Fibroblastes dermiques humains: une source cellulaire potentielle pour l'endothélialisation des prothèses vasculaires

Sciences fondamentales

DOI of or1Departme

Ing�eni�erie tissu2Departme

Linkoping, Lin3Departme

Linkoping, Su

CorrespondExperimentalLinkoping, Su

Ann Vasc SurgDOI: 10.1016/� Annals of V�Edit�e par ELS

Fibroblastes dermiques humains: une sourcecellulaire potentielle pourl’endoth�elialisation des proth�eses vasculaires

Lisa K. Karlsson,1 Johan P.E. Junker,1 Magnus Grenegard,2 Gunnar Kratz,1,3 Linkoping,

Su�ede

Introduction: R�ecemment, les travaux de recherche concernant les sources de cellules utilisa-bles en ing�enierie tissulaire vasculaire se sont multipli�es. De pr�ec�edentes �etudes rapportaientque des cellules potentiellement multipotentes �etaient retrouv�ees dans le tissu conjonctif cutan�e.De meme, des r�esultats pr�eliminaires de notre groupe sugg�eraient que les fibroblastes dermi-ques humains auraient la capacit�e de modifier leur ph�enotype in vitro en un ph�enotype sem-blable aux cellules endoth�eliales. Comme premi�ere �etape dans l’utilisation de ces cellules ening�enierie tissulaire vasculaire, nous cherchions �a d�eterminer leurs capacit�es �a former une cou-che de cellules de type endoth�elial-like sur une matrice in vitro. De plus, nous �etudions lapossibilit�e d’ensemencer des fibroblastes dermiques sur une matrice, puis de d�ebuter secondai-rement l’induction vers un ph�enotype cellulaire endoth�elial-like.M�ethodes: Les cellules cultiv�ees dans un milieu fibroblastique classique ou dans un milieud’induction endoth�elial �etaient ensemenc�ees sur une matrice �a base de g�elatine. Afin d’�etudierl’organisation des cellules, des colorations �etaient r�ealis�ees de routine. La diff�erenciation �etaitconfirm�ee par Western blot et immunohistochimie par des anticorps dirig�es contre les mol�eculescommun�ement utilis�ees dans l’identification des cellules endoth�eliales.R�esultats et Conclusion: Nos r�esultats soutiennent l’id�ee que des fibroblastes dermiqueshumains diff�erenci�es en cellules de type endoth�elial-like avant ensemencement d�emontraientune ressemblance histologique avec des cellules endoth�eliales matures, alors que des fibroblastesensemenc�es dont la diff�erenciation endoth�eliale �etait induite secondairement croissaient en multi-couches. Cependant, l’expression de diff�erentes mol�ecules de surface indiquant un ph�enotypeendoth�elial �etait observ�ee aves les deux techniques. En conclusion, les r�esultats pr�esent�es danscette �etude indiquent que les fibroblastes dermiques humains diff�erenci�es suivant un ph�enotypeendoth�elial-like pourraient etre une nouvelle source d’endoth�elialisation pour proth�eses vasculaires.

iginal article: 10.1016/j.avsg.2009.03.007.

nt of Clinical and Experimental Medicine, Center forlaire, University Hospital of Linkoping, Linkoping, Su�ede.

nt of Medical and Health Sciences, University Hospital ofkoping, Su�ede.

nt of Plastic Surgery, University Hospital of Linkoping,�ede.

ance: Lisa Karlsson, MSc, Department of Clinical andMedicine, University Hospital of Linkoping, SE-581 85�ede, E-mail: [email protected]

2009; 23: 663-674j.acvfr.2010.03.001ascular Surgery Inc.EVIER MASSON SAS

INTRODUCTION

La pathologie vasculaire est un probl�eme majeur de

sant�e publique �a l’�epoque actuelle. Les m�ethodes

th�erapeutiques utilis�ees font souvent appel �a l’utili-

sation de proth�eses autologues ou synth�etiques

(Dacron� ou polyt�etrafluro�ethyl�ene).1-3 Cepen-

dant, le fait que les sources de mat�eriel vasculaire

autologue soient limit�es ainsi que les probl�emes

d’occlusion des proth�eses synth�etiques encoura-

geaient la recherche d’alternatives th�erapeutiques

diff�erentes en ing�enierie tissulaire. L’objectif ultime

de l’ing�enierie tissulaire est de cr�eer des substituts

fonctionnels afin de remplacer les tissus perdus ou

endommag�es, en appliquant les principes de la

719

mailto:[email protected]

720 Karlsson et al. Annales de chirurgie vasculaire

biologie et de l’ing�eni�erie.4 Au cours de la d�ecennie

pr�ec�edente, diff�erentes techniques ont �et�e d�ecrites

pour la conception de proth�eses vasculaires.5-7 En

1998, L’Heureux et al.8 d�ecrivaient une m�ethode par

laquelle un vaisseau sanguin �etait compl�etement

g�en�er�e in vitro. Cependant, malgr�e les progr�es

r�ecents, il n’existe pas de greffon vasculaire id�eal

pour l’utilisation en pratique clinique.

Une alternative �a la conception d’un vaisseau

sanguin complet par l’ing�enierie tissulaire est

l’endoth�elialisation de proth�eses synth�etiques.

En 1984, Herring et al.9 publiaient la premi�ere�etude montrant les b�en�efices de l’ensemencement

de proth�eses vasculaires avec des cellules

endoth�eliales. Plusieurs �etudes ult�erieures mon-

traient que l’ensemencement de proth�eses vascu-

laires avec des cellules endoth�eliales avant

implantation fournissait une protection contre la

formation de thrombus et am�eliorait ainsi la survie

des greffons �a long terme.2,5,10-12 Cependant, obte-

nir des cellules endoth�eliales autologues humaines

peut s’av�erer difficile. Des cellules autologues ayant

une plasticit�e cellulaire, comme les cellules souches

m�esenchymateuses et h�ematopo€ı�etiques, �etaient

largement �etudi�ees comme source cellulaire alter-

native en ing�enierie tissulaire vasculaire.13,14

Cependant, il existe des obstacles majeurs contre

l’utilisation clinique de ces cellules du fait de leur

pr�el�evement et de leur culture.13,15,16

Au cours de ces derni�eres ann�ees, des populations

cellulaires ayant la capacit�e de modifier leur ph�eno-

type et de contribuer �a diff�erentes lign�ees distinctes

de leur tissu d’origine ont �et�e trouv�ees dans diff�erents

tissus.15-18 Un certain nombre d’�etudes rapportaient

que des cellules ayant un potentiel multipotent�etaient retrouv�ees dans le stroma conjonctif

cutan�e.19-23 Les r�esultats de notre �equipe indiquaient

que les fibroblastes dermiques humains, tout du

moins une de leurs sous-populations, pouvaient se

diff�erencier en plusieurs lign�ees m�esenchymateuses

comme l’os, le cartilage ou la graisse.24,25 Les fibro-

blastes existent en grand nombre dans la peau, et une

production cellulaire importante pouvait etre obte-

nue par des proc�ed�es mini-invasifs �a partir d’une

petite biopsie de peau. De plus, les r�esultats pr�elimi-

naires de notre groupe sugg�eraient que les fibro-

blastes dermiques humains avaient la capacit�e de se

diff�erencier suivant un ph�enotype endoth�elial-like

in vitro. La diff�erenciation survenait lorsque les

fibroblastes dermiques �etaient cultiv�es sur un milieu

de culture contenant du s�erum humain. Les cellules

endoth�eliales-like exprimaient le facteur von Wille-

brand (vWf), incorporaient des lipoprot�eines de basse

densit�e marqu�ees au fluorochrome, et formaient des

r�eseaux capillaires-like.

Notre objectif primaire �etait d’investiguer l’utilisa-

tion des fibroblastes dermiques humains diff�erenci�es

suivant un ph�enotype endoth�elial-like comme

source d’endoth�elialisation des proth�eses vasculai-

res. Nous utilisions une matrice �a base de g�elatine

porcine de type A hautement r�eticul�ee. D’anciennes

publications d�emontraient que la g�elatine favorise la

liaison et la croissance de plusieurs types cellulaires

chez le mammif�ere, et plus particuli�erement les cel-

lules endoth�eliales.26 La matrice �a base de g�elatine

utilis�ee dans cette �etude a �et�e pr�ealablement utilis�ee

pour guider la r�eg�en�eration tissulaire ainsi que pour

des th�erapies �a base de cellules in vitro et in vivo, et

ses propri�et�es indiquaient qu’elle pouvait etre

utilis�ee en ing�enierie tissulaire vasculaire.27-32 Le

deuxi�eme but de cette �etude �etait d’investiguer la

possibilit�e d’ensemencer des matrices avec des

fibroblastes dermiques humains puis de d�ebuter

secondairement l’induction en cellules de type

endoth�elial-like. Notre th�eorie �etait que cette pro-

c�edure pouvait raccourcir le temps de culture requis

pour l’endoth�elialisation des proth�eses vasculaires

par des fibroblastes dermiques humains.

MAT�ERIELS ET M�ETHODES

Isolement des cellules

Fibroblastes dermiques humains. Les fibroblastes

dermiques humains �etaient obtenus �a partir de sp�eci-

mens tissulaires (d�echets tissulaires) de patients en

bonne sant�e op�er�es en chirurgie plastique. Les tissus�etaient transport�es dans une compresse imbib�ee de

chlorure de sodium et trait�es dans les 24 heures.

Des cultures primaires de fibroblastes humains�etaient isol�ees manuellement en diss�equant la cou-

che dermique des �echantillons cutan�es, puis les frag-

ments �etaient incub�es �a 37 �C pour la nuit sur un

milieu d’aigle modifi�e par Dulbecco (Dulbecco modi-

fied eagle medium, DMEM) contenant 2% de s�erum de

veau fœtal ( fetal calf serum, MCF), de la collag�enase

165 U/mL (type 1; Worthington, Freehold, New

Jersey, E-U), et de la Dispase� 2,5 U/mL (GIBCO

BRL, Life Technologies, Karlsruhe, Allemagne). Les

cellules �etaient trait�ees par incubation dans un fla-

con de culture cellulaire de 75 cm2 �a 37 �C avec 5%

de CO2 et 95% d’humidit�e dans un milieu de crois-

sance fibroblastique ( fibroblast growth medium, FGM;

DMEM contenant 10% de MCF, des antibiotiques, et

des antimycotiques [p�enicilline 50 U/mL et strepto-

mycine 50 mg/mL]). Les milieux �etaient chang�es

trois fois par semaine.

Clones de fibroblastes. Afin d’�eliminer le risque de

contamination cellulaire des cultures fibroblastiques

primaires, des fibroblastes dermiques normaux ainsi

que des clones de fibroblastes �etaient utilis�es. Pour

Vol. 23, No. 5, 2009 Les fibroblastes comme source de cellules endoth�eliales 721

produire les clones de fibroblastes, les cultures de

fibroblastes dermiques humains d�etach�ees du pla-

teau de culture lors des passages 1-4 par proc�ed�es

enzymatiques, en rincant les cellules dans de l’acide�ethyl�enediaminet�etraac�etique (EDTA) �a 0,25%

(v/v). Ensuite, les cellules �etaient incub�ees �a 37 �Cdans de l’EDTA �a 0,12% (v/v) et de la trypsine �a0,12% (v/v). La suspension cellulaire �etait ensuite

observ�ee en utilisant un microscope invers�e �equip�ed’un micromanipulateur (InjectMan NI 2; Eppen-

dorf, Hamburg, Allemagne), et d’une micropipette

(CellTram Air, Eppendorf). En utilisant le microma-

nipulateur, les cellules isol�ees �etaient transf�er�ees

dans des puits s�epar�es sur une plaque de culture �a24 puits. Dans les puits ou la confluence �etait atteinte,

les cellules �etaient trait�ees en utilisant des passages

cons�ecutifs jusqu’�a ce que des nombres ad�equats

soient obtenus pour les exp�eriences de diff�erencia-

tion. Le milieu �etait chang�e trois fois par semaine.

Cellules endoth�eliales humaines. Les cellules

endoth�eliales humaines �etaient isol�ees suivant le pro-

tocole d�ecrit par Jaffe et al.33 Bri�evement, des cordons

ombilicaux provenant de nouveaux-n�es bien por-

tants �etaient conserv�es �a 4 �C dans un tampon

phosphate salin (TPS). Les veines �etaient canul�ees,

rinc�ees au TPS, puis inject�ees avec une solution de

collag�enase 165 U/mL (type 1, Worthington). Apr�es

20 minutes d’incubation �a 37 �C, les vaisseaux �etaient

mass�es avec douceur et perfus�es vigoureusement

avec du TPS. La solution cellulaire �etait centrifug�ee et

le culot cellulaire �etait suspendu �a nouveau dans un

milieu de croissance pour cellules endoth�eliales

(Endothelial growth medium, EGM; DMEM contenant

30% de s�erum humain provenant de plusieurs don-

neurs, des antibiotiques, et des antimycotiques

(p�enicilline 50 U/mL et streptomycine 50 mg/mL avec

3,3 mM d’isobutylm�ethylxantine [Sigma, Stock-

holm, Su�ede] et 0,8 mg/mL de toxine chol�eriforme

[Sigma]). Les cellules �etaient cultiv�ees dans 75 cm2 de

flacons de culture impr�egn�es de g�elatine (g�elatine

2%) �a 37 �C avec 5% de CO2 et 95% d’humidit�e. Le

milieu �etait chang�e trois fois par semaine.

Coloration immunohistochimique des

cultures cellulaires primaires

Les ph�enotypes des cultures primaires des cellules

endoth�eliales, des fibroblastes dermiques normaux,

et des clones de fibroblastes �etaient caract�eris�es

en immunohistochimie, en utilisant du s�erum anti-

vWf, de la cadh�erine endoth�eliale vasculaire (ve-

cadh�erine), du CD31, et de l’oxyde nitrique

synth�etase endoth�eliale (NOS3). Toutes les

exp�erimentations �etaient r�ealis�ees �a temp�erature

ambiante sauf pr�ecision contraire. Bri�evement, les

cellules �etaient lav�ees pendant 3� 5 min dans du TPS

avant d’etre fix�ees par un tampon de para-

formald�ehyde neutre �a 4% (TPN) pendant 15 minu-

tes. Les cellules �etaient ensuite lav�ees dans du TPS 3�5 min, puis incub�ees pendant 45 minutes avec du

s�erum bloquant (albumine s�erique bovine 5%) con-

tenant 0,05% de Triton X-100 afin de perm�eabiliser

les membranes cellulaires. Du Triton X-100 �etait

ajout�e uniquement lors de la coloration des �epitopes

intracellulaires (vWf et NOS3). Ensuite, les cellules�etaient incub�ees pendant 1 heure avec des anticorps

primaires (vWf dilution 1:200, clone F8/86l, Dako

Cytomation, Glostrup, Danemark; ve-Cadh�erine

dilution 1:200, clone F-8, Santa Cruz Biotechnolo-

gies, Santa Cruz, Californie; CD31 dilution 1:50, clone

JC/70A, Abcam, Cambridge, RU; et NOS3 dilution

1:50, Santa Cruz Biotechnologies). Apr�es rincage

dans du TPS, les cellules �etaient incub�ees pendant 1

heure avec un anticorps conjugu�e secondaire Ale-

xaFluor488 (dilution 1:500, Invitrogen, Stockholm,

Su�ede). Finalement, les cellules �etaient rinc�ees 3� 5

min dans du TPS puis assembl�ees en utilisant le r�eactif

Prolong gold antifade (VWR, Stockholm, Su�ede)

contenant du 4’,6-diamidino-2-ph�enylindole (DAPI).

Les controles incluaient l’omission des anticorps

primaires. Les antis�erum primaires et secondaires

utilis�es dans cette �etude avaient �et�e utilis�es dans

plusieurs autres �etudes et test�es en consid�erant leurs

sp�ecificit�es et leurs r�eactivit�es crois�ees.34-39 Les�echantillons �etaient examin�es en utilisant des

microscopes �a lampes fluorescentes Olympus (Solna,

Su�ede) BX41 et IX51 (x40/0,75) munis de filtres

d’excitation appropri�es (U-MWIB2, BP 460-490

nm), puis les images �etaient captur�ees en utilisant un

appareil Olympus DP70 CCD.

Induction de la diff�erentiation

La diff�erentiation de cultures monocouches des

fibroblastes dermiques humains et des clones de

fibroblastes en cellules de type endoth�elial-like �etait

induite en modifiant le milieu de culture cellulaire

FGM en EGM, un milieu dans lequel les cellules

endoth�eliales matures maintiennent leur �etat de

diff�erentiation. La diff�erentiation �etait confirm�ee

apr�es 10 jours de culture par analyse en western

blot et analyse immunohistochimique selon le pro-

tocole d�ecrit ci-dessus pour la caract�erisation ini-

tiale des cellules endoth�eliales, des fibroblastes, et

des clones de fibroblastes.

Ensemencement des cellules sur les

matrices

Dans l’�etude pr�esent�ee, nous utilisions une matrice

bas�ee sur une matrice �a base de g�elatine porcine


de type A hautement r�eticul�ee (Percell Biolytica,

Astorp, Su�ede). La matrice avait des pores inter-

connect�es avec une dimension interne moyenne

de 30 mm par pore, ce qui offrait des surfaces sub-

stantielles pour l’adh�esion cellulaire et facilitait la

signalisation paracrine. La matrice �etait pr�epar�ee

selon les recommandations du fabricant.

Bri�evement, la matrice d’environ 1 mm d’�epaisseur�etait hydrat�ee dans du TPS, coup�ee en pi�eces circu-

laires d’un diam�etre de 8 mm, et st�erilis�ee par un

autoclave (121 �C, 20 min, 15 psi). Les matrices

st�erilis�ees �etaient lav�ees au DMEM et plac�ees dans

des plaques de culture �a 24-puits.

Les matrices �etaient ensemenc�ees avec (1) des cel-

lules endoth�eliales cultiv�ees dans de l’EGM (avant et

apr�es ensemencement), (2) des fibroblastes et des

clones de fibroblastes cultiv�es dans du FGM (avant

et apr�es ensemencement), (3) des fibroblastes

diff�erenci�es en types cellulaires endoth�elial-like culti-

v�es dans de l’EGM (avant et apr�es ensemencement),

et (4) des fibroblastes et des clones de fibroblastes

cultiv�es dans du FGM (avant ensemencement). La

diff�erentiation de ces cellules �etait induite 24 heures

apr�es ensemencement en changeant le milieu de

culture par de l’EGM �a la place du FGM. Les cellules

endoth�eliales �etaient ensemenc�ees �a une densit�e de

200,000/cm2, alors que les fibroblastes dermiques

humains et les clones de fibroblastes �etaient

ensemenc�es �a une densit�e de 20,000/cm2.

Coloration �a l’h�ematoxylinee�eosine et

immunohistochimie des cellules

ensemenc�ees sur les matrices

Les cellules cultiv�ees sur des matrices pendant 10

jours �etaient lav�ees pendant 3 � 5 minutes dans

du TPS, imm�ediatement fix�ees dans du NBP 4%

pendant 24 heures, puis d�eshydrat�ees dans de

l’�ethanol-xyl�ene, et fix�ees dans de la paraffine. Des

coupes de 7 mm d’�epaisseur �etaient r�ealis�ees au

microtome RM 2255 (Leica Microsystem, Helsing-

borg, Su�ede). Les coupes �etaient d�eparaffin�ees,

color�ees �a l’h�ematoxylinee�eosine, et color�ees en

immunohistochimie. Pour l’analyse immunohisto-

chimique, un kit Vectastain Elite ABC (Immuno-

kemi, Jarfalla, Su�ede) �etait utilis�e pour d�etecter les

anticorps primaires. Bri�evement, les coupes �etaient

incub�ees avec du s�erum bloquant pendant 20 minu-

tes pour �eviter la liaison de prot�eines non sp�ecifi-

ques, avant d’etre incub�ees avec des anticorps

primaires dirig�es contre le vWf (dilution 1:20, clone

F8/86; Dako Cytomation), la ve-cadh�erine (dilution

1:50, clone F-8; Santa Cruz Biotechnologies), le

CD31 (dilution 1:50, clone JC/70A; Abcam); le

NOS3 (dilution 1:50, Santa Cruz Biotechnologies),

et le B2 (dilution 5 mg/mL; Sigma-Aldrich,

St. Louis, Missouri, E-U) pendant une heure.

Avant incubation des coupes avec les anticorps

dirig�es contre le CD31 ou le NOS3, deux �etapes

visant �a retrouver les antig�enes �etaient r�ealis�ees. Les

coupes color�ees avec des anticorps anti-CD31�etaient incub�ees avec une solution epsine 0,5%

pendant 10 minutes �a 37 �C. Les coupes color�ees

avec des anticorps anti-NOS3 �etaient incub�ees

pendant 20 minutes dans une solution de

r�ecup�eration cible (Dako Cytomation) pr�echauff�ee �a95 �C. Ensuite, les coupes �etaient rinc�ees pendant 3

� 5 minutes dans du TPS et incub�ees avec un anti-

corps secondaire biotinyl�e pendant 30 min. Les�echantillons �etaient lav�es �a nouveau et incub�es avec

le r�eactif Vectastain Elite ABC pendant 30 min.

Apr�es lavage dans du TPS pendant 3 � 5 min, les

anticorps fix�es �etaient localis�es avec le kit Vector VIP

(Immunokemi). Toutes les coupes �etaient contre-

color�ees au DAPI et enduites de g�elatine de glyc�erol

(Merck, Darmstadt, Allemagne). Les controles ne

contenaient pas d’anticorps primaire.

Analyse Western Blot

Un Western blot �etait r�ealis�e pour confirmer la

pr�esence de marqueurs endoth�eliaux dans les fibro-

blastes diff�erenci�es suivant un ph�enotype cellulaire

de type endoth�elial-like. Les prot�eines des cellules

cultiv�ees pendant 10 jours dans les flacons de

culture cellulaire et les cellules cultiv�ees sur les

matrices �etaient utilis�ees. Le milieu de culture cellu-

laire �etait retir�e, et les cellules �etaient lav�ees par

deux fois avec du TPS froid. Les cellules cultiv�ees

dans les flacons �etaient d�etach�ees en utilisant un

grattoir cellulaire, alors que les matrices �etaient

d�ecoup�ees en petits cubes puis trait�ees au sonica-

teur. Les suspensions cellulaires �etaient centrifug�ees�a 200 � g pendant 5 min, et le culot cellulaire �etait

incub�e avec un tampon de lyse pendant 30 minutes

sur de la glace. Les lysats cellulaires �etaient incub�es �a15000 � g pendant 5 minutes �a 4 �C, et les sur-

nageants �etaient collect�es et conserv�es �a e20 �Cavant l’analyse suivante. La teneur totale en pro-

t�eines �etait d�etermin�ee �a l’aide du Bio-Rad Protein

Assay avec de l’albumine s�erique bovine comme

standard (Bio-Rad Laboratories, Stockholm, Su�ede).

Les �echantillons utilis�es pour le Western blot�etaient bouillis �a 95 �C pendant 5 minutes apr�es

avoir ajout�e un tampon d’�echantillon de Laemmli

(Bio-Rad Laboratories) et du b-mercapto�ethanol.

L’�electrophor�ese �etait r�ealis�ee dans des gels ready

Tris/HCl 7,5% (Bio-Rad Laboratories) selon les

m�ethodes habituelles. Des montants �equivalents

d’�echantillons (30 mg de prot�eines pour les cellules


cultiv�ees dans des flacons de cultures cellulaires et

60 mg de prot�eines pour les cellules cultiv�ees sur

les matrices) �etaient charg�es par ligne. Les gels�etaient �equilibr�es dans un tampon de transfert pen-

dant 15 minutes. Les prot�eines �etaient transf�er�ees

sur des membranes de nitrocellulose (Bio-Rad Labo-

ratories) et incub�ees dans une solution bloquante

(lait sec 5% dans 0,05 M de Trizma [pH 7,5], 0,15

M de NaCl, et du Tween 0,05%) pendant 90 minutes�a temp�erature ambiante. Ensuite, les membranes�etaient incub�ees pour la nuit �a 4 �C avec des anti-

corps primaires dirig�es contre: le vWf (1:100, clone

F8/86; Dako Cytomation) ou le NOS3 (dilution

1:200, Santa Cruz Biotechnologies) dilu�e dans un

tampon de dilution (lait sec 0,1 % dans 0,05 M de

Trizma [pH 7,5], 0,15 M de NaCl, et du Tween

0,05%). Apr�es cela, les membranes �etaient lav�ees

et incub�ees pendant une heure �a temp�erature

ambiante avec des anticorps secondaires conjugu�es�a la peroxydase de radis dilu�es �a 1:5000 dans un

tampon de dilution (lait sec 0,1% dans 0,05 M de

Trizma [pH 7,5], 0,15 M de NaCl, et du Tween

0,05%). Apr�es plusieurs lavages, les bandes �etaient

r�ev�el�ees par chemiluminescence (Amersham

ECL� Western Blotting System; GE Healthcare,

Uppsala, Su�ede). Des plaquettes humaines (40 mg

de prot�eine) �etaient utilis�ees comme controles

pour la d�etection de vWf.

R�ESULTATS

Caract�erisation initiale des ph�enotypes

cellulaires

Afin d’�eliminer le risque de contamination par

diff�erents types cellulaires au sein des cultures cellu-

laires primaires, les ph�enotypes des cellules

endoth�eliales, des fibroblastes dermiques, ainsi que

des clones de fibroblastes �etaient caract�eris�ees en

immunohistochimie, avant ensemencement des cel-

lules sur les matrices. Au cours de la culture primaire

monocouche, les cellules endoth�eliales d�emontraient

une immunocoloration positive lors de l’utilisation

d’anticorps dirig�es contre le vWf, la ve-cadh�erine, le

CD31, et le NOS3 (Fig. 1A, E, I, M), alors que cela

n’�etait pas le cas avec les fibroblastes dermiques

(Fig. 1B, F, J, N) ou les clones de fibroblastes

(r�esultats non pr�esent�es) cultiv�es sur du FGM, lors-

que le meme protocole exp�erimental �etait utilis�e.

La modification ph�enotypique des fibroblastes en

cellules de type endoth�elial-like �etait induite par

culture de fibroblastes dermiques normaux ainsi

que des clones de fibroblastes dans de l’EGM pen-

dant 10 jours. Avant ensemencement cellulaire sur

les matrices, la modification ph�enotypique �etait

confirm�ee en immunohistochimie par l’utilisation

d’anticorps primaires dirig�es contre le vWf, la

ve-cadh�erine, le CD31, et le NOS3. Une majorit�ede cellules d�emontraient une immunor�eactivit�e �ala fois cytoplasmique et extracellulaire au vWf

(Fig. 1C, D) ainsi que des localisations cyto-

plasmiques de NOS3 (Fig. 1O, P), alors qu’une

immunocoloration moins prononc�ee �etait d�etect�ee

lorsque du s�erum anti-ve-cadh�erine �etait utilis�e(Fig. 1 G, H). Les fibroblastes ou les clones de

fibroblastes dont la diff�erenciation en cellules de

type endoth�elial-like �etait induite ne d�emontraient

pas d’immunor�eactivit�e lors de la coloration des

anticorps anti-CD31 (Fig. 1 K, L). Afin de confirmer

les r�esultats de l’immunocoloration, nous avons�egalement r�ealis�e une analyse western blot. Cette

derni�ere confirmait nos pr�ec�edents r�esultats en

d�emontrant la pr�esence de vWf au sein des cellules

endoth�eliales et des fibroblastes diff�erenci�es en cel-

lules de type endoth�elial-like (Fig. 2).

Evaluation de l’organisation et de la

diff�erentiation des cellules cultiv�ees sur

les matrices

Les matrices �etaient ensemenc�ees avec (1) des cellu-

les endoth�eliales (Fig. 3A), (2) des fibroblastes et des

clones de fibroblastes cultiv�es dans du FGM

(Fig. 3B), (3) des fibroblastes diff�erenci�es en cellules

de type endoth�elial-like cultiv�ees dans de l’EGM

(Fig. 3C), et (4) des fibroblastes et des clones de

fibroblastes induits �a se diff�erencier d’abord en cel-

lules de type endoth�elial-like apr�es ensemencement

sur matrice (Fig. 3D). Afin d’�evaluer l’organisation

et la migration des cellules cultiv�ees sur matrices,

des coupes d�eparaffin�ees �etaient color�ees avec du

DAPI et de l’h�ematoxylinee�eosine. De plus, la

diff�erenciation des fibroblastes et des clones de

fibroblastes en cellules de ph�enotype endoth�elial-

like �etait confirm�ee par western blot et immunoco-

loration par des anticorps primaires dirig�es contre le

vWf, la ve-cadh�erine, le CD31, le NOS3, et le B2.

Migration des cellules dans les pores des

matrices

La coloration au DAPI r�ev�elait que tous les types cel-

lulaires �etaient capables de migrer dans les pores des

matrices. Les fibroblastes et les clones de fibroblastes

cultiv�es dans du FGM (avant et apr�es ensemence-

ment) migraient d’avantage par rapport aux cellules

endoth�eliales ou les fibroblastes diff�erenci�es en cel-

lules de type endoth�elial-like avant ensemence-

ment. Cependant, la migration cellulaire la plus

importante �etait retrouv�ee chez les fibroblastes,

dont la diff�erentiation en cellules de type

Fig. 1. Caract�erisation immunohistochimique des

ph�enotypes cellulaires. Les cellules endoth�eliales

d�emontraient une immunocoloration positive en utili-

sant des anticorps anti-vWf (A), ainsi que des anticorps

anti-ve-cadh�erine (E), anti-CD31 (I), et anti-NOS3 (M).

Les fibroblastes diff�erenci�es en cellules de type

endoth�elial-like d�emontraient une immunocoloration

positive en utilisant des anticorps dirig�es contre le vWf

(C) et le NOS3 (O). Les cellules d�emontraient une

immunocoloration positive mineure lorsque de l’anti-

s�erum de ve-cadh�erine (G) �etait utilis�e. Aucune colora-

tion au CD31 n’�etait observ�ee (K). Les clones de

fibroblastes diff�erenci�es en cellules de type endoth�elial-

like d�emontraient une immunocoloration positive lors-

que des anticorps dirig�es contre le vWf (D) et le NOS3 (P)

�etaient utilis�es. Les cellules d�emontraient �egalement une

immunocoloration positive mineure en utilisant de

l’antis�erum de ve-cadh�erine (H), mais aucune coloration

au CD31 (L) n’�etait d�etect�ee. Aucune immunor�eactivit�en’�etait observ�ee sur les fibroblastes controle (B, F, J, N)

ou sur les clones de fibroblastes (r�esultats non pr�esent�es)

en utilisant les memes anticorps primaires. La coloration

DAPI �etait utilis�ee pour visualiser le noyau cellulaire

(fl�eches). Echelle ¼ 25 mm pour l’ensemble des images.


Fig. 2. Analyse western blot du vWf. Les cellules

endoth�eliales, les fibroblastes, et les fibroblastes

diff�erenci�es en cellules de type endoth�elial-like �etaient

analys�es en utilisant un western blot avec des anticorps

primaires dirig�es contre le vWf apr�es 10 jours de culture

dans des flacons. Un montant �equivalent de prot�eines

totales �etait analys�e dans tous les types cellulaires.


endoth�elial-like �etait induite apr�es ensemencement

sur matrice.

Cellules endoth�eliales cultiv�ees sur

matrices

Les coupes color�ees �a l’h�ematoxylinee�eosine et au

DAPI r�ev�elaient que les cellules endoth�eliales culti-

v�ees pendant 10 jours sur matrice �etaient organis�ees

suivant une monocouche confluente. Pendant toute

l’exp�erimentation, les cellules endoth�eliales

d�emontraient une immunocoloration positive au

vWf (Fig. 4A), �a la ve-cadh�erine (Fig. 5A), au

CD31 (donn�ees non pr�esent�ees), au NOS3 (Fig. 6A),

et au B2 (Fig. 7A). De plus, l’analyse en western blot

confirmait nos pr�ec�edents r�esultats en d�emontrant

la pr�esence de NOS3 dans ces cellules (Fig. 8).

Fibroblastes et clones de fibroblastes

cultiv�es sur matrices

Les fibroblastes et les clones de fibroblastes cultiv�es

dans du FGM (avant et apr�es ensemencement) for-

maient des couches cellulaires continues, jusqu’�aune �epaisseur de trois couches cellulaires, lorsqu’ils�etaient cultiv�es sur matrice pendant 10 jours. Ces

cellules ne d�emontraient aucune immunocolora-

tion au vWf (Fig. 4B, C), �a la ve-cadh�erine

(Fig. 5B, C), au CD31 (donn�ees non pr�esent�ees), au

NOS3 (Fig. 6B, C) en utilisant le meme protocole

exp�erimental. Cependant, les fibroblastes et les

clones de fibroblastes color�es avec un s�erum anti-

r�ecepteur B2 �a la bradykinine d�emontraient une

faible immunocoloration (Fig. 7B, C). L’analyse

western blot confirmait nos pr�ec�edents r�esultats en

d�emontrant l’absence de NOS3 dans les fibroblastes

dermiques normaux (Fig. 8).

Fibroblastes diff�erenci�es en cellules de

type endoth�elial-like avant

ensemencement sur matrices

Les coupes color�ees �a l’h�ematoxylinee�eosine et au

DAPI r�ev�elaient que les fibroblastes diff�erenci�es en

cellules de type endoth�elial-like avant ensemence-

ment croissaient suivant une monocouche concen-

trique, similaire �a ce qui est observ�e au sein des

cellules endoth�eliales. Les cellules d�emontraient

une immunocoloration positive au s�erum anti-vWf

(Fig. 4E). Cependant, toutes les cellules n’expri-

maient pas ce marqueur. De plus, les cellules

d�emontraient une immunocoloration positive �a la

ve-cadh�erine (Fig. 5E), au NOS3 (Fig. 6E), et au B2

(Fig. 7E) avec un type de coloration ressemblant �a ce

qui est vu dans les cellules endoth�eliales. Il n’�etait pas

vu d’immunor�eactivit�e lorsque des anticorps anti-

CD31 �etaient utilis�es (donn�ees non pr�esent�ees). De

plus, l’analyse western blot d�emontrait la pr�esence

de NOS3 dans ces cellules (Fig. 8).

Fibroblastes ensemenc�es sur matrices

dont la diff�erenciation �etait

secondairement induite en cellules

de type endoth�elial-like

Afin de diminuer le temps de culture n�ecessaire �al’endoth�elialisation de proth�eses vasculaires, des

fibroblastes dermiques humains �etaient ensemenc�es

sur une matrice et leur diff�erentiation en cellules de

type endoth�elial-like �etait induite 24 heures plus

tard. Au contraire des fibroblastes normaux cultiv�es

dans du FGM, ces cellules formaient une multicou-

che �epaisse lorsqu’elles �etaient cultiv�ees sur matrice.

Cependant, les clones de fibroblastes trait�es de la

meme facon ne formaient pas une multicouche

mais une monocouche confluente comparable aux

cellules endoth�eliales et aux fibroblastes diff�erenci�es

en cellules de type endoth�eliales avant ensemence-

ment. L’immunocoloration des fibroblastes et des

clones de fibroblastes ensemenc�es sur les matrices

puis induits �a se diff�erencier en cellules de type

endoth�elial-like d�emontraient des r�esultats similai-

res �a ceux observ�es au sein des fibroblastes

diff�erenci�es avant ensemencement. Les cellules


vWf (Fig. 4D, F), �a la ve-cadh�erine (Fig. 5D, F), au

NOS3 (Fig. 6D, F), et au B2 (Fig. 7D, F). Les clones

d�emontraient un important degr�e d’immunocolo-

ration �a la ve-cadh�erine. Cependant, l’intensit�e de la

coloration retrouv�ee dans les fibroblastes avant

ensemencement �etait augment�ee et le type de

coloration �etait d’avantage similaire �a celui observ�edans les cellules endoth�eliales. Aucune

immunor�eactivit�e n’�etait observ�ee lorsque des

anticorps anti-CD31 �etaient utilis�es (donn�ees non

pr�esent�ees).

Aucune immunocoloration n’�etait observ�ee dans

les �echantillons incub�es sans anticorps primaires

(controles n�egatifs, donn�ees non pr�esent�ees).

Fig. 3. Sch�ema de l’�etude. Des cellules

endoth�eliales cultiv�ees dans l’EGM pen-

dant 10 jours �etaient ensemenc�ees sur des

matrices de g�elatine et cultiv�ees dans

l’EGM pendant 10 jours suppl�ementaires

(A). Les fibroblastes dermiques humains

et les clones de fibroblastes cultiv�ees dans

le FGM pendant 10 jours �etaient

ensemenc�es sur des matrices de g�elatine

et cultiv�es dans du FGM pendant 10 jours

suppl�ementaires (B). Les fibroblastes

dermiques humains �etaient induits �a se

diff�erencier en cellules de type

endoth�elial-like par culture dans de

l’EGM 10 jours avant ensemencement sur

les matrices de g�elatine. Les cellules

�etaient cultiv�ees dans l’EGM sur la

matrice pendant 10 jours suppl�ementaires

(C). Les fibroblastes dermiques humains

�etaient cultiv�es dans du FGM pendant 10

jours puis ensemenc�es sur les matrices de

g�elatine, la diff�erenciation en cellules de

type endoth�elial-like �etait induite par le

changement du milieu de culture, du

FGM �a l’EGM (D).


DISCUSSION

Les r�esultats obtenus dans cette �etude r�ev�elent que

les fibroblastes dermiques humains diff�erenci�es en

cellules de type endoth�elial-like formaient une

monocouche lorsqu’ils �etaient cultiv�es sur des

matrices de g�elatine, avec des cellules exprimant

les marqueurs commun�ement utilis�es pour

caract�eriser les cellules endoth�eliales matures. Les

fibroblastes ensemenc�es sur les matrices dont la

diff�erenciation en cellules de type endoth�elial-like�etait induite secondairement d�emontraient une

immunocoloration positive meme si l’organisation

de ces cellules montrait d’avantage de similarit�eavec les fibroblastes dermiques normaux que les cel-

lules endoth�eliales.

De pr�ec�edentes �etudes montraient que l’impr�e-

gnation de proth�eses synth�etiques avec des compo-

sants naturels de la matrice extra-cellulaire, comme

le collag�ene, la fibronectine, ou meme la g�elatine,

am�eliorait l’adh�esion cellulaire.2,40-42 Dans cette�etude, nous utilisions une matrice bas�ee sur de la

g�elatine porcine, une matrice ayant diff�erents

caract�eres attrayants en ing�enierie tissulaire. Par

exemple, elle est biocompatible, biod�egradable (au

sein de substances non toxiques), facilement

fabriqu�ee, et relativement peu on�ereuse. Les

r�esultats obtenus dans l’�etude actuelle

d�emontraient que les cellules endoth�eliales, les

fibroblastes, et les fibroblastes diff�erenci�es en

cellules de type endoth�elial-like �etaient cultiv�es

avec succ�es sur cette matrice. Cette matrice avait

d�ej�a �et�e utilis�ee dans de nombreuses �etudes in vitro

et in vivo, d�emontrant de bons r�esultats sur

la viabilit�e cellulaire, la migration et la prolif�era-

tion.27-32 Nos constatations soutiennent ces

r�esultats.

La pr�esence de cellules contaminantes dans la

culture fibroblastique primaire pouvait possible-

ment conduire �a un r�esultat faussement positif

concernant les capacit�es de diff�erenciation. Nous

avons corrig�e ce probl�eme de plusieurs facons: pre-

mi�erement, les cellules endoth�eliales ne sont pas

favoris�ees par le FGM; deuxi�emement, elles

adh�erent rarement aux surfaces non impr�egn�ees;

troisi�emement, l’utilisation de clones de fibroblastes

r�eduit grandement la risque de r�esultats faussement

positifs r�esultant d’une contamination; enfin, avant

toute exp�erimentation, les ph�enotypes des fibro-

blastes et des clones de fibroblastes �etaient

confirm�es par immunohistochimie indirecte utili-

sant des anticorps dirig�es contre des mol�ecules sp�eci-

fiques des cellules endoth�eliales. Puisque ni les

fibroblastes, ni les clones de fibroblastes ne mon-

traient d’immunor�eactivit�e �a ces marqueurs, le

risque d’avoir des cellules contaminantes au sein

des cultures cellulaires utilis�ees dans ces

exp�erimentations est quasiment �elimin�e.

Nos r�esultats soutiennent l’id�ee que les fibroblas-

tes dermiques humains diff�erenci�es en cellules de

Fig. 4. Immunocoloration utilisant des anticorps dirig�es

contre le vWf. Images repr�esentatives des coupes mon-

trant les cellules cultiv�ees sur une matrice de g�elatine

pendant 10 jours, immunocolor�ee par de l’antis�erum de

vWf. L’expression du vWf �etait retrouv�ee dans les cellules

endoth�eliales (A), les fibroblastes diff�erenci�es en cellules

de type endoth�elial-like sur la matrice (D), les fibro-

blastes diff�erenci�es en cellules de type endoth�elial-like

avant ensemencement sur la matrice (E), et les clones de


like sur la matrice (F). Noter la pr�esence d’une

immunor�eactivit�e indiqu�ee par les fl�eches. Aucune

immunor�eactivit�e ne pouvait etre trouv�ee dans les

fibroblastes controles (B, C). La coloration au DAPI �etait

utilis�ee pour visualiser les noyaux cellulaires ( fl�eches).

Echelle ¼ 50 mm pour toutes les images.


type endoth�elial-like (avant ensemencement)

d�emontraient une ressemblance histologique avec

les cellules endoth�eliales matures. Les cellules for-

maient une monocouche confluente similaire �acelle des cellules endoth�eliales lorsqu’elles �etaient

cultiv�ees sur une matrice de g�elatine in vitro. Ceci

renforce donc l’hypoth�ese selon laquelle l’induction

d’un ph�enotype cellulaire endoth�elial chez les fibro-

blastes est possible. De plus, nos r�esultats r�ev�elent

que les fibroblastes diff�erenci�es en cellules de type

endoth�elial-like expriment des mol�ecules de surface

principalement observ�ees chez les cellules

endoth�eliales matures. L’expression de diff�erents

marqueurs indiquant un ph�enotype cellulaire

endoth�elial mature est commun�ement utilis�ee

pour valider une diff�erenciation endoth�eliale.

Une couche cellulaire endoth�eliale confluente,

anticoagulante, et antithrombog�enique est

importante pour qu’un substitut vasculaire soit

durable. De pr�ec�edentes �etudes montraient une

forte corr�elation entre la production d’acide nitrique

(NO) et la perm�eabilit�e des proth�eses vasculaires

utilis�ee lors des pontages.43 Le NOS3 est une

source clef de NO dans le syst�eme cardiovascu-

laire.44 La liaison de la bradykinine au r�ecepteur

coupl�e �a la prot�eine G de type B2 conduit �a l’acti-

vation de NOS3, puis �a la production de NO.44,45

Nous testions les possibilit�es d’activit�e NO au sein de

nos cellules de type endoth�elial-like par western

blot et immunohistochimie indirecte avec des anti-

corps dirig�es contre le r�ecepteur B2 �a la bradykinine

et le NOS3. Nos r�esultats r�ev�elaient que les fibro-

blastes diff�erenci�es (avant ensemencement) en cel-

lules de type endoth�elial-like d�emontraient une

immunor�eactivit�e �a ces deux marqueurs, avec un

type de coloration comparable �a celui des cellules


contre la ve-cadh�erine. Images repr�esentatives des cou-

pes montrant les cellules cultiv�ees sur une matrice de

g�elatine pendant 10 jours, immunocolor�ee par de l’anti-

s�erum de ve-cadh�erine. Une immunocoloration positive

�etait d�etect�ee dans les cellules endoth�eliales (A), les


like sur la matrice (D), les fibroblastes diff�erenci�es en

cellules de type endoth�elial-like avant ensemencement

sur la matrice (E), et les clones de fibroblastes diff�erenci�es

en cellules de type endoth�elial-like sur la matrice (F).

Noter la pr�esence d’une immunor�eactivit�e indiqu�ee par

les fl�eches. Aucune immunor�eactivit�e n’�etait retrouv�ee

dans les fibroblastes controles (B, C) en utilisant le meme

antis�erum. La coloration au DAPI �etait utilis�ee pour

visualiser les noyaux cellulaires ( fl�eches). Echelle ¼ 50 mm

pour toutes les images.


endoth�eliales. De plus, la pr�esence de NOS3 au sein

de ces cellules �etait confirm�ee en utilisant une

analyse western blot. Ces r�esultats indiquent que les

fibroblastes diff�erenci�es en cellules de type

endoth�elial-like peuvent servir de couche cellulaire

fonctionnelle se substituant aux cellules

endoth�eliales. Cependant, d’autres �etudes investi-

guant les propri�et�es h�emostatiques non throm-

bog�eniques et h�emostatiques de la couche cellulaire

sont requises avant l’utilisation de ces cellules en

clinique.

Un inconv�enient de la plupart des proth�eses vas-

culaires issues de l’ing�enierie tissulaire est le temps

requis entre l’isolement cellulaire et l’implantation

proth�etique. Dans le but de r�eduire les temps de

culture n�ecessaires, nous recherchions une

possibilit�e d’ensemencer des fibroblastes dermiques

normaux sur une matrice puis de d�ebuter

secondairement la diff�erenciation en induisant un

ph�enotype cellulaire endoth�elial-like. Nos r�esultats

r�ev�elaient que les fibroblastes diff�erenci�es en cellu-

les de type endoth�elial-like sur matrice exprimaient

le vWf, la ve-cadh�erine, le NOS3, et le B2. Cepen-

dant, l’organisation des cellules r�ev�elait en fait plus

de similarit�es avec les fibroblastes dermiques nor-

maux qu’avec les cellules endoth�eliales, avec une

multicouche de cellules se d�eveloppant �a la surface

de la matrice. Ceci pourrait etre expliqu�e par le fait

que les fibroblastes ensemenc�es en premier puis

diff�erenci�es secondairement formaient d�ej�a des

structures avec une croissance de type ‘‘fibroblaste-

like’’ avant que le ph�enotype soit modifi�e. Quelque

peu en contradiction avec cela, il y a le type de

croissance des clones de fibroblastes diff�erenci�es sur

matrice, qui d�emontrait une morphologie mono-

cellulaire. De plus, les clones montraient �egalement


contre le NOS3. Images repr�esentatives des coupes

montrant les cellules cultiv�ees sur une matrice de

g�elatine pendant 10 jours, immunocolor�ee par des anti-

corps anti-NOS3. Une immunocoloration positive �etait

d�etect�ee dans les cellules endoth�eliales (A), les fibro-

blastes diff�erenci�es en cellules de type endoth�elial-like

sur la matrice (D), les fibroblastes diff�erenci�es en cellules

de type endoth�elial-like avant ensemencement sur la

matrice (E), et les clones de fibroblastes diff�erenci�es en

cellules de type endoth�elial-like sur la matrice (F). Noter

la pr�esence d’une immunor�eactivit�e indiqu�ee par les

fl�eches. Aucune immunor�eactivit�e n’�etait retrouv�ee dans

les fibroblastes controles (B, C) en utilisant le meme

antis�erum. La coloration au DAPI �etait utilis�ee pour

visualiser les noyaux cellulaires ( fl�eches). Echelle ¼ 50 mm

pour toutes les images.


un haut degr�e de coloration �a la ve-cadh�erine.

D’avantage de connaissances sur les facteurs

d’induction conduisant �a la diff�erenciation

endoth�eliale des fibroblastes contribuera proba-

blement �a une diff�erenciation plus efficace. Cepen-

dant, avec les connaissances disponibles aujourd’hui,

il semble que les cellules doivent etre diff�erenci�ees

avant ensemencement sur matrice pour obtenir un

r�esultat optimal.

CONCLUSIONS

En nous basant sur les r�esultats obtenus dans la

pr�esente �etude, nous concluons que les fibroblastes

diff�erenci�es suivant un type cellulaire endoth�elial-

like ont la capacit�e d’endoth�elialiser des proth�eses

vasculaires in vitro. Lorsqu’ils sont cultiv�es sur des

matrices de g�elatine, les fibroblastes diff�erenci�es en

cellules de type endoth�elial-like avant ensemence-

ment croissaient suivant une monocouches et mon-

traient une ressemblance histologique avec les

cellules endoth�eliales matures. De plus, ces cellules


vWf, �a la ve-cadh�erine, au NOS3, et au B2. De

plus, l’analyse western blot confirmait les r�esultats

observ�es en immunochimie en d�emontrant la

pr�esence de NOS3 dans ces cellules. Les fibroblastes

ensemenc�es sur des matrices puis induits �a se

diff�erencier en cellules de type endoth�elial-like�etaient organis�es suivant une multicouche �epaisse

lorsqu’ils �etaient cultiv�es sur des matrices. Cepen-

dant, ces cellules d�emontraient �egalement

l’expression de mol�ecules commun�ement utilis�ees

dans la caract�erisation des cellules endoth�eliales. Les

r�esultats pr�esent�es dans cette �etude pourraient avoir


contre le r�ecepteur B2 �a la bradykinine. Images

repr�esentatives des coupes montrant la coloration

immunohistochimique des cellules cultiv�ees sur une

matrice de g�elatine pendant 10 jours, en utilisant des

anticorps anti- r�ecepteur B2 �a la bradykinine. L’expres-

sion of B2 �etait d�etect�ee dans les cellules endoth�eliales

(A), les fibroblastes diff�erenci�es en cellules de type

endoth�elial-like sur la matrice (D), les fibroblastes

diff�erenci�es en cellules de type endoth�elial-like avant

ensemencement sur la matrice (E), et les clones de


like sur la matrice (F). Noter la pr�esence d’une

immunor�eactivit�e indiqu�ee par les fl�eches. Une immuno-

coloration mineure �etait retrouv�ee dans les fibroblastes

controles (B, C) en utilisant le meme antis�erum. La

coloration au DAPI �etait utilis�ee pour visualiser les noy-

aux cellulaires ( fl�eches). Echelle ¼ 50 mm pour toutes les

images.

Fig. 8. Analyse western blot du NOS3. Les cellules

endoth�eliales, les fibroblastes, et les fibroblastes

diff�erenci�es en cellules de type endoth�elial-like �etaient

analys�es par western blot avec des anticorps primaires

dirig�es contre le NOS3 apr�es 10 jours de culture sur

matrice. Un montant �equivalent de prot�eines totales �etait

analys�e dans tous les types cellulaires.


un impact important en ing�enierie tissulaire vascu-

laire. Etre capable d’utiliser des fibroblastes dermi-

ques humains comme cellules sources pourrait

drastiquement faciliter l’utilisation de mat�eriaux

autologues issus de l’ing�enierie tissulaire vasculaire,

pas uniquement concernant l’endoth�elialisation des

proth�eses, mais �egalement en vue de la conception

de vaisseaux sanguins complets et dans la vascula-

risation des ressources issues de l’ing�enierie.

Nous remercions A. Lonn et K. Briheim pour leur assistance

technique. Nous remercions �egalement les Professeurs C.

Dabrosin et A. Abrahamsson pour leur aide concernant

l’analyse western blot. Ce travail recevait des financements

provenant de Material in Medicine et du comt�e de Linkoping,

Su�ede.

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Fibroblastes dermiques humains: une source cellulaire potentielle pour l'endothélialisation des prothèses vasculaires