UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA

Faculte des Sciences et Technologie

et des Sciences de la Matiere

Département Sciences de la Matière

Mémoire

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Sciences de la Matière Filière : Chimie

Spécialité : Chimie Appliquée

Presenté par : ZARROUR Brahim

Thème

Soutenu le 27/06/2012

Devant le jury composé de :

Mme DEHAK Karima MC (B) université Ouargla Président Melle HAMMOUDI Roukia MA (B) université Ouargla Examinateur M HADJ-MAHAMMED Mahfoud Professeur université Ouargla Rapporteur Mme BOUZIANE Mebarka MA (A) université Ouargla Co- Rapporteur

Année Universitaire 2011-2012

Etude phytochimique de quelques extraits obtenus de le plante Matricaria pubescens (Astéracéas) et

évaluation de leur activité antioxydante

N° d’ordre : N° de série :

Remerciements Ce travail a été réalisé au laboratoire de Biogéochimie des Milieux Désertiques, sous la direction de Monsieur HADJ-MAHAMMED Mahfoud professeur et de Madame BOUZIANE Mebarka, Maître assistant classe A, à l’université Kasdi Merbah Ouargla, qu’ils trouvent ici l’expression de mes remerciements, mon profond respect et sincères considérations pour leurs orientations, encouragements et leur soutien pour faire aboutir ce travail de recherche à son terme.

Je remercie Mme DEHAK Karima, Maître de conférences classe B à l’université Kasdi Merbah Ouargla, pour l’honneur qu’elle me fait en acceptant de présider le jury de ce mémoire.

Je remercie également Melle Hammoudi Roukia, Maître assistant classe B à l’université Kasdi Merbah Ouargla d’avoir accepté d’examiner mon travail.

Les remarques et conseils de tous les enseignants de post-graduation de l’université de Ouargla m’ont été d’un grand apport et soutien, qu’ils trouvent ici l’expression de mon profond respect et grande considération.

J’adresse mes remerciements et ma reconnaissance à tous les enseignants, étudiants et travailleurs de l’université de Ouargla et de l’université de Annaba, qui ont contribué de près ou de loin à ma formation pédagogique et scientifique.

Je ne saurais oublier tous ceux et celles qui m’ont marqué par leur soutien et encouragements : tous les membres de notre laboratoire et tous les collègues de ma promotion, je leur exprime mon respect et ma profonde sympathie.

Résumé

Au cours de cette étude, les polyphénols totaux contenus dans la plante Matricaria pubescens ont été extraits par trois méthodes en utilisant les mélanges : methanol/eau 80:20 acétone/eau 80:20 et l’eau 100%, et quantifiés par spectrophotométrie UV-VIS en présence du réactif Folin-Ciocalteu. Quand aux flavonoides, l’estimation de leur quantité a été faite par la même spectrophotométrie en présence de AlCl3. Les teneurs les plus importantes ont été obtenues pour l’extrait hydroacoolique : 28 µg EAG/mgExt pour les polyphénols totaux et16,12 µg EQ/mgExt pour les flavonoides L’activité antioxydante des extraits préparés a été mesurée par deux méthodes. La première qui utilise le radical libre 1, 1-diphényl-2 - picrylhydrazyle (DPPH) et le FRAP a été la deuxième méthode en utilisant TPTZ. Les extraits hydroalcooliques, hydroacétonique et l’extrait aqueux ont montré respectivement les pourcentages d’inhibition 42% 10,81% 17,07% par la méthode DPPH.

Mots clés : Matricaria pubescens, polyphénols, flavonoides, activité antioxydant. Abstract

In this study, total polyphenols contained in the plant Matricaria pubescens were extracted by three methods using the following mixtures; methanol/water 80: 20 acetone-water 80: 20 and 100% water; and quantified by uv-vis spectrophotometry in the presence of Folin-Ciocalteu reagent. The estimate of flavonoids quantities was made in the presence of AlCl3 by the same spectrophotometry. The most important levels were obtained for the hydroacoolique extract: 28 µg EAG/mgExt of total polyphenols and16,12 µg EQ/mgExt of flavonoids. Antioxidant activity of the prepared extracts was measured by two methods. The first one use the free radical 1, 1-diphenyl-2 - picrylhydrazyle (DPPH) and FRAP was the second method which use TPTZ. Hydroacoolique, hydroacetonique and aqueous extracts showed respectively 42% 10,81% 17,07% by DPPH method.

Key words : Matricaria pubescens, polyphénols, flavonoides, antioxydant activity.

الملخصبواسطة ثالثة Matricaria pubescens من نبات الكلي تالبولیفینوال محتوى تم استخراج وقیاس، في ھذه الدراسةوالقیاس الطیفي باألشعة الفوق %100والماء 20:80الماء :األسیتون 20:80الماء : المیثانول طرق من مخالط محالیل

القیاس الطیفي بواسطة یداتنووعند قیاس الكمیة المقدرة الفالفو Folin-Ciocalteu ف شبنفسجیة المرئیة في حضور كاوھي ماءونویدات في مستخلص المیثانول الالفوالف توقد تم الحصول على أكبر قیمة للبولیفینوالAlCl3 نفسھ في وجود كاشف

. µg EQ/mgExt 16.12و µg EAG/mgExt 28,00على التوالي DPPHالفعالیة المضادة لألكسدة للمستحلصات المحضرة تم حسابھا بطریقتین في األول باستعمال الجذر الحر

1,1diphényl-2-picrylhydrazyle وطریقةFRAP كانت الطریقة الثانیة باستعمال .TPTZ %17.07% 10% 42 على التوالي نسب المؤویةال ھذه الكحول مائي واألستون مائي والماء الثالثة وأظھرت المستخلصات

. µgEAA / mgExt 0,33 1,12 1,25و DPPHمن خالل طریقة .، النشاطیة المضادة لألكسدةیداتنوالفالفوت، البولیفینوال ،Matricaria pubescens :الكلمات المفاحیة

SOMMAIRE Liste des abréviations Liste des tableaux Liste des Figures Introduction

Partie Bibliographique Chapitre I : I- Présentation de la plante étudiée

I-1- Présentation de la plante étudiée 1

I-2- L'utilisation traditionnelle de la plante 2

Chapitre II : Les composés phénoliques et les flavonoïdes

II-1-Présentation sur les polyphénols 3

II-2- Structure et catégories des composés phénoliques 3

II-3-Biosynthèse des composés phénoliques 4

II-4-Les flavonoïdes 8

II-4-1- Présentation sur les flavonoïdes 7

II-4-2- Structures et classification des flavonoïdes 8

II-5- Biosynthèse des flavonoïdes 12

II-6-Propriétés biologiques 15

II-6-1- Propriétés biologiques des composés phénoliques 15

II-6-2- Propriétés biologiques des flavonoïdes 16

Chapitre III : Antioxydants

III-1- Radicaux libres et stress oxydant 17

III-2- Antioxydants naturels 17

III-2-1- Classification des antioxydants par rapport à leur mécanisme d’action 18

III-2-2- Classification des antioxydants suivant la nature chimique 19

Exemples d’antioxydants d’origine naturelle 20

Exemples d’antioxydants synthétiques 21

III-3- Mécanisme d’action 22

III-3-1- Mécanisme d’action des polyphénols contre les ROS 22

III-3-2- Mécanisme d’action des flavonoïdes contre les ROS 22

III-3-2- a- Capture directe des radicaux libres 23

III-3-2- b- Capture des cations métalliques 23

Partie Expérimentale Chapitre IV : Matériel et méthodes IV-1 - Matériel végétal utilisé 24 IV-2 – Méthodes d’extraction 24 IV-3-Analyses chromatographiques 28

IV-3-1- Chromatographie analytique sur couche mince (CCM) 28 IV-3-2- Chromatographie sur papier (CP) 29 IV-4-Étude quantitative 30 IV-4-1-Dosage des phénols totaux 30 IV-4-2-Dosage des flavonoïdes 31 IV-5-Étude de l’activité antioxydant e 32 IV-5-1-Méthode DPPH (2.2’-diphényl-1-picrylhydrazyl) 32 IV-5-2-Méthode FRAP (Ferric reducing antioxidant power) 33 Chapitre V : Résultats et discussion V-1-Extraction des composés phénoliques 34 V-2- chromatographie analytique 35 V-2-1-Chromatographie sur couche mince 35

a- Résultats de séparation par CCM sur polyamide 35 b-Résultats de séparation par CCM sur gel de silice 36 c-Résultats de séparation sur plaque de cellulose 38

V-2-2-Chromatographie analytique sur papier 38 a- Résultats de séparation par CP 40

V-3-Quantification des composés phénoliques 41 V-3-1-Dosage des phénols totaux 41 V-3-2-Dosage des flavonoïdes 43 V-4-Activité antioxydant des composés phénoliques 45 V-4-1-Evaluation de l’activité antioxydant (test du DPPH) 45 V-2- Evaluation de la réduction du fer (FRAP) 47

Conclusion Références bibliographiques

Liste des tableaux

Tableau 1 : Classification systématique de la plante 1

Tableau 2 : quelques classes des polyphénols 3

Tableau 3 : Principales classes de flavonoïdes 9

Tableau 4 : Distribution alimentaire des principales classes de flavonoïdes 11

Tableau 5 : Activités biologiques de quelques composés phénoliques 16

Tableau 6 : Quelques composés phénoliques à activité antioxydant dans les épices 21

Tableau 7 : Structures de quelques antioxydants synthétiques 21

Tableau 8 : Couleurs et rendements des extraits phénoliques obtenus 34

Tableau 9 : Résultats de séparation par CCM polyamide 36

Tableau 10 : Résultats de séparation par CCM sur gel de silice 1er élution 37

Tableau 11 : Résultats de séparation par CCM sur gel de silice 2eme élution 37

Liste des figures

Figure 1: Photo de la plante Matricaria pubescens 2

Figure 2 : La biosynthèse des composés phénoliques voie de shikimate 6

Figure 3 : La biosynthèse des composés phénoliques voie de phénylalanine 7

Figure 4 : Structure de base des flavonoïdes 8

Figure 5 : La biosynthèse des flavonoïdes illustrant les voies de l'acétyle CoA et de la

phénylalanine

13

Figure 6 : Illustration les différentes réactions enzymatiques conduisant aux

principales classes de flavonoïdes

14

Figure 7 : Les systèmes de défense contre les radicaux libres 19

Figure 8 : sites de chélations des flavonoïdes (quercétine) 23

Figure 9 : Les étapes d’extraction des polyphénols par le MeOH (80%) 25

Figure 10 : Les étapes d’extraction des polyphénols par l’acétone (80%) 26

Figure 11 : Les étapes d’extraction des polyphénols par H2O 27

Figure 12 : Forme libre et réduite du radical DPPH 32

Figure 13 : Réduction du Fe+3-TPTZ en Fe+2-TPTZ 33

Figure 14 : Plaque CCM sur une phase stationnaire de polyamide

à 254 nm et 365 nm

35

Figure 15 : chromatogramme de Aq sur plaque de polyamide20*20 36

Figure 16 : Chromatogramme de A sur plaque de cellulose à 365 nm 38

Figure 17 : Chromatogramme de D sur plaque de cellulose à 365 nm 38

Figure 18 : Chromatogramme de Aq sur plaque de cellulose à 365 nm 39

Figure 19 : Chromatogramme de A sur papier wathman à 365 nm 39

Figure 20 : Chromatogramme de D sur papier wathman à 365 nm 40

Figure 21 : Chromatogramme de Aq sur papier wathman à 365 nm 40

Figure 22 : Courbe d’étalonnage des phénols totaux 41

Figure 23 : Teneurs en polyphénols totaux dans les extraits étudiés 42

Figure 24 : Courbe d’étalonnage des flavonoïdes totaux 43

Figure 25 : Teneure en flavonoïdes dans les extraits préparés 43

Figure 26 : Courbe d’étalonnage de l'acide ascorbique 45

Figure 27 : L'activité antioxydant dans les extraits étudiés 45

Figure 28 : Pouvoir réducteur de l’acide ascorbique par la méthode FRAP 47

Figure 29 : Pouvoir réducteur de l’acide ascorbique par la méthode FRAP 47

Liste des abréviations

A: Extrait méthanolique

D: Extrait hydrocétonique

Aq: Extrait aqueux

AcOH : Acide acétique

BAW : n-Butanol/Acide acétique/eau

BuOH :Buthanol

CCM : Chromatographie sur couche mince

CP : chromatographie sur papier

DPPH· : Radical 2.2 diphényle-1-picrylhydrazyl

EAA : Equivalent d’acide ascorbique

EAG : Equivalent d’acide gallique

EQ : Equivalent de quercétine

FRAP : Ferric reducing antioxidant power

ROS : Reactive Oxygen Species

Rf : Rapport frontal TPTZ : 2,4,6-tris(2-pyridyl)-1,3,5-s-triazine

UV/VIS : Radiation ultraviolette/ Visible

Introduction

Introduction

La plupart des espèces végétales qui poussent dans le monde possèdent des vertus

thérapeutiques, car elles contiennent des produits chimiques agissant directement sur

l'organisme. On les utilise aussi bien en médecine classique qu'en phytothérapie.

En effet, les produits chimiques auxquels les plantes médicinales leurs doivent plus souvent,

leurs propriétés, appartiennent à cette catégorie de substances qu'on range habituellement

aujourd'hui parmi les métabolites secondaires : alcaloïdes, hétérosides, essences à terpènes, ou

dérivés du phényle propane (cinnamiques, ...etc.), lignines, résines, gommes...etc.

En dehors des plantes médicinales classiques, souvent officinales, connues et utilisées depuis

plus ou moins longtemps, il reste encore beaucoup à faire pour dresser l'inventaire complet des

espèces susceptibles d'application thérapeutique, il faudra étudier toutes les plantes utilisées en

médecine populaire indigène. Pour cela, on propose notre contribution sur la plante « Matricaria

pubescens » qui est très utilisée par la population saharienne. Ce travail rentre dans le

programme de recherche de notre laboratoire (Biogéochimie des milieux désertiques), c'est un

axe qui s'intéresse à la valorisation des plantes sahariennes à caractère médicinal. nous nous

sommes proposé de caractériser qualitativement et quantitativement les polyphénols qui peuvent

être contenus dans cette plante et l’évaluation de leurs activité antioxydante. A cet effet, notre

travail s’échelonne comme suit :

I- Partie bibliographique

- Généralités sur les plantes médicinales spontanées sahariennes, et leur

utilisation en médicine traditionnelle.

- Etude botanique sur la plante « Matricaria pubescens» (classification, description, et

utilisation, …..).

- Etude de quelques grandes familles chimiques et leur pouvoir antioxydant.

II- Partie Expérimentale

1- Extraction des polyphénols et des flavonoïdes par trois méthodes.

2- Analyse par la chromatographie sur papier (CP) et sur couche mince (CCM) avec une

variété de phases stationnaires.

3- Evaluation de l’activité antioxydante de cette plante par deux méthodes, la réduction de

fer (FRAP) et le piégeage du radical libre DPPH.

Première partie Partie bibliographique

I-1-Présentation de la plante étudiée

Matricaria pubescens est une plante spontanée, elle pousse en abondance dans les régions

sahariennes. Elle est très utilisée en médecine et préparations traditionnelles [1]. Sa classification

et son aspect sont illustrés par le tableau 1 et la figure 1 respectivement.

Tableau 1: Classification systématique de la plante [2] [3] [4]

Figure 1 : Photo de la plante Matricaria pubescens

Spermaphytes Embranchement

Angiospermes S/Embranchement

Monocotyledones Classe

Compositea Sous-classe

Asterales Ordre

Astéracéas Famille

Matricaria Genre

Pubescens Espèce

Camomille Nom français

Guretoufa , Ouazouaza Nom vernaculaire

Aynasnis Nom tamasheq

I-2-Utilisation traditionnelle de la plante : Dans une large mesure, l'utilisation de cette plante dans la médecine traditionnelle est très

variée. Selon le nombre de personnes provenant de différentes parties du désert, elle est utilisée

pour traiter la dysménorrhée (tous les troubles des conditions liées à la menstruation), la toux et

les maladies oculaires, les maladies rénales, les rhumatismes et les douleurs des maladies

infectieuses et de l'abdomen, et la sécheresse, la dentition, les allergies, et la morsure des

scorpions.

Elle est également utilisée dans la saveur des soupes, en particulier au cours du mois de

Ramadan ; le beurre fondu des chèvres lorsqu’il est filtré à travers les tiges et les feuilles de la

plante devient très parfumé et se conserve mieux ; elle peut être ajoutée au thé. Elle est récoltée

et commercialisée à grande échelle dans les marchés. [1] [5]

II-Les composés phénoliques et flavonoïdes

II-1-Présentation des polyphénols Les polyphénols constituent une famille de molécules largement répandues dans le règne

végétal. On les trouve dans les plantes, depuis les racines jusqu’aux fruits. Les polyphénols sont

des métabolites secondaires, ce qui signifie qu’ils n’exercent pas de fonctions directes au niveau

des activités fondamentales dans l’organisme végétal, comme la croissance, ou la reproduction

[2].

L’expression de « composés phénoliques » est utilisée pour toute substance chimique

possédant dans sa structure un noyau aromatique, portant un ou plusieurs groupements

hydroxyles. Un nombre considérable de ces composés sont formés de deux noyaux benzéniques

A et B reliés par un hétérocycle de type pyrane. Ces composés diffèrent les uns des autres par la

position des substitutions sur les noyaux A et B, par la nature de l’élément central et par la

position, la nature et le nombre de molécules de sucre fixées [6].

Les polyphénols sont des produits de la condensation de molécules d’acétyl-coenzyme A et de

phénylalanine. Cette biosynthèse a permit la formation d’une grande diversité de molécules qui

sont spécifiques d’une espèce de plante, d’un organe, ou d’un tissu particulaire [7].

II-2- Structure et catégories des composés phénoliques : Structuralement, les composés phénoliques comprennent un noyau aromatique, qui possède

un ou plus de substituant hydroxylé. Ce dernier conduit les composés phénoliques simples à se

polymériser pour obtenir des phénols complexes ou polymérisés ; malgré la grande diversité

structurale, ce groupe est connu sous le nom : Polyphénols. [8]

La plupart des composés phénoliques sont présents conjugués avec un mono ou poly

saccharides, liés à un ou plusieurs groupes phénols, ça peut être aussi des dérivations

fonctionnelles comme des esters et des méthyles esters. Ces composés peuvent être groupés dans

plusieurs classes comme le montre le tableau 2.

Tableau 2 : Quelques classes des polyphénols [9].

Classe Structure

Phénols simples, benzoquinones

acide hydroxybenzoique

acéthophénones, acide phénylacétique

acide hydroxycinnamique, phénylpropanoides

(coumarines, isocoumarines, chromones)

flavonoides, isoflavonoides

lignanes, néolignanes

biflavonoides

tannins condensés (proanthocyandines, ou flavolans)

C6

C6-C1

C6-C2

C6-C3

C6-C3-C6

(C6-C3)2

(C6-C3-C6)2

(C6-C3-C6)n

D'après cette classification, les acides phénoliques, les flavonoides et les tannins sont

considérés comme les principaux composés phénoliques [10][28].

II-2-1- Les acides phénoliques : Cette classe est divisée en deux sous-classes

a- Les hydroxybenzoiques : Incluent plusieurs molécules et les plus fréquentes sont ; L'acide gallique, l'acide vanillique,

l'acide syringique et le p-hydroxybenzoique. Ces composants ont une structure de C6-C1 en

commun [19].

Acide P-hydroxybenzoique Acide gallique Acide vanillique

b- les hydroxycinnamiques : Ces molécules possèdent un cycle aromatique avec 3 carbones en plus C6-C3, par exemple :

l'acide caféique, l'acide férulique, p-coumarique, et l'acide sinapique [6] [3].

II-3-Biosynthèse des composés phénoliques :

II-3-1-Voie de biosynthèse des composés phénoliques Les grandes lignes des voies de biosynthèse des principaux composés phénoliques sont

maintenant bien connues. Les deux acides aminés aromatiques (phénylalanine et tyrosine) sont

présents dans les protéines mais sont également à l'origine de la formation de la plupart des

molécules phénoliques chez les végétaux. Ces composés sont issus par deux grandes voies

métaboliques:

a- voie de l'acide shikimique : (figure 2) Elle conduit à la formation du précurseur immédiat des phénols par désamination de la

phénylalanine. La séquence biosynthétique qui suit, dénommée séquence des phénylpropanoides,

permet la formation des principaux acides hydroxycinnamiques. Les formes actives de ces

derniers avec la coenzyme A permettent d'accéder aux principales classes des composés

phénoliques. citons quelques transformations :

- vers les acides de la série benzoique (acides gallique, protocatéchique…) par β-

oxydation. L'acide gallique lui-même, par combinaison avec des sucres simples, conduit

aux tannins hydrolysables (tannins galliques et ellagiques) .

- vers les estres de type chlorogénique par estérification avec un acide alcool (acide

quinique, tartrique, shikimique…).

- vers les coumarines, par cyclisation interne des molécules suivie de modifications

complémentaires (glycosilations, prénylations…)

- vers les lignines par réduction, formation des monolignols puis polymérisation oxydative

initiée dans la paroi cellulaire par les peroxydases et éventuellement les laccases[12] [17]

[18].

b- La voie de phénylpropanoide : (figure 3)

Acide p-coumarique Acide cafeique

La voie de phénylpropanoide commence par la phénylalanine (Phe) qui fournit en plus

des principaux acides phénoliques simples, coumarines, isoflavonoïdes, flavonoïdes, acide

salicylique, des précurseurs de lignine, qui est quantitativement le second biopolymère le plus

important après la cellulose [20].

Figure 2 : La biosynthèse des composés phénoliques par voie de shikimate [20].

Figure 3 : La biosynthèse des composés phénoliques par la voie de phénylalanine [12].

II-4-Les flavonoïdes

II-4-1- Présentation des flavonoïdes : Le nom flavonoïde proviendrait du terme flavedo, désignant la couche externe des écorces

d’orange, cependant d'autres auteurs supposaient que le terme flavonoïde a été plutôt prêté du

flavus ; (flavus = jaune).

Les flavonoïdes ont été isolés par le scientifique E.Chervreul en 1814, mais n’ont été

réellement découverts qu'en 1930 par Albert Szent-Györgyui. Désignés sous le nom de vitamine

P, en raison de leur efficacité à normaliser la perméabilité des vaisseaux sanguins, cette

dénomination fut abandonnée lorsqu'on se rendit compte que ces substances ne correspondaient

pas à la définition officielle des vitamines, il devient clair que ces substances appartiennent aux

flavonoïdes.

Les travaux relatifs aux flavonoïdes sont multiples. Prés de 4000 flavonoïdes ont été

décrits[5] [14] [15].

II-4-2- Structures et classifications des flavonoïdes :

a-Structure Ces molécules ont un poids moléculaire faible, se présentant en 15 atomes de carbones

arrangés comme suit : C6-C3-C6, elles sont composés de deux noyaux aromatiques A et B, liés

par un pont de 3 carbones souvent sous forme d'un hétérocycle.

Les substitutions variées au sein de la molécule donnent les différentes sous-classes des

flavonoides : Les flavones, et les flavonols sont les plus connus grâce à leur pouvoir antioxydant

élevé, et les plus divers sur le plan structural.

Les substitutions touchant les noyaux A ou B qui peuvent survenir dans chaque classe des

flavonoides sont : une oxydation, alkylation, glycosylation, acylation, et sulfonation [12] [14].

Figure 4 : Structure de base des flavonoïdes.

b-Classification Tableau 3: Principales classes de flavonoïdes[16].

Classes Structures chimiques R3' R4' R5' Exemples

Flavones

H OH H Apigénine

OH OH H Lutéoline

OH OCH3 H Diosmétine

Flavonols

H OH H Kaempférol

OH OH H Quercétine

OH OH OH Myrecétine

Flavanols

OH

OH

H

Catéchine

Flavanones

H

OH

H

Naringénine

OH

OH

H

Eriodictyol

Anthocyanidines

H OH H Pelargonidine

OH OH H Cyanidine

OH OH OH Delphénidine

Isoflavones

R5 R7 R4'

OH OH OH Genisteine

H O-Glu OH Daidzeine

c-Localisation : Les flavonoïdes sont impliqués dans de nombreuses interactions des plantes avec les

conditions biotiques et abiotiques de leur environnement, ces substances sont accumulées dans

différentes parties cellulaires et tissulaires de la plante durant l'organogénèse et sous l'influence

de plusieurs facteurs stimulants [17].

Sur le plan cellulaire, les flavonoïdes sont synthétisés dans les chloroplastes puis migrent

et se dissolvent dans les vacuoles, la répartition de ces composés montre des accumulations très

localisées, généralement en relation avec une fonction physiologique ou avec l’interaction de la

plante avec son environnement. Ainsi, les flavonoïdes qui ont une localisation épidermique ont

un rôle d'écran vis-à-vis des rayonnements solaires, tandis que ceux qui sont impliqués dans les

mécanismes de défense ont plutôt une localisation sous épidermique [18].

d- Distribution Les flavonoïdes sont présents dans toutes les parties des végétaux supérieurs: racines,

tiges, feuilles, fruits, graines, bois et pollens. Ils peuvent aussi être rencontrés dans certaines

boissons et chez certains fourrages (ex: trèfle). Certaines classes de flavonoïdes sont présentes exclusivement chez certains végétaux, on

trouvera par exemple, les flavanones dans les agrumes, les isoflavones dans le soja, les

anthocyanes et les flavonols ont eux une large distribution dans les fruits et les légumes, tandis

que les chalcones se retrouvent plus fréquemment dans les pétales des fleurs. Elles sont

considérées comme des pigments naturels au même titre que les chlorophylles et les

caroténoïdes.

Le monde animal est aussi concerné par les flavonoïdes, on peut citer l’isolement de

quinze à seize composés aromatiques à partir du lait de vache avec 5 à 6 composés importants

dus principalement à la consommation des plantes.

On trouve aussi la chrysine, la quercétine, de la galangine dans les propolis ; sécrétion des

bourgeons de nombreux arbres (le bouleau, le sapin, le saule…) récoltés par les abeilles, ces

insectes les fabriquent en modifiant la propolis par leurs enzymes salivaires. Les abeilles mettent

en œuvre les propriétés antifongiques et antibactériennes des polyphénols pour aseptiser leurs

ruches [8][18]. Le tableau 4 représente la distribution des principaux flavonoïdes dans certains

aliments.

Tableau 4 : Distribution alimentaire des principales classes de flavonoïdes [15] [16] .

Flavonoïdes Exemples Aliments Caractéristiques

Flavonols

Quercétine

Kaempférol

Oignon, poireau,

brocolis, pommes,

chou frisé, vin

rouge, thé.

Le groupe le plus abondant

des composés phénoliques.

Flavones

Lutéoline

Apigénine Persil, céleri.

Le groupe le plus abondant

des composés phénoliques.

Flavanones

Naringénine

Eriodictyol

Fruits du

genre

Citrus.

le flavanone le plus abondant est

la naringénine, isolée pour la

première fois à partir des écorces

de citrus.

Isoflavones

Genisteine

Daidzeine

Graines de

soja et

produits qui

en

dérivent.

Ils sont présents

dans les plantes sous forme

libre ou glycosylée.

Flavan3-ols

Catéchine

Epicatéchine

Epigallocatéchine

Vin rouge,

thé

noire, thé

vert, cacao,

chocolat.

impliqués dans la biosynthèse de

proanthocyanidines par des

condensations enzymatiques

et chimiques

Anthocyanidines

Cyanidine

Delphénidine

Raisins, vin

rouge,

certaines

variétés de

céréales.

Représentent le groupe le

plus important des

substances colorées, ces

pigments hydrosolubles

contribuent à la coloration

des angiospermes.

II-5- Biosynthèse des flavonoïdes : (figures 5 et 6) Les flavonoïdes se trouvent d'une manière systématique dans toutes les plantes vasculaires.

Ou ils peuvent être localisés dans divers organes : racines, tiges, bois, feuilles, fleurs el fruits. Ils

possèdent tous le même élément structural de base, car ils dérivent d'une origine biosynthétique

commune. Le cycle A est formé à partir de trois molécules de malonyl-coenzyme A (malonyl-

CoA), issues du métabolisme du glucose (voie de la glycolyse). Les cycles B et C proviennent eux aussi du métabolisme du glucose, mais par la voie du

shikimate via la phénylalanine qui est convertie en p-coumarate puis en p-coumaroyl-CoA, le p-

coumaroyl-CoA et les 3 malonyl-CoA se condensent en une seule étape enzymatique pour

former une chalcone, la 4,2’.4’,6’-tétrahydroxychalcone (réaction catalysée par la chalcone

synthétase). Le cycle C se forme par cyclisation de la chalcone, réaction catalysée par la chalcone-

isomérase qui induit une fermeture stéréospécifique du cycle conduisant à un seul énantio-mêre

2(S)-flavanone: la naringénine. Ce cycle s'hydrate ensuite pour former les différentes classes de

flavonoïdes [19] [9].

La chalcone (4,2'.4',6'-tétrahydroxychalcone) est métabolisée en différentes classes de

flavonoïde : flavanone, aurone, flavanonol, flavone, anthocyane et flavonol.

Figure 5: La biosynthèse des flavonoïdes illustrant les voies de l'acétyle CoA

et de la phénylalanine [5].

Figure 6 : Illustration les différentes réactions enzymatiques conduisant

aux principales classes de flavonoïdes [15].

Les composés de chaque sous-classe se distinguant par le nombre, la position el la nature

des substituant (groupements hydroxyles, rnéthoxyles et autres) sur les deux cycles aromatiques

A et B et la chaîne en C3 intermédiaire. A l'état naturel, on trouve très souvent les flavonoïdes

sous forme de glycosides. Une ou plusieurs de leurs fonctions hydroxyles sont alors glycosylées.

La partie : du flavonoïde autre que le sucre est appelée aglycone [14].

II-6-Propriétés biologiques :

II-6-1- Propriétés biologiques des composés phénoliques : Les polyphénols ont une multitude d’activités biologiques dépendant de leurs structures

chimiques. Ils constituent une importante famille d’antioxydants dans les plantes, les fruits et les

légumes puisqu’elles comprennent plus de 6000 molécules.

Contrairement aux antioxydants synthétiques comme le butylhydroxyanisole (BHA) et le

butylhydroxytoluène (BHT) et 2.2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH), les polyphénols n’ont

aucun effet nuisible sur la santé humaine [5].

Les polyphénols ont également un rôle dans le contrôle de la croissance et le

développement des plantes en interagissant avec les diverses hormones végétales de croissance.

Ils permettent aux végétaux de se défendre contre les rayons ultraviolets. Certains d’entre eux

jouent le rôle de phytoalexines comme les isoflavonols permettant de lutter contre les infections

causées par les champignons, ou par les bactéries.

Les pigments non azotés sont impliqués dans le processus de pollinisation : ils attirent

l’attention des insectes pollinisateurs, ou servent au contraire à dessiner les formes pour éloigner

les prédateurs. D’autre sont des inhibiteurs d’enzymes et interviennent dans la protection de

l’homme vis-à-vis de certaines maladies.

Les polyphénols sont également utilisés dans l’industrie agro-alimentaire comme additif,

colorant, arôme ou agent de conservation. Le tableau 5 illustre les rôles attribués aux

différentes classes de polyphénols [9] [13].

Tableau 5 : Activités biologiques de quelques composés phénoliques [14]

Composés phénoliques Activité biologique

Acide Phénolique Acide cafeique

Acide Salicylique

Antibactérienne

Antifongique, antioxydante

Tanins Tanin gallique

Proanthocyanidine

Effet stabilisant sur le collagène,

antioxydant, antidiarrheique , effet

antiseptique , effet vasoconstricteur

Flavonoïdes

Lutéoléine

Catéchine

Hespéridine

Quercétine

Naringénine

Antitumorale, anticarcinogène,

anti -inflammatoire, antioxydante,

antiallergique, antiulcéreuse, antivirale,

antimicrobienne, hypotenseur diurétique.

Coumarines Dicoumarol Anticoagulant, antioxydant,

protectrice vasculaire et antioedémateuse

II-6-2- Propriétés biologiques des flavonoïdes

Les flavonoïdes ont suscité l'intérêt scientifique depuis plusieurs décennies. D'abord à

cause de leur importance dans la physiologie des plantes et de leurs rôles dans la pigmentation,

mais aussi parce qu'ils sont impliqués dans la croissance et la reproduction des plantes. Ils ont

également pour fonction de protéger ces dernières contre les pathogènes d'origine virale ou

bactérienne, les prédateurs comme les insectes. Les flavonoïdes, en particulier, sont impliqués

chez les plantes dans le transport d'électrons lors de la photosynthèse, et ils jouent un rôle de

protection contre les effets néfastes des rayons ultraviolets en agissant comme antioxydant. Les

flavonoïdes parviennent à capturer les espèces réactives de l'oxygène associées au stress

oxydatif, les empêchant ainsi de créer des dommages cellulaires. En effet, i1s sont capables

d'inactiver et de stabiliser les radicaux libres grâce à leur groupement hydroxyle fortement

réactif. Ils inhibent aussi l'oxydation des LDL et, de ce fait, peuvent prévenir l'athérosclérose et

diminuer les risques de maladies cardiovasculaires [18] [16] [13].

III- Antioxydants

III-1- Radicaux libres et stress oxydant L’oxygène est un élément essentiel pour les organismes multicellulaires parce qu’il

permet de produire de l’énergie en oxydant la matière organique. Mais nos cellules

convertissent une partie de cet oxygène en métabolites toxiques : les radicaux libres

organiques [17].

Un radical libre est une espèce chimique, atome ou molécule, contenant un électron non

apparié. Ce déséquilibre n’est que transitoire et il est comblé soit par l’acceptation d’un autre

électron soit par le transfert de cet électron libre sur une autre molécule. Ces espèces radicalaires

très instables et très réactives sont produites d’une manière continue au sein de notre organisme,

dans le cadre de nombreux phénomènes biologiques. Par exemple, lors de la respiration

cellulaire, l’oxygène moléculaire se transforme en diverses substances oxygénées,

communément appelées radicaux libres de l’oxygène ou espèces réactives oxygénées

(Reactive Oxygen Species : ROS) [15].

Dans certaines situations, cette production augmente fortement, entraînant un stress

oxydatif que l’on définit comme un déséquilibre entre la production et la destruction de ces

espèces. Ce déséquilibre est à l’origine de nombreux facteurs, notamment les polluants présents

dans l’air que nous respirons et l’eau et les aliments que nous consommons. Les rayons

ultraviolets du soleil, d’autres radiations, la fumée de tabac et l’exercice excessif sont

également des facteurs qui augmentent considérablement la présence des radicaux libres dans

notre organisime [3].

En raison de leur capacité à endommager les cellules, les tissus et les organes, les

espèces réactives de l’oxygène sont impliquées dans un grand nombre de pathologies, tant

aiguës que chroniques[17].

Ces radicaux sont responsables de l’altération de l’ADN, du vieillissement cellulaire qui

est à la base de certaines maladies comme l’athérosclérose, le cancer, la maladie d’Alzheimer ou

la maladie de Parkinson [15].

III-2- Antioxydants naturels De nombreuses espèces oxydantes sont produites, et bien qu’elles soient souvent

indispensables à l’organisme, elles ne sont pas moins responsables de dégâts importants.

Un antioxydant est toute substance, présente à une concentration inférieure à celle du

substrat oxydable, qui est capable de retarder ou de prévenir l’oxydation de ce substrat.

Les antioxydants sont des composés puissants qui peuvent neutraliser les radicaux libres

impliqués dans la dégradation cellulaire, et nous aident ainsi à garder une vie active et saine.

Quelques antioxydants sont fabriqués par le corps humain, d’autres tels que les vitamines et

polyphénols, doivent être apportés par notre alimentation.

Il couvre un large nombre de molécules et des domaines très divers comme l’alimentation,

l’industrie chimique, l’industrie pharmaceutique.

Bien que la classification de tous les antioxydants connus est difficile, ils sont classés

généralement par leur mécanisme d’action ou par leur nature chimique [19].

III-2-1- Classification des antioxydants par rapport à leur mécanisme d’action Indépendamment de leur localisation, les antioxydants peuvent agir à deux niveaux : en

prévenant la formation de radicaux libres oxygénés ou en épurant les radicaux libres

oxygénés. En complément de cette double ligne de défense, l’organisme est en outre capable de

réparer ou d’éliminer les molécules endommagées par l’attaque radicalaire [17].

a- Les antioxydants primaires Plusieurs noms ont été attribués à ce groupe par exemple, antioxydants primaires,

chain breaking, piégeur des radicaux libres. Ce genre d’antioxydants peut inhiber la réaction

d’initiation et la propagation de l’oxydation en participant au processus d’oxydation et en

convertissant les radicaux libres vers leurs formes inactives. Les antioxydants primaires sont

généralement des composés phénoliques (AH) capables de donner un atome d’hydrogène au

radical libre et le convertir en un composé stable non radicalaire. Les antioxydants de ce groupe

réagissent de façon prédominante avec les radicaux peroxydés, pour deux raisons : la

concentration élevée de ces radicaux et la faible énergie du groupement (ROO·), en

comparaison avec les autres radicaux comme le (RO·) et la faible concentration du piégeur du

radical libre dans l’aliment. Un piégeur du radical libre, même à des concentrations faibles,

entre en compétition avec les lipides pour rendre le radical libre inactif par l’intermédiaire

d’une réaction de libération d’un électron, suivie d’une déprotonation [4].

b- Les antioxydants secondaires Les composés de ce groupe sont catalogués comme préventifs ou antioxydants

secondaires. Ils englobent une large gamme de différentes substances chimiques qui inhibent

l’oxydation des lipides par différents mécanismes et ne transfèrent pas le radical libre sous sa

forme non-radicalaire. Avec quelques exceptions, les antioxydants secondaires sont

généralement reliés à l’inhibition de facteurs initiant l’oxydation. ce groupe inclut : des

chélateurs de métaux pro-oxydatifs, des piégeurs de la molécule d’oxygène, inhibiteurs des

enzymes pro-oxydative, enzymes antioxydantes et destructeurs des hydroperoxides (Figure 7).

Parfois, quelques antioxydants peuvent exercer plusieurs fonctions anti-oxydatives, par exemple,

l’acide ascorbique peut être un piégeur du radical libre, désactivateur des oxygènes singulets

dans une solution aqueuse et effectivement régénérer du tocophérol. Plusieurs flavonoïdes

sont des piégeurs de radicaux libres et chélateurs de métaux. [19] [13]

Figure 7 : Les systèmes de défense contre les radicaux libres

III-2-2- Classification des antioxydants suivant la nature chimique Plusieurs antioxydants synthétiques et quelques composés naturels (tocophérol, acide

ascorbique, Béta-carotène) sont officiellement autorisés pour l’utilisation dans l’alimentation.

Leur présence s’avère également nécessaire au sein des produits pharmaceutiques et de

cosmétiques afin d’éviter leur dégradation. Cependant, des études toxicologiques ont jugé

certains antioxydants synthétiques comme sources de danger.

La recherche de nouveaux antioxydants naturels est l’objectif de nombreux industriels et

scientifiques. Dans la littérature, des milliers de publications ayant pour sujet les antioxydants

naturels ainsi que leur effet sur l’organisme humain peuvent être consultées [19].

Exemples d’antioxydants d’origine naturelle a- L’acide ascorbique et ses dérivés : (E300)

Il possède un caractère acide et intervient dans les échanges d’oxydoréduction grâce à sa

fonction ène-diol. L’acide ascorbique s’oxyde en acide déshydroascorbique, prévenant ainsi

l’oxydation d’autres substances moins réactives [18] :

Oxydation de l’acide ascorbique

b- Tocophérols Ces additifs sont apparentés à la vitamine E et sont contenus dans les lipides végétaux. En

1936, en étudiant le rancissement des huiles stockées, Olcott et Mattil s’aperçurent que celles-ci

étaient protégées contre l’autoxydation, ils les nomment "inhibitols" qui sont des tocophérols.

Les tocophérols sont des composés phénoliques de structure apparentée à celle de l’α-tocophérol.

On distingue l’α-tocophérol (E307), le γ-tocophérol (E308) et le δ-tocophérol (E309).

[15] :

α-tocophérol γ –tocophérol δ –tocophérol c- Composés phénoliques extraits de végétaux :

Ces composés ne sont pas reconnus comme additifs car ils sont étiquetés comme «

épices ». Leur statut pourrait évoluer de par leurs propriétés antioxydantes. Les principaux

végétaux riches en composés phénoliques sont répertoriés dans le tableau 6.

Tableau 6 : Quelques composés phénoliques à activité antioxydante dans les épices [20].

Végétaux Composés

phénoliques présents

Structures

Muscade Isoeugénol / Eugénol

Gingembre Gingérol/ Shogaol / Zingérone

Vanille Vanilline

Curcuma Curcumine

Exemples d’antioxydants synthétiques Plusieurs composés dont les formules sont répertoriées dans ce tableau sont utilisés dans ce domaine.

Tableau 7: Structures de quelques antioxydants synthétiques [9] Noms Structures

le gallate de propyle (E310)

le gallate d’octyle (E311)

le gallate de dodécyle (E312)

le butylhydroxyanisole ou BHA

(E320)

2 isomères

le butylhydroxytoluène ou BHT

(E321)

III-3- Mécanisme d’action

III-3-1- Mécanisme d’action des polyphénols contre les ROS Le processus d’oxydation est de type radicalaire : les antioxydants vont intervenir comme

"capteurs" de radicaux libres. Les antioxydants de type phénolique réagissent selon un

mécanisme proposé dès 1976 par Sherwin : l’antioxydant cède formellement un radical

hydrogène, qui peut être un transfert d’électrons suivi, plus ou moins rapidement, par un transfert

de proton [7].

R• + RH+ [ ] Mécanisme d’action des antioxydants phénoliques

III-3-2- Mécanisme d’action des flavonoïdes contre les ROS : L’activité antioxydante des flavonoïdes peut prendre plusieurs formes dans la régulation du

stress oxydatif, vis-à-vis les effets délétères des radicaux libres. Ces composants peuvent

intervenir en captant directement les radicaux libres, ou inhibant les enzymes responsables de la

génération des ROS, ou en captant les cations métalliques. [7]

a- Capture directe des radicaux libres :

La structure chimique des flavonoïdes leur confère la capacité de fixer directement les

radicaux libres « effet antiradicalaire ». Les flavonoïdes peuvent piéger le radical superoxyde,

hydroxyle, alkoxyle et peroxyle, par transfert d’hydrogène.

FL − OH + R• FL-O• + RH FL : représente le flavonoïde.

R : représente le radical libre.

Le radical flavonoxy (FL-O•) peut réagir avec un autre radical pour former une structure quinone

stable. La capacité antiradicalaire des flavonoïdes dépend principalement de leurs structures. [21]

b- Capture des cations métalliques : Les ions métalliques présents dans notre organisme, comme le fer ou le cuivre, peuvent

donner naissance à des radicaux hydroxyles très réactifs.

Les flavonoïdes sont connus par leur capacité à former des complexes stables avec les ions

métalliques et sont alors capables d’inhiber la réaction de Fenton et ainsi empêcher la production

des ROS, pour cette raison sont considérés comme de bons chélateurs.

On peut résumer les sites essentiels pour la chélation des ions métalliques :

- Un noyau catéchol sur le cycle B, Les groupes 3-hydroxyle et 4-oxo du cycle C.

- Les groupes 4-oxo et 5-hydroxyle entre les cycles A et C.

La quercétine est la plus active des flavonoïdes. [22]

Figure 8 : sites de chélations des flavonoïdes (quercétine)

Deuxième partie Partie expérimentale

IV-Méthodes et matériels

IV-1 - Matériel végétal utilisé Nous avons étudiés une plante locale de la région de Ghardaïa, Le matériel végétal

constitué des parties aériennes de la plante Matricaria pubescens est récolte en mars 2011. Après

séchage à une température ambiante et à l’abri de la lumière solaire, afin de préserver au

maximum l’intégrité de sa composition chimique. IV-2- Méthodes d’extraction Cette étape consiste à extraire le maximum de molécules polyphénoliques contenues dans

les parties aériennes de la plante en utilisant des solvants organiques mélangés avec de l’eau ou

seulement de l’eau. Les méthodes utilisées dans ce travail sont les suivantes :

a- macération du matériel végétal broyé dans une solution hydroalcoolique (méthanol/eau) à

chaud, une méthode très utilisée pour extraire ce type de composés. Généralement cette

opération est répétée deux à trois fois pour extraire le maximum de principes actifs [10].

b- macération du matériel végétal broyé dans le mélange acétone/eau pour empêcher l’action

de polyphénoloxydases qui dégraderaient les composés phénoliques [17] [10].

c- macération de la poudre végétale dans l’eau chaude, Parce que l'utilisation de la plante

dans les préparations traditionnelles est généralement faite dans l'eau.

IV-2-1-Protocoles d’extraction

Selon ces protocoles d’extraction, 1 g du matériel végétal broyé est soumis à une extraction par

macération à chaud et/ou à froid. Les figures suivantes décrivent les étapes suivies dans chacun

[6].

Figure 9 : Les étapes d’extraction des polyphénols par le MeOH (80%) Extrait A.

Figure 10 : Les étapes d’extraction des polyphénols par l’acétone (80%) Extrait D.

Figure 11 : Les étapes d’extraction des polyphénols par H2O Extrait Aq.

IV -3-Analyses chromatographiques

IV -3-1- Chromatographie analytique sur couche mince (CCM)

IV -3-1-1- Principe Cette méthode se repose sur la séparation des différents constituants d’un extrait selon leur force

de migration dans la phase mobile qui est en générale un mélange de solvant; adapté au type de

séparation recherché (Ferrari 2002), et leur affinité vis-à-vis la phase stationnaire qui peut être

gel de polyamide ou gel de silice. Elle nous permet d’avoir les empreintes du contenu

polyphénolique et flavonoique de l’extrait [13].

IV-3-1-2- Protocole de CCM sur polyamides Phase stationnaire : gel de polyamide fixée sur plaques de verre ou aluminium.

Phase mobile :

Monodimensionnelle : H2O/ EtOHl/nBuOH/AcOH (13/3/3/1)

Bidimensionnelle (1) sens : H2O/ EtOHl/nBuOH/AcOH (13/3/3/1)

(2) sens : H2O/ EtOHl/nBuOH/AcOH (60/20/25/2)

Extraits : hydroacétonique (D), hydromethanolique (A) et extrait aqueux (Aq) de la plante.

Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une

vitesse qui dépend de leur nature et de celle de la phase mobile [17].

Révélation: la visualisation des plaques est faites par deux méthodes

Physiques: sous une lampe UV en utilisant deux longueurs d’onde : 365nm et 254nm.

Chimique et Physique: par la suite les plaques sont exposées aux vapeurs d’ammoniaque (NH3

)suivie d’une deuxième visualisation sous la lumière UV aux deux longueurs d’ondes

précédentes.

IV-3-1-3- Protocole de CCM sur gel de silice Phase stationnaire : plaque de gel de silice fixée sur une feuille d'aluminium.

Phase mobile : l’élution dans cette phase (choisie après plusieurs tests) est répétée deux fois.

Première fois: AcOEt/ MeOHl/H2O (9/1,5/0,5).

Deuxième fois: AcOEt/ MeOHl/H2O (9/1,5/0,5).

Extraits : hydroacétonique (D), hydromethanolique (A) et extrait aqueux (Aq) de la plante.

Révélation: la visualisation des plaques est faites par deux méthodes

Physiques: sous une lampe UV en utilisant deux longueurs d’onde : 365nm et 254nm.

Chimique et Physique: par la suite les plaques sont exposées aux vapeurs d’ammoniaque (NH3

)suivie d’une deuxième visualisation sous la lumière UV aux deux longueurs d’ondes

précédentes.

IV-3-1-4- Calcul du Rapport frontal (Rf) Pour chaque spot on a calculé le facteur de rétention qui est égal à la distance parcourue

par le constituant divisé par la distance parcourue par le solvant.

d : Distance parcourue par le constituant

D : Distance parcourue par le front de l’éluant

Ce facteur permet de mentionner une information préliminaire sur la structure des substances

flavonoiques en tenant compte la nature du solvant utilisé.

Sachant que plusieurs facteurs peuvent influencer sur la valeur du Rf ex : la qualité de

l’adsorbant, la qualité du solvant, la concentration de l’échantillon, la saturation de la cuve.

IV-3-2-Chromatographie sur papier (CP)

IV-3-2-1- Principe Cette technique de séparation repose sur le phénomène de partage des constituants d’un extrait

entre la phase stationnaire et la phase mobile. Elle utilise une phase stationnaire constituée par

l’eau elle-même absorbée par la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. La phase

mobile est le plus souvent un mélange très polaire de solvants organiques et de l’eau, qui

entraîne les molécules séparées avec des vitesses et distances différentes, selon leur degré

d’affinité vis-à-vis les deux phases.

Elle est généralement appliquée pour la séparation et parfois la purification des produits ayant de

petites quantités.

IV-3-2-2- Protocole Afin de réaliser l’élution par cette méthode en deux dimensions, chaque extrait est déposé

sous forme d’un petit point au coin d’une feuille de papier wathman n°1, préalablement saturée

avec de l’eau puis séchée. Les systèmes de solvant utilisés après plusieurs essais sont:

• Pour la première dimension (BAW): n-BuOH/AcOH/H2O (4/1/1) • Pour la deuxième dimension: l’acide acétique/eau distillée (10/90).

Après le développement et le séchage du chromatogramme, les taches homogènes sont

marquées et délimitées dans une chambre noire sous la lumière UV à 254 et 366 nm, cette

opération est répétée après chaque élution, et à la fin une révélation chimiques en utilisant les

vapeurs de NH3 et par la suite un autre examen du chromatogramme sous la lumière UV à 254 et

366 nm pour noter les changement de couleurs avant et après NH3 [17].

Rf=d/D

IV-4-Étude quantitative

IV-4-1-Dosage des polyphénols totaux Les polyphénols produits par les végétaux en tant que métabolites secondaires constituent

une large gamme de molécules chimiques, dont leur nature chimique et teneur sont extrêmement

variables d’une espèce à autre. Plusieurs méthodes analytiques peuvent être utilisées pour la

quantification des polyphénols totaux. L’analyse par le réactif de Folin–Ciocalteu est la plus

utilisée [20].

IV-4-1-1-Principe Le dosage des polyphénols totaux a été effectué par une méthode adaptée par Singleton et

Ross (en 1965) avec le réactif de folin–Ciocalteu. Le réactif est formé d’acide

phosphotungestique H3PW12O40 et d’acide phosphomolybdique H3PMo12O4 , qui sont réduits

lors de l’oxydation des phénols en oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de molybdène (Mo8O3),

ce qui nous aide à doser les phénols dans le visible à une longueur d’onde de l’ordre 760 nm [7]

[9].

IV-4-1-2-Procédure expérimentale

Une courbe d’étalonnage standard a été obtenue à partir des solutions d’acide gallique de

différentes concentrations à partir d’une solution mère (100µg/ml). 1 ml de chaque solution a été

introduit à l’aide d’une micropipette dans des tubes à essai, suivis de l’addition de 2,5 ml du

réactif de Folin-Ciocalteu (10 fois dilué dans l’eau distillée). Après 10 min 2 ml de carbonates

de sodium à 20% ont été ajoutées, les solutions ainsi obtenues ont été secouées immédiatement

et sont maintenues à l’obscurité pendant 60 minutes à température ambiante. L’absorbance de

chaque solution a été déterminée à 760 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-VIS. Le blanc de

la réaction ne contenant pas de polyphénols est réalisé comme le point 0μg.ml-1 de la gamme.

Les lectures de la densité optique à 760 nm, des solutions ainsi préparées ont permis de tracer la

courbe d’étalonnage de l’acide gallique. L’analyse quantitative des phénols totaux des extraits

phénoliques a été réalisée par la même procédure. Toutes les mesures sont répétées 3 fois.

La quantité des phénols totaux extraite directement de la courbe d’étalonnage.

Q(µgEAG/ml)

IV-4-2-Dosage des flavonoïdes :

IV-4-2-1- Principe : La quantification des flavonoïdes a été effectuée par une méthode basée sur la formation de

complexes entre les composés phénoliques et le trichlorure d'aluminium. Les complexes produits

sont de couleur jaune absorbent dans le visible à 415 nm. [30]

IV-4-2-2- Procédure expérimentale Des volumes égaux de l’extrait et une solution AlCl3 (2%) sont mélangés. L’absorbance est

mesurée à 415 nm, après incubation à température ambiante pendant 40 min.

Dans les mêmes conditions et de la même façon sont mesurées les absorbances de la série des

solutions standards de quercétrine préparées à partir d’une solution mère de concentration égale à

0,1 mg/ml. Toutes les manipulations sont répétées 3 fois.

Le taux des flavonoïdes contenant dans l’extrait de la plante est calculé selon l’équation

suivante :

X : quantité des flavonoïdes (mg équivalent quercetine /g d’extrait plante) : mgEQ/g extrait. A : l’absorbance de l’extrait. A0 : l’absorbance de la solution de quercetine m : masse de l’extrait de plante (mg). m0 : masse de la quercetine dans la solution. [27] IV-5-Étude de l’activité antioxydante Pour évaluer l’effet antioxydant des extrait de la plante Matricaria pubescens, deux

techniques ont été réalisées : en utilisant le radical 2.2'-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) et la

technique FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power).

IV-5-1-Méthode DPPH (2.2’-diphényl-1-picrylhydrazyl) IV-5-1-1-Principe L’activité antiradicalaire des composés polyphénoliques contenus dans les extraits préparés

est évaluée en mesurant leurs capacités de piéger le radical libre DPPH (2.2'-diphényl-1-pycril-

hydrazyl) sa couleur violette foncée se transforme en jaune lors de sa réduction (capté par les

produits testés) [11] .

Figure 12 : Forme libre et réduite du radical DPPH

IV-5-1-2-Protocole

X= (A.m0)/(A0.m)

+antiox—OH + antiox-O• DPPH Radical libre polyphénols DPPH-H forme réduite polyphénol radical

(violet) (Jaune) (phénoxyle)

Une prise de 2,9ml d’une solution DPPH (6.10-5 M) préparée dans le méthanol absolu est ajoutée

à 100 µl d’extrait à une concentration de 1mg/ml (choisie après des essais préliminaires). L’acide

ascorbique à des concentrations : 5, 10, 15, 20, 30, 40, ……100 µg /ml a servit pour tracer la

courbe d’étalonnage. Les absorbances sont mesurées à 517 nm après incubation des solutions pendant 30 minutes à

l’obscurité. Le contrôle est la solution DPPH sans antioxydant.

Le pourcentage de piégeage du radical DPPH est calculé selon l’équation suivante :

A1 : absorbance du contrôle (solution du DPPH sans extrait).

A2 : absorbance en présence d’extrait.

Chaque test est répété trois fois, les résultats ont été présentés par la moyenne des trois

essais [28].

IV-5-2- Méthode FRAP (Ferric reducing antioxidant power) IV-5-2-1-Principe : L'essai FRAP (Ferric reducing antioxidant power) est réalisé selon la méthode décrite dans

la référence bibliographique [30]. Cette méthode mesure le pouvoir réducteur des antioxydants

présents dans un mélange par leur capacité de réduire le tripyridyl-triazine ferrique (Fe+3-TPTZ)

en tripyridyl-triazine ferreux (Fe+2-TPTZ) à un pH acide. [2]

Figure 13 : Réduction du Fe+3-TPTZ en Fe+2-TPTZ.

%de piégage=[(A1 – A2) / A1] x 100

IV-5-2-2-Protocole Une solution fraîche du réactif FRAP est préparée en mélangeant 10 ml de la solution du

TPTZ (10 mM) dans une solution 4 mM de HCl) avec 10 ml du FeCl3 (20 mM) et 100ml de la

solution tampon d’acétate de Sodium/ acide acétique à un PH égal à 3,6.

150 µl d’extrait à concentration de 1mg/ml, ou une solution de l’acide ascorbique (avec dilutions

appropriées) en tant qu’antioxydant étalon, ajouté à 2850 µl du réactif FRAP, le mélange est

incubé à 37 oC pendant 30 minutes à l’obscurité. L’eau bidistillée est utilisée à la place de

l’antioxydant pour préparer le blanc de la courbe d’étalonnage.

Les lectures de la densité optique sont faites à 593 nm, les solutions ainsi préparées ont permis

de tracer la courbe d’étalonnage de l’acide Ascorbique. Toutes les mesures sont répétées 3 fois

[29].

Chapitre V : Résultats et discussion

V-1-Extraction des composés phénoliques

Les parties aériennes de la plante Matricaria pubescens ont été soumises à trois types

d’extraction des composés phénoliques, ces méthodes sont basées sur la macération de la poudre

végétale à chaud ou à froid avec des mélange de solvants de polarité croissante : acétone/eau

(extrait D), méthanol/eau (extrait A) et afin de se rapprocher plus aux préparations

traditionnelles, nous avons utilisé seulement de l’eau chaude pour l’obtention de l’extrait (Aq).

D’une manière générale, les rendements des extraits varient en fonction des paramètres

de l’extraction solide-liquide des polyphénols: la température, le solvant d’extraction, la taille

des particules et le coefficient de diffusion du solvant.

Les extraits obtenus ont été conservés au réfrigérateur avant d'être analysés. le tableau

8 donne la couleur et le rendement de chaque extrait phénolique obtenu.

Tableau 8 : Couleurs et rendements des extraits phénoliques obtenus.

Solvant Couleur de l'extrait Rendement (%)

Méthanol/eau Jaune foncé 23,22 Acétone/eau Vert foncé 19,07

L’eau Jaune clair 21,98

Le rendement le plus élevé est obtenu avec le mélange hydroalcoolique (23,22%) suivi du

rendement de l’extrait réalisé avec l’eau (21,98%), et la valeur la plus faible est celle obtenue avec

le mélange hydrocétonique (19,07 %).

Nous pouvons donc dire que le mélange hydroalcoolique est semble être efficace et le plus

sélectif pour extraire les polyphénols du Matricaria pubesens. Cela est du à l'affinité des

composés phénoliques aux solvants polaires. Le même raisonnement peut être établi pour

l’extrait de l’eau, mais l’absence de la portion organique dans le mélange extractif a influé sur la

valeur du rendement.

V-2- Chromatographie analytique V-2-1-Chromatographie sur couche mince a-Résultats de la séparation par CCM sur polyamide

Cette technique peut nous informer sur le contenu en polyphénols et en particulier en

flavonoïdes des extraits analysés, et nous procurer les informations nécessaires pour la poursuite

des autres analyses préparatives.

En se basant sur les résultats analytiques, les phases les plus riches en flavonoïdes seront

choisies pour effectuer les étapes de l’isolement et la purification.

Les spots sont visualisés par la lumière UV sous deux longueurs d’onde 254 nm, puis 365 nm.

Cette dernière a donné des fluorescences plus claires et distinctes que la première longueur

d’onde. En deuxième lieu l’exposition aux vapeurs de NH3 puis visualisation par la lumière UV

est entreprise. Les images de les figures 14 et 15, et le tableau 9 , illustrent les différentes

séparations obtenues sur les chromatogrammes CCM et les Rf dans le cas du polyamide.

vision de l'œil à 254 nm à 365 nm

Figure 14 : Plaque CCM sur une phase stationnaire de polyamide

à 254 nm et 365 nm+ vapeurs NH3.

Tableau 9 : Résultats de séparation par CCM polyamide

Extrait (A) Extrait (D) Extrait (Aq)

Couleur NH3 + UV Rf

Couleur NH3 + UV Rf

Couleur NH3 + UV Rf

Jaune 0,11 Marron 0,09 Violet 0,1

Marron 0, 22 Marron 0,22 Bleu 0,15

Jaune 0,36 Marron 0,27 Jaune 0,21

Jaune 0,47 Bleu 0,38 Bleu 0,3

-- -- Violet 0,44 Jaune 0,46

-- -- Marron 0,48 Jaune bleu 0,67

-- -- Marron 0,67 Violet 0,76

-- -- Violet 0,77 -- --

Les chromatogrammes obtenus sur polyamide, présentent une bonne migration par

conséquent une bonne séparation qui permet l’analyse qualitative des composés polaires comme

les polyphénols et flavonoïdes, les spots sont bien distincts et montrent une richesse considérable

en substances. Selon leurs fluorescences et leurs Rf, nous pouvons dire que nos échantillons sont

riches en flavones (tâches violettes, marron, et bleues).

à 254 nm+ vapeurs NH3 à 365 nm+ vapeurs NH3

Figure 15 : chromatogramme bidimensionnel de Aq sur plaque de polyamide 20*20. b-Résultats de la séparation par CCM sur gel de silice :

Une analyse chromatographique sur couche mince CCM a été réalisée sur les trois

extraits obtenus précédemment, en utilisant le système d'élution AcOEt/MeOH/H2O, qui a été

choisi après plusieurs tests, sur des plaques de gel de silice. Les profils CCM de ces extraits

montrent que les extraits sont presque identiques et riches en produits relativement séparables

(tableaux 10 et 11).

Tableau 10 : Résultats de la séparation par CCM sur gel de silice 1ère élution

(A) (D) (Aq)

Couleur NH3 + UV Rf

Couleur NH3 + UV Rf

Couleur NH3 + UV Rf

Marron 0,85 Marron 0,10 Marron 0,10 Marron 0,81 Marron 0, 14 Marron 0,15 Marron 0,77 Marron 0,21 Marron 0,21 Marron 0,72 Marron 0,25 Violet 0,30 Violet 0,37 Marron 0,30 Violet 0,46 Violet 0,30 Marron 0,37

Marron 0,67 Rose 0,72 Marron 0,77 Rose 0,95

Tableau 11 : Résultats de la séparation par CCM sur gel de silice 2eme élution.

(A) (D) (Aq)

Couleur NH3 + UV Rf

Couleur NH3 + UV Rf

Couleur NH3 + UV Rf

Marron 0,09 Marron 0,05 Marron 0,49

Marron 0, 15 Marron 0, 32

Marron 0,47 Marron 0,37

Marron 0, 54 Marron 0,48

Marron 0,6

Violet 0,65

En comparant le système d’élution qui a été choisi pour cette analyse dans des études

antérieures pour les mêmes extraits de la même famille de la plante, nous avons constaté qu’il

fournit les meilleurs résultats. . La

révélation en chromatographie sur gel de silice, par la vapeur d'ammoniac, a montré des taches

marrons et violettes. Ces résultats confirment la présence de composés similaires en polarités

pour les deux extrait A et D. Dans cette analyse en utilisant le système d’élution AcOH/MeOH/H2O, les résultats de

séparation sont acceptables mais peuvent à notre sens être améliorés.

c-Résultats de la séparation sur plaque de cellulose : Il s’agit de l’utilisation d’une surface plane de cellulose considérée comme support

maintenant par imprégnation, une phase stationnaire liquide. Le système de solvants le plus

utilisé dans cette technique sont: n-butanol/acide acétique/eau : (BAW) : 4 /1 / 1 (phase

organique). Les résultats obtenus pour nos trois extraits sont illustrés par les figures 19 à 21.

Figure 16 : Chromatogramme de A sur plaque de cellulose n°1 (révélation à 365 nm+vapeurs NH3).

Figure 17 : Chromatogramme de D sur plaque de cellulose n°1 (révélation à 365 nm+vapeurs

NH3).

Figure 18:Chromatogramme de Aq sur plaque de cellulose n°1(révélation à 365 nm+vapeurs NH3).

V-2-3-Chromatographie analytique sur papier :

a-Résultats de la séparation par CP : La séparation des composés contenus dans les extraits A, D et Aq est effectuée par un autre

type de chromatographie, sur papier wathman n°1. Cette technique est très connu et appliquée

surtout quand il s’agit de petites quantités d’échantillons. Le choix de cette technique, dans notre

cas, était fait juste dans le but d’explorer plusieurs et différentes méthodes chromatographiques

de séparation.

Chacun des trois extraits A, D et Aq est déposé sur une feuille type Whatman n°1, suivi

d’un développement à deux dimensions et enfin la révélation s’est effectuée par les vapeurs

d’ammoniac. Les chromatogrammes ainsi obtenus sont représentés sur les figures 16 à 18.

Figure 19 : Chromatogramme de A sur papier wathman n°1 (révélation à 365 nm+ vapeurs

NH3).

Figure 20 : Chromatogramme de D sur papier wathman n°1 (révélation à 365 nm+ vapeurs NH3).

Figure 21 : Chromatogramme de Aq sur papier wathman n°1 (révélation à 365 nm+ vapeurs NH3).

V-3-Quantification des composés phénoliques

V-3-1-Dosage des phénols totaux : La spectrophotométrie UV/Vis. a permis de quantifier le taux des polyphénols présents

dans les extraits préparés de notre plante.

La courbe d’étalonnage (figure 22) établie à l’aide de différentes concentrations de l’acide

gallique à partir d’une solution mère à 100 µg/ml, nous a permis d’estimer la teneur en composés

phénoliques de chacun des trois extraits. Elle a été alors calculée à partir de la courbe d'étalonnage

et exprimée en µg équivalent en acide gallique par ml de la l’extrait brut (µgEAG/ml d’extrait pur).

Les résultats obtenus sont représentés sur la figure (23).

Comme le montre l’histogramme, la teneur en polyphénols totaux dans les extraits A, Aq

et D est variable, et diffère d’un extrait à un autre.

L'extrait (A) a présenté la plus grande teneur en composés phénoliques 28,00 µg EAG/ml

Ext. L’extrait Aq d’une teneur 15,1 µg EAG/ml, renferme moins de polyphénols que A mais la

quantité de ces composés dans le troisième extrait D (11,2 µg EAG/ml) est la plus faible. Il est à

noter que la teneur en composés phénoliques des trois extraits varie dans le même sens que leurs

rendements.

Figure 22 : Courbe d’étalonnage de l’acide galliue.

Figure 23 : Teneurs en polyphénols totaux dans les trois extraits étudiés.

R² = 0,998

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

D O

Acide gallique mg/ml

Phénols totaux

0

2

4

6

8

10

12

14

28,00

11,2

15,1

µgE

AG

/ml E

xt

A D Aq

V-3-2-Dosage des flavonoïdes Les teneurs en flavonoïdes dans les extraits ont été estimées par la méthode utilisant AlCl3.

La spectrophotométrie a permis de quantifier les flavonoïdes dans les extraits de la plante

étudiée. La courbe d’étalonnage est tracée en utilisant différentes concentrations de la quercétine,

un flavonoide très connu de la famille des falvonols (figure 24).

Les résultats sont représentés sur l’histogramme de la figure 25: la teneur en flavonoïdes

est exprimée en microgramme équivalent de quercétine par milligramme d’extrait (µg EQ/mg

d’extrait). La teneur en flavonoïdes totaux variable, et diffère d’un extrait à un autre.

Les résultats indiquent que l’extrait A, comparé aux deux autres extraits, présente aussi la

teneur la plus élevée en flavonoïdes qui est de 16,21 µg EQ/mg d’extrait c.à.d 57,5 % de ses

polyphénols sont de la famille des flavonoides.

L’extrait hydroacétonique (D) a montré qu’il contient plus de flavonoides que celui

obtenu avec l'eau (Aq), ces extraits contiennent respectivement 11,2 et 10,66 µg EQ/mg

d’extrait. C.à.d. 95,5 % des polyphénols de D sont des flavonoides, alors que seulement 54,9

% des polyphénols de Aq ont des structures de flavonoïdes.

En comparant les teneurs en flavonoïdes à celles des composés phénoliques dans tous les

extraits, nous remarquons qu'elles sont toutes plus faibles, ce qui indique que les extraits

contiennent d'autres composés phénoliques possédant d’autres structures chimiques que celles des

flavonoïdes (acides phénoliques, tanins...).

Figure 24 : Courbe d’étalonnage des flavonoïdes totaux

R² = 0,998

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50

D O

Quercetine µg/ml

Flavonoïde

Figure 25 : Teneur en flavonoïdes dans les extraits préparés.

V-4-Activité antioxydante des composés phénoliques Comme nous avons déjà indiqué, la surproduction des radicaux libres dans l’organisme et le

déficit du système de défense endogène peuvent engendrer de diverses pathologies ; cancer,

vieillissement….etc. Actuellement, La recherche vise à renforcer ces défenses endogènes par des

substances naturelles issues de plantes, qui sont douées des propriétés antiradicalaires. L'intérêt

croissant des effets bénéfiques de l'antioxydant sur la santé a mené au développement d'un grand

nombre de tests pour déterminer les capacités antioxydantes des extraits naturels. Le test DPPH et le

test FRAP sont parmi les plus utilisés dans la littérature.

V-4-1-Evaluation de l’activité antioxydante (test du DPPH) : L’activité est définie en pourcentage de piégeage du radical libre DPPH., ou l’absorbance du

mélange réactionnel qui contient le radical libre et l’échantillon de l’antioxydant est reliée avec

l’absorbance du mélange sans aucun antioxydant (solution contrôle) :

% de piégeage. = [(Abs contrôle – Abs échantillon)/ Abs contrôle] x 100

Comme il n’existe pas de mesure absolue de la capacité antioxydante d’un composé, les résultats sont

souvent portés par rapport à un antioxydant de référence, comme l’acide ascorbique (vitamine C), [30]

(figure 26). Le % de piégeage du radical libre DPPH. montre la capacité de l’extrait, à une

concentration fixée, de réduire ou non les radicaux et dans beaucoup de cas, l’augmentation de la

concentration de l’antioxydant amène l’augmentation de ces indices relatifs [31].

Le radical libre DPPH a permis l’estimation de l’activité antioxydante des extraits préparés. C’est un

radical synthétique de couleur violette qui vire vers le jaune quand il est capté par les flavonoides

contenus dans les extraits testés. L’intensité de la couleur jaune reflète la capacité antiradicalaire de la

0

5

10

15

20 16,21

10,66

8,31m

gEQ

/mg

Ext

A D Aq

molécule, et dépend de la nature, la concentration et la puissance de cette molécule. La concentration

des extraits testés est égale à 1mg/ml. Les principaux résultats de l'activité antioxydante de la plante

étudiée sont résumés sur la figure 27. L’histogramme présente les pourcentages de l’activité

antioxydante des extraits testés vis-à-vis du radical libre DPPH. L'extrait avec le méthanol/eau

présente le pouvoir antiradicalaire le plus élevé (42,5%), suivi par les deux autres extraits aqueux

(17,07%) et l'acétone(10,81). Nous constatons que les composés flavoniques contenus dans la

plante, sont doués d’un pouvoir antioxydant important, nous pouvons également supposer que

les radicaux liés aux flavonoïdes sont différents. Parce que l’activité antioxydante dépend

essentiellement du nombre des groupements hydroxyles, leur position, et les radicaux liés au

squelette moléculaire.

Figure 26 : Courbe d’étalonnage de l'acide ascorbique

Figure 27 : L'activité antioxydante des extraits étudiés.

R² = 0,978

0102030405060708090

0 20 40 60 80 100 120

(%) d

e pi

égea

ge

A.Ascorbiue µg/ml

Test du DPPH

0

10

20

30

40

50 42,5

10,8117,07

(%) d

e pi

égea

ge

A D Aq

V-4-2-Méthode de la réduction de fer (FRAP) L’activité antioxydante des extraits de la plante étudiée a été évaluée en utilisant la

méthode de FRAP. Cette dernière est un essai simple, rapide et reproductible. Elle est universelle

et peut être appliquée aussi bien chez les plantes que les plasmas et dans les extraits organiques

et aqueux.

Cette méthode est basée sur la capacité des polyphénols à réduire le fer ferrique Fe+3 en fer

ferreux Fe+2. La puissance de réduction est l’un des mécanismes antioxydants.

Dans notre travail nous avons opté pour tester les trois extraits. L’acide ascorbique (AA) à

(100µg/ml) est utilisé comme antioxydant de référence (figure 28) .

Les résultats obtenus illustrés par la figure 29, montrent que la capacité de réduire le fer

est presque la même pour les deux extraits de méthanol 80 % et l'acétone 80 % qui ont donné

respectivement 1 ,26 et 1,12 µg EAA/mg Ext , et elle est la plus élevée par rapport à l’extrait

avec l'eau qui a présenté une très faible activité (0,33 µg EAA/mg Ext) à une concentration de 1

mg/ml.

En tant que bons donneurs d'électrons, ce type de composés montrent la capacité réductrice

sur la réduction de Fe+3 en Fe+2. Ainsi, la plante Matricaria pubescens qui contient une quantité

notable de polyphénols et de flavonoïdes peut jouer un rôle majeur dans l'inhibition

antioxydante. Les résultats de cette étude ont indiqué que cette plante peut être utilisée comme

source naturelle d’antioxydants, facilement accessible.

Figure 28 : Pouvoir réducteur de l’acide ascorbique par la méthode FRAP

Figure 29 : Pouvoir réducteur dans les extraits phénoliques des plantes étudiées.

R² = 0,980

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 20 40 60 80 100 120

DO

Acide ascobique µg/ml

Méthode (FRAP)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,41,26

1,12

0,33

µgEA

asco

rbiq

ue

A D Aq

Conclusion

Conclusion

Ce travail nous a permis en premier lieu de maitriser les plus simples techniques

analytiques en passant de l’extraction des polyphénols aux outils analytiques de base dans

l’étude des composantes les plus intéressantes contenues dans une plante.

En outre, ce travail nous a permis de quantifier les composés phénoliques en utilisant les

techniques universelles appropriées après avoir effectué des analyses chromatographiques

analytiques de ces composés (polyphénols, flavonoïdes,...etc.) contenus dans cette plante.

Le choix de ce sujet est dicté par des travaux antérieurs effectués dans le cadre de la

valorisation des plantes spontanées à caractère médicinal des régions arides et semi-arides. Parmi

ces plantes, celle faisant l’objet de notre travail est Matricaria pubescens de la famille de

Asteraceae, issue de la région Ghardaïa.

Les parties aériennes de Matricaria pubescens, soumises à l'extraction par macération a

froid et à chaud avec des solvants de polarités différentes (Méthanol, Acétone et l’eau), sont

caractérisée par les couleurs et les rendements obtenues.

Les extractions suivies par l’étude chromatographique qualitative (CP et CCM) utilisant

différentes conditions opératoires, nous ont permis d’avoir un aperçu sur la composition

phénolique de notre plante.

Le dosage des polyphénols totaux par la méthode de Folin ciocalteau, des flavonoïdes en

utilisant la méthode au chlorure d'aluminium, nous a permis d’obtenir les résultats suivants : la

teneur en polyphénols totaux est comprise entre 28,00 et 11.2 (µg EAG/ml Ext). Alors que la

teneur en flavonoïdes est comprise entre 16,12 et 8.32 (µg EQ/mg Ext).

Pour évaluer l'activité antioxydante, le test DPPH a été utilisé, et les résultats ont montré

que le meilleur résultat est obtenu pour l’extrait A à 42,5% d’inhibition et par la méthode FRAP,

il a présenté 1 ,26 µg EAA/mg Ext. Notons enfin que ce travail va nous ouvrir des horizons de recherche ciblés dans le

domaine des plantes utilisées en médecine traditionnelle dans les zones arides, notamment en

terme de mise en évidence des principes actifs et l’évalution de leurs activités biologiques.

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Résumé Au cours de cette étude, les polyphénols totaux contenus dans la plante Matricaria pubescens ont été extraits par trois méthodes en utilisant les mélanges : methanol/eau 80:20 acétone/eau 80:20 et l’eau 100%, et quantifiés par spectrophotométrie uv-vis en présence du réactif Folin-Ciocalteu. Quand aux flavonoides, l’estimation de leur quantité a été faite par la même spectrophotométrie en présence de AlCl3. Les teneurs les plus importantes ont été obtenues pour l’extrait hydroacoolique : 28 µg EAG/mgExt pour les polyphénols totaux et16,12 µg EQ/mgExt pour les flavonoides L’activité antioxydante des extraits préparés a été mesurée par deux méthodes. La première qui utilise le radical libre 1, 1-diphényl-2 - picrylhydrazyle (DPPH) et le FRAP a été la deuxième méthode en utilisant TPTZ. Les extraits hydroalcooliques, hydroacetonique et l’extrait aqueux ont montré respectivement les pourcentages d’inhibition 42% 10,81% 17,07% par la méthode DPPH.

Mots clés : Matricaria pubescens, polyphénols, flavonoides, activité antioxydant.

Abstract In this study, total polyphenols contained in the plant Matricaria pubescens were

extracted by three methods using the following mixtures; methanol/water 80: 20 acetone-water 80: 20 and 100% water; and quantified by uv-vis spectrophotometry in the presence of Folin-Ciocalteu reagent. The estimate of flavonoids quantities was made in the presence of AlCl3 by the same spectrophotometry. The most important levels were obtained for the hydroacoolique extract: 28 µg EAG/mgExt of total polyphenols and16,12 µg EQ/mgExt of flavonoids. Antioxidant activity of the prepared extracts was measured by two methods. The first one use the free radical 1, 1-diphenyl-2 - picrylhydrazyle (DPPH) and FRAP was the second method which use TPTZ. Hydroacoolique, hydroacetonique and aqueous extracts showed respectively 42% 10,81% 17,07% by DPPH method.

Key words : Matricaria pubescens, polyphénols, flavonoides, antioxydant activity.

الملخصبواسطة ثالثة Matricaria pubescens من نبات الكلي تالبولیفینوال محتوى تم استخراج وقیاس، في ھذه الدراسة

والقیاس الطیفي باألشعة الفوق %100والماء 20:80الماء :األسیتون 20:80الماء : المیثانول طرق من مخالط محالیلالقیاس الطیفي بواسطة یداتنووعند قیاس الكمیة المقدرة الفالفو Folin-Ciocalteu ف شبنفسجیة المرئیة في حضور كا

ونویدات في مستخلص المیثانول الماءالفوالف توقد تم الحصول على أكبر قیمة للبولیفینوالAlCl3 نفسھ في وجود كاشف . µg EQ/mgExt 16.12و µg EAG/mgExt 28,00على التواليوھي

DPPHسدة للمستحلصات المحضرة تم حسابھا بطریقتین في األول باستعمال الجذر الحر الفعالیة المضادة لألك1,1diphényl-2-picrylhydrazyle وطریقةFRAP كانت الطریقة الثانیة باستعمال .TPTZ

%17.07% 10% 42 على التوالي نسب المؤویةال ھذه الكحول مائي واألستون مائي والماء الثالثة وأظھرت المستخلصات . µgEAA / mgExt 0,33 1,12 1,25و DPPHمن خالل طریقة

DPPH مكروغرام مكافئ لحمض األسكوربیك بواسطة طریقة 0,33 1,12 1,25و.FRAP .، النشاطیة المضادة لألكسدةیداتنوالفالفوت، البولیفینوال ،Matricaria pubescens :الكلمات المفاحیة