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FECONDATIONFECONDATION
IntroductionIntroduction
Les gamètesLes gamètesLes spermatozoïdesLes spermatozoïdes
Les ovocytesLes ovocytes
Les étapes de la fécondationLes étapes de la fécondation
Fécondation : Rencontre et Fusion du
gamète mâle et du gamète femelle
LES SPERMATOZOIDES
Millions...Milliers
Centaines…Dizaines
Cellule haploïde
Cellule capacitée
Modifications membranaires
Hyperactivation
Trompe utérine
L’OVOCYTE
Métaphase de Méiose II
Globule polaire/Espace périvitellin
Trompe utérine
La fécondation : grandes étapes (1)
I. Maturation épididymaire du spermatozoïde
II. Capacitation du spermatozoïde
III. Hyperactivation du spermatozoïde
IV. Interaction spermatozoïde - cumulus oophorus
V. Interaction spermatozoïde - zone pellucide
VI. Acrosome et réaction acrosomiale
La fécondation : grandes étapes (2)
VII. Traversée de la zone pellucide
VIII. Fusion spermatozoïde – œuf
IX. Activation de l’œuf
X. Réaction corticale et blocage de la polyspermie
XI. Décondensation du noyau du spermatozoïde dans l’ooplasme
XII. Achèvement de la mitose, développement des pronuclei
Maturation épididymaire du spermatozoïde (fécondance du
spermatozoïde)• Où ?• Durée ? Question de temps• Comment ?• Acquisition de la mobilité• Membrane
– Redistribution des protéines : Répartition inégale des glycoprotéines sur la tête du spermatozoïde
– Cholestérol qui est incorporé dans la membrane du spermatozoïde (stabilisation de la membrane)
– Préparation à la réaction acrosomiale ?
• Dans certaines espèces, il y a de grosses modifications morphologiques et/ou biochimiques du spermatozoïde pendant la traversée épididymaire– matrice de l'acrosome– protamines– gaine fibreuse du flagelle, etc...
Capacitation
• Capacitation = sorte de "décongélation" de la membrane plasmique
• Hétérogénéité des spermatozoïdes– Tous ne sont pas capacités– Beaucoup meurent avant d’être
capacités– Faire la différence entre sénescence du
spermatozoïde et capacitation
• Certains spermatozoïdes de cobaye peuvent faire leur réaction acrosomiale sans incubation préalable ! Exception ?
RENCONTRE DES GAMETES
Ampoule-Isthme tubaire
• In vivo le rapport spermatozoïde / œuf 1:1 • Pas de rôle de dispersion du cumulus par de nombreux
spermatozoïdes (# in vitro)• Le spermatozoïde doit être capacités pour pénétrer dans le
cumulus• Le spermatozoïde ayant fait sa réaction acrosomiale se
colle mais ne pénètre pas dans le cumulus• On ne sait pas si le spermatozoïde humain a besoin d'être
capacité pour pénétrer le cumulus
Entrée du spermatozoïde dans le cumulus
Le cumulus oophorus
• Cumulus = Matrice + Cellules
– MatriceAcide hyaluronique polymérisé + protéines(collagène, laminine, fibronectine, tenascine-C, inhibiteur de l’inter trypsine,…)
– CellulesCD44 (principal récepteur à l’acide hyaluronique de la surface cellulaire) Intégrines
Corona radiata
• Cellules folliculaires au contact de la ZP
• Envoient des prolongements à la surface de l'ovocyte à travers la ZP
• Rapports variables entre corona radiata et cellules du cumulus
TRAVERSEE DU MASSIF DES CELLULES FOLLICULEUSES
DISSOCIATION OU RETRACTION
Mécanisme de la traversée
• Rôle de la hyaluronidase membranaire (?) : non essentielle mais facilitante
• Autres enzymes de surface : acrosine, -galactosidase,...
• D'où viennent ces enzymes de surface ?– Épididyme ?– Capacitation ?– Acrosome
• Le mouvement hyperactif sert à la traversée (si on retire les spermatozoïdes du cumulus, ils reprennent un mouvement hyperactif)
Wassarman,PM2005p95
Interaction spermatozoïde – zone pellucide
Wassarman,PM2005p95 (fig1)
Fig. 1. Binding of free-swimming mouse sperm to the ZP of ovulated mouse eggs (B) Transmission electron micrograph of a sperm head bound to the ZP of an ovulated egg. Zona pellucida (ZP), nucleus (n), acrosome (a), plasma membrane (PM).
Spermatozoïde de souris non réagi à la surface de la ZP
Origine et biosynthèse de la zone pellucide
• Produite exclusivement par l'ovocyte– des ovocytes en culture peuvent synthétiser
toutes les glycoprotéines de la ZP– Acide hyaluroniquue en surface
• La synthèse et la sécrétion débutent très tôt
RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (1)
Zone pellucide
Glycoprotéines ZP1-ZP2-ZP3
Spécifiques d’une espèce
Acide hyaluronique
• Wassarman,PM2005p95Fig. 2. Organization of ZP filaments. Diagrammatic representation of the organization of mouse ZP glycoproteins ZP1, ZP2 and ZP3 in the crosslinked filaments that constitute the egg ZP. Note the repeating (periodicity 15 nm) structure ∼within the filaments and the employment of ZP1 as a crosslinker of filaments.
Zone pellucide de souris
ZP 4 chez l’homme (ZP1)
Les ligands de la ZP
ZP3 = ligand primaire
• Se lie à la membrane plasmique du spermatozoïde au-dessus du capuchon acrosomial
• Avant la réaction acrosomiale
• • Chaîne oligosaccharidique
(Fixation du spermatozoïde)
Chaîne peptidique (Réaction acrosomique)
ZP2 = ligand secondaire
• Se lie à la membrane acrosomiale interne du spermatozoïde
• Après la réaction acrosomiale
RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (2)
Zone pellucide
ZP2 : chaîne oligosaccharidique (Fixation
du
spermatozoïde)
Deuxième site de fixation/Ancrage du
spermatozoïde
RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (3)
Spermatozoïde
Enzymes membranaires : Récepteurs
Galactosyltransférase (Homme, Lapin,
Taureau…)
-D-Mannosidase (Homme, Souris…)
Lectines
Membrane plasmique périacrosomique
Chaîne oligosaccharidique de la ZP3
RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (4)
Spermatozoïde
Cell Adhesion Molecules (CAM)
PH-20
Membrane plasmique post acrosomique
et membrane acrosomique interne
Chaîne oligosaccharidique de la ZP2
RECONNAISSANCE-FIXATION A LA ZONE PELLUCIDE (2)
Point de fixation
Double fixation : ZP3 puis ZP2
Apex du spermatozoïde
Augmentation du nombre de sites de
fixation
Spermatozoïde couché sur la zone
pellucide
REACTION ACROSOMIQUE (1)
Libération des enzymes
contenues dans l’acrosome
Fusion membrane acrosomique
externe/membrane plasmique
REACTION ACROSOMIQUE (2)
Chaîne peptidique de la ZP3 : Ligand
Galactosyltransférase : Récepteur
spermatique
Interaction ligand-Récepteur:
-Protéine G
-Activation Phospholipase C : Calcium
REACTION ACROSOMIQUE (3)
1-Augmentation du calcium
intracellulaire
2-Augmentation du pH intracellulaire
3-Déstabilisation de la membrane
4-Exocytose du contenu de l'acrosome
ACROSINE
1-Fixation à la ZP (souris)
2-Non destruction de la ZP
3-Rupture liaison ZP2/ZP3
4-Fixation et franchissement de la ZP
(Non déterminant)
HYALURONIDASE
1-Aucun effet sur la corona radiata
2-Destruction de l'acide hyaluronique
de la ZP
3-Franchissement de la ZP
-N-ACÉTYLGLUCOSAMINIDASE
1-Franchissement de la ZP+++
2-Rupture liaison Spermatozoïde ZP2/ZP3
DISSOCIATION DE LA ZONE PELLUCIDE
1-Rétraction
2-Enzymes acrosomiques
3-Traversée de la zone pellucide
Mécanique (Flagelle)
Enzymatique (ZP2)
Bedford,JM1998p1275
• FIG. 7. Spermatozoa entering the zona in different unfertilized oocytes recovered from mated hamsters about 3 h after ovulation. A) A reacted spermatozoon tethered by acrosomal shroud (arrow) beginning to intrude into the surface of the zona. B) A reacted spermatozoon intruding further into the zona matrix. C) Here the penetrating sperm head has disappeared from view into the zona substance. Such interactions give no indication of local lysis of the zona surface during initial penetration. SEM 36000.
Hamster, 3 heures après l’ovulation
LES ÉTAPES DE LA FÉCONDATION (2)
Fusion des gamètes
Activation de l’ovocyte
Réaction corticale
Achèvement de la 2ème mitose de la
méiose
Formation des deux pronoyaux
FUSION DES GAMÈTES
Reconnaissance des membranes
plasmiques
Ovocytes/Spermatozoïdes
Fusion des membranes plasmiques
RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (1)
Mécanismes moléculaires de fusion
Virus/Hôte
Protéines spécifiques
Deux domaines d’activité
Domaine de Fixation : Disintégrine
Domaine de Fusion : Protéase
RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (2)
Protéines spécifiques
Famille ADAM
A Disintegrin And Metalloprotease domain
deux sous-unités
: Fusion
: Fixation
RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (3)
Protéines spécifiques
Cobaye : Fertiline (PH30)
Deux sous-unités et
Précurseurs (deux domaines)
Disintégrine et Métalloprotéase
Transit épididymaire
: Coupure du domaine Disintégrine /FUSION
: Coupure du domaine Métalloprotéase/FIXATION
RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (4)
Protéines spécifiques
: Coupure du domaine Disintégrine /FUSION
Motif peptidique (Virus rubéole)
Fusion et pénétration de la membrane
plasmique ovocytaire
: Coupure du domaine
Métalloprotéase/FIXATION
Les Disintégrines
RECONNAISSANCE DES MEMBRANES PLASMIQUES (5)
Protéines spécifiques
Homme
Fertiline
SP 10
PÉNÉTRATION DU SPERMATOZOÏDE
Fixation/Fusion
Segment équatorial
Membrane acrosomique interne
Membrane plasmique du spermatozoïde
Membrane plasmique ovocytaire :
Intégrines (Protéines de fixation)
Molécules du spermatozoïde et de l’oolemme participant aux interactions gamétiques
ACTIVATION OVOCYTAIRE (1)
Mise en marche du premier cycle
cellulaire
Modifications morphologiques
Pénétration du spermatozoïde
Formation des pronoyaux
Emission des granules corticaux
Redistribution des organites
ACTIVATION OVOCYTAIRE (2)
Modifications Moléculaires
Elévation du calcium libre intra-ovocytaire
Achèvement de la méiose II ovocytaire
ACTIVATION OVOCYTAIRE
Elévation du calcium libre intra-
ovocytaireFixation/Fusion
Protéine G
Inositol triphosphate (IP3)
Libération du Calcium séquestré (RE)
OSCILLATEUR CYTOPLASMQIQUE ET SES MODULATEURS
Facteur spermatique
Influx calcique trans-membranaire
Phase du cycle cellulaire
Sensibilité des récepteurs
Réserves en calcium intra-ovocytaire
MATURATION OVOCYTAIRE
Augmentation des réserves en calcium
intra-ovocytaire (RE)
Augmentation des canaux calciques
Réorganisation du RE
CYCLE CELLULAIRE
Phase M : Oscillateur+++Augmentation du calcium
Activation du MPF
ACTIVATION DE L’OSCILLATEUR
Interphase : Oscillateur -
MECANISMES D’ACTIVATION OVOCYTAIRE
Récepteurs membranaires ovocytaires
Facteurs solubles du spermatozoïde
Calcium
IP3
Protéine
« Oscillations calciques »
Santela,L2004p400
• Figure 2. Spatio-temporal changes of the inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3)-induced Ca2C release during oocyte maturation. Starfish oocytes are coinjected with the Ca2C dye Oregon Green 488 BAPTA-1 and InsP3, which is caged to inhibit its activity before photoliberation. The agonist is liberated by photoactivation at different times after application of the maturing hormone 1-methyladenine (1-MA). Shown are pseudocolored relative fluorescence images of the InsP3-induced increase in Ca2C. Blue corresponds to low Ca2C levels, whereas green and yellow correspond to higher Ca2C levels. After global photoactivation of InsP3, a Ca2C increase is detected in the animal hemisphere containing the nucleus of an oocyte matured for 12 min with 1-MA. A slightly higher Ca2C response after uncaging of InsP3 is detected in a different oocyte matured for 14 min with 1-MA. Note that at this time of maturation (14 min), the animal cortical region of the oocyte is much more sensitive to InsP3, which is liberated throughout the oocyte after UV. The area of higher InsP3 sensitivity then spreads towards the vegetal hemisphere and becomes global 30 min after the hormonal stimulation.
Spatio-temporal changes of the inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3)-induced Ca++ release
during oocyte maturation
Onde calcique
EMISSION DES GRANULES CORTICAUX
Exocytose des granules corticaux
Point de fusion du spermatozoïde
Contenu enzymatique
Imperméabilisation de la zone pellucide
ovocytaire
(Homme)
Imperméabilisation de la membrane plasmique
(lapin)
Berg LK, Wessel GM. Cortical granules of the sea urchin translocate early in oocyte maturation. Development. 1997, 24(9):1845-50.
• Timing of CG translocation.• (A-C) Immunolocalization of oocytes showing the
position of cortical granules as the oocyte matures.• (A) GV-staged oocyte;• (B) GVM;• (C) in vitro-matured oocyte. Cortical granules are
labeled with antibody to hyalin. (Bar, 50 mm).
Berg LK, Wessel GM. Cortical granules of the sea urchin translocate early in oocyte maturation.
Development. 1997 May;124(9):1845-50. (fig3)
Anticorps contre la hyaline des granules corticaux (oursin)
Ovocyte au stade vésicule germinale
Vésicules germinales matures
Ovcyte maturé in vitro
REDISTRIBUTION DES ORGANITES (1)
Mitochondries
paternelles : dégradation ou inactivation
maternelles : persistance dans l'œuf
Centrioles
Formation d’un demi-fuseau : spermaster
(centriole paternel)
Centrosome
Duplication des centrioles
REDISTRIBUTION DES ORGANITES (2)
Isolement des génomes
Pas de fusion des pronoyaux
Réplication de l’ADN
Isolement des chromosomes paternels :
-Zygote
-Blastomère
FORMATION DES PRONOYAUX
Perte de l’enveloppe nucléaire spermatique
Décondensation du noyau spermatique
(Protamines-Histones ovocytaires)
Reconstitution de l’enveloppe nucléaire
Pronucleus mâle
Achèvement de la Méiose II/Emission du 2ème
Globule polaire : Pronucleus femelle
Ward WS, Coffey DS. Biol Reprod. 1991 Apr;44(4):569-74.
DNA packaging and organization in mammalian spermatozoa: comparison with
somatic cells.
Hiiragi,T2004p360
• Figure 3 Relationship between cytoskeleton, chromosomes and first cleavage plane specification. a–f, Triple immunofluorescence staining of the embryo for microtubules (green), actin (red) and DNA (blue). Scale bar represents 20mm. a, Late interphase. b, The end of interphase. Arrowheads in a and b denote the small foci of microtubules. c, Prophase. Paternal and maternal chromosome aggregates (large and small arrow, respectively) are surrounded by masses of microtubules (arrowheads). d, Metaphase Metaphase plate with barrel-shaped spindle. e, Anaphase. Cleavage furrow is formed at the overlap of extended microtubules (arrowheads). f, Telophase. g, Time-lapse images of an embryo doubly recorded in DIC and fluorescence for DNA. Time is given in h:min after hCG injection. Scale bar represents 50mm. h, Schematic view of the process, summarized from a–g. Green, red and blue bars represent microtubules, maternal and paternal chromosomes, respectively.
Relationship between cytoskeleton, chromosomes and first cleavage plane specification.
La première semaine
Divisions de segmentation
Divisions des blastomères Migration dans la trompeMise en route du génome de l’embryon (4 cellules)
2ème jour : 4 cellules
4ème jour : Morula (64 cellules)
5éme - 6ème jour : Blastocyste (200 cellules)
La première semaine
Compaction de la morula (J4 - J5)
Jonctions serrées - Jonctions adhérentes
Adhésion des blastomères
Polarisation des blastomères périphériques (face libre / Face adhésive)
La première semaine
Formation du blastocyste (J5 - J6)
Jeune blastocyste
Blastocyste expansé Eclosion embryonnaire
Blastocèle
Trophectoderme* Placenta* Cellules polarisées* Jonctions serrées
La première semaine
Masse cellulaire interne (MCI)
Bouton embryonnaire (absence de contact avec l’extérieur)
* Embryon* Annexes : cordon - amnios
Cellules embryonnaires souches totipotentes (cellules ES)
Cellules non polarisées - Jonctions perméables (GAP junctions)
Fin de la première semaine
Eclosion embryonnaire (J6 - J7)
Expansion du blastocyste
Rupture de la zone pellucide
Implantation embryonnaire (J8)
Eclosion assistéeEclosion assistée
Eclosion assistéeEclosion assistée
Supersperm
LES ÉTAPES DE LA FÉCONDATION (1)
Rencontre des gamètes
Traversée du massif des cellules
folliculeuses
Reconnaissance-Fixation à la zone
pellucide
Réaction acrosomique
Dissociation de la zone pellucide
LES ÉTAPES DE LA FÉCONDATION (2)
Fusion des gamètes
Activation de l’ovocyte
Réaction corticale
Achèvement de la 2ème mitose de la
méiose
Formation des deux pronoyaux