologramme shows an additive effect with artesunate and a synergistic effect with chloroquine and other alkaloids. This result is in agreement with the use of this plant in Cambodian traditional medicine for the treatment of malaria.


Antiprotozoal and cytotoxic triterpenoid saponins from the roots of Cephalaria gigantea

N. Tabatadze(1), R. Elias(2), F. Delmas(2), C. Di Giorgio(2), M.C. Pauw-Gillet(3), G. Dekanosidze(1), E. Kemertelidze(1), L. Angenot(4), G. Balansard(2)

(1) Institute of Pharmacochemistry, Academy of Sciences of Georgia, 36, St. P. Sarajishvili, 0159 Tbilissi, Georgia (2) Laboratory of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy, Université de la Méditerranée, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 5 France (3) University of Liège, Institute of Chemistry (B6c) Laboratory of Histology-Cytology (GIGA-CRPSNS), B.4000 Liège 1 (Sart-Tilman), Belgium (4) University of Liège, Faculty of Pharmacy, Laboratory of Pharmacognosy, B-4000 Liège 1 (Sart-Tilman), Belgium

Cephalaria gigantea (Led.) E. Bobr. (Dipsacaceae) is an endemic plant of Caucasus growing

in Georgia [1]. The roots of this plant contains a large amount of triterpene saponins. It had been used in traditional (folk) medicine as sedative and anti-inflammatory remedy [1]. 11 triterpene glycosides have been isolated from the roots and their structures were determined by chemical and spectroscopic methods [2-3].

Antiprotozoal and cytotoxic activities of two monodesmosides : giganteoside D and E, their mixture 50/50 and crude saponins extract have been studied. Antiprotozal activities has been determined against Leishmania infantum promastigotes and Trichomonas vaginalis. The most active against Trichomonas vaginalis was giganteoside E (IC50 2.5-5 µg/ml). The sinergism of activity has been found in the case of a mixture of D and E (50/50) (IC50 1-2.5 µg/ml).

R1O

COOH

CH2R2

1

3 27

17

12

20

22

2930

25

28

24

Glycosides R1 R2Giganteoside D Rhap(1 2) Xylp H Giganteoside E Rhap(1 2)Rhap(1 2)Xylp(1 2)Arap OH

Cytotoxic activity of monodesmosides of Cephalaria was investigated in vitro using three cancer cell lines, namely, mouse pigmented B16 melanoma, human non pigmented melanoma MEL-5 and human leukemia HL-60. Giganteosides D and E showed interesting antiproliferative effect on human cell lines with IC50 values in the range 3.15-7.5 µM. References 1. Rastitelnie resursi SSSR, Leningrad, ed. by Nauka, 1990, 30-31. 2. Tabatadze N.A., Zviadadze L.D., Dekanosidze G.E., Kemertelidze E.P., Georgia Chemical Journal, 2003, 3, 156-157. 3. Tabatadze N., Mshvildadze V., Dekanosidze G., Sviadadze L., Elias R., Ollivier E., Faure R., Balansard G., Bull. Georg.

Acad. Sci., 2005, 171, 265-268.



ÉTUDE DE PLANTES ISSUES DE LA MEDECINE TRADITIONNELLE UTILISEE CONTRE LE PALUDISME AUX COMORES

Ali MOHAMED KAOU(1), Valérie MAHIOU(1), Nadine AZAS(2), Monique GASQUET(2), Sidi AÏNOUDDINE(3), Saïd HASSANI(3), Ibrahim YAHAYA(3), Guy BALANSARD, Pierre TIMON-DAVID, Collaboration technique : Gilbert BOUDON

1 Laboratoire de pharmacognosie, Faculté de Pharmacie, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05. 2 Laboratoire de parasitologie, Faculté de Pharmacie, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05. 3 Centre National de Documentation et de Recherches Scientifiques (CNDRS), Moroni Comores.

L’Union des Comores, a fait de la lutte contre le Paludisme une priorité compte tenu de son

ampleur. C’est un petit pays avec un faible niveau de vie et un accès aux soins de santé moderne difficile. L’indice plasmodique, pourcentage des sujets porteurs du parasite, en saison de pluie varie de 19 à 60 % selon les localités. Le taux d’hospitalisation pour cause de paludisme est de 69 % avec un taux de mortalité de 25 % chez les enfants de moins de 5 ans. La chimiosensibilité de P. falciparum à la chloroquine a montré un taux d’échec thérapeutique précoce de 19 %. C’est pourquoi les plantes antipaludiques utilisées traditionnellement constituent un des meilleurs recours pour la population.

Dans le cadre de la recherche sur les plantes antipaludiques, en collaboration avec le Centre National de Documentation et de Recherches Scientifiques des Comores (CNDRS), nous avons effectué deux enquêtes ethnobotaniques sur le terrain. Dans la première, nous avons sélectionné onze plantes utilisées en médecine traditionnelle dans le traitement du paludisme et des maladies parasitaires. Ces plantes, après extraction par des solvants de différentes polarités, ont subi des tests de screening sur Plasmodium falciparum afin de sélectionner celles qui présentent une activité antiplasmodiale in vitro et donc un intérêt pour une étude phytochimique. Une deuxième enquête a été réalisée en complément sur l’utilisation des deux plantes les plus actives dans les tests biologiques.

L’étude phytochimique des deux plantes sélectionnées, Flueggea virosa et Piper capense, nous a

permis par un fractionnement bioguidé, d’isoler des composés des deux extraits les plus actifs. Les structures de ces composés ont été réalisées par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et Spectrométrie de Masse (SM). Certaines sont en cours de détermination. L’activité de ces composés a été testée sur Plasmodium falciparum.

1. ADJANOHOUN,E.J. Contribution aux études éthnobotaniques et floristiques aux Comores, ACCT Paris 1983. 2. AZAS N, et al., Parasitol res. Ss., 2002,165-171. 3. VAN DER HEYDER HC et al. Clinical and Diagnostic Laboratory immunology., 1995. 2(4),417-425 4. NYASSE B, NONO J, SONKE B, Pharmazi 59, 2004, 492-494

EA 1734

Université de la Méditerranée Biogénotoxicologie et Mutagenèse Environnementale



MICROCALORIMETRY AS A TOOL FOR Cr VI TOXICITY EVALUATION TO HUMAN DERMAL FIBROBLASTS

W. LIU , F. CHASPOUL , D. BERGE LEFRANC , L. DECOME , P. GALLICE Laboratoire PRNT- EA 1784-IFR PMSE 112

Although exposure to Cr VI is mostly associated with bronchial asthma and lung cancer, it

may also cause deep ulcerations of skin and nasal mucosa. Also Cr VI has shown to be responsible for allergic contact dermatitis. Numerous works have pointed out to multiple possible targets of Cr VI toxicity. Despite recent progress in the understanding of Cr VI toxic potential, the specific mechanisms of Cr VI-induced toxicity are not entirely elucidated.

However, it appears that recognized cytotoxic, mutagenic and carcinogenic potentials of Cr

VI are associated with complex cellular. Because microcalorimetry has been shown to be a suitable tool to study the global cellular metabolic pathways by measuring the heat production associated to it, we attempted to evaluate cellular heat production as a reflect of Cr VI toxicity in the present study. The heat production of suspended human dermal fibroblasts was measured by isothermal flow microcalorimetry. In control cells, the normal heat production was 15 ± 5 pW/cell. This heat production was found to be independent of age.

Whatever the Cr VI concentration tested (0 to 500 µM), the heat production is completely

inhibited, over time period from 4 hours (500 µM) to 22 hours (20 µM). This result can be associated to death of cells. To quantify this phenomenon, the corresponding energy was determined as function of Cr VI concentration. Using integrated areas of energy, a 50% decrease was induced by a 30 µM concentration of Cr VI. In an attempt to relate this result with classical cellular toxicity assay, cell viability was performed with the WST-1 test. This test is based on the cleavage of the tetrazolium salt WST-1 by mitochondrial dehydrogenase in viable cells. The Cr VI concentration that inhibited 50% viable cells was 30 µM.

Our results showed that microcalorimetry could be an efficient tool for the primary Cr VI

cytotoxic studies on living cells. This metal alters the cellular bioenergetic leading in fine to the cellular death. Additional experiments are required to elucidate the nature and/or extent of this effect. Our results suggest a mitochondrial alteration, and studies on oxygen consumption are needed.

Laboratoire de Synthèse et Etude de Substances Naturelles

à Activités Biologiques


Conception and Pharmacological Evaluation of Aminosterols Analogues of Squalamine

LONCLE Céline

Laboratoire de Synthèse et Evaluation de Substances Naturelles à Activités Biologiques Case 342, Faculté de Saint Jérôme, Université Paul Cézanne Avenue Escadrille Normandie Niémen 13397 Marseille, Cedex 20 - Courriel : [email protected]

Squalamine is a 5α-hydrido-7α-hydroxyl-24sulphated cholestane steroids conjugated to spermidine at C-3β. This molecule isolated from the dogfish Squalus acanthias, presents numerous biological activities such as: angiogenesis inhibitor, antitumor agent, anticancer agent (lung, ovarian and prostate), appetite suppression, antifungal and antibacterial activities. Due to these antimicrobial activities, squalamine pertains to a new family of antibiotic. Nevertheless, its low concentration in animal (10ng/g of liver) does not permit industrial

extraction. Moreover, chemical synthesis remains expensive by requiring numerous steps (11 for 19 steps) with overall yields varying from 0.3% and 19%. Thus, the synthesis of analogues seems to be one of the most promising solution.

NH2 H

H2N

NH3+OSO3

OH+

-

+

In our laboratory, we have prepared two different families of analogues: 6-aminosterols and

7-aminosterols. These synthesis involve a new titanium (IV) reductive amination method key step permitting the totally diastereoselective preparation of such derivatives in excellent yields. Herein, we will report and discuss the antimicrobial activities of such compounds against various non resistant and resistant strains.



STEREOSELECTIVE SYNTHESIS AND ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF NEW SQUALAMINE AMINO AND POLYAMINOSTEROLS ANALOGUES

Chanaz SALMI

Université Paul Cézanne. Faculté de Saint Jérôme. Lab. de Synthèse et Etude de Substances Naturelles à Activités Biologiques (SESNAB), service 342, Av. Escadrille Normandie-Niemen, 13397 Marseille Cedex 20. France. [email protected]

The increase in infections caused by multidrug-resistant nosocomial pathogens encurged the development of new antibiotic classes. Recently, a new aminosterol called squalamine has been isolated from the dogfish shark, Squalus acanthias and has been the focus of a great deal of attention. This natural water soluble cationic steroid displays potent antimicrobial activities against fungi, protozoa and both Gram-negative and positive bacteria. Subsequent studies have shown it to exhibit also a potent antiangiogenic activity preventing the formation of blood vessels during the development of the malignant tumours and is actually under phase II clinical trials in chemotherapy (1). This amphiphilic steroid is a 7,24-dihydroxylated, 24-sulfated cholestane conjugated to spermidine at C-3.

OSO3-

OHNH

NH

NH2SquaIamine

+

+

+ However feasibility to obtain large quantities of this antibiotic, from natural source or by

synthesis, appears challenging. In order to understand the structure-activity relatationships of such compounds, we have recently developped a new stereoselective titanium reductive amination reaction applied to the synthesis of structural analogues of squalamine from 5α-cholestan-3-one (2).

R'

RHN

R'

OOH OH

R' =

RNH2+Ti(Oi-Pr)4 (1.5 equiv.)

MeOH, NaBH4 (1 equiv.)

Thus, new various amino and polyamino (spermine and spermidine) sterols were obtained through this efficient procedure. These aminosterol derivatives are obtained with a total stereoselectivity and in good chemical yields varying from 50 to 98% depending on the nature of the considered amine. Some of these compounds possess a broad –spectrum of activity against Gram-positive bacteria comparable to that of Squalamine, except against Gram-negative bacteria and these results will be discussed. In addition, some molecules exhibit fungicidal activities towards resistant strains of Candida. 1. Brunel, J.M.; Salmi, C.; Loncle, C.; Vidal, N.; Letourneux, Y. Curr Cancer Drug Targets 2005, 5, 267-272. 2. Salmi, C.; Letourneux, Y.; Brunel, J. M. Lett. Org. Chem. 2006, 3,396-401.



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Faculté de Pharmacie de Marseille - pharmacie.univ … · paclitaxel) have significant consequences on cell response to the following drug (i.e vinflunine). Especially, this study